CN117907608B - 一种Claudin2蛋白的检测方法及其相关产品和应用 - Google Patents
一种Claudin2蛋白的检测方法及其相关产品和应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种Claudin2蛋白的检测方法及其相关产品和应用，涉及生物领域。本发明提供了一种萃取液，包括组织蛋白酶S或弹性蛋白酶1和组织蛋白酶E，采用该萃取液能够从粪便样本中有效提取Claudin2蛋白，使其溶解在粪便上清液中，从而实现从粪便样本中检测目标蛋白Claudin2，实现Claudin2蛋白的无侵入性的有效检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体而言，涉及一种Claudin2蛋白的检测方法及其相关产品和应用。
背景技术
人封闭蛋白2（Claudin2，CLDN2）是四次跨膜蛋白，包括四个跨膜结构域（TM1-4）、细胞内N端和C末端以及两个细胞外环（ECL1和ECL2）。ECL1包含四条β链和一条胞外螺旋（ECH），ECL2包含一条β链和一个细胞表面暴露的部分跨膜结构域。
Claudin2在健康成人的肠道上皮低表达，在炎症性肠病、乳糜泄患者的肠道上皮表达显著升高。由于它是膜结构蛋白，不溶解在粪便上清液中，目前，对Claudin2的检测主要是免疫组织化学方法对肠上皮的切片进行免疫组织化学检测或检测肠道内容物中的Claudin2基因产物。但免疫组织化学检测是侵入性的，需要内镜下取肠黏膜组织活检，应用范围受到限制。例如，专利申请号为KR1020210140215，申请日为2021-10-20的专利中公开Claudin2能在实验鼠的结肠灌洗液中用PCR方法检测。分子检测方法由于需要定量PCR仪，并且需要在专门的PCR实验室里进行检测，受到检测场地的严格限制。现有Claudin2的检测过程繁琐，且存在无法准确定量等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Claudin2蛋白的检测方法及其相关产品和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种Claudin2蛋白的检测或提取方法，其包括采用萃取液从粪便样本中非疾病诊断目的的检测Claudin2或提取Claudin2；所述萃取液的活性成分包括蛋白酶；所述蛋白酶包括以下任意一种：组织蛋白酶S；弹性蛋白酶1和组织蛋白酶E。
第二方面，本发明实施例提供了一种试剂组合或试剂盒，所述试剂组合或试剂盒包括：前述实施例中所述的萃取液。
第三方面，本发明实施例提供了前述实施例中所述的萃取液在制备用于检测Claudin2或提取Claudin2的产品或用于辅助诊断Claudin2水平异常相关的疾病的产品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过特殊的萃取液配方，能够从粪便样本中有效提取Claudin2蛋白，使其溶解在粪便上清液中，从而实现从粪便样本中检测目标蛋白Claudin2，实现Claudin2蛋白的无侵入性的有效检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例3中试纸条的结构示意图。
附图标记：1-样品垫；2-结合垫；3-硝酸纤维素膜；4-吸水纸；5-检测线（T线）；6-质控线（C线）。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一方面，本发明实施例提供了一种Claudin2蛋白的检测或提取方法，其包括采用萃取液从粪便样本中非疾病诊断目的的检测Claudin2或提取Claudin2；所述萃取液的活性成分包括蛋白酶；所述蛋白酶包括以下任意一种：组织蛋白酶S；弹性蛋白酶1和组织蛋白酶E。
弹性蛋白酶1与组织蛋白酶E的组合和组织蛋白酶S具有相同的功效，均可以同时将目标序列从粪便样本中含有的Claudin2蛋白序列（可参照SEQ ID NO:1）中解离出来，并作为用于检测Claudin2蛋白的靶标物，从而实现对粪便样本中Claudin2蛋白的定性或定量检测。相对于现有技术仅能实现血液样本中Claudin2的检测而言，本发明实施例提供的萃取液以及检测方法能够在无创且无特殊设备的情况下，高效、低成本地实现Claudin2蛋白的精准检测。
所述目标序列包括多肽2和多肽3中的任意一种或多种。多肽2的氨基酸序列如SEQID NO:3所示，多肽3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在一些实施例中，所述蛋白酶为组织蛋白酶S。组织蛋白酶S（C01.034: cathepsinS），该酶能同时酶切Claudin2蛋白序列中ECL1多肽的N端和C端，更重要的是，在ECL1（多肽1）的内部不存在其他该酶的酶切位点。具体地，组织蛋白酶S能够在ECL1多肽序列N端的第25-28位点的Met Leu+Leu Pro中间的俩Leu间进行酶切，同时能够在C端第71-74位点的Leu-Gly+Leu-Pro中间的Gly与Leu间进行酶切。需要说明地是，此处的“+”代表酶切位点。
在一些实施例中，所述蛋白酶包括组织蛋白酶S时，所述蛋白酶还包括炭疽致死因子（M34.001: anthrax lethal factor）。ECL1多肽序列C端第71-74位点的Leu-Gly+Leu-Pro也是炭疽致死因子的酶切位点。致死因子（lethal factor，LF）是一种能水解丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的金属蛋白酶，是炭疽毒素（toxin）的重要成分之一。炭疽LF由四个结构域组成：结构域Ⅰ主要负责与保护性抗原（protective antigen，PA）结合；结构域Ⅱ是主要功能区域；结构域Ⅲ具有高度可变性且能与底物特异性结合；结构域Ⅳ含有锌离子结合序列，发挥蛋白质的毒性作用。
组织蛋白酶S具有同时识别酶切目标区域N端和C端的作用，单独使用组织蛋白酶S作为蛋白酶也可以将目标序列（多肽2，序列如SEQ ID NO:3所示）从Claudin2蛋白中解离出来。炭疽致死因子能够识别目标区域的C端，且不会切割识别目标区域的其他位点，可以与组织蛋白酶S联合作为蛋白酶使用，其作用效果与单独采用组织蛋白酶S无显著差异，酶切后可同样获得多肽2。
在一些实施例中，所述蛋白酶为组织蛋白酶S和炭疽致死因子的混合。
在另一些实施例中，所述蛋白酶为弹性蛋白酶1和组织蛋白酶E的混合。用弹性蛋白酶1（S01.153: elastase-1）能够在ECL1多肽序列的N端31-34位点Lys-Thr+Ser-Ser之间的Thr和Ser进行酶切，组织蛋白酶E（A01.010: cathepsin E）能够在C端第69-72位点Thr-Leu+Leu-Gly之间的Leu和Leu进行酶切，以获得目标序列多肽3，多肽3的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。
相对于本发明实施例限定的特定蛋白酶而言，ECL1多肽的C端还可以被其他蛋白酶，例如组织蛋白酶B（C01.060: cathepsin B）、组织蛋白酶L（C01.032: cathepsin L）以及组织蛋白酶K（C01.036: cathepsin K）酶解；但其不适用于本发明提供的检测方法，将其应用于本发明将无法有效实现Claudin2蛋白的定性或定量检测。
在一些实施例中，在所述萃取液中，所述组织蛋白酶S的终浓度为0.05~10ng/mL。该终浓度具体可以为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10ng/mL中的任意一种或任意两者之间的范围。
在一些实施例中，在所述萃取液中，所述弹性蛋白酶1的终浓度为0.01~20ng/mL。该终浓度具体可以为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，在所述萃取液中，所述组织蛋白酶E的终浓度为0.01~10ng/mL。该终浓度具体可以为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，在所述萃取液中，所述炭疽致死因子的终浓度为0.01~5ng/mL。该终浓度具体可以为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述萃取液还包括：缓冲液、二硫苏糖醇和表面活性剂中的任意一种或多种。需要说明的是，缓冲液、二硫苏糖醇和表面活性剂属于萃取液中的常规添加成分，本发明的主要发明构思在于萃取液中的活性成分蛋白酶的确定。
在一些实施例中，所述缓冲液选自：Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液和硼酸盐缓冲液中的任意一种。
在一些实施例中，当缓冲液为Tris-HCl缓冲液时，Tris-HCl在萃取液中的终浓度可以为5~90mM，具体可以为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90mM中的任意一种或任意两种之间的范围；pH可以为5~8，具体可以为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，当缓冲液为PBS缓冲液时，PBS在萃取液中的终浓度可以为1~50mM，具体可以为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mM中的任意一种或任意两种之间的范围；pH可以为5.5~7.5，具体可以为5.5、6、6.5、7、7.5中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，当缓冲液为硼酸盐缓冲液时，硼酸盐在萃取液中的终浓度可以为2~100mM，具体可以为2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mM中的任意一种或任意两种之间的范围。pH可以为6~9，具体可以为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述表面活性剂包括：吐温20、吐温80、曲拉通X-100、曲拉通X-405、tetronic1307、BRIIJ35和SDS中的任意一种或多种。
在一些实施例中，在所述萃取液中，吐温20、吐温80、曲拉通X-100和曲拉通X-405的体积分数（终浓度）可以独立地为0.01%~5%。具体可以为0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，在所述萃取液中，tetronic1307、BRIIJ35和SDS的质量分数可以独立地为0.01%~5%。具体可以为0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，在所述萃取液中，二硫苏糖醇（DTT）的终浓度为0.5~20mM。该终浓度具体可以为0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述检测Claudin2的步骤包括：将所述萃取液与待测样本混合，对混合后的产物离心，取上清液用于检测。
在一些实施例中，所述检测Claudin2的步骤包括：将所述萃取液与待测样本混合，对混合物进行过滤，取过滤液用于检测。
在一些实施例中，所述检测的方法包括：酶联免疫法、免疫层析法、化学发光法和免疫比浊法中的任意一种。
在一些实施例中，所述取上清液或过滤液用于检测的步骤还包括：采用捕获抗体捕获靶标物和/或采用检测抗体检测靶标物的信号；
其中，所述捕获抗体和/或所述检测抗体的抗原独立地为抗原多肽，所述抗原多肽选自多肽1、多肽2和多肽3中的任意一种；所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
多肽1~3为三段具有较高免疫原性的氨基酸序列，通过基因重组、转染和表达，可获得Claudin2抗原蛋白，可作为检测试剂盒中的标准品。同时，将多肽1~3中的任意一种或多种免疫动物，可筛选获得高特异性的抗Claudin2蛋白的抗体，抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体或抗原结合片段。将筛选获得的抗体与固相载体结合，可作为捕获粪便上清液中的靶标物的捕获抗体，和/或将筛选获得的抗体与标记物结合，作为用于检测靶标物的检测抗体。
另一方面，本发明实施例还提供了一种试剂组合或试剂盒，所述试剂组合或试剂盒包括前述任意实施例中所述的萃取液。
本文中的“多种”指代两种或两种以上。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例中所述的萃取液在制备用于检测Claudin2或提取Claudin2的产品或用于辅助诊断Claudin2水平异常相关的疾病的产品中的应用。
在一些实施例中，所述Claudin2水平异常相关的疾病包括：炎症性肠病或乳糜泄中的任意一种或多种。所述Claudin2水平包括所述Claudin2蛋白水平和/或mRNA水平。
在一些实施例中，所述产品包括：试剂或试剂盒。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的萃取液在构建用于辅助预测或辅助诊断炎症性肠病或乳糜泄的预测模型中的应用。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗原多肽，所述抗原多肽选自多肽1、多肽2和多肽3中的任意一种；多肽1、多肽2和多肽3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。
另一方面，本发明实施例还提供了一种多肽组合物，所述组合物包括多肽1、多肽2和多肽3中的任意两种或三种。多肽1、多肽2和多肽3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
另一方面，前述实施例所述的抗原多肽或多肽组合物在从粪便样本中非疾病诊断目的的检测Claudin2或提取Claudin2中的应用。
另一方面，前述实施例所述的抗原多肽或多肽组合物在制备用于检测Claudin2或提取Claudin2的产品或用于辅助诊断Claudin2水平异常相关的疾病的产品中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
后续实施例采用的样本：炎症性肠病（IBD）组及健康对照组粪便样本各50例。具体地，炎症性肠病组为送检到检测中心的确诊样本，其中克罗恩病41例，溃疡性结肠炎9例；年龄10-42岁；男29例，女21例。健康对照组为本中心员工及家属粪便样本，年龄9-48岁；男30例，女20例。
实施例1
本实施例提供了多组用于从粪便样本中萃取Claudin2蛋白的萃取液，具体如下。
表1 萃取液的组分以及组分的终浓度
备注：表格中各组分的浓度为其在萃取液中的终浓度。
实施例2
本实施例提供了一种基于酶联免疫法（ELISA法）检测Clandin2的试剂盒及其检测方法。
一、试剂盒
该试剂盒包括：酶标板、校准品、质控品、酶结合物、底物、清洗液、终止液和粪便萃取液（实施例1中的萃取液1~6）。
其中，酶结合物为抗多肽2（SEQ ID NO:3）的鼠单抗标记辣根过氧化物酶（HRP）。该酶标板包被有抗ECL1蛋白的羊多抗。校准品为6个浓度梯度的ECL1蛋白。
该试剂盒中部分试剂的制备方法：
（1）包被酶标板：将抗ECL1蛋白的羊多抗以CB缓冲液稀释至5μg/mL，每孔100μL包被微孔板，4℃过夜。拍干孔内液体，用含BSA的封闭缓冲液每孔250μL，37℃孵育2小时，拍去封闭液，37度烘干备用。
（2）抗多肽2鼠单抗标记辣根过氧化物酶（HRP）：称取2mg HRP置于离心管中，加入1mL纯水溶解，加入1mL 浓度为10mg/mL 的NaIO4溶液，4度避光反应20min。加入0.05mL乙二醇，室温反应10min。超滤纯化。向其中加入2mg抗多肽2的鼠单抗，4度避光反应3小时，加0.2mL 浓度为5mg/mL 的NaBH4溶液，混匀，以0.05M CB透析过夜。将标记好的酶标抗体取出，加入等体积甘油，置于-20℃保存备用。
二、检测方法
（1）每10mg粪便加5mL萃取液充分混合，3000rpm离心5min，取上清液用于检测。以每孔100μL加入酶标板，37度孵育2小时，洗板3次。
（2）加入酶结合物，孵育1小时，洗板4次。
（3）酶标板中加入底物TMB，孵育15分钟，加入终止液终止显色反应，用450nm波长检测OD值，与标准品的OD值比较，计算待检样本中Claudin2（ECL1）的浓度。
三、试剂盒的检测效果验证
实验方法
将本实施例提供的试剂盒及其检测方法作为实验组，同时设置一组对照组，分别对粪便样本进行100例样本进行检测（炎症性肠病IBD组和健康对照组粪便样本各50例）。
另设一组对照，对照组的检测方法为基于PCR检测样本中的Claudin2 RNA的方法，粪便核酸提取试剂外购自天根生物。
实验结果
表2 实验结果
本发明实施例提供的ELISA试剂粪便考察了萃取液1~6。由表1结果可知，萃取液1~3均达到良好的效果，阳性符合率分别为76%、78%和76%，阴性符合率分别为96%、92%和90%，总符合率分别为86%、85%和83%。对照组PCR方法的阳性、阴性及总符合率分别为68%、58%和63%。结果显示，组织蛋白酶S单独或者与炭疽致死因子组合，以及组织蛋白酶E与弹性蛋白酶1组合均比对照PCR检测方法优异。其中萃取液1配方最为简单，具有性价比高的优势。
萃取液4~6检测结果不如PCR法。
实施例3
本实施例提供了一种基于荧光层析法定量检测Claudin2的试剂盒及其检测方法。
一、试剂盒
该试剂盒包括：荧光层析定量检测卡、校准ID卡及粪便萃取液（实施例1中的萃取液1、7~13）。
其中，所述荧光层析定量检测卡为铝箔袋密封包装，包括检测卡和干燥剂。所述检测卡包括塑料卡壳合试纸条。试纸条结构如图1所示，该试纸是在PVC底板上粘贴有硝酸纤维素膜3、样品垫1、结合垫2和吸水纸4，样品垫1叠压在结合垫2一端，结合垫2另一端和吸水纸4分别层压在硝酸纤维素膜3的两端上；该结合垫2上有时间分辨荧光微球标记的抗ECL1蛋白鸡多抗（鸡IgY多克隆抗体）；该硝酸纤维素膜3上设有检测线5（T线）和质控线6（C线），检测线5（T线）包被有抗多肽3（SEQ ID NO:4）兔单抗（兔单克隆抗体），质控线6（C线）包被有羊抗鸡IgY多抗（Goat anti-Chicken IgY polyclonal Antibody）。
该试剂盒的制备方法：
（1）时间分辨荧光微球标记抗ECL1蛋白鸡多抗。
取时间分辨荧光微球200μL（0.2μm，1%），13500rpm 4℃离心15min，弃上清。加入10mg/ml 的EDC，反应15min后离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液（20mM，pH8.0）400μL，超声15s混匀；加入抗ECL1蛋白鸡多抗80μg，25℃反应2h；离心，弃上清，加入封闭液，反应1h；离心，弃上清，加入400μL硼酸盐缓冲液，超声混匀，做好标签，4℃保存待用。
（2）结合垫和样品垫的制备
聚酯膜用含有表面活性剂的缓冲液（配方：20mM pH 8.0 PBS，其中含有质量分数为5%的BSA、质量分数为0.5% 的S9和质量分数为3%的海藻糖）浸泡进行预处理，37℃干燥过夜，制备得到结合垫；取制备好的结合垫，以金标HM3035喷金划膜仪，将标记有抗ECL1蛋白鸡多抗的时间分辨荧光微球，以2μL/cm喷至预处理的结合垫上，37℃干燥4小时，干燥后裁切为30×0.8cm制备得到样品垫。制备得到特异性结合垫。
玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液（配方：50mM pH 8.0 BB，其中含有质量分数为2%的BSA、质量分数为0.5%的S9）浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，裁切为30×1.6cm制备得到样品垫。
（3）在硝酸纤维素膜（NC膜）上包被T线和C线
将NC膜贴至背衬底板的指定位置，将抗多肽3（SEQ ID NO:4）兔单抗以及羊抗鸡IgY多抗（Goat anti-Chicken IgY polyclonal Antibody）分别稀释至1mg/mL及0.5mg/mL，通过金标HM3035喷金划膜仪均匀的喷涂至NC膜上用于制备T线及C线，37℃干燥过夜。
（4）组装
将步骤（2）结合垫叠压在步骤（3）得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤（2）得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品（检测卡）。
（5）制作校准曲线
校准品为6个浓度梯度的ECL1蛋白，取校准品1套加入检测卡中，反应10min后以荧光读数仪FIC-S100进行检测得到校准曲线，通过HMreader软件制备得到校准ID卡。
二、检测方法
以粪便处理管的采便棒对粪便样本采样（每10mg粪便中加入5mL萃取液）后，震荡使粪便样本混匀溶解，挤出萃取后的样本萃取液至试管中。取80μL加入加样孔，反应10min后置于荧光读数仪检测，即可得到样本中Claudin2（ECL1）的含量。
三、试剂盒的检测效果验证
实验方法
将本实施例提供的试剂盒及其检测方法作为实验组，同时设置一组对照组，分别对粪便样本进行100例样本进行检测（炎症性肠病IBD组和健康对照组粪便样本各50例）。
对照组的检测方法和检测试剂同实施例2。
实验结果
表3 实验结果
由表3结果可知，萃取液1、8、11结果一致，三组采用的者蛋白酶含量一致，缓冲体系、表面活性剂及DTT含量等因素变化对结果无显著差异。8组萃取液的层析法结果均优于对照组PCR法，其中萃取液1、8和11最优。
实施例4
本实施例提供了一种基于磁微粒化学发光法检测Clandin2的试剂盒及其检测方法。
一、试剂盒
该试剂盒包括：粪便萃取液（实施例1中的萃取液）、生物素化抗多肽3（SEQ ID NO:4）鼠单抗、标准品、吖啶酯标记的抗多肽2（SEQ ID NO:3）兔单抗、链霉亲和素磁微粒、激发液和清洗液。其中，校准品为不同浓度梯度ECL1蛋白。
该试剂盒中部分试剂的制备方法：
（1）生物素化抗多肽3鼠单抗的制备
取2mg抗多肽3鼠单抗置于离心管中，加入80μL的活化生物素，25℃反应30min，将反应液取出，以0.02M PBS透析过夜。将生物素化抗多肽3鼠单抗取出，加入0.05%Proclin300，于2-8℃备用。
（2）吖啶酯标记抗多肽2兔单抗
取2mg抗多肽2兔单抗，按抗体：吖啶酯=1:20摩尔比加入已活化的吖啶酯，室温反应30min。将反应液透析后取出，加入0.05% Proclin300，于2-8℃备用。
二、检测方法
（1）将粪便样本与实施例1中的萃取液震荡1min混合均匀（每10mg粪便样本加入5mL萃取液），对混合后的产物过滤，取过滤液用于检测。
（2）发光仪型号为：科斯迈smart500s。设置发光仪检测参数：加样量20μL，生物素化抗多肽3鼠单抗 100μL以及吖啶酯标记抗多肽2兔单抗100μL，孵育30min，清洗4次，检测。
（3）粪便样本萃取液及校准品上机检测，根据校准品的发光值计算样本中Claudin2（ECL1）浓度。
三、试剂盒的检测效果验证
实验方法
将本实施例提供的试剂盒及其检测方法作为实验组，同时设置一组对照组，分别对粪便样本进行100例样本进行检测（炎症性肠病IBD组和健康对照组粪便样本各50例）。
对照组的检测方法和检测试剂同实施例2。
实验结果
表4 实验结果
由结果可知，所有考察的配方均优于对照PCR法。8个配方之间无显著差异，其中萃取液1、15、16特别优异。
实施例5
本实施例提供了一种胶乳增强免疫比浊法检测Clandin2的试剂盒及其检测方法。
一、试剂盒
该试剂盒包括：R1试剂、R2试剂和粪便萃取液（实施例1中的萃取液）。其中，所述R1试剂为MOPS缓冲液。所述R2试剂为标记了抗ECL1蛋白鸡多抗的乳胶微球和标记了抗ECL1兔单抗乳胶微球的混合液；标记了抗ECL1蛋白鸡多抗的乳胶微球粒径为300nm，标记抗ECL1兔单抗乳胶微球粒径为100nm。
试剂盒中部分试剂的制备方法：
（1）R1试剂制备
R1试剂为包含质量分数为1% 的PEG6000、质量分数为1%的BSA及体积分数为0.05%的Proclin300的MOPS缓冲液。配液完成后0.45μm滤膜过滤，分装后于2-8℃备用。
（2）R2试剂制备
抗ECL1蛋白鸡多抗的乳胶微球的制备：
取乳胶微球100μL（300nm)，13500rpm 4℃离心10min，弃上清。加入0.04ml NHS溶液及0.02ml EDC溶液，超声至混匀，室温反应半小时。离心，弃上清。加入1mg 抗ECL1蛋白鸡多抗，涡旋混匀，室温旋转反应2小时。离心，弃上清。加入1ml封闭液，超声涡旋混匀，室温旋转反应1小时，离心，弃上清，加入微球保存液超声混匀，于2-8℃备用。
抗ECL1兔单抗的乳胶微球的制备：
取乳胶微球100μL（100nm），13500rpm 4℃离心20min，弃上清。加入0.04ml NHS溶液及0.02ml EDC溶液，超声至混匀，室温反应半小时。离心，弃上清。加入1mg抗ECL1兔单抗，涡旋混匀，室温旋转反应2小时。离心，弃上清。加入1ml封闭液，超声涡旋混匀，室温旋转反应1小时，离心，弃上清，加入微球保存液超声混匀，于2-8℃备用。
将上述两种乳胶微球为体积比1:1混合后，稀释10倍制备获得R2试剂。
二、检测方法
（1）将粪便样本与实施例1中的样本萃取液震荡1min混合均匀（每10mg粪便中加入5mL萃取液）后，过滤，得到的粪便萃取液用于后续检测。
（2）生化仪为迈瑞BS-240全自动生化仪。设置生化仪检测参数：加样量10μL，R1120μL，R2 20μL，孵育时间8，反应时间（5,16）。
（3）粪便样本萃取液及校准品（6个浓度梯度的ECL1蛋白）上机检测，根据校准品的反应度值计算样本中Claudin2（ECL1）浓度。
三、试剂盒的检测效果验证
实验方法
将本实施例提供的试剂盒及其检测方法作为实验组，同时设置一组对照组，分别对粪便样本进行100例样本进行检测（炎症性肠病IBD组和健康对照组粪便样本各50例）。
对照组的检测方法和检测试剂同实施例2。
实验结果
表5 实验结果
4个萃取液配方，阳性符合率68~72%，与对照PCR法无显著差异，但阴性符合率86~92%、总符合率79~82%，两者均显著优于对照方法。萃取液1在本方法中比ELISA、荧光层析及磁微粒发光中阳性符合率及总符合率相对较低，考虑可能是比浊法相比前三种方法检测灵敏度方面的略弱。萃取液18~20均优于对照PCR法。
本发明涉及的序列见下表。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种Claudin2蛋白的检测方法，其特征在于，其包括采用萃取液从粪便样本中非疾病诊断目的的检测Claudin2或提取Claudin2；所述萃取液的活性成分包括蛋白酶；所述蛋白酶包括以下任意一种：组织蛋白酶S；弹性蛋白酶1和组织蛋白酶E；
所述检测的方法包括：酶联免疫法、免疫层析法、化学发光法和免疫比浊法中的任意一种；
在所述萃取液中，所述组织蛋白酶S的终浓度为0.05~10ng/mL；
在所述萃取液中，所述弹性蛋白酶1的终浓度为0.01~20ng/mL；
在所述萃取液中，所述组织蛋白酶E的终浓度为0.01~10ng/mL。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶包括组织蛋白酶S时，所述蛋白酶还包括炭疽致死因子；
在所述萃取液中，所述炭疽致死因子的终浓度为0.01~5ng/mL。
3.根据权利要求1~2任一项所述的检测方法，其特征在于，所述萃取液还包括：缓冲液、二硫苏糖醇和表面活性剂中的任意一种或多种。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液选自：Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液和硼酸盐缓冲液中的任意一种；
所述表面活性剂包括：吐温20、吐温80、曲拉通X-100、曲拉通X-405、tetronic1307、BRIIJ35和SDS中的任意一种或多种。
5.根据权利要求1~2任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测Claudin2的步骤包括：将所述萃取液与待测样本混合，对混合后的产物离心或过滤，取上清液或过滤液用于检测。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述取上清液或过滤液用于检测的步骤还包括：采用捕获抗体捕获靶标物和/或采用检测抗体检测靶标物的信号；
其中，所述捕获抗体和/或所述检测抗体的抗原独立地为抗原多肽，所述抗原多肽选自多肽1、多肽2和多肽3中的任意一种；所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1~6任一项中所述的萃取液。
8.一种试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括：权利要求1~6任一项中所述的萃取液。
9.萃取液在制备用于检测Claudin2或制备提取Claudin2的产品或制备用于辅助诊断Claudin2水平异常相关的疾病的产品中的应用，所述萃取液为如权利要求1~6任一项中所述的萃取液。
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