CN103288953B - 一种血浆中功能性蛋白质的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种血浆中功能性蛋白质的分离纯化方法，向血浆溶液中添加可溶性无机盐和亲水性有机溶剂，形成双水相萃取体系，得富含血浆功能性蛋白的上相萃取液；萃取液再经疏水层析和离子交换层析进一步分离纯化后，得到电泳纯度高于95%的血浆功能性蛋白。本发明简化了血浆功能性蛋白的纯化步骤，有机溶剂/盐双水相萃取具有溶剂回收方便、成本低、分相时间短、无须反萃取操作、能够选择性去除血浆中葡萄糖以及部分蛋白杂质；萃取液直接利用疏水层析和离子交换层析分离纯化，避免了脱盐的繁琐步骤，大幅提高血浆功能性蛋白质的分离纯化效果。本发明解决了制约血浆蛋白中功能性蛋白质分离纯化中分离步骤繁琐、成本高、纯度低等问题。

Description

一种血浆中功能性蛋白质的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种蛋白质的分离纯化方法，尤其涉及一种分离纯化血浆中功能性蛋白质的方法。

背景技术

血浆由90%的水、7%的蛋白以及3%的糖类有机物组成，这7%的蛋白包含了数百个具有广泛生理功能的蛋白质，使得血浆成为了大多治疗产品或生物药物的分馏产品的原材料，从血浆中分离提取得到的功能性蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子类（纤维蛋白、原凝血因子VIII）、蛋白抑制剂类等品种。其中白蛋白含量最高，占其总量的一半以上，为单链、非糖基化蛋白，主要参与维持渗透压、运输物质脂肪酸及协助人体解毒等功能。白蛋白的血液制品是目前应用最为广泛的血浆蛋白制品，临床上主要用于失血性休克、低蛋白血症等疾病的治疗。免疫球蛋白在血液中的丰富程度仅次于白蛋白，达到了蛋白总量的15%，以免疫球蛋白G最为重要，主要参与高等生物的体液免疫，保护机体免受病原体等抗原的侵害，在体内，免疫球蛋白具有与病原体或毒素结合，活化补体，强化吞噬杀伤效应，产生过敏反应及减缓器官移植中的排斥反应等生物学功能，是人和动物体内抗感染的主力效应分子，并具有治疗癫痫症、抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞早期凋亡的作用，应用领域十分广泛。

表1.一些主要人血浆功能性蛋白质

目前，血浆中功能性蛋白质的分离纯化方法主要采用Cohn氏低温乙醇沉淀法，该方法在二战期间有Cohn等人发明，随后由Kistler和Nitschmann等人进行改进，该方法主要通过在低温条件下（-7-5℃），向血清中分步添加不同浓度（8-25%）的乙醇，使IgG、白蛋白等分步沉淀，再用离心的方法收集血浆蛋白中的功能性蛋白质。该方法具有易于工业化的优点，但在实际应用中也存在着诸多的问题，首先，该方法需要在低温环境下操作，并且需要对温度控制的精度要求较高、设备投入大，能耗大；其次，该方法操作步骤繁琐、收率低、纯度低，需要多步沉淀和离心，造成血浆蛋白中功能蛋白质的大量损失。研究表明，仅IgG的损失就达到50%，经过该方法分离得到的血浆功能性蛋白质的纯度也无法满足临床的需要。近年来许多研究者尝试新的分离方法，中国专利授权公开号CN1281617C公开了一种采用压滤工艺分离血浆蛋白的方法，可以提高血浆蛋白的收率，但仍需采用分步沉淀的方法，且未提及用该方法获得的血浆蛋白纯度。中国专利授权公告号CN1259338C公开了一种可在密封的管道内进行血浆蛋白分离方法，该方法对Cohn法进行了改进，采用压滤替代Cohn法中固液分离部分的离心操作，生产周期可以缩短一半，但仍然未克服Cohn法存在的问题。WO9805685A1公开了一种采用大孔阴离子交换介质纯化血浆中功能性蛋白质的方法，可以避免多步沉淀和离心，但IgG的纯度只有36-66%。中国专利授权公告号CN1089609C公开了一种采用亲和层析获得高纯度IgG的方法，但亲和介质的高成本，限制着该方法的应用。

血浆蛋白成分复杂，而且存在着HIV、HBV等病毒的残留，使血浆功能性蛋白质对使用者的健康存在潜在的威胁，迫切需要发现成本低、操作简便、收率高的高纯度血浆功能性蛋白质的制备方法。

双水相萃取技术出现于20世纪60年代，最早的研究是基于两种聚合物或一种聚合物与一种盐，如聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐，在一定浓度下的分子空间阻碍作用，而形成不互溶的两水相。Vargas等发现由聚乙二醇/磷酸钾、氯化钠组成的双水相体系可以分离IgG和白蛋白（Biotechnology progress,2012,28,1005-1011)，但该方法中水溶性高聚物黏度大，需要反萃取，后续分离步骤繁琐,而且价格昂贵的高聚物回收困难，分离成本高昂（食品工业科技，2007，28，235～238）。WO2013039449公开了一种使用EOPO聚合物分相后采用多元酸聚合物沉淀的血浆蛋白的方法，可以在常温下分离血浆功能性蛋白质，但依然存在成本高、步骤繁琐等缺点。由亲水性有机溶剂和盐形成的双水相，可以萃取金属络合物，中药有效成分和低分子二元醇等（天然产物研究与开发，2002，21(3):75～77；《分析测试学报》，2006，18，647～649；CN101012151A；CN101012152A），是一种新的提取分离方法。本申请的部分发明人提交过两件中国发明专利申请（CN101481403和CN102070714A），用这种双水相体系萃取酵母发酵液中重组人血清白蛋白。但与酵母发酵液相比，血浆不仅形状差别大，而且其中蛋白质的种类、含量也差别巨大。如何从血浆中快速、有效地分离纯化获得高纯度功能性蛋白质，成为目前研究的重点及难点。

发明内容

本发明提供了一种操作简单、低成本、纯度高的血浆中功能性蛋白质的方法，使用亲水性有机溶剂和无机盐形成的双水相体系对血浆功能性蛋白质萃取时，能够大幅度简化操作步骤、提高收率，而含血浆功能性蛋白质的双水相萃取液，采用和现有技术不同的柱层析手段，可以得到高纯度的血浆功能性蛋白质。

本发明的技术方案为如下。

一种血浆中功能性蛋白质的分离纯化方法，包括如下步骤：

（1）向血浆溶液中添加可溶性无机盐Ⅰ和亲水性有机溶剂，搅拌均匀，形成双水相萃取体系，静置后，收集上相萃取液；

（2）步骤（1）的上相萃取液经蒸馏回收溶剂后，过Phenyl Sepharose6FF^TM疏水层析柱，先用平衡液Ⅰ洗脱至无蛋白流出，再用洗脱液Ⅰ梯度洗脱，收集功能性血浆蛋白馏分；

（3）步骤（2）的功能性血浆蛋白馏分经透析得蛋白样品溶液，过Q SephroseFF或DEAE Sephrose FF离子交换层析柱，先用平衡液Ⅱ洗脱至无蛋白流出，再用洗脱液Ⅱ梯度洗脱，得高纯度血浆功能性蛋白；

其中所述可溶性无机盐Ⅰ为磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、卤化物、柠檬酸盐中的一种或两种以上的混合物；所述亲水性有机溶剂为乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、异丁醇、乙二醇或丙酮中的一种；所述平衡液Ⅰ含有0.2～3mol/L可溶性无机盐Ⅱ和5～50mmol/L缓冲液；所述洗脱液Ⅰ含有0～1mol/L可溶性无机盐Ⅱ和5～50mmol/L缓冲液；所述平衡液Ⅱ含有5～50mmol/L缓冲液；所述洗脱液Ⅱ含有0～1mol/L可溶性无机盐Ⅱ和5～50mmol/L缓冲液；所述可溶性无机盐Ⅱ为磷酸氢二钾、柠檬酸钠、氯化钠中的一种或两种以上的混合物；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种。

在上述技术方案中，步骤（1）的双水相萃取体系，静置后，分层为上相和下相，其中上相萃取液中富含血浆功能性蛋白质，主要为白蛋白和免疫球蛋白（IgG）。本发明的双水相萃取体系的萃取方式可以采用单级萃取，但蛋白质回收率低于80%的萃取体系采用多级萃取。

在上述技术方案中，所述血浆溶液为血液经过离心去除血细胞的上清液、或是采用Cohn法部分纯化的馏分；可溶性无机盐Ⅰ或可溶性无机盐Ⅱ可以为固体的或浓盐溶液。

本发明步骤（1）中所述可溶性无机盐Ⅰ占双水相体系质量的1%～45%，优选5%～35%,更优选15%～25%。

本发明步骤（1）中所述亲水性有机溶剂占双水相体系质量的3%～50%，优选5%～40%,更优选12%～25%。

本发明步骤（1）中所述可溶性无机盐Ⅰ为磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾中的一种或两种以上以任意比例的混合物，优选磷酸氢二钾、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠中的一种或两种以上以任意比例的混合物。

本发明步骤（1）中所述双水相萃取体系的静置的时间为0.5～36小时，优选0.8～8小时，更优选1～4小时；双水相体系的温度为0～37℃，优选2～30℃，更优选4～25℃；双水相体系的pH值为3～13，优选5～10,更优选7～9。

本发明步骤（2）所述蒸馏的温度为20～45℃，蒸馏至上相萃取液中有机溶剂含量低于20%。

本发明步骤（2）中回收有机溶剂的上层萃取液，加入可溶性无机盐Ⅱ，其在萃取液中的终浓度为0.3～4.0mol/L，优选0.4～3mol/L,更优选0.5～2mol/L;调pH至5.5～9.0，然后添加到疏水层析柱中进行分离。

本发明步骤（2）中所述平衡液Ⅰ或洗脱液Ⅰ的pH值为5.5～9.0；在步骤（3）中平衡液Ⅱ或洗脱液Ⅱ的pH值为5.5～9.0。

用本发明的方法从血浆中分离得到的血浆功能性蛋白，尤其是白蛋白和免疫球蛋白，其蛋白电泳纯度高于95.0%，与标准品相比较，其蛋白活性为95%以上，其蛋白结构无变化。

本发明向血浆溶液中添加可溶性无机盐和亲水性有机溶剂并充分搅拌，通过调节盐、亲水性有机溶剂的种类和比例，以及体系的pH值使溶液形成双水相，选择性去除血浆中葡萄糖以及部分蛋白杂质，提高血浆功能性蛋白的萃取效率。用有机溶剂/盐双水相萃取体系回收的血浆功能性蛋白，根据萃取后上相富含盐的特点，选用疏水层析进行纯化实验，避免了脱盐的繁琐步骤；疏水层析后可得到的血浆功能性蛋白馏分，利用血浆功能性蛋白的等电点差异，选用离子交换进行分离，可得到高纯度的血浆功能性蛋白，整个层析过程具有处理量大，成本低等优点。

本发明的有益效果：本发明简化了血浆功能性蛋白的纯化步骤，有机溶剂/盐双水相萃取具有溶剂回收方便、成本低、分相时间短、无须反萃取操作、能够选择性去除血浆中葡萄糖以及部分蛋白杂质、易于从实验室规模到工业生产放大等优点，血浆功能性蛋白质的分离无需低温环境和多步离心操作。分离后的血浆蛋白溶液经柱层析纯化后血浆功能性蛋白质的电泳纯度大于95.0%。本发明，解决了制约血浆蛋白中功能性蛋白质分离纯化中分离步骤繁琐、成本高、纯度低等问题。

附图说明

图1.实施例1的方法分离、纯化的人血浆功能性蛋白IgG和白蛋白的非还原SDS-PAGE电泳图；

图2.实施例1的方法分离、纯化的人血浆功能性蛋白IgG和IgG标准品的荧光光谱图；

图3.在磷酸氢二钾-乙醇双水相体系中，乙醇、磷酸氢二钾浓度对IgG萃取收率的影响；

图4.在柠檬酸钠-乙醇双水相体系中，乙醇、柠檬酸钠浓度对IgG萃取收率的影响；

图5.在碳酸钠-乙醇双水相体系中，乙醇、碳酸钠浓度对IgG萃取收率的影响；

图6.在碳酸钠-乙醇、磷酸氢二钾-乙醇双水相体系中，静置时间对IgG萃取收率的影响。

具体实施方式

下述实施例仅用于详细说明本发明的血浆功能性蛋白质发酵液的分离方法，不应理解为对本发明的限制。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学试剂公司购买。所用化学试剂均为分析纯。

材料和仪器：

新鲜猪血购自大连棒棰岛股份有限公司肉联厂、人血浆由大连医科大学附属第二医院提供。人血清白蛋白、IgG标准品分别购自上海生物制品研究所和美国Equitech Bio公司。葡萄糖含量检测试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司。仪器：酶标仪为瑞士Tecan公司Sunrise16039400，荧光分光光度计为美国瓦里安Cary Eclipse FL0812M018。Phenyl Sepharose6FF^TM、Q Sephrose FF^TM、DEAESephrose FF^TM为GE healthcare life Science公司产品。

实验方法：

蛋白浓度和回收率分析：

采用Bradford法测定血浆样品中总蛋白含量及上相萃取相中总蛋白含量，血液样品中功能性蛋白质的浓度按照如下公式计算：

功能性蛋白的浓度（mg/ml)=样品中功能性蛋白的百分含量（%）×样品的总蛋白含量(mg/ml)；其中样品中功能蛋白的百分含量为：样品用还原SDS-PAGE电泳胶分离后，使用Genetools扫描，面积积分后计算而得。

可溶性无机盐/有机溶剂的双水相萃取功能性蛋白质的回收率按照如下方法计算：

功能性蛋白质回收率（%）=（上相萃取相中功能性蛋白质浓度（mg/ml)×上相萃取相体积（ml））/(血浆溶液中功能蛋白质浓度(mg/ml)×体积（ml））

电泳方法

还原SDS-PAGE电泳和非还原SDS-PAGE电泳方法采用生物工程实验手册的方法，（化学工业出版社，p23-35），分离胶浓度为8%和12%，浓缩胶浓度为3%。

IgG活性分析

采用ELISA法测定(食品与生物技术学报，2006,25,97-101）。

IgG的结构分析

采用荧光光谱法测定，光程为1cm激发波长：280nm；发射波长：295nm～400nm。激发光狭缝：5nm；发射光狭缝：5nm；每个样品扫描三次，并和标准品对比。

葡萄糖去除率测定方法

采用葡萄糖氧化酶法，使用试剂盒测定原液和双水相萃取的样品中葡萄糖的含量，按照下列公式计算去除率：

葡萄糖去除率（%）=（1-（上相萃取相中葡糖糖浓度（mM)×上相萃取相体积（ml)/(原液中葡萄糖浓度（mM）×原液体积（ml））×100%。

实施例1 人血浆功能性蛋白质的纯化

（1）双水相固液分离处理

配制40%K₂HPO₄溶液，用磷酸调pH7.0，在室温（24℃）下，依次称取2.5gpH7.0的40%K₂HPO₄溶液、0.8g水、1.0g人血浆、0.7g乙醇，搅拌混匀，在4℃静置2小时，形成双水相，收集上相萃取液，蛋白浓度分析显示，上相萃取液中富含IgG和白蛋白，收率分别为81.18%和87.61%。

（2）疏水层析纯化

将步骤（1）的上层萃取液调pH6.0后，进行减压蒸馏回收乙醇，蒸馏温度为37℃，蒸馏时间为30min，上层萃取液中乙醇含量低于10%。

将Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水介质装入XK16/20柱内，柱床体积为5ml，用2倍柱床体积的平衡液Ⅰ平衡色谱柱，平衡液Ⅰ为0.5mol/L柠檬酸钠的20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0。

取10ml回收乙醇后的上相萃取液，添加1.47g柠檬酸钠使溶液中柠檬酸钠终浓度为0.5mol/L，用HCl调pH7.0，使溶液的电导和pH值与平衡液Ⅰ相近，用0.45μm孔径的超滤膜过膜，得上样样品溶液。将上样样品溶液以2ml/min的流速流入用平衡液Ⅰ平衡好的Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水层析柱进行上样。上样结束后，用2倍柱床体积的平衡液Ⅰ洗脱未结合组分。然后用洗脱液Ⅰ梯度洗脱，所述洗脱液Ⅰ为柠檬酸钠-磷酸钠缓冲液，由如下梯度依次洗脱：首先2倍柱体积的0.175mol/L的柠檬酸钠-20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗脱，弃洗脱液（除去杂蛋白）；接着用2倍柱体积的0.075mol/L的柠檬酸钠-20mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0)和2倍柱体积的20mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）分步洗脱，根据280nm检测收集各部分洗脱峰，超滤浓缩后电泳检测，含有白蛋白和IgG的馏分合并、备用。

（3）阴离子交换层析纯化

将Q Sepharose FF^TM阴离子交换介质装入XK16/20柱内，柱床体积为2ml，用2倍柱床体积的平衡液Ⅱ平衡色谱柱，平衡液Ⅱ为20mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5。将在步骤(2)得到的白蛋白和IgG混合馏分用平衡液Ⅱ透析除盐，得白蛋白和IgG混合透析馏分1ml,将其流入平衡好的Q Sepharose FF^TM阴离子交换柱进行上样。上样结束后，用2倍柱床体积的平衡液Ⅱ洗脱未结合组分。上样结束后，用2倍柱床体积的平衡液Ⅱ洗脱未结合组分，然后使用二元梯度***洗脱，洗脱液A为含1mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5，洗脱液B为20mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5，洗脱梯度为0%洗脱液A-50%洗脱液A，洗脱时间为50min，流速为0.5ml/min。根据280nm检测收集各洗脱峰，电泳检测结果表明，通过阴离子交换层析可得到白蛋白和IgG单一成分。

纯化后IgG和白蛋白分析：

ⅰ.纯度分析：

收集阴离子交换层析得到的IgG和白蛋白馏分，分别用截留分子量为10,000的超滤管浓缩至250μl，得纯化IgG样品和纯化白蛋白样品，采用8%的非还原SDS-PAGE进行分析，上样量10μg，考马斯亮蓝染色后呈单带，Gene-Tools软件分析，纯化IgG和纯化白蛋白的纯度均大于99.0%。分离后样品的电泳图如图1所示。

ⅱ.IgG的活性和结构分析：

将纯化IgG样品和人IgG标准品均配置包被量为700ng，ELISA法测定活性，纯化IgG样品的活性为标准品的96.4%。

将纯化IgG样品和IgG的标准品进行荧光光谱测定，荧光光谱图如图2所示，两者光谱重合，表明用本发明的方法分离纯化的IgG的结构未发生变化。

实施例2 猪血浆功能性蛋白质的分离纯化

（1）双水相固液分离处理

在室温（24℃）下，取新鲜的猪血液1,000ml，3000r/min，15min离心两次，去除血细胞，取上清，0.9%生理盐水等体积稀释，得到猪血浆溶液。称取20gK₂HPO₄溶解于46g水中，缓慢加入20g血浆、14g乙醇，充分搅拌，测定体系的pH值为9.6。室温静置2小时，形成双水相，收集上相萃取液，蛋白浓度分析显示，上相萃取液中富含IgG和白蛋白，收率分别为95.7%和93.0%。

（2）疏水层析纯化

将步骤（1）的上层萃取液调pH7.0后，进行减压蒸馏回收乙醇，蒸馏温度为30℃，蒸馏时间为40min，上层萃取液中乙醇含量低于10%。

将Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水介质装入XK16/20柱内，柱床体积为5ml，用2倍柱床体积的平衡液Ⅰ平衡色谱柱，平衡液Ⅰ为0.5mol/L磷酸氢二钾-20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0。

将回收乙醇后的上相萃取液中添加1mol/L的磷酸氢二钾溶液至溶液中磷酸氢二钾的终浓度为0.5mol/L，用HCl调pH7.0。以2ml/min的流速流入用平衡液Ⅰ平衡好的Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水柱进行上样。上样结束后，用2倍柱床体积的平衡液Ⅰ洗脱未结合组分。然后用洗脱液Ⅰ梯度洗脱，所述洗脱液Ⅰ为磷酸氢二钾-磷酸钠缓冲液（pH7.0），由如下梯度依次洗脱：首先用4倍柱体积的0.4mol/L的磷酸氢二钾-20mmol/L磷酸钠缓冲液洗脱，弃洗脱液，接着分别用2倍柱体积的0.25mol/L的磷酸氢二钾-20mmol/L磷酸钠缓冲液(洗脱液A)，0.1mol/L的磷酸氢二钾-20mmol/L磷酸钠缓冲液（洗脱液B）和20mmol/L磷酸钠缓冲液（洗脱液C）依次洗脱，根据280nm检测收集各部分洗脱峰，超滤浓缩后电泳检测，含有白蛋白和IgG的馏分合并、备用。

在上述步骤（2）的另一具体实施方式中，当平衡液Ⅰ中含有0.1mol/L磷酸氢二钾、0.9mol/柠檬酸钠，或者0.9mol/L柠檬酸钠、0.05mol/L NaCl，或者0.3mol/L柠檬酸钠、0.3mol/L磷酸氢二钾的10mmol磷酸钠的缓冲液时，也可以利用Phenyl Sepharose 6FF^TM疏水层析获得白蛋白和IgG的馏分；把疏水层析的缓冲液体系换成pH6.0的磷酸缓冲液、pH8.0的Tris-HCl缓冲液、pH7.5的巴比妥钠-盐酸缓冲液，也不影响获得IgG和白蛋白馏分。

（3）阴离子交换层析纯化

将DEAE Sepharose FF^TM阴离子交换介质装入XK16/20柱内，柱床体积为2ml，用2倍柱床体积的平衡液Ⅱ平衡色谱柱，平衡液Ⅱ为20mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8。将在步骤(2)得到的白蛋白和IgG混合馏分用平衡液Ⅱ透析除盐，得白蛋白和IgG透析馏分1ml,将其流入上述平衡好的DEAE Sepharose FF^TM阴离子交换柱进行上样。上样结束后，用2倍柱床体积的平衡液Ⅱ洗脱除去未结合组分，然后使用二元梯度***洗脱，洗脱液A为含1mol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl缓冲液，pH8.5，洗脱液B为20mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5，洗脱梯度为0%洗脱液A-50%洗脱液A，洗脱时间为50min，流速为0.5ml/min。根据280nm检测收集各洗脱峰，电泳检测结果表明，通过阴离子交换层析可得到白蛋白和IgG单一成分。

收集阴离子交换层析得到的IgG和白蛋白馏分，分别用截留分子量为10,000的超滤管浓缩至250μl，得纯化IgG样品和纯化白蛋白样品，采用12%的还原SDS-PAGE电泳分析，纯化IgG和纯化白蛋白的纯度分别为97.2%和95.8%，ELISA法测定纯化IgG的活性为标准品的95.2%。

在上述步骤（3）的另一具体实施方式中，当洗脱液A为含有氯化钠与柠檬酸钠浓度比8:2混合盐，或氯化钠与柠檬酸钠浓度比为1:1混合盐,或磷酸氢二钾和氯化钠浓度比9:1混合盐的30mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.5），以及将缓冲盐体系调整为40mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH9.5），10mmol/L的巴比妥钠-盐酸缓冲液（pH9.0）、20mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）时，IgG和白蛋白的电泳纯度也可以达到95%以上。

实施例3 有机溶剂、盐浓度对双水相萃取IgG收率的影响

选取不同浓度的磷酸氢二钾、柠檬酸钠和碳酸钠与不同浓度的乙醇以及适量水配比，形成双水相体系,体系的pH值为7.0，考察在不同的双水相体系中有机溶剂、盐浓度对人IgG萃取收率的影响。在所有体系中，IgG的添加量为1mg，静置时间为8小时，收集上相萃取液，Bradford法测定其中的蛋白含量，并计算IgG回收率（%）。

在磷酸氢二钾-乙醇体系中，乙醇的终浓度为14-16%（w/w)，磷酸氢二钾的浓度为18-24%(w/w)，温度为15°C；IgG回收率结果如图3所示。

在柠檬酸钠-乙醇体系中，乙醇的终浓度为22-25%（w/w)，柠檬酸钠的浓度为18-24%(w/w)，温度为30°C；IgG回收率结果如图4所示。

在碳酸钠-乙醇体系中，乙醇的终浓度为13-17%（w/w)，柠檬酸钠的浓度为12-21%(w/w)，温度为30°C；IgG回收率结果如图5所示。

由图3～5结果可知，由不同种类、不同浓度的盐和有机溶剂组成的双水相体系中，在适当范围的盐浓度和有机溶剂浓度的条件下，均能够得到较高的IgG收率，在本实施例的大多数双水相体系的IgG回收率在90%以上。其中，20%磷酸氢二钾-14%乙醇的体系的收率最高，回收率为97.4%。以上结果显示，本发明的有机溶剂/盐双水相体系能够得到较高的IgG萃取收率。

此外，还使用3%碳酸钠（w/w）-42%乙醇（w/w）和5%乙醇（w/w）-40%磷酸氢二钾的双水相体系萃取IgG，回收率分别为18.5%和21.5%，本发明的有机溶剂/盐双水相体系可以在较宽的盐、醇范围内萃取IgG。

实施例4 pH值对双水相萃取IgG收率的影响

按照实施例3的方法，配制3组磷酸氢二钾-乙醇双水相体系，其中乙醇终浓度为14%（w/w)，磷酸氢二钾终浓度为20%（w/w)，用磷酸将3组双水相体系的pH值分别调至7.0和8.0，未调pH（pH为9.6），以上三种pH的双水相体系中，萃取人IgG（加入量为1mg）的回收率分别为88.4%、92.1%和97.4%。

按照实施例3的方法，配制3组柠檬酸钠-乙醇双水相体系，其中乙醇终浓度为19%（w/w)，磷酸氢二钾终浓度为25%(w/w),用柠檬酸将3组双水相体系的pH值分别调至pH6.0和7.0，未调pH（pH为8.8），以上三种pH的双水相体系中，萃取人IgG（加入量为1mg）的回收率分别为69.4%、92.9%和90.2%。

以上结果显示，在相同的有机溶剂/盐双水相体系中，体系的pH值影响人IgG蛋白的萃取收率，但在适当的pH范围下能够得到较高的IgG萃取收率。

实施例5 有机溶剂/混合盐双水相萃取IgG。

称取适量磷酸氢二钾、氯化钠、水和乙醇混合均匀，形成混合盐-乙醇双水相体系，体系中乙醇终浓度为14%（w/w)，磷酸氢二钾终浓度为20%（w/w)，氯化钠浓度为2.5%。所述体系中加入1mg IgG，混合均匀，室温放置8h,收集上相萃取液，测得IgG回收率为93.9%。

称取适量碳酸钠、氯化钠、水和乙醇混合均匀，形成混合盐-乙醇双水相体系，体系中乙醇终浓度为13%（w/w)，碳酸钠终浓度为19%（w/w)，氯化钠浓度为2.5%。所述体系中加入1mg IgG，混合均匀，室温放置8h,收集上相萃取液，测得IgG回收率为81.5%。

以上结果显示，有机溶剂/混合盐双水相体系，在适当的盐浓度和有机溶剂浓度的范围内，能够得到较高的IgG萃取收率。

实施例6 静置时间对人IgG收率的影响

按照实施例3的方法，配制三种双水相体系，分别为：

磷酸氢二钾-乙醇体系1：体系中乙醇终浓度为14%（w/w)，磷酸氢二钾终浓度为20%（w/w)；

磷酸氢二钾-乙醇体系2：体系中乙醇终浓度为14%（w/w)，磷酸氢二钾终浓度为24%（w/w)；

碳酸钠-乙醇体系：体系中乙醇终浓度为13%（w/w)，碳酸钠终浓度为19%（w/w)。

上述三种体系中均加入1mg IgG，搅拌均匀后，在室温下静置2-24小时，收集上相萃取液，检测IgG含量，考察静置时间对IgG回收率的影响，如图6所示，磷酸氢二钾-乙醇的双水相体系中，静置时间影响IgG的萃取效率，但在适当的范围内仍保持较高的萃取效率。本发明中选择适当的双水相体系的静置时间，可以提高IgG的萃取效率。

实施例7 双水相萃取对血浆中葡萄糖的去除

按照实施例3的方法，配制磷酸氢二钾-乙醇双水相体系，体系中乙醇终浓度为14%（w/w)，磷酸氢二钾终浓度为20%（w/w)，调pH分别为7.0，8.0，未调pH组的pH为9.6。所述三个体系，总质量均为5g。

上述三个体系中加入1g猪血浆溶液（猪血浆溶液的获得方法同实施例2），搅拌均匀，在室温放置8h,收集上相萃取液，测定得到在三个体系中猪血浆葡萄糖去除率分别为51.8%，52.2%和52.6%，表明本发明中的双水相萃取方法在萃取血浆功能性蛋白质的同时，去除大量的杂质，减少后续分离纯化中杂质的除去负担。

本发明对血浆溶液使用有机溶剂/盐双水相萃取得到的萃取液，除去乙醇后，使用商品化的介质，以结合方式进行疏水和阴离子交换层析，可以得到纯度大于95%的白蛋白和IgG，双水相萃取可以除去血浆中葡萄糖等杂质。和已知文献相比，简化了纯化步骤，提高了纯化纯度，不仅缩短了纯化时间，而且提高了产品的质量。

尽管本发明为了详述实施例时，对实验条件进行了限定，但本领域的工作人员可以在不违反本发明精神的范围内选用不同的条件，或对实验方法和次序进行调整。

Claims (3)

1.一种血浆中白蛋白和IgG的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向血浆溶液中添加可溶性无机盐Ⅰ和亲水性有机溶剂，搅拌均匀，形成双水相萃取体系，静置后，收集上相萃取液；

(2)步骤(1)的上相萃取液经蒸馏回收溶剂后，加入可溶性无机盐Ⅱ，其在萃取液中的终浓度为0.3～4.0mol/L，调pH至5.5～9.0，过Phenyl Sepharose6FF^TM疏水层析柱，先用平衡液Ⅰ洗脱至无蛋白流出，再用洗脱液Ⅰ梯度洗脱，收集含有白蛋白和IgG的馏分；

(3)步骤(2)的含有白蛋白和IgG的馏分经透析得蛋白样品溶液，过QSephrose FF或DEAE Sephrose FF离子交换层析柱，先用平衡液Ⅱ洗脱至无蛋白流出，再用洗脱液Ⅱ梯度洗脱，得白蛋白和IgG的单一成分；

其中所述可溶性无机盐Ⅰ为磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、卤化物、柠檬酸盐中的一种或两种以上的混合物；所述亲水性有机溶剂为乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、异丁醇、乙二醇或丙酮中的一种；所述平衡液Ⅰ含有0.2～3mol/L可溶性无机盐Ⅱ和5～50mmol/L缓冲液；所述洗脱液Ⅰ含有0～1mol/L可溶性无机盐Ⅱ和5～50mmol/L缓冲液；所述平衡液Ⅱ含有5～50mmol/L缓冲液；所述洗脱液Ⅱ含有0～1mol/L可溶性无机盐Ⅱ和5～50mmol/L缓冲液；所述可溶性无机盐Ⅱ为磷酸氢二钾、柠檬酸钠、氯化钠中的一种或两种以上的混合物；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种；

所述的上相萃取液中富含血浆功能性蛋白质，主要为白蛋白和IgG；步骤(1)中所述可溶性无机盐Ⅰ占双水相体系质量的15％～25％，亲水性有机溶剂占双水相体系质量的12％～25％；

步骤(1)中所述静置的时间为0.5～36小时；双水相体系的温度为0～37℃；双水相体系的pH值为5～10；

步骤(2)中所述平衡液Ⅰ或洗脱液Ⅰ的pH值均为5.5～9.0；

步骤(3)中所述平衡液Ⅱ或洗脱液Ⅱ的pH值均为5.5～9.0。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述可溶性无机盐Ⅰ为磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾中的一种或两种以上的混合物。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述蒸馏的温度为20～45℃，蒸馏至有机溶剂含量低于20％。