CN110484514B - 利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一种利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法。该方法为：将柠檬酸钠或磷酸氢二钾溶解于噬菌体裂解液中，加入乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂，温和涡旋混合，分相形成上、中、下三相的三相体系，完成第一步盐析萃取；向第一步盐析萃取所得下相溶液中加入正丙醇等亲水性有机溶剂，进行第二步盐析萃取，噬菌体在中间相得到富集和纯化。本发明解决了目前噬菌体分离工艺中存在的噬菌体与细菌代谢物难以分离、成本高等问题。该方法工艺简单、分离时间短、回收率高、分离成本低、除杂率高，是一种很有工业应用前景的分离方法。

Description

利用两步盐析萃取分离纯化噬菌体裂解液中噬菌体的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种利用盐析萃取技术分离纯化噬菌体裂解液中 噬菌体的方法。

背景技术

21世纪以来，抗生素滥用引发的细菌耐药问题已成为全球性的公共卫生危机，新型抗 生素的研发困境也导致临床上的抗菌治疗形势日趋严峻。据2016年英国政府报告称，预计 至2050年，每年“超级细菌”导致的死亡人数将增至1000万人。抗生素危机使得多重耐药 菌和泛耐药菌感染疾病的治疗正面临着无药可用的严峻形势，也使得开发一种强有力的、 具有适应症人群大、临床效果显著、不同于现有的独特杀菌机制、成本低、易于保存和使 用等特点的抗菌治疗手段成为当务之急。

噬菌体因其巨大的抗菌潜力将有望成为治疗耐药细菌感染类疾病的抗生素替代品。烈 性噬菌体可以特异性识别宿主细菌，短时间内指数增殖并裂解宿主细菌，释放大量子代噬 菌体并杀死细菌。另外，噬菌体拥有与抗生素完全不同的抗性机制，因此两者不存在交叉 耐药性。美国食品与药物管理局(FDA)2016年和2019年先后批准了人体外用和静脉给药 的噬菌体疗法临床试验，标志着世界最大医药市场的监管路径已经对噬菌体疗法开放。

工业上噬菌体的制备包括宿主培养、噬菌体感染宿主和噬菌体分离纯化三大步骤。作 为一种高价值生物产品，噬菌体下游的分离纯化非常关键。但是噬菌体粗裂解液中的成分 非常复杂，主要含有宿主细胞、细胞碎片、杂蛋白、核酸、多糖和内毒素(LPS)等杂质， 而应用于治疗的噬菌体必须保持较高的效价和活性，但一般噬菌体的效价都较低，所以在 噬菌体的大规模浓缩处理和分离纯化过程中所面临的是极为复杂的工程化难题。

大规模制备噬菌体的分离纯化一般经历粗分离、精制和去内毒素等几个环节。粗分离 主要指去除宿主细胞和细胞碎片等杂质，工业上主要通过低速离心的方法，实验室制备还 利用氯仿萃取和膜过滤等手段；精分离主要指在粗分离的基础上去除杂蛋白和核酸等杂质， 并进一步浓缩噬菌体，主要采用超速离心、长时间的中速离心、强阴离子交换色谱、CsCl 密度梯度离心、超滤和PEG-NaCl/MgSO₄沉淀等手段。CsCl密度梯度离心是实验室最经典 的噬菌体纯化方法，通过超速离心1-4h，可除去细胞及其碎片、蛋白和内毒素等多种杂质， 但存在离心时间较长，操作程序复杂，操作要求严格，不易掌握等缺点，难以实现工业化； 离子交换色谱在得到高纯度的噬菌体的同时也存在回收率不高，价格昂贵，重复使用率低 等缺点。应用于去除内毒素的方法，实验室主要采用CsCl浓度梯度离心，此外还有利用有 机溶剂萃取的报道和专利，如利用正辛醇/正丁醇以及Triton X-100等来萃取内毒素，另外 也可以采用碱性磷酸酶使内毒素灭活的方法，最受关注和应用最广的还是阴离子交换色谱 法，但价格昂贵，重复使用率低，不适用于工业化生产。PEG/盐型双水相体系已有应用于 噬菌体T4和M13等回收的报道，但不同体系对不同噬菌体的萃取效果差异较大，如PEG 400-KH₂PO₄体系能将噬菌体M13萃取至上相，噬菌体收率达到83％，相对于蛋白质纯化倍 数为18.2；而PEG 8000-磷酸盐体系只能将30％的噬菌体T4萃取到上相。传统的多聚物双 水相体系难以工业化应用主要有如下原因：多聚物价格贵，成本较高，回收较困难；粘度 大，影响传质效率，PEG与噬菌体等难分离；不易扩大规模等问题。工业上噬菌体的纯化较多采用几种分离手段和色谱技术联用的方法，噬菌体的收率可达70％以上，蛋白除杂率高达90％左右(接近氯化铯密度梯度离心)。但上述工艺存在的主要问题如下：工艺步骤繁琐，操作时间长，导致生产效率低和总收率低；采用超滤、色谱层析的除杂方法，导致内 毒素的除杂效果不显著；未从过程集成角度综合考虑固液分离、浓缩、除杂等多步操作。 总的来看，工业上力求达到符合cGMP要求的技术方法存在过于繁琐、成本高、损失大和 效率低等问题。

相对于传统的多聚物/盐或多聚物/多聚物组成的双水相萃取体系，新兴的盐析萃取 (Salting-out extraction，SOE)体系有望取而代之，用于噬菌体的分离纯化中。盐析萃取是以 有机溶剂作萃取剂、盐作盐析剂，在两者的综合作用下从水相中萃取亲水性目标产物的一 种分离方法。萃取剂多数是亲水性溶剂，也可以是疏水性溶剂；盐析剂多数是无机盐，也 可以是有机盐。当萃取剂为亲水性溶剂时，形成的两相中均含大量水，所以也被称之为双 水相萃取(Aqueous two-phase system，ATPS)。相对于传统的双水相体系而言，盐析萃取体 系具有传质快、分相时间短，溶剂廉价易回收，易于放大等优势，近几年已广泛应用于酶、 蛋白、生物基化学品、天然产物等分离提取，但在噬菌体的分离纯化方面尚未见报道。

综上所述，提供一种快捷、高效的噬菌体分离纯化技术是十分必要的，理想的噬菌体 分离纯化技术是回收噬菌体的同时将杂蛋白、宿主细胞和碎片、内毒素去除，并能将噬菌 体浓缩，除去大部分水分。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种两步盐析萃取分离纯化 噬菌体裂解液中噬菌体的方法。本发明的方法操作简便、所得噬菌体的活性和收率较高。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

一种两步盐析萃取分离噬菌体裂解液中噬菌体的方法，包括以下步骤：

(1)制备含有噬菌体裂解液和可溶性盐的混合溶液；

(2)将步骤(1)所得混合溶液与有机溶剂A混合，分相得到富含有机溶剂A的上相溶液、凝集中间相以及富含盐和噬菌体的下相组成的三相体系I；

(3)将步骤(2)所得下相与有机溶剂B混合，分相得到富含有机溶剂B的上相溶液、富含噬菌体的凝集中间相以及富含盐、杂蛋白和内毒素的下相组成的三相体系II。

在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述噬菌体裂解液中噬菌体效价为10⁶-10¹¹pfu/mL、 总蛋白浓度为400-800μg/mL、细菌浓度为10⁴-10⁶cfu/mL、内毒素浓度为1.2×10⁴-1.4×10⁵ EU/mL。所述噬菌体裂解液中噬菌体效价优选为10⁸-10¹¹pfu/mL。

在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述可溶性盐为柠檬酸钠或磷酸氢二钾中的一种， 所述可溶性盐的浓度能够显著地影响到在第(2)步中得到三相分配体系，一般来说，在步 骤(1)中所述可溶性盐的含量占三相体系I总质量的3％-20％，即可使得在步骤(2)中得到三相体系Ⅰ，在优选的情况下，所述可溶性盐的含量占三相体系I总质量的5％-10％。

在上述技术方案中，在步骤(2)中所述的有机溶剂A为乙酸乙酯、正丙醇、正癸醇、叔丁醇或正丁醇的一种，有机溶剂A的加入量为所述三相体系Ⅰ总质量的10％-47％，优选为10％-30％。

在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述混合溶液的pH控制在5-11的范围内时，有利于维持噬菌体的侵染活性不受损失。为了能够更好地形成三相体系Ⅰ并且使噬菌体尽可能地全部进入下相溶液中，所述盐混合溶液的pH优选为6-11，更优选为6.5-10。为了将所述混合溶液的pH控制在上述范围内，可以通过滴加质量含量为36％的浓盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液。

在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述噬菌体裂解液由将噬菌体侵染的宿主菌进行 培养而获得，也可以由将噬菌体侵染的宿主菌进行培养，再经离心或膜过滤去除杂质而获 得。

在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述噬菌体为烈性噬菌体。

在上述技术方案中，在步骤(2)和步骤(3)中，所述分相的方式为离心分相，该分相温度可以为0-40℃，优选为4-37℃，更优选为10-25℃；相对离心力可以为500-5000g， 优选为1000-2000g，更优选为2000-3500g；离心时间可以为2-60min,优先为2-40min， 更优选为5-20min。

在上述技术方案中，在步骤(2)和步骤(3)中，所述分相的方式为静置分相，该分相温度可以为4-30℃，优选为10-25℃，更优选为12-17℃；静置时间为0.1-4h，优选为 0.3-3h，更优选为0.5-2h。

在上述技术方案中，在步骤(3)中所述的有机溶剂B为正丙醇、正丁醇、叔丁醇或异丙醇中的一种，所述有机溶剂B的加入量为所述三相体系Ⅱ总质量的10％-50％，优选为15％-40％，更优选为25％-40％。

在上述技术方案中，在步骤(3)中，所述分相的方式为静置分相，该分相温度为4-30℃、 时间为0.25-2h。

本发明中，噬菌体裂解液可利用摇瓶和常规液体增殖的方法来培养噬菌体而获得。

本发明的方法的有益效果：

本发明的方法，通过两步盐析萃取将噬菌体分离纯化的多步操作集成，大大简化操作 步骤、缩短操作时间、提高噬菌体提取的总收率；相比现有工艺来说，省去多步超速离心、 阴离子交换和去内毒素的操作，可减少操作工序，降低生产成本，提高生产效率；采用本 发明的方法制备得到的噬菌体的纯度显著提高，而且本发明所用的有机溶剂均可回收后重 复使用，进一步降低了环境压力和成本；本发明的方法放大效应小，有良好的工业化应用 前景。采用本发明的方法所得噬菌体的回收率均高于70％，噬菌体相对于蛋白、细菌细胞 等悬浮物和内毒素等杂质的纯化倍数分别为19-44、12-18和4-5，浓缩倍数达350-420。

具体实施方式

下面结合具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发 明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。

以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。

1.噬菌体phiKpS2粗裂解液的制备：

所用的宿主是肺炎克雷伯杆菌S2(Klebsiella pneumoniae,简称KpS2，保藏号CGMCC 2028)，其噬菌体phiKpS2(Gene bank登录号：KX587949)属于有尾烈性噬菌体。噬菌体 粗裂解液是以常规方法制备得到的含有噬菌体、宿主细胞、杂蛋白、核酸、内毒素和细胞碎片等的混合液。

噬菌体粗裂解液的制备方法：将采用LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl)、摇瓶培养5-6h后的肺炎克雷伯杆菌S2与噬菌体phiKpS2按一定比例混合， 在37℃、200rpm的条件下摇瓶培养得到，通过调整感染复数(MOI)或共培养的时间，得 到含有不同效价的噬菌体粗裂解液，其中噬菌体的效价、蛋白浓度、细菌含量和内毒素含 量分别为10⁶-10¹¹pfu/mL、4-800μg/mL、10⁴-10⁶cfu/mL、1.2×10⁴-1.4×10⁵EU/mL。

2.分析方法

(1)噬菌体效价测定方法：

噬菌体效价(Plaque Form Unit)即单位体积样品中噬菌体的数量，采用单层琼脂平板 法(spot)测定。向制备好的单层LB固体培养基中加入1mL对数期宿主菌菌悬液，使菌悬液均匀平铺在固体培养基上，吸走多余的菌液，晾干。将噬菌体样品(噬菌体粗裂解液)梯度稀释(10^-1-10^-10)，每个稀释梯度取5μL滴在上述平板上，待晾干后，将平板倒置于 37℃培养箱过夜培养，统计形成的空斑个数，根据公式计算噬菌体效价，每个样品三个平 行。

噬菌体效价(pfu/mL)＝噬菌体空斑个数×样品稀释倍数×200

注：200为取样量折算数。

(2)细菌等悬浮物的测定采用分光光度法，650nm下测定浊度。蛋白测定采用改良型 BCA蛋白浓度测定试剂盒(C503051-0500，生工生物工程(上海)股份有限公司)，内毒素测定采用内毒素检测鲎试剂盒(EC80545S，厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)。

(3)细菌含量采用梯度稀释平板计数法。对噬菌体裂解液10800g离心10min获得的细菌沉淀进行两遍灭菌蒸馏水洗涤后，进行10^-1-10^-6梯度稀释，取200μL各梯度稀释样品在LB固体平板上涂布，37℃放置过夜，统计平板上的菌落数。

细菌浓度(cfu/mL)＝细菌菌落数×样品稀释倍数×5

实施例1噬菌体粗裂解液的制备

取-20℃保存的肺炎克雷伯杆菌KpS2，按照1％(v/v)的接种量接种于新鲜LB培养基 中，在37℃、200rpm条件下摇床培养5-6h后得对数期宿主菌(10⁸-10⁹cfu/mL)，与10⁹pfu/mL 的phiKpS2噬菌体悬液按一定感染复数(MOI，噬菌体数量/宿主细菌数量)混合，再加入新鲜LB培养基，侵染培养2.5-6h。这样可得到不同效价的噬菌体粗裂解液，如噬菌体效价为10⁶-10¹¹pfu/mL，总蛋白含量为400-800μg/mL，细菌浓度为10⁴-10⁶cfu/mL，内毒素浓度 为1.2×10⁴-1.4×10⁵EU/mL，pH7.2左右。

实施例2不同有机溶剂-磷酸氢二钾盐析萃取体系的分离效果

采用实施例1制得的噬菌体粗裂解液，噬菌体效价为10⁹pfu/mL，总蛋白含量为526μg/mL，OD₆₅₀＝0.462，细菌浓度为4×10⁵cfu/mL，内毒素浓度为1.2×10⁵EU/mL，pH7.3。 在16℃室温下，向盛有噬菌体粗裂解液的50mL离心管中分别加入占体系总质量5.0％、5.3％ 和19.7％的磷酸氢二钾，温和涡旋混合使得盐完全溶解，分别加入占体系总质量47.3％的乙酸丁酯、44.4％的甲基叔丁基醚和35.7％的乙醇，分别形成A、B和C三种有机溶剂-磷酸氢二钾盐析萃取体系，通过2000g离心10min加速成相。分别取上、下相各200μL，并取出 全部凝集中间相用灭菌蒸馏水稀释混匀，测定各相噬菌体效价、蛋白浓度和内毒素含量， 下相噬菌体的收率以及杂质去除率的结果见表1。

表1.不同有机溶剂和盐体系对萃取所得噬菌体分离效果的影响

注：K是分配系数，即噬菌体在上下两相之间的效价之比。

在18℃室温下，按照实施例1方法制得噬菌体粗裂解液(噬菌体效价1.2×10¹⁰pfu/mL， 蛋白浓度548μg/mL，OD₆₅₀＝0.458)，向噬菌体粗裂解液中分别加入占体系质量13％、10％ 和11％的磷酸氢二钾，温和涡旋混合使得盐完全溶解之后，分别加入体系质量分数为28％ 正丙醇、30％叔丁醇、30％正丁醇形成D、E和F三种不同的醇-盐萃取体系。噬菌体回收率和蛋白以及内毒素的清除率见表1。

由表1可知，有机溶剂/磷酸氢二钾盐析萃取体系将噬菌体萃取至下相(1/K≥1.0)，有 机溶剂种类对噬菌体活性影响差异较大，如噬菌体phiKpS2对乙酸丁酯、甲基叔丁基醚和 乙醇敏感性较高，不适合用作盐析萃取分离的萃取剂。而正丙醇、正丁醇和叔丁醇对噬菌 体的回收效果良好，其中正丙醇-K₂HPO₄体系的噬菌体回收和内毒素除杂效果都较优，在 得到73.91％噬菌体回收率的同时可以去除29.97％的杂蛋白和99.81％的内毒素。从内毒素 去除和噬菌体回收的角度来考虑，优选正丙醇-磷酸氢二钾体系。

实施例3不同有机溶剂-柠檬酸钠盐析萃取体系的分离效果

在20℃条件下，按照实施例2的方法步骤，向噬菌体粗裂解液中分别加入占体系质量 7.5％和20％的柠檬酸钠，温和涡旋混合使得盐完全溶解之后，分别加入体系质量分数为47.5％乙酸乙酯和29.4％正癸醇形成两种不同的盐析萃取体系。分相后下相噬菌体收率及蛋 白和内毒素的去除率如表2所示。

表2.不同有机溶剂-柠檬酸钠盐析萃取体系的分离效果

由表2可知，正癸醇和乙酸乙酯对噬菌体的回收效果均较好，回收率高于70％，同时 蛋白和细胞悬浮物的除杂效果也较好，但从回收率来看，优选乙酸乙酯-柠檬酸钠体系。

实施例4不同盐含量对噬菌体盐析萃取的影响

在21℃条件下，按照实施例2中步骤和方法进行，向噬菌体裂解液中加入不同质量含 量的柠檬酸钠盐，通过滴加浓盐酸(36％，w/w)或氢氧化钠溶液(1mol/L)来调节盐混合溶液的pH值为裂解液初始值7.3，随后加入46％的乙酸乙酯，然后1250g离心10min，辅 助成相。测定下相溶液的噬菌体效价、蛋白浓度、细菌等悬浮物浊度OD₆₅₀，计算噬菌体的 收率、杂蛋白和细菌的去除率。

表3.柠檬酸钠盐含量所得噬菌体的分离纯化效果

从表3可以看出，柠檬酸钠含量对噬菌体的分布影响较大，当柠檬酸钠含量为10％时 噬菌体的收率高达99.87％，此时杂蛋白和细胞等悬浮物去除率也是最高的。噬菌体相对杂 蛋白的纯化倍数为2-2.5，相对细菌等悬浮物的纯化倍数为2.5-3.5。

实施例5有机溶剂含量对噬菌体盐析萃取的影响。

在24℃条件下，参照实施例4中的最优条件，向噬菌体裂解液中加入总体系质量10％ 的柠檬酸钠，所得盐混合溶液pH值为7.78，随后加入不同质量百分比的乙酸乙酯，2000g 离心15min，辅助成相，噬菌体回收率、杂蛋白和细菌的去除率见表4。

表4.有机溶剂含量对噬菌体分离纯化效果的影响

从表4可看出，10％-47％范围内乙酸乙酯含量对盐析萃取噬菌体的影响较小，噬菌体 回收率较高，10％-30％的浓度范围适合噬菌体的回收，收率高于95％。较高的乙酸乙酯浓 度(47％)对噬菌体回收、杂蛋白和细菌去除都不利。

实施例6pH对盐析萃取噬菌体的影响

在23℃下，按照实施例2中步骤和方法进行，向噬菌体裂解液中加入体系总质量10％ 的柠檬酸钠，通过浓盐酸(36％，w/w)和1mol/L的氢氧化钠调节至不同的pH值，加入体系总质量30％的乙酸乙酯，500g离心5min，辅助成相。测定下相溶液的噬菌体效价、蛋 白浓度、细菌等悬浮物浊度OD₆₅₀，计算噬菌体的收率、杂蛋白和细菌的去除率，结果见表 5。

表5.pH对噬菌体盐析萃取效果的影响

从表5可以看出，在pH 6.5-9.6范围内，下相的噬菌体收率、杂蛋白和细胞等悬浮物去 除率比较理想。

实施例7第二步盐析萃取体系中有机溶剂的选择

在28℃条件下，参照实施例6中的最优体系，在进行乙酸乙酯-柠檬酸钠盐析萃取后， 用移液枪取出全部下相溶液，放入灭菌的50mL离心管中，再分别加入体系总质量31％、30％和35％的正丙醇、叔丁醇和异丙醇，室温下温和涡旋混匀2min，2000g离心15min， 进行第二步盐析萃取。取出全部凝集中间相用灭菌蒸馏水稀释混匀，测定噬菌体效价、蛋 白浓度和细菌等悬浮物浊度OD₆₅₀，计算噬菌体的收率、杂蛋白和细菌的去除率，如表6所 示。

表6.第二步盐析萃取噬菌体的分离纯化效果

由表6可知，正丙醇、叔丁醇和异丙醇均能使噬菌体以凝集物的形态分配到中间相， 回收率可达到75％以上，同时能除去80％以上的蛋白和95％以上的细菌等悬浮物。就蛋白 除杂率来看，优选正丙醇作为第二步盐析萃取的萃取剂。

实施例8第二步盐析萃取中正丙醇含量的影响

在27℃下，参照实施例7中的方法，保持第一步盐析萃取中柠檬酸钠和乙酸乙酯含量 以及pH不变，改变第二步盐析萃取体系中正丙醇的质量百分比，分相后取样测定中间相凝 集物的噬菌体效价、蛋白浓度、细菌等悬浮物浊度OD₆₅₀，计算噬菌体的收率、杂蛋白和细菌的去除率，结果如表7所示。

表7.第二步盐析萃取中正丙醇含量对噬菌体分离纯化的影响

从表7可以看出，用优选的30％乙酸乙酯(w/w)/10％柠檬酸钠(w/w)/60％噬菌体粗 裂解液(w/w)进行第一步盐析萃取后，在下相富含噬菌体溶液中加入26％～34％的正丙醇 进行第二步盐析萃取，当正丙醇浓度为31％时，中相噬菌体的收率最高(76.68％)，杂蛋白 和细菌去除率均达到96％，噬菌体相对于蛋白和细菌的纯化倍数分别为19.3和18.04。

实施例9噬菌体裂解液初始效价的影响

按照实施例1的方法进行噬菌体制备，改变感染复数(MOI)，得到一系列不同初始效 价的噬菌体粗裂解液。随后，按照实施例8的步骤和方法进行两步盐析萃取，第二步盐析萃取体系中正丙醇浓度为31％。噬菌体收率如表8所示。

表8.噬菌体初始效价对两步盐析萃取的影响

从表8可看出，噬菌体粗裂解液的初始效价对两步盐析萃取的回收有显著影响，随着 效价提高噬菌体收率增加，优选初始效价范围为10⁷-10¹⁰pfu/mL。

实施例10两步盐析萃取噬菌体

1.噬菌体粗裂解液制备：方法如实施例1，所得噬菌体效价为2.62×10¹⁰pfu/mL，蛋白 浓度为478μg/mL，细菌等悬浮物OD₆₅₀＝0.453，细菌浓度为4×10⁵cfu/mL，内毒素含量为1.4×10⁵EU/mL。

2.乙酸乙酯-柠檬酸钠第一步盐析萃取噬菌体，下相溶液加入正丙醇进行第二步盐析萃 取，步骤如下：

(1)在21℃室温条件下，取1g柠檬酸钠溶于6g噬菌体粗裂解液中，温和涡旋振荡1min至充分溶解，得到柠檬酸钠混合溶液，pH为7.78；

(2)向步骤(1)所得盐混合溶液中加入3g乙酸乙酯，温和涡旋振荡2min至充分混合，然后在15℃、2000g下离心10min以辅助分相，形成富含乙酸乙酯的上相溶液、凝集 物中间相以及富含盐和噬菌体的下相溶液组成的三相体系Ⅰ，将三相进行分离；

(3)向步骤(2)所得三相体系Ⅰ的下相溶液中补加3g正丙醇，温和涡旋振荡2min 至充分混合，然后在15℃、2000g下离心10min以辅助分相，形成富含正丙醇的上相溶液、 富含噬菌体的凝集中间相以及富含盐的下相溶液组成的三相体系Ⅱ，将三相进行分离；

(4)向步骤(3)中所得富含噬菌体中间相凝集物中加入1mL灭菌蒸馏水制成噬菌体悬浮液。

分别取样测定上述步骤(2)所得下相和(4)所得中间相噬菌体悬液的噬菌体效价、蛋白浓度、OD₆₅₀和内毒素含量，计算噬菌体收率以及蛋白、细菌等悬浮物和内毒素的去除率，结果见表9所示。

表9.两步盐析萃取噬菌体的分离纯化效果

从表9可看出，第一步盐析萃取可将99.87％的噬菌体分配至下相，杂蛋白、细菌等悬 浮物和内毒素的去除率分别达到68.53％、81.98％和10.61％；通过第二步盐析萃取可将 76.78％的噬菌体集中到中间相，同时去除87.38％的杂蛋白、76.42％的细菌等悬浮物和 81.35％的内毒素。两步盐析萃取可以回收76.68％的噬菌体，去除96.03％的杂蛋白、95.75％ 的细菌等悬浮物和83.33％的内毒素，噬菌体相对于杂蛋白、细菌和内毒素的纯化倍数分别 是19.31、18.04和5.19倍，同时相对于粗裂解液噬菌体浓缩了416倍。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是本发明并不限于此。在本发明的技术构 思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的 合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发 明的保护范围。

Claims (7)

1.一种两步盐析萃取分离噬菌体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）制备含有噬菌体裂解液和可溶性盐的混合溶液；

（2）将步骤（1）所得混合溶液与有机溶剂A混合，分相得到富含有机溶剂A的上相溶液、凝集中间相以及富含盐和噬菌体的下相组成的三相体系I；

（3）将步骤（2）所得下相与有机溶剂B混合，分相得到富含有机溶剂B的上相溶液、富含噬菌体的凝集中间相以及富含盐、杂蛋白和内毒素的下相组成的三相体系II；

在步骤（1）中，所述可溶性盐为柠檬酸钠；

在步骤（2）中，所述有机溶剂A为乙酸乙酯、正癸醇中的一种；

在步骤（3）中，所述有机溶剂B为正丙醇、正丁醇、叔丁醇或异丙醇中的一种；

所述噬菌体为Gene bank登录号为KX587949的噬菌体phiKpS2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述噬菌体裂解液中噬菌体效价为10⁶-10¹¹ pfu/mL、总蛋白浓度为400μg/mL -800 μg/mL、细菌浓度为10⁴-10⁶ cfu/mL、内毒素浓度为1.2×10⁴-1.4×10⁵ EU/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述可溶性盐的加入量为所述三相体系I总质量的3%-20%。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述噬菌体裂解液是噬菌体侵染宿主菌后进行共培养而获得的。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述有机溶剂A的加入量为所述三相体系I总质量的10%-47%。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述有机溶剂B的加入量为所述三相体系II总质量的10%-50%。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）和（3）中，所述分相的方式为离心分相或静置分相，在所述离心分相中，分相温度为0℃-40℃、相对离心力为500 g -5000g、时间为2 min -60 min，在所述静置分相中，分相温度为4℃-30℃、时间为0.25 h -2 h。