CN110488025A - 一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途，检测试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；免疫复合体包括：钙卫蛋白校准品，钙卫蛋白质控品，由标记后的第一特定抗体、标记后的第二特定抗体和待测样本复合后形成的被标记的钙卫蛋白复合物抗体；第一特定抗体，第二特定抗体与钙卫蛋白的结合方式为：一种抗体与钙卫蛋白S100A8肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合；本发明能够准确、定量检测人粪便样本中钙卫蛋白含量，具有灵敏度高、稳定性好的优点，对肠道健康检测具有较高的临床辅助价值。

Description

一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠 道健康检测的用途

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)为累及回肠、直肠、结肠的一种慢性、特发性肠道炎症性疾病。临床表现腹泻、腹痛，甚至可有血便。本病包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。溃疡性结肠炎是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症，疾病通常先累及直肠，逐渐向全结肠蔓延。克罗恩病可累及全消化道，为非连续性全层炎症，最常累及部位为末端回肠、结肠和肛周。IBD病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫***异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用，认为是由多因素相互作用所致，主要包括环境、遗传、感染和免疫因素。

IBD具有慢性和反复发作的临床特点，因此在治疗过程中，需要反复对疾病进行疗效的评估，以判断治疗效果或及时调整治疗方案；对于缓解期的患者，也需要长期密切随访复查，以监测其是否复发。目前判断IBD活动度最准确的方法是进行结肠镜联合活组织检查。但结肠镜及组织活检存在以下问题：属于侵入性检查，患者存在痛苦的体验；检查时间相对较长，整个过程需要病人的积极配合；临床工作中，部分患者难以接受，依从性差；对于儿童而言，更加不能耐受肠镜带来的痛苦，很难配合其检查；值得警惕的是，对重症或爆发型患者，行结肠镜检查有诱发中毒性巨结肠的风险，针对这类病人，反复多次行结肠镜检查属于禁忌；此外，当合并狭窄、镜身不能通过时，结肠镜无法评价狭窄以上肠腔的炎症情况。综上所述，结肠镜及组织活检不能完全满足临床的需要。因此，需要一种能有效反应肠道粘膜炎症的、简便、无创的检查指标。

炎症性肠病常用实验室检查方法主要有血沉、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和白细胞总数(white blood cells,WBC)、血小板(platelet，PLT)、血红蛋白、白蛋白、血沉等，但这些指标的敏感性和特异性尚不理想，且易受到全身其他炎症的影响，临床应用价值有限。粪便铟标记的白细胞***率是反映IBD疾病活动度的金标准，但它取样费时、操作复杂，且需要注入核素，对患者健康造成一定的影响，限制了其应用。

市场需要一种能够无创、简便、特异性强、敏感性高、避免全身炎症影响的肠道健康检测方法。

用粪便钙卫蛋白辅助检测炎症性肠病，已经被写入国内外指南的推荐。例如我国炎症性肠病诊断与治疗的共识意见指出“有条件的单位可做粪便钙卫蛋白等检查作为辅助检查指标”，2010年世界胃肠病学组织关于炎症性肠病诊断和治疗的实践指南也将粪便钙卫蛋白作为推荐的辅助检查之一。粪便钙卫蛋白在炎症性肠病诊断中发现最早、研究最广泛，最具有代表性。

钙卫蛋白属于S100蛋白大家族，由中性粒细胞、巨噬细胞等骨髓源性细胞分泌，是中性粒细胞和活化的巨噬细胞质中重要的蛋白质，约占中性粒细胞胞质蛋白质的60％左右。在炎症、肿瘤、感染、免疫调节、细胞凋亡、衰老等重要的病理和生理过程中均发挥重要作用。钙卫蛋白在人体内的细胞、组织以及体液中分布广泛，能够在血浆、粪便、尿液、唾液、滑膜液、脑脊液以及结肠粘膜组织活检中被检测到。钙卫蛋白作为一种肠炎症标志物，可以清楚的区分器质性炎症性疾病IBD和功能性疾病IBS，可以作为一种评价炎症性肠病的活动性指标，评估炎症性肠病黏膜，评价药物治疗作用，治愈和预测疾病复发情况。

正是因为钙卫蛋白在体内分布广泛、许多重要的生理功能，它在历史上曾经有多种命名：例如在1980年由Fagerhol等人率先从中性粒细胞的胞质中分离出来的L1蛋白质；1987年由Odink等人在类风湿性关节炎浸润的巨噬细胞中发现的MRP-14蛋白；1988年由Wilkinsoin等人发现的钙粒蛋白；以及转移抑制因子相关蛋白、囊性纤维化有关的抗原、p14物质等，最终经Anderson等人证实上述蛋白均为同一蛋白质，后经进一步证实这种蛋白质具有典型S-100蛋白大家族的结构特征，因此将这种与钙结合、多功能、具有保护性的蛋白命名为钙卫蛋白。

粪便钙卫蛋白性质稳定，利于存储。钙卫蛋白的理化性质极其稳定，一方面与钙结合后耐酶，另一方面本身具有抗微生物的生物活性，这些特性使得钙卫蛋白在肠腔和外界环境中可以长期保持性质稳定、并利于存储。在室温下，钙卫蛋白在大便中保持稳定性质可长达7天。

钙卫蛋白在大便中的分布均匀，因此单次粪便钙卫蛋白检测的可重复性好。研究证实IBD患者的粪便铟标志白细胞***率和一次取样的钙卫蛋白水平具有很好的相关性，为临床上随机单次测定钙卫蛋白的可靠性提供了依据。

目前，检测钙卫蛋白含量的方法主要有免疫层析法和酶联免疫法。其中，采用胶体金层析法的上市代表产品为厦门为正生物科技有限公司的钙卫蛋白检测试剂盒，由于胶体金与被标记的蛋白质是依靠静电作用结合，结合不稳定，交易受酸碱因素等外界干扰，因此其检测灵敏度较低，常用于定性或半定量检测，无法精准定量检测；采用免疫荧光层析法的上市代表产品为广州沣润生物科技有限公司的钙卫蛋白测定试剂盒，因荧光发光需要外加光源，在垂直光源的方向上检测，生物样品中的蛋白质、氨基酸等分子也会产生背景荧光，易导致测定中的本底较高、产生干扰因素等问题。此外荧光免疫技术用于定量测定时，需要选择合适的荧光试剂以及样品的处理方法以减少非特异性吸附蛋白的影响，技术复杂，且成本较高；采用酶联免疫法的上市产品为德国Buhlmann Laboratories AG的钙卫蛋白检测试剂盒，能定量测定粪便中钙卫蛋白的含量，但是采用酶联免疫法测试需要进行洗板、孵育、加显色底物等繁琐步骤，且试验过程受环境温度等影响较大，需要专业人员操作，测试时间较长。市场需要一种能够代替一般免疫学方法，能够准确、定量检测人粪便样本中钙卫蛋白含量的检测试剂，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途，能够准确、定量检测人粪便样本中钙卫蛋白含量，具有灵敏度高、稳定性好的优点，对肠道健康检测具有较高的临床辅助价值。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，包括：免疫复合体，磁珠化学发光检测体系，固定分离相为磁微粒；

免疫复合体包括：钙卫蛋白校准品，钙卫蛋白质控品，由标记后的第一特定抗体、标记后的第二特定抗体和待测样本复合后形成的“标记后的第一特定抗体—钙卫蛋白—标记后的第二特定抗体”的被标记的钙卫蛋白复合物抗体；

前述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，第一特定抗体，第二特定抗体与钙卫蛋白的结合方式为：一种抗体与钙卫蛋白S100A8肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

前述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，第一特定抗体，第二特定抗体与钙卫蛋白的结合方式为：一种抗体与钙卫蛋白S100A8肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A8肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

前述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，第一特定抗体，第二特定抗体与钙卫蛋白的结合方式为：一种抗体与钙卫蛋白S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

前述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，定分离相为链霉亲和素包被的磁微粒。

前述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，固定分离相为钙卫蛋白单克隆或多克隆抗体包被的磁微粒。

前述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，标记为发光标记物标记，发光标记物包括：吖啶酯，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠。

前述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，第一特定抗体、第二特定抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，所述单克隆抗体来源于小鼠、大鼠、兔的杂交瘤细胞，所述多克隆抗体来源于兔、羊、鸡。

一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白的检测方法，收集并萃取待测粪便样本，加入全自动化学发光仪的反应杯中，在每个反应杯中加入第一被标记的钙卫蛋白抗体、被包被的磁微粒溶液、第二被标记的钙卫蛋白抗体，在加入第二被标记的钙卫蛋白抗体前孵育、清洗，并在加入第二被标记的钙卫蛋白抗体后二次孵育、清洗，或在加入第二被标记的钙卫蛋白抗体后一次孵育、清洗，最后加入底物液或激发液对反应体系进行激发发光，依据已定标的校准曲线信息进行数据结果处理；

第一被标记的钙卫蛋白抗体、第二被标记的钙卫蛋白抗体为：一种抗体与钙卫蛋白S100A8或S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A8或S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白在肠道健康检测的用途，用于检测肠道健康状况。

本发明的有益之处在于：

本发明采用两个特定的抗体结合钙卫蛋白不同抗原决定簇的“双抗体夹心”技术，得到“标记后的第一特定抗体—钙卫蛋白—标记后的第二特定抗体”的免疫复合体，能够特异性检测人粪便样本中的钙卫蛋白，灵敏度高，稳定性好；

本发明采用全自动磁珠化学发光平台开发出的检测方法，检测步骤简单，时间短；

用本发明检测得到的结果与临床检测结果具有良好的一致性，能很好反映肠道炎症性疾病症状，评价炎症性肠病的活动性指标，评估炎症性肠病黏膜，评价药物治疗作用，治愈和预测疾病复发情况，对肠道健康检测具有较高的临床辅助价值。

附图说明

图1是本发明钙卫蛋白(S100A8/S100A9)的异四聚体结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

△一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，包括：免疫复合体，抗体检测体系；

免疫复合体包括：钙卫蛋白校准品，钙卫蛋白质控品，由标记后的第一特定抗体、标记后的第二特定抗体和待测样本复合后形成的“标记后的第一特定抗体—钙卫蛋白—标记后的第二特定抗体”的被标记的钙卫蛋白复合物抗体；

第一特定抗体，第二特定抗体与钙卫蛋白的结合方式为：一种抗体与钙卫蛋白S100A8肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

钙卫蛋白是一个分子量为36kD的钙、锌离子结合蛋白。由分子量为14kD的S100A9肽链和分子量为8kD的S100A8肽链以非共价键连接形成二聚体或四聚体形式。每条肽链可结合多个Ca2+和Zn2+，从而具有耐热性和增强水解性的特性。

如图1所示的钙卫蛋白(S100A8/S100A9)异四聚体的结构示意图所示，标记1和标记2为S100A8二聚体，标记3和标记4为S100A9二聚体，两者特异性杂合形成钙卫蛋白异四聚体，图中标记C为钙结合位点。

S100A8肽链氨基酸序列：

1 mltelekaln siidvyhkys likgnfhavy rddlkkllet ecpqyirkkg advwfkeldi

61 ntdgavnfqe flilvikmgv aahkkshees hke；

S100A9肽链氨基酸序列：

1 mtckmsqler nietiintfh qysvklghpd tlnqgefkel vrkdlqnflk kenknekvie

61 himedldtna dkqlsfeefi mlmarltwas hekmhegdeg pghhhkpglg egtp；

其中S100A9与钙结合，S100A9亚基的功能结构域为EF手型结构域，即由螺旋体E、螺旋体F和两者之间的铰链区构成的手指样的结构，能够与钙结合，并被活化。活化的S100A9进而能够与细胞膜上的晚期糖基化终产物受体、Toll样受体等结合，激活细胞内的NF-κB，刺激细胞核内的S100A9启动子，转录S100A9 mRNA，表达成更多的S100A9蛋白，在细胞内与钙结合后，一方面与花生四烯酸结合，与细胞膜上的NADPH氧化酶复合体反应，刺激活性氧簇通路，介导炎症通路的信号转导，形成炎症的瀑布效应；除此之外，细胞内激活的钙卫蛋白还可与细胞骨架元素如角蛋白中间丝结合，介导炎症细胞的迁徙。值得一提的是，钙卫蛋白还能通过自身的修饰，如亚硝基化、S-谷胱甘肽化、甲硫氨酸氧化作用，实现对炎症量级和炎症范围的调控。

钙卫蛋白是一种过渡金属络合蛋白，其功能的发挥依赖与钙、锌、锰等金属离子的结合。除了上述与钙结合以外，钙卫蛋白的两条亚基能共同形成两个锰结合位点。而在S100A9的肽链末端，存在锌结合位点，与锌结合后，具有抗微生物的活性。

抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系，固定相为磁微粒。有以下两种固相分离实施方案：

实施例方案一，“链霉亲和素-生物素”体系；

一种钙卫蛋白检测试剂，包括：

生物素标记的钙卫蛋白单克隆或多克隆抗体；

标记物标记的钙卫蛋白单克隆或多克隆抗体，作为一种实施例，发光信号标记物可以是吖啶脂，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠；

钙卫蛋白定标品，成分包括：人粪便钙卫蛋白抗原；

钙卫蛋白质控品，成分包括：人粪便钙卫蛋白抗原；

待测样本；

链霉亲和素包被的磁微粒；

钙卫蛋白定标卡：卡内烧录钙卫蛋白定标品相关信息；

钙卫蛋白试剂卡：卡内烧录钙卫蛋白校准曲线相关信息；

清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；

样本萃取液，样本萃取液的成分包括：氯化钙、吐温20、叠氮钠；

全自动免疫检验***用底物液A液，成分包括：过氧化氢；

全自动免疫检验***用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。

实施例方案二，抗体直接包被的磁微粒体系；

一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，包括：

钙卫蛋白单克隆或多克隆抗体包被的磁微粒，

标记物标记的钙卫蛋白单克隆或多克隆抗体抗体，作为一种实施例，标记物可以是吖啶脂，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠；

钙卫蛋白定标品，成分包括：人粪便钙卫蛋白抗原；

钙卫蛋白质控品，成分包括：人粪便钙卫蛋白抗原；

待测样本；

钙卫蛋白定标卡：卡内烧录钙卫蛋白定标品相关信息；

钙卫蛋白试剂卡：卡内烧录钙卫蛋白校准曲线相关信息；

清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；

样本萃取液，样本萃取液的成分包括：氯化钙、吐温20、叠氮钠；

全自动免疫检验***用底物液A液，成分包括：过氧化氢；

全自动免疫检验***用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。

△一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白的检测方法包括以下步骤：

(1)用样本萃取液将新鲜人粪便样本收集并萃取，得到澄清待测样本；

(2)按定标程序用定标品对粪便钙卫蛋白定量检测进行定标；

(3)各添加75uL的质控品和样本到指定的反应杯中；

(4)在各反应杯中添加50uL生物素标记钙卫蛋白抗体；

(5)在各反应杯中添加20uL链霉亲和素包被的磁微粒溶液；

(6)37℃孵育15min；

(7)用清洗液清洗各反应杯3次；

(8)在各反应杯中添加100uL吖啶酯标记钙卫蛋白抗体；

(9)37℃孵育15min；

(10)用清洗液清洗各反应杯3次；

(11)在各反应杯中添加200uL全自动免疫检验***用底物液A液；

(12)在各反应杯中添加200uL全自动免疫检验***用底物液B液；

(13)在全自动化学发光仪上依序测量，依据钙卫蛋白试剂卡烧录的校准曲线信息进行数据结果处理。

钙卫蛋白试剂卡烧录的校准曲线如下所示：

本发明的试剂的用途是：检测肠道健康状况。溃疡性结肠炎及克罗恩病等一系列病因不明的肠道非特异性炎症疾病的辅助诊断，疾病是处于活跃期还是休眠期的判读，炎症性肠病患者的指导用药和疗效评估，应用于体检科，运用本发明试剂筛查体检人群中是否有炎症性肠病患者，检测其肠道健康状况，及时把握治疗最佳时期；其它科室，例如内科或消化科，出现不明原因的腹泻、腹痛、恶心呕吐等症状患者，不适用于进行肠镜等直接检查患者，可以通过本发明试剂进行辅助诊断；对于已确诊炎症性肠病患者，运用本发明试剂，检测其严重程度，临床用药后效果，以及是否完全康复。

△将本发明的检测方法应用在肠道健康检测的步骤包括：

步骤一，体检样本采集和前处理；检验机构使用样本萃取液对体检人员进行正规粪便样本的采集和萃取，萃取步骤严格按照样本萃取液使用说明进行。经萃取的待测样本在15-25℃可保存3天，2-8℃可保存5天，-20℃可保存3个月，仅限冻融3次。样本在运输时应避免剧烈震动。

步骤二，检测试剂前处理：使用前，将粪便钙卫蛋白检测试剂置于室温复温，准备第一被标记的钙卫蛋白抗体，第二被标记的钙卫蛋白抗体，钙卫蛋白定标品，钙卫蛋白质控品，待测样本，被包被的磁微粒，清洗液，全自动免疫检验***用底物液A液，全自动免疫检验***用底物液B液；作为一种实施例，第一被标记的钙卫蛋白抗体为生物素标记钙卫蛋白抗体，第二被标记的钙卫蛋白抗体为吖啶酯标记钙卫蛋白抗体，被包被的磁微粒为链霉亲和素包被的磁微粒溶液。

步骤三，定标品、质控品前处理：定标品、质控品每管添加1.0mL的蒸馏水或去离子水溶解，静置5分钟，上下颠倒混匀，确保所有的固体物溶解完全且无气泡产生。使用完毕后应立即置于-20℃保存，仅限冻融3次。

步骤四，定标：将抗体及磁微粒溶液放入试剂瓶套装，仪器扫入钙卫蛋白试剂卡，将试剂瓶套装放入仪器指定位置；随后，将钙卫蛋白定标卡扫入仪器中，并将定标品放入指定的反应架中，对钙卫蛋白定量检测进行定标；

步骤五，在全自动化学发光测定仪上检测，，按下表程序进行加样和操作(单位：μL)：

步骤六，计算：化学发光分析仪通过钙卫蛋白试剂卡内烧录的标准曲线和测定的相对光强度(RLU)计算样品和质控品的浓度值。

步骤七，质控：依据质控品的测定浓度，与标示值范围进行比较，若超出标示的质控范围，说明本次检测不合格，需重新进行检测。

步骤八，根据参考范围和检测结果判定健康情况。参考范围如下：

正常健康人群的界定值低于200μg/g；

阳性人群的界定值大于50μg/g；

强阳性人群的界定值为大于500μg/g。

参考范围的应用和检测结果的解释：

粪便钙卫蛋白检测试剂对于检验结果的解释如下：

健康人群的检测界定值低于200μg/g，是因为在不同的抗体及反应体系中，界定值会有所差异，并且在对不同地区的人群进行检测时，其正常人群的检测界定值会具有一定的波动性，例如，可以通过对当地一定数量健康人群进行检测，将健康人群检测界定值定位为180μg/g，也可以为150μg/g或100μg/g，但是其界定值上限必须低于200μg/g。因此当检测样本结果高于200μg/g时，可以判断此样本为阳性，临床解释为出现肠道炎症性疾病症状，可以进行结肠镜联合活组织检查作为进一步确诊，需要在专业医生指导下进行治疗；

阳性人群的界定值大于50μg/g，是通过对一定数量的下消化道出血患者粪便样本进行检测，将检测结果通过统计学方法得出的下限值，不同地区的不同人群可以依据当地阳性样本结果确定阳性值，例如可以通过对当地一定数量的下消化道出血患者粪便样本进行检测，将阳性样本检测界定值定位为60μg/g，也可以为70μg/g或80μg/g，但是其界定值下限必须大于50μg/g。因此当检测样本结果低于50μg/g时，可以判断此样本为阴性，临床解释为未出现肠道炎症性疾病症状；

强阳性人群的界定值为大于500μg/g，是依据已确诊的重度肠道炎症性疾病患者的粪便钙卫蛋白含量确定的。当样本检测结果在500μg/g以上，判断为强阳性，临床解释为较严重的肠道炎症性疾病症状，需要在专业医生指导下进行及时的干预和治疗。

运用本试剂进行一项人粪便钙卫蛋白浓度研究，再对样本结果采用百分位数法求得参考范围，这个参考范围能够很好的辅助个人肠道炎症性疾病症状的诊断，在实验四中得到验证。

需要说明的是：本发明是一种检测产品，并非疾病的诊断和治疗的方法，只是辅助临床判断的工具而已。

以下对50μg/g、200μg/g和500μg/g的界定值进行说明。

将200μg/g作为粪便钙卫蛋白检测试剂正常人群的界定值上限，是通过运用本发明专利所述的粪便钙卫蛋白检测试剂对575例新鲜粪便样本(其中男性288例，平均年龄35.53岁±标准差18.86岁；女性287例，平均年龄36.52岁±标准差17.12岁)进行检测，将检测结果用spss软件统计得出的。其统计结果表明，受试者的检测范围为0-460.2ng/mL，平均值为110.25ng/mL，95％置信区间为21.34-402.38ng/mL。将结果的95％置信区间上限402.38ng/mL定为正常人群中粪便钙卫蛋白的界定值上限，依据粪便的稀释倍数，换算成每克粪便中钙卫蛋白含量，正常人群的界定值上限为200μg/g。

将50μg/g作为粪便钙卫蛋白检测试剂阳性人群的界定值下限。用本发明专利所述的粪便钙卫蛋白检测试剂对141例肠道炎症性疾病患者(其中63例确诊溃疡性结肠炎患者、58例确诊克罗恩病患者和20例其它肠道炎症性疾病患者)的新鲜粪便样本进行检测，检测结果用spss软件统计。其统计结果表明，受试者的检测范围为92.34-1010.2ng/mL，平均值为490.25ng/mL，95％置信区间为100.60-858.38ng/mL。将结果的95％置信区间下限100.60ng/mL定为阳性人群中粪便钙卫蛋白的界定值下限，依据粪便的稀释倍数，换算成每克粪便中钙卫蛋白含量，阳性人群的界定值下限为50μg/g。

将500μg/g作为粪便钙卫蛋白检测试剂强阳性的界定值。用本发明专利所述的粪便钙卫蛋白检测试剂对141例肠道炎症性疾病患者(其中63例确诊溃疡性结肠炎患者、58例确诊克罗恩病患者和20例其它肠道炎症性疾病患者)的新鲜粪便样本进行检测，检测结果用spss软件统计。其统计结果表明，受试者的检测范围为92.34-1060.2ng/mL，平均值为490.25ng/mL，95％置信区间为100.60-858.38ng/mL。将受试者的检测范围上限1010.2ng/mL定为强阳性界定值，依据粪便的稀释倍数，换算成每克粪便中钙卫蛋白含量，强阳性的界定值为500μg/g。

需要说明的是：本发明是一种检测产品，并非疾病的诊断和治疗的方法，只是辅助临床判断的工具而已。

△以下通过实验验证本发明的效果；

实验一，灵敏度实验：

取零浓度校准品作为样本测定其相对光强度值(xi)，重复测定20次，得出20次测量结果的相对光强度值(xi)，求出平均值按公式(1)计算标准差(SD)，得出所对应的相对光强度值。根据试剂盒内试剂卡烧录的校准曲线方程，将所对应的相对光强度值代入上述方程，求对应的浓度值，即为灵敏度,根据行业标准及设计要求，灵敏度应不大于1.0μg/g。

根据上述方法，本实验用零浓度校准品L1进行血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的灵敏度实验。实验结果如下：

上述结果表明，粪便钙卫蛋白检测试剂的灵敏度为0.83ng/mL，低于1.0ng/mL的标准，说明试剂盒的检测灵敏度较高。

实验二，准确度实验：

取一个浓度水平的工作校准品，重复检测3次，按公式(2)计算相对偏差(B％)，根据行业标准及设计要求，如果3次结果的相对偏差(B％)都不大于15.0％的要求，即判为合格。如果大于等于2次的结果不符合，即判为不合格。如果有1次结果不符合，则应重新连续测试20次，并分别按照公式(3)计算相对偏差，如果大于等于19次测试的结果的相对偏差(B％)都不大于15.0％的要求，则准确度符合要求。

B％＝(M-T)/T×100％…………………………(2)

B％：相对偏差；

M：校准品测试值；

T：校准品靶值。

根据上述方法，本实验用粪便钙卫蛋白检测试剂工作校准品L4进行粪便钙卫蛋白检测试剂的准确度实验。实验结果如下：

上述结果表明，粪便钙卫蛋白检测试剂工作校准品L4的相对偏差(B％)均低于15.0％的标准，说明粪便钙卫蛋白检测试剂的准确度较好。

实验三，线性范围实验：

配置6个稀释浓度(xi)且接近线性范围上限和下限的样本，测定相对光强度值，每个浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程y＝a+bx。按公式(3)计算线性回归的相关系数(r)，根据行业标准及设计要求，相关系数(r)应不小于0.990。

表1样本浓度稀释制备示例

样本编号	1	2	3	4	5	6
							高值样本(mL)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
低值样本(mL)	1.0	0.8	0.6	0.4	0.2	0

根据上述方法，本实验的高值样本选取粪便钙卫蛋白检测试剂工作校准品L7，低值样本选取粪便钙卫蛋白检测试剂工作校准品L1，按照表1的稀释比例，进行线性范围测定。实验结果如下：

结果分析：上述结果表明，粪便钙卫蛋白检测试剂的线性相关系数(r)为0.992，符合线性范围规定，说明粪便钙卫蛋白检测试剂在测定范围内的线性较好。

实验四，本发明的检测方法与临床检测的对比试验：

受试粪便样本由嘉兴某体检机构提供。样本为新鲜人粪便样本，受试样本共120例，其中男性55例，女性65例，年龄范围在10-84岁，平均年龄为44岁。实验地点为嘉兴行健生物科技有限公司的一级生物实验室。

对照试剂选取瑞士Buhlmann Laboratories AG公司的钙卫蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)。该试剂为国内已注册上市的进口试剂，注册证号为国械注进20172400529。对照试剂预期用途为体外定量检测粪便提取物中的钙卫蛋白含量，与本发明所述试剂的样本类型及预期用途一致。对照试剂的包装规格为96人份/盒。对照试剂质量较好，且临床应用广泛。根据对照试剂说明书要求，使用对照试剂对上述的受试粪便样本进行粪便钙卫蛋白含量测定。得到受试粪便样本中钙卫蛋白含量的检测结果。

以本发明专利所述的一种钙卫蛋白检测试剂为考核试剂，配套检测仪器为南京迪格诺斯ACL2800全自动化学发光测定仪，对上述的受试粪便样本进行粪便钙卫蛋白含量测定。受试粪便样本预先经过样本萃取液萃取，萃取过程可以按照样本萃取液说明书进行，也可以按照天平称量法，对粪便样本取样并称重，根据样本萃取液说明书中的样本稀释比例，对粪便样本进行萃取。随后上机进行检测，检测步骤和过程严格按照考核试剂说明书及其配套全自动化学发光测定仪说明书进行，得到受试粪便样本中钙卫蛋白含量的检测结果。

以下为一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白临床对比试验的检测结果：

结果处理1：

将对照试剂和考核试剂方法进行一致性分析：用Analyse-it数据处理软件对上述数据做Passing&Bablok回归分析，得出Passing&Bablok回归方程为Y＝-0.45+0.96X，其截距(A)和斜率(B)的数据如下表所示：

结果分析：

Passing&Bablok回归分析判定标准：(1)截距A是两种方法之间***性差异的度量。截距A的95％置信区间可用于检验A＝0的假设。如果A的置信区间包含值0，说明两者之间不存在***性差异。如果假设被拒绝，则得出结论：A与0存在显著性不同，并且两种方法至少相差恒定量；(2)斜率B是两种方法之间比例差异的度量。斜率B的95％置信区间可用于检验B＝1的假设。如果B的置信区间包含值1，说明两者之间不存在比例差异。如果假设被拒绝，则得出结论：B与1存在显著性不同，并且两种方法之间至少存在比例差异。

依据判定标准，本临床试验的截距(A)和斜率(B)的95％置信区间均包含假设值，说明考核试剂的测定结果与对照试剂测定的粪便样本钙卫蛋白含量不存在***性差异以及比例差异，具有很好的一致性。

结果处理2：

将对照试剂和考核试剂方法的成对数据进行一致性分析：用spss数据处理软件对上述数据做成对样本T检验，结果如下：

成对样本统计量：

成对样本相关系数：

成对样本检验：

结果分析：

成对样本T检验原理：对两个同质样本分别接受两种不同的处理或同一个样本先后接受不同的处理，以判断处理是否有差别。成对样本T检验根据数据对样本来自的配对总体的均值是否有显著性差异进行推断。

根据统计学的“小概率原理”，本临床试验选取显著性水平α＝0.05，若P≥0.05，则说明差异不显著；若P＜0.05，则说明差异显著。

根据行业标准及临床实验设计要求，若相关系数r≥0.975，则说明两者具有一定的相关性。

从成对样本相关系数表中，得出对照试剂和考核试剂的测定结果相关系数为0.989，大于行业标准及临床实验设计要求的0.975，说明两者的相关性较好；且相关系数的概率值(即P值)为0.000，小于显著性水平0.05，说明对照试剂和考核试剂对同一样本的测定数据具有显著的线性相关性。

成对样本检验表给出对照试剂和考核试剂测定结果的T值为-0.777，自由度为0.119，两者的双侧显著性指标(P值)为0.439，大于显著性水平0.05，说明两者没有显著性差异，一致性较好。

本发明提供一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途，能够准确、定量检测人粪便样本中钙卫蛋白含量，具有灵敏度高、稳定性好的优点，对肠道健康检测具有较高的临床辅助价值。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 嘉兴行健生物科技有限公司

<120> 一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白的试剂及其检测方法和用途

<141> 2019-09-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 93

<212> PRT

<213> Calpain

<400> 1

Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr

1 5 10 15

His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp

20 25 30

Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys

35 40 45

Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly

50 55 60

Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val

65 70 75 80

Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu

85 90

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> Calpain

<400> 2

Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile

1 5 10 15

Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu

20 25 30

Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe

35 40 45

Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile Met Glu

50 55 60

Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile

65 70 75 80

Met Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu

85 90 95

Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly

100 105 110

Thr Pro

Claims (10)

1.一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，其特征在于，包括：免疫复合体，磁珠化学发光检测体系，固定分离相为磁微粒；

免疫复合体包括：钙卫蛋白校准品，钙卫蛋白质控品，由标记后的第一特定抗体、标记后的第二特定抗体和待测样本复合后形成的“标记后的第一特定抗体—钙卫蛋白—标记后的第二特定抗体”的被标记的钙卫蛋白复合物抗体。

2.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，其特征在于，所述第一特定抗体，第二特定抗体与钙卫蛋白的结合方式为：一种抗体与钙卫蛋白S100A8肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

3.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，其特征在于，所述第一特定抗体，第二特定抗体与钙卫蛋白的结合方式为：一种抗体与钙卫蛋白S100A8肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A8肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

4.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，其特征在于，所述第一特定抗体，第二特定抗体与钙卫蛋白的结合方式为：一种抗体与钙卫蛋白S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

5.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，其特征在于，所述固定分离相为链霉亲和素包被的磁微粒。

6.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，其特征在于，所述固定分离相为钙卫蛋白单克隆或多克隆抗体包被的磁微粒。

7.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，其特征在于，所述标记为发光标记物标记，所述发光标记物包括：吖啶酯，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠。

8.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白，其特征在于，所述第一特定抗体、第二特定抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，所述单克隆抗体来源于小鼠、大鼠、兔的杂交瘤细胞，所述多克隆抗体来源于兔、羊、鸡。

9.一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白的检测方法，其特征在于，收集并萃取待测粪便样本，加入全自动化学发光仪的反应杯中，在每个反应杯中加入第一被标记的钙卫蛋白抗体、被包被的磁微粒溶液、第二被标记的钙卫蛋白抗体，在加入第二被标记的钙卫蛋白抗体前孵育、清洗，并在加入第二被标记的钙卫蛋白抗体后二次孵育、清洗，或在加入第二被标记的钙卫蛋白抗体后一次孵育、清洗，最后加入底物液或激发液对反应体系进行激发发光，依据已定标的校准曲线信息进行数据结果处理；

所述第一被标记的钙卫蛋白抗体、第二被标记的钙卫蛋白抗体为：一种抗体与钙卫蛋白S100A8或S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合，另一种抗体与钙卫蛋白S100A8或S100A9肽链氨基酸序列中的氨基酸表位特异性结合。

10.一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白在肠道健康检测的用途，其特征在于，用于检测肠道健康状况。