ES2320604T3 - Identificacion de polimorfismos del adn mediante la utilizacion de citometria de flujo. - Google Patents

Identificacion de polimorfismos del adn mediante la utilizacion de citometria de flujo. Download PDF

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Abstract

Procedimiento homogéneo para la determinación de la identidad de una base en una cadena de ADN, que comprende en orden las etapas de: (a) alineamiento de un oligonucleótido a la cadena de ADN de forma inmediatamente adyacente a la base cuya identidad se va a determinar; (b) incubación de la cadena de ADN alineada y del oligonucleótido con cuatro dideoxinucleótidos distintos, teniendo uno de los dideoxinucleótidos una molécula indicadora fluorescente en presencia de ADN polimerasa, lo que extiende de ese modo el oligonucleótido por una unidad de base; (c) inmovilización del oligonucleótido extendido en una microesfera y (d) análisis de la microesfera mediante la utilización de citometría de flujo, mediante la cual se determina la base bajo investigación.

Description

Identificación de polimorfismos del ADN mediante la utilización de citometría de flujo.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a la utilización de citometría de flujo para la determinación de la composición de una base de nucleótido del ADN y, más en particular, a la utilización de la citometría de flujo para determinar la identificación de la base de polimorfismos de un solo nucleótido, incluyendo polimorfismos, inserciones y eliminación de nucleótidos. La presente invención se llevó a cabo con ayuda del gobierno bajo el contrato Nº W-7405-ENG-36 adjudicado por el Departamento de Energía de Estados Unidos a los regentes de la Universidad de California. El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.
Antecedentes de la invención
La determinación de la secuencia de bases del ADN del genoma humano tendrá un impacto trascendental en la ciencia biomédica en el próximo siglo. La consecución del primer ADN humano completo reforzará una variedad de aplicaciones, desde la determinación del mapa genético de genes asociados a enfermedades, hasta pruebas diagnósticas para susceptibilidad a enfermedades y respuesta de enfermedades a fármacos. La determinación de la composición de la base en posiciones del ADN específicas, variables, conocidas como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) es especialmente importante. La generación actual de procedimientos para la determinación de la secuencia son demasiado lentos y costosos para satisfacer los requisitos del análisis de SNP a gran escala. Por lo tanto, hay una necesidad de disponer de procedimientos más rápidos y más eficientes para el análisis de secuencias genéticas para los SNP.
Los SNP tienen una serie de utilizaciones en la determinación del mapa genético, la identificación de genes asociados a enfermedades y en pruebas diagnósticas. Todas y cada una de estas aplicaciones incluyen la determinación de la composición de la base en la posición del SNP. La secuenciación convencional puede proporcionar esta información, aunque resulta poco práctica para la identificación de una gran cantidad de posiciones en una gran cantidad de individuos. Para aumentar la capacidad de procesamiento se han desarrollado distintos procedimientos alternativos.
Se han desarrollado dos técnicas para determinar la composición de la base en una posición individual: minisecuenciación (véase, por ejemplo, "Minisecuenciación: Una Herramienta Específica Para Análisis de ADN Y Diagnóstico En Matrices de Oligonucleótidos" ("Minisequencing: A Specific Tool For DNA Analysis And Diagnostics On Oligonucleotide Arrays") de Tomi Pastinen y otros, Genome Research 7, 606 (1997)) y ligación de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, "Determinación En Pocillo Individual Del Genotipo De Variaciones De La Secuencia Dialélica Mediante Análisis De Ligación De Oligonucleótidos Basado En ELISA De Dos Colores" ("Single-Well Genotyping Of Diallelic Sequence Variations By A Two-Color ELISA-Based Oligonucleotide Ligation Assay") de Vincent O. Tobe y otros, Nuclear Acids Res. 24, 3728 (1996)). En la minisecuenciación, se diseña un cebador para interrogar una posición específica de una cadena molde de muestra y se utiliza polimerasa para extender el cebador con un dideoxinucleótido marcado. En la ligación de oligonucleótidos, se diseña un cebador similar y se utiliza ligasa para unir de forma covalente un oligonucleótido situado más abajo que es variable en la posición de interés. En cada uno de los casos, se utiliza la preferencia de una enzima por los sustratos con bases emparejadas correctamente para diferenciar la identidad de la base, que se revela mediante la unión covalente de un marcador al cebador. En la mayoría de las aplicaciones estos ensayos se configuran con el cebador inmovilizado sobre un sustrato sólido, que incluye microplacas, perlas magnéticas y recientemente, oligonucleótidos dispuestos en forma de micromatriz sobre portaobjetos de microscopio. Las estrategias de detección incluyen el marcaje directo con detección por fluorescencia o el marcaje indirecto mediante la utilización de biotina y de una estreptavidina marcada con detección mediante fluorescencia, quimioluminiscencia o absorción.
Las micromatrices de oligonucleótido o "biochips de ADN" han generado mucha atención debido a su potencial para el análisis masivo en paralelo. La perspectiva de secuenciar decenas de miles de bases de una muestra pequeña en tan solo unos pocos minutos es excitante. En este momento, esta tecnología tiene una disponibilidad limitada puesto que en la actualidad se encuentran disponibles ensayos para secuenciar solo unos pocos genes, con costes de hardware y de consumibles importantes. Además, la metodología general de llevar a cabo la secuenciación mediante hibridación no es especialmente robusta, con el requisito de tener una optimización de las condiciones de hibridación que depende de forma significativa de la secuencia. Sin embargo, el paralelismo con una tecnología de "matriz" es muy fuerte y la determinación múltiple de la secuencia es un elemento importante del nuevo procedimiento de citometría
de flujo.
El documento US-A-5.670.325 da a conocer procedimientos para la detección de la presencia de secuencias mutantes en una subpoblación de secuencias de genes en una muestra biológica. Estos procedimientos son especialmente útiles para la identificación de individuos con mutaciones genéticas indicativas de cáncer colorrectal temprano. Más específicamente, el procedimiento para la detección de la presencia de una subpoblación clonal de células transformadas en una muestra biológica obtenida de un organismo, comprende las etapas de: a) determinación a partir de la muestra biológica de un número X de un primer polinucleótido normal característico de una región genómica del citado organismo que no se encuentra mutado en la citada subpoblación de células transformadas; b) determinación a partir de la muestra biológica de un número Y de un segundo polinucleótido normal en una región genómica del citado organismo sospechosa de haber mutado en la citada subpoblación de células transformadas; y c) determinación de si existe una diferencia entre el número X y el número Y, siendo indicativa la presencia de una diferencia estadísticamente significativa de una subpoblación clonal de células transformadas en la citada muestra biológica.
Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para la determinación de la composición de la base en posiciones específicas de una cadena de ADN que utiliza la determinación de la composición de la base en posiciones específicas de una cadena de ADN mediante la utilización de microesferas y citometría de flujo, en el que la especificidad de las enzimas para la discriminación de la composición de la base se combina con el análisis en paralelo de un conjunto de microesferas fluorescentes.
En la descripción que sigue a continuación se expondrán una parte de los objetivos, ventajas y nuevas características adicionales de la invención y en otra parte resultarán evidentes para los expertos en la materia tras el examen de lo siguiente, o se podrán deducir mediante la práctica de la invención. Los objetivos y ventajas de la invención se pueden alcanzar y llevar a cabo por medio de los instrumentos y de las combinaciones especialmente indicados en las reivindicaciones adjuntas.
Características de la invención
Para conseguir los objetivos anteriores y otros, y de acuerdo con los propósitos de la presente invención tal como se refleja y se describe ampliamente en el presente documento, el procedimiento para la determinación de la composición de la base en posiciones específicas de la cadena de ADN del presente documento incluye las siguientes etapas: preparación de un cebador de oligonucleótido que lleva un marcador de inmovilización o de captura, dideoxinucleótidos marcados de forma fluorescente; extensión del cebador de oligonucleótido mediante la utilización de ADN polimerasa con el dideoxinucleótido fluorescente; unión de forma específica de los cebadores marcados a microesferas y medición de la fluorescencia de las microesferas mediante citometría de flujo.
Preferentemente, los cebadores de oligonucleótido se diseñan para alinearse a la muestra de ADN bajo investigación de forma inmediatamente adyacente a la posición de interés, de manera que se interrogue a la siguiente base de nucleótido de la muestra de ADN.
También se prefiere que los cebadores tengan en su extremo terminal 5' uno de los siguientes: (a) un grupo amino u otro grupo funcional adecuado para el acoplamiento covalente a una microesfera; (b) un grupo biotina adecuado para la unión a avidina o a estreptavidina inmovilizado en una microesfera; o (c) un marcador de oligonucleótido que sea complementario con una sonda de captura de oligonucleótido inmovilizada en la superficie de una microesfera.
Los beneficios y las ventajas de la presente invención incluyen un procedimiento sensible, homogéneo y flexible para la determinación de la composición de bases del ADN en posiciones específicas.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incorporan y que forman parte de la memoria descriptiva, describen una realización de la presente invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. En los
dibujos:
La figura 1a es una representación esquemática de minisecuenciación basada en microesferas para citometría de flujo, en la que se utiliza un cebador inmovilizado en una microesfera para la hibridación con la secuencia de ADN bajo investigación en presencia de dideoxinucleótidos, de los que como mínimo uno se encuentra marcado de forma fluorescente, y de polimerasa, de manera que el cebador se extiende por una base, mientras que la figura 1b es una representación esquemática del cebador resultante que tiene un solo dideoxinucleótido fluorescente unido al extremo del mismo, que se puede detectar mediante la utilización de citometría de flujo, y que representa la base complementaria al SNP en el ADN.
La figura 2a es una representación esquemática de minisecuenciación basada en microesferas para citometría de flujo similar a la descrita en las figuras 1a y 1b del presente documento, excepto que se utilizan cebadores biotinilados solubles y microesferas de captura recubiertas de avidina en lugar de los cebadores que ya se han inmovilizado en las microesferas, la figura 2b muestra la hibridación del cebador biotinilado en la cadena de ADN que se va a investigar y la extensión de este cebador mediante un dideoxinucleótido A fluorescente (asumiendo que el SNP es una base T) como resultado de la ADN polimerasa presente en la disolución, y la figura 2c muestra la captura del cebador biotinilado extendido sobre una microesfera recubierta de avidina después de que se funde la cadena de ADN hibridada, con el posterior análisis de fluorescencia mediante la utilización de la citometría de flujo.
La figura 3a es una representación esquemática de un procedimiento de minisecuenciación múltiple basado en microesferas que utiliza cebadores de secuencia marcada solubles y microesferas de captura que llevan sonda de una forma similar a la minisecuenciación mostrada en las figuras 2a y 2b del presente documento, excepto porque se ha asumido que en la cadena de ADN se encuentran presentes cuatro SNP, mientras que la figura 3b muestra las microesferas y los cebadores extendidos capturados que se van a analizar mediante la utilización de citometría de flujo.
La figura 4a es una representación esquemática de un ensayo de ligación de oligonucleótido basado en microesferas que utiliza citometría de flujo, en la que se muestra un cebador inmovilizado en una microesfera junto con cebadores complementarios fluorescentes para la ligación al cebador que se ha hibridado a la cadena de ADN que se va a investigar en la región del SNP, mientras que la figura 4b es una representación esquemática del cebador unido a la microesfera, al que se ha ligado el complemento fluorescente adecuado después de que se ha fundido el ADN, siendo indicativa la fluorescencia de la microesfera determinada mediante citometría de flujo de que el complemento fluorescente se ha unido a la cadena de ADN.
Las figuras 5a y 5b son representaciones esquemáticas de ligación de oligonucleótido en ADN sin amplificar, seguido de amplificación mediante la técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa), captura en microesferas y análisis de la fluorescencia de las microesferas mediante citometría de flujo, para el caso en el que la base complementaria se encuentra en la cadena de ADN y para el caso en el que no existe la base complementaria en la cadena de ADN, respectivamente.
Descripción detallada
En resumen, la presente invención comprende la utilización de cebadores de oligonucleótido, dideoxinucleótidos fluorescentes, ADN polimerasa, microesferas y citometría de flujo para determinar la composición de la base del ADN en posiciones específicas en una cadena de ADN. Se incuban cebadores de oligonucleótido marcados con una muestra de ADN y se permite que se alineen de forma inmediatamente adyacente a la posición de interés. Se añaden dideoxinucleótidos fluorescentes y ADN polimerasa y se permite que se extienda el cebador por una unidad de base, de forma que tras la incorporación enzimática del dideoxinucleótido fluorescente individual dentro de la cadena de ADN, la cadena de ADN se puede .detectar mediante un citómetro de flujo. La ADN polimerasa puede ser sequenasa, termosequenasa o cualquier otra ADN polimerasa convencional o termoestable.
Otra realización de la invención utiliza cebadores de oligonucleótido, indicadores de oligonucleótido y ADN ligasa junto con microesferas y citometría de flujo para llevar a cabo esta determinación. Se añaden un oligonucleótido indicador fluorescente y ADN ligasa y se permite el ligado del cebador al indicador. Los oligonucleótidos indicadores fluorescentes se diseñan para unir el ADN de la muestra en la posición inmediatamente 3' respecto del cebador de oligonucleótido alineado. Es decir, la secuencia del oligonucleótido indicador es complementaria a la de la cadena de ADN de la muestra, excepto en su extremo 5', en el que el indicador es variable para interrogar la posición de interés en el ADN de la muestra, que a continuación se puede investigar por su identificación fluorescente mediante la utilización de citometría de flujo. La ADN ligasa puede ser cualquier ligasa convencional o termoestable. La extensión o la ligación del cebador se pueden mejorar a través de la utilización de ciclos térmicos utilizando ADN polimerasa o ligasa estables frente al calor.
Los cebadores de oligonucleótido se unen a las microesferas antes, o después de la extensión o de la ligación enzimática. Los cebadores marcados con grupos amino se pueden unir de forma covalente a microesferas carboxiladas mediante la utilización de EDAC (etil dimetilaminopropil carbodiimida). Los cebadores biotinilados se pueden unir a microesferas recubiertas de avidina o de estreptavidina. Los cebadores que llevan un marcador de secuencia de oligonucleótido se pueden alinear con secuencias de captura de oligonucleótido complementarias inmovilizadas en microesferas de forma covalente, o mediante la interacción entre la biotina y la avidina. Las microesferas pueden estar compuestas de poliestireno, celulosa u otro material adecuado. Para llevar a cabo el análisis múltiple de secuencia se pueden utilizar microesferas que tengan tamaños diferentes, o que se encuentren teñidas con distintas cantidades de colorantes fluorescentes.
Habiendo descrito en general la invención, los siguientes ejemplos están destinados a proporcionar más detalles específicos de la misma.
Ejemplo 1 Minisecuenciación mediante citometría de flujo utilizando cebadores inmovilizados
A continuación se hará referencia con detalle a las realizaciones preferentes de la presente invención tal como se muestra en los dibujos adjuntos. Haciendo referencia a las figuras, la figura 1a es una representación esquemática de minisecuenciación basada en microesferas para citometría de flujo, en la que se utiliza un cebador inmovilizado en una microesfera para la hibridación con la secuencia de ADN bajo investigación en presencia de dideoxinucleótidos, de los que como mínimo uno se encuentra marcado de forma fluorescente, y de polimerasa. El cebador se extiende por una base mediante la acción de la polimerasa. La figura 1b es una representación esquemática del cebador resultante que tiene un solo dideoxinucleótido fluorescente unido al extremo del mismo, que se puede detectar mediante la utilización de citometría de flujo, y que representa la base complementaria al SNP en el ADN. La cadena de ADN molde de la muestra se amplifica en primer lugar mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y el producto resultante se trata con fosfatasa alcalina de gamba (SAP), y con exonucleasa I (Exo I) para eliminar los deoxinucleótidos trifosfato y los cebadores PCR no consumidos, respectivamente. El cebador de minisecuenciación, diseñado para interrogar una posición específica en la cadena de ADN bajo investigación, se inmoviliza por medio de un grupo amino 5' sobre una microesfera de poliestireno carboxilada utilizando un reactivo de entrecruzamiento (por ejemplo, carbodiimida). Se añaden las microesferas que llevan el cebador (5 \mul) al ADN amplificado (1 \mul, 1 nM), ADN polimerasa (una unidad, termosequenasa, Amersham Life Sciences, Cleveland, OH), un ddNTP marcado con fluoresceína (5 \muM), 5 \muM de cada uno de los otros tres ddNTPs no fluorescentes y tampón (tampón de termosequenasa, Amersham) en un volumen total de 10 \mul. Este procedimiento se repitió tres veces utilizando cada uno de los cuatro ddNTPs fluorescentes. Las mezclas de reacción se sometieron a 99 ciclos a 94ºC durante 10 s y a 60ºC durante 10 s en un termociclador. Se diluyeron dos microlitros de cada mezcla de reacción en 500 \mul de tampón TEB (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albúmina de suero bovino al 0,5 (p/v), BSA) y se midió la fluorescencia asociada a las microesferas mediante la utilización de citometría de flujo. Mediante la utilización de este procedimiento, se determinó la identidad correcta de la base de nucleótido para una posición específica en una cadena molde de oligonucleótido con una relación señal-ruido mayor de cien.
Ejemplo 2 Minisecuenciación mediante citometría de flujo utilizando cebadores biotinilados
La figura 2a es una representación esquemática de minisecuenciación basada en microesferas para citometría de flujo similar a la descrita en las figuras 1a y 1b del presente documento, excepto porque se utilizan cebadores biotinilados solubles y microesferas de captura recubiertas de avidina en lugar de los cebadores que ya se han inmovilizado en las microesferas. La figura 2b muestra la hibridación del cebador biotinilado en la cadena de ADN que se va a investigar y la extensión de este cebador mediante un dideoxinucleótido A fluorescente (asumiendo que el SNP es una base T) como resultado de la ADN polimerasa presente en la disolución. La figura 2c muestra la captura del cebador biotinilado extendido sobre una microesfera recubierta de avidina después de que se funde la cadena de ADN hibridada, con el posterior análisis de fluorescencia mediante la utilización de la citometría de flujo. La cadena de ADN molde de la muestra se amplifica mediante PCR y el producto resultante se trata con fosfatasa alcalina de gamba (SAP) y con exonucleasa I (Exo I) para eliminar los deoxinucleótidos trifosfato y los cebadores PCR no consumidos, respectivamente. Se prepara el cebador de minisecuenciación, diseñado para interrogar una posición específica en la cadena de ADN molde, y que lleva un grupo biotina en posición 5'. Se añade el cebador biotinilado a la cadena de ADN molde (1 \mul, 1 nM), ADN polimerasa (una unidad, termosequenasa, Amersham), un ddNTP marcado con fluoresceína (5 \muM), 5 \muM de cada uno de los otros tres ddNTPs no fluorescentes y tampón (tampón de termosequenasa Amersham) en un volumen total de 10 \mul. Este procedimiento se repite tres veces utilizando un ddNTP fluorescente diferente. Las mezclas de reacción se sometieron a 99 ciclos a 94ºC durante 10 s y a 60ºC durante 10 s en un termociclador. Para capturar los cebadores biotinilados se añadieron a la mezcla de reacción cinco \mul de microesferas recubiertas de avidina. Se diluyen dos microlitros de cada mezcla de reacción en 500 \mul de tampón TEB (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albúmina de suero bovino al 0,5 (p/v), BSA) y se mide la fluorescencia asociada a las microesferas mediante la utilización de citometría de flujo. Mediante la utilización de este procedimiento, se determinó la identidad de la base de nucleótido correcta en treinta de treinta muestras amplificadas mediante PCR, tal como se confirmó mediante técnicas convencionales de secuenciación del ADN.
Ejemplo 3 Minisecuenciación mediante citometría de flujo utilizando cebadores marcados
La figura 3a es una representación esquemática de un procedimiento de minisecuenciación múltiple basado en microesferas que utiliza cebadores de secuencia marcada solubles y microesferas de captura que llevan sonda de una forma similar a la minisecuenciación mostrada en las figuras 2a y 2b del presente documento, excepto porque se ha asumido que en la cadena de ADN se encuentran presentes cuatro SNP. La figura 3b muestra las microesferas y los cebadores extendidos capturados para su análisis mediante la utilización de citometria de flujo. La cadena de ADN molde de la muestra se amplifica mediante PCR y el producto resultante se trata con fosfatasa alcalina de gamba (SAP) y con exonucleasa I (Exo I) para eliminar los deoxinucleótidos trifosfato y los cebadores PCR no consumidos, respectivamente. Se prepara el cebador de minisecuenciación, diseñado para interrogar una posición específica en la cadena de ADN molde, y que lleva un marcador de la secuencia 5'. Se diseña una sonda de captura para unirse al marcador de la secuencia 5' del cebador y se inmoviliza en microesferas. Se añade el cebador que lleva el marcador de captura a la cadena de ADN molde (1 \mul, 1 nM), ADN polimerasa (una unidad, termosequenasa, Amersham), un ddNTP marcado con fluoresceína (5 \muM), 5 \muM de cada uno de los otros tres ddNTPs no fluorescentes y tampón (tampón de termosequenasa Amersham) en un volumen total de 10 \mul. Este procedimiento se repite tres veces utilizando un ddNTP fluorescente diferente. Las mezclas de reacción se sometieron a 99 ciclos a 94ºC durante 10 s y a 60ºC durante 10 s en un termociclador. Para capturar los cebadores biotinilados se añaden a la mezcla de reacción cinco microlitros de microesferas recubiertas de avidina. Se diluyen dos microlitros de cada mezcla de reacción en 500 \mul de tampón TEB (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, albúmina de suero bovino al 0,5% (p/v), BSA) y se mide la fluorescencia asociada a las microesferas mediante la utilización de citometría de flujo.
Ejemplo 4 Ligación de oligonucleótido mediante citometría de flujo utilizando cebadores inmovilizados
La figura 4a es una representación esquemática de un ensayo de ligación de oligonucleótido basado en microesferas que utiliza citometría de flujo, en la que se muestra un cebador inmovilizado en una microesfera junto con cebadores complementarios fluorescentes para la ligación al cebador que se ha hibridado a la cadena de ADN que se va a investigar en la región del SNP. La figura 4b es una representación esquemática del cebador unido a la microesfera, al que se ha ligado el complemento fluorescente adecuado después de que se ha fundido el ADN, siendo indicativa la fluorescencia de la microesfera determinada mediante citometria de flujo de que el complemento fluorescente se ha unido a la cadena de ADN. La cadena de ADN molde de la muestra se amplifica mediante PCR y el producto resultante se trata con fosfatasa alcalina de gamba (SAP) y con exonucleasa I (Exo I) para eliminar los deoxinucleótidos trifosfato y los cebadores PCR no consumidos, respectivamente. El cebador de ligación a oligonucleótido, diseñado para interrogar una posición específica en la cadena de ADN molde, se inmoviliza a través de un grupo amino en posición 5' sobre una microesfera de polioxiestireno carboxilada mediante la utilización de carbodiimida. Se preparan cuatro oligonucleótidos indicadores fluorescentes, diseñados para unirse de forma inmediatamente adyacente a la posición de interés, aunque variando en el extremo terminal 5'. Las microesferas que llevan cebador se añaden (5 \mul) a la cadena de ADN molde (1 \mul, 1 nM), ADN ligasa (una unidad, termoligasa, Epicentre Technologies, Madison, WI), un oligonucleótido indicador marcado con fluoresceína (5 \muM) y tampón (tampón de termoligasa, Epicentre) en un volumen total de 10 \mul. Este procedimiento se repite tres veces utilizando cada uno de los cuatro oligonucleótidos indicadores fluorescentes (5 \muM). Las mezclas de reacción se sometieron a 99 ciclos a 94ºC durante 10 s y a 60ºC durante 10 s en un termociclador. Se diluyen dos microlitros de cada mezcla de reacción en 500 \mul de tampón TEB (Tris-HCl 50 mM, pH 8, 0, EDTA 0,5 mM, albúmina de suero bovino al 0,5% (p/v), BSA) y se mide la fluorescencia asociada a las microesferas mediante la utilización de citometría de flujo. Mediante la utilización de este procedimiento, se determinó la identidad de la base de nucleótido correcta en treinta de treinta muestras amplificadas mediante PCR, tal como se confirmó mediante técnicas convencionales de secuenciación del ADN.
Ejemplo 5 Ligación múltiple de oligonucleótido en ADN sin amplificar, seguida de amplificación mediante PCR
Las figuras 5a y 5b son representaciones esquemáticas de ligación de oligonucleótido en ADN sin amplificar, seguida de amplificación mediante la técnica PCR, captura en microesferas y análisis de la fluorescencia de las microesferas mediante citometría de flujo, para el caso en el que la base complementaria se encuentra en la cadena de ADN y para el caso en el que no existe la base complementaria en la cadena de ADN, respectivamente.
Se diseña un conjunto de cebadores de oligonucleótido que incluyen un oligonucleótido (oligonucleótido -1-) que es complementario con la secuencia de la cadena de ADN molde situada de forma inmediatamente adyacente a una posición de interés, y cuatro oligonucleótidos (oligonucleótidos -1A-, -1C-, -1G- y -1T-) que son complementarios con la secuencia de la cadena de ADN molde situada de forma inmediatamente adyacente al oligonucleótido -1-, y que contiene la posición de interés. Cada uno de los cuatro oligonucleótidos (-1A-, -1C-, -1G- y -1T-) difiere en la base de nucleótido situada junto al otro oligonucleótido (oligonucleótido -1-), que se corresponde con cada una de las cuatro bases posibles -A-, -C-, -G- y -T-. El oligonucleótido -1- está destinado a su ligación con uno de los otros oligonucleótidos (-1A-, -1C-, -1G- o -1T-), dependiendo del que contenga la base complementaria para la posición de interés. Además, cada uno de los dos oligonucleótidos de una pareja potencial (total de cinco oligonucleótidos) contiene nucleótidos adicionales que forman una "cola" constituida por una posición de cebado para la PCR. Esta posición es diferente para el oligonucleótido -1- respecto de los oligonucleótidos -1A-, -1C-, -1G- y -1T-, que tienen la misma posición de unión del cebador dentro de este grupo, pero que es diferente de la del oligonucleótido -1-. Se llevan a cabo cuatro reacciones de ligación en paralelo, cada una con el oligonucleótido -1-, una con cada uno de los demás oligonucleótidos (-1A-, -1C-, -1G- o -1T-) y con una enzima ADN ligasa. Se espera que todos los oligonucleótidos se hibriden con la cadena molde, aunque solo se ligará al oligonucleótido -1- el oligonucleótido con una correspondencia perfecta. El producto de ligación resultante servirá como la cadena molde para una reacción mediante PCR posterior mediante la utilización de un cebador (cebador -1-) complementario a la cola introducida dentro del oligonucleótido -1-, y utilizando el otro cebador (cebador -2-) que tiene la misma secuencia que la de la cola de oligonucleótidos -1A-, -1C-, -1G- y -1T-. Los oligonucleótidos que no se han ligado no se pueden amplificar con la técnica PCR (figura 5b) debido a que no existe posición de cebado para el oligonucleótido -2- a menos que la amplificación mediante PCR del cebador -1- se extienda a través de un fragmento ligado, lo que crea una secuencia complementaria para el cebador - 2-. Además de los dNTPs sin marcar utilizados durante la etapa de PCR, se añaden dNTPs marcados de forma fluorescente para marcar los fragmentos procedentes de la PCR durante la amplificación. De forma alternativa, el cebador -2- se marca con un colorante fluorescente, lo que genera productos de amplificación mediante PCR marcados con colorante en el caso de que tenga lugar la amplificación.
La etapa final implica la adición a la mezcla procedente de la PCR de microesferas con un oligonucleótido inmovilizado en su superficie que tiene la misma secuencia que los oligonucleótidos -1A-, -1C-, -1G- y -1T-, excepto por el nucleótido variable situado en un extremo y por la posición de cebado situada en el otro. Se pretende que esta microesfera capture a los productos marcados obtenidos mediante la PCR si se encuentran presentes en la mezcla PCR por medio del alineamiento con el complemento recién sintetizado del complejo de oligonucleótido ligado. A continuación se analiza mediante citometría de flujo la fluorescencia de las perlas debida a los fragmentos hibridados. Muchos conjuntos de cebadores pueden clasificar en categorías de forma simultánea muchos SNP en disolución, siendo capturado cada uno sobre una perla diferente en un conjunto múltiple que se va a leer de forma simultánea en un citómetro de flujo.
La descripción anterior de la invención se ha presentado para propósitos ilustrativos y de descripción y no se pretende que sea exhaustiva ni que limite la invención a la forma precisa que se ha descrito y, obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las explicaciones anteriores. Por ejemplo, para unir los cebadores de oligonucleótido a las microesferas para realizar análisis que utiliza la citometría de flujo, los cebadores de oligonucleótido pueden incluir un marcador de secuencia que se hibrida a una sonda de captura que es complementaria con el marcador de secuencia y que se inmoviliza en las microesferas, marcadores de secuencia y sondas de captura que contienen, como mínimo, una de las bases no naturales iso-C y 5-metil-iso-G. Las realizaciones se escogieron y se describieron para ofrecer la mejor explicación de los principios de la invención y de su aplicación práctica para, de ese modo, permitir que otros expertos en la materia utilicen de la mejor forma la invención en distintas realizaciones y con diferentes modificaciones que resulten idóneas para la utilización contemplada en particular. Se pretende que el alcance de la invención se encuentre definido por las reivindicaciones adjuntas del presente documento.

Claims (11)

1. Procedimiento homogéneo para la determinación de la identidad de una base en una cadena de ADN, que comprende en orden las etapas de:
(a) alineamiento de un oligonucleótido a la cadena de ADN de forma inmediatamente adyacente a la base cuya identidad se va a determinar;
(b) incubación de la cadena de ADN alineada y del oligonucleótido con cuatro dideoxinucleótidos distintos, teniendo uno de los dideoxinucleótidos una molécula indicadora fluorescente en presencia de ADN polimerasa, lo que extiende de ese modo el oligonucleótido por una unidad de base;
(c) inmovilización del oligonucleótido extendido en una microesfera y
(d) análisis de la microesfera mediante la utilización de citometría de flujo, mediante la cual se determina la base bajo investigación.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido es biotinilado y la microesfera es recubierta con avidina o con estreptavidina.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido se une de forma covalente a la microesfera.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido se hibrida a una sonda de captura complementaria inmovilizada en una microesfera.
5. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que el oligonucleótido comprende un marcador de secuencia que se hibrida a la sonda de captura y en el que el marcador de secuencia y la sonda de captura comprenden, como mínimo, una base no natural seleccionada entre el grupo compuesto por iso-C y 5-metil-iso-G.
6. Procedimiento homogéneo para la determinación de la identidad de una base en una posición de una cadena de ADN, que comprende en orden las etapas de:
(a) alineamiento de un primer oligonucleótido y de un segundo oligonucleótido a la cadena de ADN adyacente al primer oligonucleótido y en presencia de ADN ligasa, en el que el segundo oligonucleótido contiene una molécula indicadora fluorescente y una base interrogadora, que es variable de forma que interroga la posición de interés en el ADN de la muestra, en el que solo se ligará al primer nucleótido el segundo oligonucleótido que tenga una correspondencia perfecta en la base interrogadora.
(b) disociación de la cadena de ADN e inmovilización de los oligonucleótidos ligados en una microesfera; y
(c) análisis de la microesfera mediante la utilización de citometría de flujo, mediante la cual se determina la base bajo investigación.
7. Procedimiento homogéneo para la determinación de la identidad de una base en una posición de una cadena de ADN, que comprende en orden las etapas de:
(a) alineamiento de un primer oligonucleótido y de un segundo oligonucleótido a la cadena de ADN adyacente al primer oligonucleótido y en presencia de ADN ligasa, en el que el segundo oligonucleótido contiene una molécula indicadora fluorescente y una base interrogadora, que es variable de forma que interroga la posición de interés en el ADN de la muestra, en el que solo se ligará al primer nucleótido el segundo oligonucleátido que tenga una correspondencia perfecta en la base interrogadora.
(b) amplificación de los oligonucleótidos ligados;
(c) captura de oligonucleótidos ligados amplificados en una microesfera;
(d) análisis de la microesfera mediante la utilización de citometria de flujo, mediante la cual se determina la base bajo investigación.
8. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que el primer oligonucleótido es biotinilado y la microesfera es recubierta con avidina o con estreptavidina.
9. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que el primer oligonucleótido se une de forma covalente a las microesferas.
10. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que el primer oligonucleótido se hibrida a una sonda de captura complementaria inmovilizada en una microesfera.
11. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que se hibrida un marcador de secuencia a la sonda de captura que es complementaria a ella, y en el que el marcador de secuencia y la sonda de captura comprenden una base no natural seleccionada entre el grupo compuesto por iso-C y 5-metil-iso-G.
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