CN106701824B - 基于人iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及一种安全可靠重编程获得人iPS细胞的方法、一种将iPS细胞简便快速高效诱导分化成为脊髓运动神经元的方法，以及一种经济有效的功能性脊髓运动神经元的获取方法及其应用。本发明以玻连蛋白为唯一生长介质，由携带重编程因子的仙台病毒感染人成纤维细胞，培养3周后获得无外源血清干扰的人iPS细胞；之后通过多种小分子化合物组合将人iPS细胞高效诱导分化成为脊髓运动神经元；进一步经星形胶质细胞条件培养基促成熟培养并在神经肌肉接头的形成中应用。本发明高效诱导获得的功能性脊髓运动神经元，可用于疾病表型的模拟和发病机制的探讨，为今后有效治疗药物的筛选提供理论依据；甚至将来可应用于疾病的细胞移植治疗。

Description

基于人iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及脊髓运动神经元的获取方法，尤其在于包括一种安全可靠重编程获得人iPS细胞的方法，一种将人iPS细胞简便快速高效诱导分化成为脊髓运动神经元的方法，还包括一种经济有效的功能性脊髓运动神经元的获取方法。
背景技术
脊髓运动神经元(motorneuron,MN)在中枢神经***支配骨骼肌的收缩运动中发挥桥梁纽带作用，控制着呼吸、吞咽等重要生命功能活动。也因为如此,脊髓运动神经元成为了不可治的运动神经元病(motorneurondisease,MND)，如肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)、脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)等的首要侵犯目标。目前缺乏安全、可靠的细胞模型是限制该类疾病机制研究及探索治疗应用的主要瓶颈。因此，如何简便高效获得无外源性血清等成分不明确物质干扰的脊髓运动神经元是今后探索疾病临床治疗的关键所在。目前已有研究可通过人的皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞(human Induced Pluripotent Stem Cells，简称人iPS细胞)分化获得脊髓运动神经元，可参见：1.Wang ZB,Zhang X,Li XJ.Recapitulation ofspinal motor neuron-specific disease phenotypes in a human cell model ofspinal muscular atrophy[J].Cell Res,2013,23(3):378-393；2.Son EY,chida JK,Wainger BJ,et al.Conversion of mouse and human fibroblasts into functionalspinal motor neurons[J].Cell Stem Cell,2011,9(3):205-218；3.Ebert AD,Yu J,RoseFF Jr,et al.Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophypatient[J].Nature,2009,457(7227):277-280。
与人胚胎干细胞相比，人iPS细胞具有来源丰富、获取方便、不涉及应用伦理问题等优势，这就为建立患者直接来源的特异细胞模型提供了一种新途径。尤其是对于罕见病而言，相当于建立了患者所有细胞类型的永生化细胞库。目前体外培养人iPS细胞多依赖于滋养层体系，其存在外源血清干扰等问题；而在脊髓运动神经元分化研究方面，虽然已有相对成熟的诱导方法，但普遍存在步骤繁杂(四步法)、耗时长(长达7周)、分化效率低(只有25％)等缺陷。此外，维持培养诱导获得的功能性神经元，常需要依赖使用昂贵的神经营养因子，也大大增加了实验成本。因此，为了解决现有不足，十分有必要探索建立一种全程不依赖滋养层体系、无外源血清等成分不明确物质干扰的人iPS细胞重编程方法；尤其是探索建立一种在体外简便快速高效诱导人iPS细胞分化成为脊髓运动神经元的分化方法，及建立一种经济有效的功能性脊髓运动神经元的获取方法。
在建立运动神经元病的脊髓运动神经元模型中，诱导得到目的细胞的数量和相应所需的时间是两大关键点，因此有效诱导分化方法的建立是研究的核心。现有研究表明，脊髓运动神经元发育分化过程主要涉及三个阶段：神经化、尾腹侧化与成熟化。其中，神经化主要是通过抑制TGF-β/Actin/Nodal通路、BMP通路和Wnt通路，从而起到抑制中、内胚层分化的作用，最终实现拟胚体往神经外胚层分化；尾腹侧化则主要是通过激活RA通路和SHH通路，从而实现中枢神经***发生头尾(端脑脊髓)与背腹(脊髓前角后角)两极的分化；成熟化则为通过抑制Notch通路，最终实现脊髓运动神经元前体向有丝***后的脊髓运动神经元转化：可参见Dasen JS,Jessell TM.Hox networks and the origins of motorneuron diversity[J].Curr Top Dev Biol,2009,88:169-200。相关研究证明，小分子化合物在人iPS细胞向神经元分化的过程中起着重要作用。然而小分子化合物的使用也存在着瓶颈效应，主要在于其毒性副作用，并且与它的工作起效浓度呈正相关。现有方案中存在相关高工作浓度化合物如DMH1，尤其是Purmorphamine的应用。其中，后者是目前公认毒性作用强，且有效工作浓度窗狭窄的一种化合物：可参见Hu BY,Zhang SC.Differentiation ofspinal motor neuronsfrompluripotenthuman stem cells[J].Nat Protoc,2009,4(9):1295-1304。因此，诱导分化因子即小分子化合物的选择也是研究的关键所在。
发明内容
本发明的目的(1)是提供一种安全可靠重编程获得人iPS细胞的方法，主要步骤为：微创获取人皮肤成纤维细胞，经携带重编程因子(hOct3/4、hSox2、hKlf4与hc-Myc)的仙台病毒感染后，于DMEM完全培养基中培养7天；再用完全培养基重悬，并以1:5比例重新接种至玻连蛋白包被处理过的孔板内培养24小时；之后更换为E8干细胞培养基，并从次日起每日进行全量换液，直至2周后即可获得iPS细胞。早期挑取iPS细胞单克隆，接种至预先包被有玻连蛋白或基质胶的孔板内进行扩增培养。
其中，如上方法中所述多孔板用前需经玻连蛋白(1：100稀释，有效浓度10μg/ml)于37℃过夜包被；或者需经基质胶(1：50稀释)于37℃包被30分钟。
本发明的目的(2)是提供一种将人iPS细胞简便快速高效诱导成为脊髓运动神经元的方法，主要步骤如下：
(1)将培养至70％-85％融合度的人iPS细胞消化并悬浮培养于含有小分子化合物组合I的神经元诱导分化培养基中2天；
(2)将细胞移至含有小分子化合物组合II的神经元诱导分化培养基中继续悬浮培养2天；
(3)将细胞移至含有小分子化合物组合III的神经元诱导分化培养基中持续悬浮培养5天；
(4)将细胞消化贴壁培养3天，此时神经元诱导分化培养基中只加入小分子化合物DAPT。
其中，步骤(1)中所述神经元诱导分化培养基为混合成分，分别含有1：1的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5xB27添加剂、0.5xN2添加剂、1x谷氨酰胺和1x非必需氨基酸。
其中，步骤(1)所述添加的小分子化合物组合I(浓度)为：DMH1(2μM)+SB431542(2μM)+CHIR99021(3μM)或LDN193189(0.3μM)+SB431542(2μM)+CHIR99021(3μM)。
其中，步骤(1)所述神经元诱导分化培养基中额外添加的小分子化合物组合II(浓度)如下：小分子化合物组合I+RA(0.1μM)+SAG(0.5μM)或小分子化合物组合I+RA(0.1μM)+Purmorphamine(1μM)。
其中，步骤(3)所述的神经元诱导分化培养基中额外添加的小分子化合物组合III(浓度)如下：RA(0.1μM)+SAG(0.5μM)或RA(0.1μM)+Purmorphamine(1μM)。
其中，步骤(4)中所述过程具体为：首先使用Accutase酶消化，再将神经元接种至包被有多聚鸟氨酸、层粘连蛋白及基质胶包被处理过的玻片上；细胞贴壁完全后，加入含有小分子化合物DAPT的神经元诱导分化培养基。
本发明的目的(3)是提供一种经济有效的功能性脊髓运动神经元的获取方法，主要步骤为：将诱导分化第9天的神经元进行消化，再接种至预先包被有多聚鸟氨酸、层粘连蛋白及基质胶玻片上，以星型胶质细胞条件培养基作为基础培养基，并同时添加小分子化合物DAPT(10μM)；每3天，半量更换新鲜培养基一次，直至诱导分化第31天为止。
其中，所述星形胶质细胞条件培养基的制备过程为：采用DMEM完全培养基培养星形胶质细胞3天，再加入新鲜的神经元诱导分化培养基，之后每日进行收集，并更换新鲜的神经元诱导分化培养基。
本发明建立了一种全程不依赖滋养层体系、无外源血清干扰的人iPS细胞培养方法，并且在一定作用条件下可简便、快速、高效定向分化获得脊髓运动神经元，此外还提供了经济有效的功能性脊髓运动神经元的获取方法，这些将为不可治的运动神经元病研究提供了一种极具应用前景的细胞模型。
附图说明
通过结合附图，以便详细描述本发明典型实施例的特征情况及其优点，附图：
图1为不依赖滋养层体系、无外源血清干扰的人iPS细胞重编程过程；其中A为仙台病毒感染前2天的人皮肤成纤维细胞，呈细长条状；B为仙台病毒感染后1周的人皮肤成纤维细胞，突起消失、呈多角形改变；C为消化后重新接种的人皮肤成纤维细胞；D为病毒感染后3周出现的原代人iPS细胞，呈球形克隆(白色箭头所示)，细胞紧密排列，折光性强。标尺，A-D均为200微米。
图2为以玻连蛋白为生长介质的人iPS细胞培养过程；其中A-C为克隆连续生长的动态变化过程，始终呈圆形外扩式生长；与D中的典型胚胎干细胞生长方式相同。标尺，A-D均为500微米。
图3为以基质胶为生长介质的人iPS细胞培养过程；其中A-C为克隆连续生长的动态变化过程，克隆形态不规则、生长方式不固定；和D中的典型胚胎干细胞生长方式明显不同。标尺，A-D均为500微米。
图4为无外源血清干扰的人iPS细胞胚胎干细胞标志物免疫荧光染色；其中A为NANOG和DAPI共标；B为SSEA-4和DAPI共标；C为TRA-1-60和DAPI共标。标尺，A-C均为50微米。
图5为体外诱导人iPS细胞分化成为脊髓运动神经元及其应用的流程示意图
图6为DP组两步法诱导运动神经元分化流程及HB9与ISLET1免疫荧光染色；其中A为悬浮第2天的拟胚体，呈典型球形，边界清晰；B为悬浮第9天的神经球，体积明显增大，透亮度、折光性增高；C为消化贴壁后第3天(诱导第12天)的脊髓运动神经元，具有明显神经元突起形态、交织成网状；D为运动神经元特异标志物HB9与DAPI共标染色；E为后脑及脊髓神经元标志物ISLET1与DAPI免疫染色；F为HB9、ISLET1及DAPI共标染色。标尺，A为500微米；B与C均为200微米；D-F均为100微米。
图7为LP组两步法诱导运动神经元分化流程及HB9与ISLET1免疫荧光染色；其中A为悬浮第2天的拟胚体，呈典型球形，边界清晰；B为悬浮第9天的神经球，体积明显增大，透亮度、折光性增高；C为消化贴壁后第3天(诱导第12天)的脊髓运动神经元，具有明显神经元突起形态、交织成网状；D为运动神经元特异标志物HB9与DAPI共标染色；E为后脑及脊髓神经元标志物ISLET1与DAPI免疫染色；F为HB9、ISLET1及DAPI共标染色。标尺，A为500微米；B与C均为200微米；D-F均为100微米。
图8为DS组两步法诱导运动神经元分化流程及HB9与ISLET1免疫荧光染色；其中A为悬浮第2天的拟胚体，呈典型球形，边界清晰；B为悬浮第9天的神经球，体积明显增大，透亮度、折光性增高；C为消化贴壁后第3天(诱导第12天)的脊髓运动神经元，具有明显神经元突起形态、交织成网状；D为运动神经元特异标志物HB9与DAPI共标染色；E为后脑及脊髓神经元标志物ISLET1与DAPI免疫染色；F为HB9、ISLET1及DAPI共标染色。标尺，A为500微米；B与C均为200微米；D-F均为100微米。
图9为LS组两步法诱导运动神经元分化流程及HB9与ISLET1免疫荧光染色；其中A为悬浮第2天的拟胚体，呈典型球形，边界清晰；B为悬浮第9天的神经球，体积明显增大，透亮度、折光性增高；C为消化贴壁后第3天(诱导第12天)的脊髓运动神经元，具有明显神经元突起形态、交织成网状；D为运动神经元特异标志物HB9与DAPI共标染色；E为后脑及脊髓神经元标志物ISLET1与DAPI免疫染色；F为HB9、ISLET1及DAPI共标染色。标尺，A为500微米；B与C均为200微米；D-F均为100微米。
图10为传统四步法诱导运动神经元分化过程及HB9与ISLET1免疫荧光染色；其中A为悬浮第4天的拟胚体，呈球形，边界清晰，但透光性较弱，死细胞多；B为拟胚体贴壁后第8天(诱导分化第15天)，具有典型花环样神经管结构(箭头所示)；C为吹打离壁后继续悬浮培养第8天(诱导分化第23天)的神经球结构，呈球形，边界清晰，折光性强；D为消化贴壁第3天(诱导分化第28天)的运动神经元，突起交织成网状；E为HB9与DAPI共标染色；F为ISLET1与DAPI共标染色。标尺，A为500微米；B-D均为200微米；F为100微米。
图11为星形胶质细胞的标志物GFAP免疫荧光染色；其中A为星形胶质细胞，呈片状、紧密贴壁生长；B-C为星形胶质细胞特异性标志物GFAP和DAPI的共标染色。标尺，A-C均为100微米。
图12为成熟运动神经元的免疫荧光染色；其中A-D，分别为运动神经元特异性标志物CHAT、SMI32及神经元标志物的TUJ1的共标染色。标尺，A-D均为50微米。
图13为功能性成熟神经元的免疫荧光染色；其中A-C分别为功能性成熟神经元的特异性标志物Synaptophysin和MAP2的共标染色。标尺，A-C均为50微米。
图14为膜片钳全细胞记录模式下的功能性成熟运动神经元电生理特性；其中A为膜片钳直视记录下的成熟运动神经元形态；B为电流钳模式下记录的诱发动作电位；C为电压钳模式下记录的钠钾通道电流。标尺，A为80微米。
图15为成熟运动神经元支配下，肌管细胞的节律收缩；成熟运动神经元和肌管细胞共培养2周后，肌管细胞的持续、规律收缩：每次收缩持续1秒(1秒和5秒为收缩期，箭头所示为收缩运动的肌管细胞)，每次收缩间隔4秒。标尺，50微米。
图16为成熟运动神经元和肌管细胞形成神经肌肉接头的免疫染色；神经肌肉接头的多维角度结构(“十”字交点所示)。其中BTX(红色标记)特异识别神经肌肉接头的运动终板结构；MHC(绿色标记)和DAPI(蓝色标记)共同标示具有多核结构的肌管细胞(横纹肌)；Synapsin(灰色标记)特异识别运动神经元末端突触结构。标尺，10微米。
图17为膜片钳全细胞记录模式下的节律收缩肌管细胞电生理特性；其为记录收缩肌管细胞的自主性发放动作电位。
具体实施方式
本发明一方面提供一种全程不依赖滋养层体系、无外源血清等成分不明确物质干扰的人iPS细胞培养方法，包括以下步骤：
1)不依赖滋养层体系的人iPS细胞重编程：将原代培养的人皮肤成纤维细胞以0.15-0.3x 106细胞/孔(优选0.2x 106细胞/孔)密度接种至12孔板内，培养1-3天(优选2天)。以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为3-5(优选5)，利用携带有重编程因子的仙台病毒(hOct3/4、hSox2、hKlf4与hc-Myc)对其进行感染。5-8天(优选7天)后，将感染后的成纤维细胞进行消化。DMEM/F12洗涤3次，加入预热后的0.25％胰酶-EDTA 0.5ml/孔，优选室温下消化1分钟，然后离心1000-1500rpm，1-3分钟(优选1200rpm，1.5分钟)。最后，完全培养基重悬以1:3-1:10(优选1:5)比例重新接种至玻连蛋白(DMEM/F12 1:100稀释)过夜包被处理过的6孔板内，于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24小时后更换为新鲜的干细胞培养基E8，之后每日进行全量换液。2周后，可获得重编程于无滋养层体系的的iPS细胞。
2)无外源血清等成分不明确物质干扰的人iPS细胞的传代扩增培养：将上一步重编程获得的iPS细胞通过机械挑取分离得到单克隆，对比分别接种至预先包被有玻连蛋白(DMEM/F12 1:100稀释，37℃、过夜)或基质胶(DMEM/F121:50稀释，37℃、30分钟)的6孔板内，均于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中扩增培养。
人iPS细胞的鉴定：
待细胞生长密度达70-85％时，对人iPS细胞进行消化传代接种至玻连蛋白包被处理过的盖玻片上。第2天，用新鲜4％多聚甲醛固定细胞，室温环境下10分钟。0.01MPBS洗涤3次，每次5分钟。20％驴血清+0.2％Triton-X-100+0.01M PBS封闭，室温1小时。用封闭液1：1000稀释一抗(NANOG、SSEA4、TRA-1-60)，4℃过夜。PBS洗涤3次，每次5分钟。0.01M PBS以1:1000稀释二抗与DAPI，室温下孵育1小时。PBS洗涤3次，每次5分钟。最后进行抗荧光淬灭剂封片。
倒置显微镜下的细胞形态观察和细胞免疫荧光染色结果显示，经过3周左右的重编程可获得全程不依赖滋养层体系、无外源血清干扰的人iPS细胞(图1)。并且在对比无滋养层体系的人iPS细胞扩增培养过程中，我们优化得到了一种以玻连蛋白为生长介质的培养方案(图2)，重要的是它具有胚胎干细胞的相同特征(图4)。
本发明另一方面提供一种由无外源血清干扰的人iPS细胞向脊髓运动神经元的简便快速高效诱导分化方法(图5)，包括以下步骤：
1)无滋养层体系的人iPS细胞的培养：加入稀释后的玻连蛋白(DMEM/F12，1:100)1ml/孔过夜包被6孔板，以E8作为基础培养基，然后接种人iPS细胞，于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养扩增。
2)向脊髓运动神经元的简便、高效诱导分化：取生长状态良好的人iPS细胞，待其生长至4-5天达70％-85％融合度(优选80％融合度)时，利用0.5mM EDTA消化离壁并悬浮于神经元诱导分化培养基。并配合使用不同小分子化合物组合进行脊髓运动神经元的定向诱导分化。其中小分子化合物组合添加情况如下：
诱导分化第0天至第2天，分别加入DMH1(2μM)+SB431542(2μM)+CHIR99021(3μM)组合或LDN193189(0.3μM)+SB431542(2μM)+CHIR99021(3μM)组合；
诱导分化第2天至第4天，在0-2天所述的小分子化合物基础上再额外分别加入RA(0.1μM)+Purmorphamine(1μM)组合或RA(0.1μM)+SAG(0.5μM)组合；
诱导分化第4天至第9天，分别加入RA(0.1μM)+Purmorphamine(1μM)组合或RA(0.1μM)+SAG(0.5μM)组合；
诱导分化第9天至第12天，均仅加入DAPT(10μM)。
本发明选取了相应各通路具有代表性的激动剂或抑制剂，联合应用进行脊髓运动神经元的诱导分化。结果发现，在以联合化合物LDN193189,SB431542,CHIR99021,RA,SAG及DAPT的作用下，诱导分化第12天即可得到高纯度(约95％)的脊髓运动神经(图9，表1)。相对于以往脊髓运动神经元的多步骤、低效分化研究(约25％，4周，图10，表1)，有着明显改善。并且发明人还首次发现小分子DMH1的应用，会导致脊髓运动神经元标志物HB9与ISL1发生分离现象(表1)。此外，本发明提供的简便、快速、高效脊髓运动神经元的诱导分化方案成功避免了相关高工作浓度化合物如DMH1，尤其是Purmorphamine的应用，有效降低了其毒副作用。
本发明的进一步目的是提供脊髓运动神经元促成熟方法及其功能研究应用，功能性脊髓运动神经元获取的主要步骤为：将诱导分化第9天的神经元进行消化，再接种至预先包被有多聚鸟氨酸、层粘连蛋白及基质胶玻片上，以星型胶质细胞条件培养基作为基础培养基，并同时添加小分子化合物DAPT(10μM)；每3天，半量更换新鲜培养基一次，直至诱导分化第31天为止。其中，所述星形胶质细胞条件培养基的制备过程为：采用DMEM完全培养基培养星形胶质细胞3天，再加入新鲜的神经元诱导分化培养基，之后每日进行收集，并更换新鲜的神经元诱导分化培养基。
进一步的，获取运动神经元专有特性主要流程是：先通过低血清体系诱导成肌细胞分化得到肌管细胞。随后将诱导分化第9天的神经球进行消化，以小克隆的形式接种至分化好的肌管细胞进行共培养，同时添加小分子化合物DAPT(10μM)。每2-3天，半量更换新鲜培养基一次，直至共培养第14天为止。
通过免疫荧光染色和膜片钳检测，结果显示在诱导分化早期(诱导分化第4周左右)即可得到功能性的成熟运动神经元(图12,13,14)，相较于以往7周左右的分化时间，效率方面有着明显提高。更为重要的是，成熟运动神经元功能的发挥在于，能与骨骼肌肌管细胞形成神经肌肉接头，而起到支配骨骼肌收缩的作用。本发明进一步通过实时拍摄观察、免疫染色及膜片钳记录，结果显示成熟运动神经元与骨骼肌肌管细胞共培养下，可形成神经肌肉接头结构并支配骨骼肌节律收缩(图15,16,17)。
基于上述内容，本发明成功建立了不依赖滋养层体系、无血清干扰的人iPS细胞培养体系；该体系内培养的人iPS细胞，在联合应用优化后的小分子化合物组合后，可以简便、快速、高效诱导获得大量、高纯度的脊髓运动神经元；并且，在星形胶质细胞条件培养基提供的微环境内可进一步快速分化为功能性的成熟运动神经元。这将为建立运动神经元病特异细胞模型提供了良好的应用前景。
实施例
材料和方法
材料来源：
皮肤组织样本取自福建医科大学附属第一医院神经内科脊肌萎缩症患者。新生C57BL/6大鼠(出生后24小时内)由中国科学院上海神经所提供。
试剂：
DMEM培养基、DMEM-F12培养基、Neurobasal培养基、E8培养基、胎牛血清(FBS)、0.25％胰酶-EDTA、玻连蛋白、N2添加物、B27添加物、Accutase消化液(Thermo FisherScientific公司，美国)；层粘连蛋白(Sigma公司，美国)；基质胶(Corning公司，美国)；乙二胺四乙酸(北京赛贝生物科技有限公司，中国)；SB431542、CHIR99021、LDN193189(Stemgent公司，美国)；多聚鸟氨酸、维甲酸(RA)(Sigma公司，美国)；DMH1、Purmorphamine、DAPT(Abcam公司，英国)；SAG(Millipore公司，德国)；仙台病毒iPS细胞重编程试剂盒(ThermoFisher Scientific公司，美国)；PBS片(Medicago公司，瑞典)；山羊抗人NANOG(R&D公司，美国)；小鼠抗人TRA-1-60、山羊抗人CHAT、小鼠抗人Synaptophysin(Millipore公司，德国)；小鼠抗人SMI32、兔抗人TUJ1、(Covance公司，美国)小鼠抗人SSEA4、小鼠抗人ISLET1(DSHB，美国)；山羊抗人HB9、兔抗人MAP2(SANTA CRUZ公司，美国)；Alexa594驴抗山羊IgG、Alexa594驴抗小鼠IgG、Alexa488驴抗小鼠IgG、Alexa488驴抗兔IgG、AlexaCy5驴抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；DAPI(Sigma，美国)；抗荧光淬灭剂(SouthernBiotech，美国)。
实施例1人iPS细胞的重编程、培养及鉴定
重编程与培养：DMEM完全培养基(含10％FBS、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)原代培养病人活检的皮肤组织块细胞。待其长满后，用DMEM洗涤1次，0.25％胰酶-EDTA消化传代，以0.2x 106细胞/孔密度接种至12孔板内，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。2天后，以感染复数(multiplicityof infection，MOI)为5，将携带有重编程因子的仙台病毒(hOct3/4、hSox2、hKlf4与hc-Myc)对其进行感染。24小时后更换上述新鲜培养基，1ml/孔；之后隔日进行全量换液。培养第6天，用DMEM/F12以1:100比例稀释玻连蛋白，包被6孔板，1ml/孔，于培养箱内过夜。培养第7天，将感染后的成纤维细胞进行消化。DMEM/F12洗涤3次，加入预热后的0.25％胰酶-EDTA 0.5ml/孔，室温下消化1分钟，然后离心1200rpm，1.5分钟。最后，完全培养基重悬以1:5比例重新接种至玻连蛋白(DMEM/F12 1:100稀释)过夜包被处理过的6孔板内，于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24小时后，更换为E8干细胞培养基；之后每日进行全量换液。培养2周后，可见人iPS细胞克隆出现。此时，予机械法挑取重编程得到的单克隆，对比分别接种至预先包被有玻连蛋白(DMEM/F12 1:100稀释，37℃、过夜)或基质胶(DMEM/F12 1:50稀释，37℃、30分钟)的6孔板内培养扩增。5-6天后，细胞生长密度约70-85％时进行传代培养。室温环境下，0.5mM EDTA消化iPSCs 1分钟，DMEM/F12洗涤1次，用E8培养基吹打离壁细胞，以1:10比例重新接种细胞至包被处理过的孔板内，于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中继续扩增培养。根据细胞生长密度，每5-6天传代1次，每日进行换液。
鉴定：
每日在倒置显微镜下连续观察克隆出现的时间及扩增培养过程的形态变化。培养扩增第5代后，通过免疫荧光技术进行胚胎干细胞标志物的表达检测，具体做法如下：待细胞生长密度达70-85％时，对其进行消化传代接种至玻连蛋白包被处理过的盖玻片上。第2天，用新鲜4％多聚甲醛固定细胞，室温环境下10分钟。0.01M PBS洗涤3次，每次5分钟。20％驴血清+0.2％Triton-X-100+0.01M PBS封闭，室温1小时。用封闭液1：1000稀释一抗(NANOG、SSEA4、TRA-1-60)，4℃过夜。PBS洗涤3次，每次5分钟。0.01M PBS以1:1000稀释二抗与DAPI，室温下孵育1小时。PBS洗涤3次，每次5分钟。最后进行抗荧光淬灭剂封片。
观察结果显示：
以感染病毒当日计为第0天(Day 0)。病毒感染前2天(Day-2)，皮肤成纤维细胞贴壁生长成细长纤维状形态(图1.A)。病毒感染后7天(Day 7)，细胞形态发生明显变化，突起消失，胞体体积增大，呈球形或多角形，折光性增强(图1.B)。重新传代接种感染后的细胞(Day 8)，其形态仍以球形为主(图1.C)。病毒感染后21天(Day 21)，出现明显细胞克隆(图1.D，箭头所示)。以玻连蛋白为生长介质的传代扩增克隆，培养第1天可见呈多细胞紧密排列生长(图2.A)，随着培养时间延长，克隆均匀逐渐增大，折光性增强、边界清晰(图2.B,C)，并与胚胎干细胞具有相同形态外观和增殖方式(图2.D)。而以基质胶为生长介质的传代扩增克隆，在培养过程中的形态变化和增殖方式与胚胎干细胞相去甚远(图3.A-D)。进一步对前者扩增得到的克隆进行免疫荧光染色鉴定，结果显示其可稳定表达胚胎干细胞相关标志物：阳性信号位于细胞核内的NANOG(图4.A)、阳性信号位于细胞膜的SSEA4(图4.B)及阳性信号位于细胞质的TRA-1-60(图4.C)。
综上结果显示，我们成功重编程得到了全程不依赖滋养层体系的人iPS细胞，并且建立了一种以玻连蛋白为生长介质的优化培养方案。重要的是，这种全程无外源血清干扰的人iPS细胞具备胚胎干细胞的相同特征，可替代后者用于今后疾病机制及治疗的研究。
实施例2人iPS细胞向脊髓运动神经元的定向诱导分化、鉴定及分化效率统计
取生长于6孔板内(Corning公司，美国)状态良好的人iPS细胞，待其生长至5-6天达70％-85％融合度时，用0.5mM EDTA室温消化1分钟，配合吹打离壁，收集至15ml离心管内(广州洁特生物过滤制品有限公司，中国)，离心1000转/分钟，1分钟。利用10ml神经诱导分化培养基(包含1:1DMEM/F12:Neurobasal培养基、0.5x N2添加物、0.5x B27添加物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸)重悬于10cm低吸附培养皿内(广州洁特生物过滤制品有限公司，中国)，同时添加不同小分子化合物组合DMH1+SB431542+CHIR99021或LDN193189+SB431542+CHIR99021，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中，以促使其形成拟胚体结构，此时计为诱导分化第0天。隔日进行全量换液，同上述分化培养基。诱导分化第2天，全量换液，所用培养基及小分子化合物同上，另外再额外添加RA+SAG或RA+Purmorphamine不同组合化合物，以促使其形成神经球结构。诱导分化第4天，全量换液，所用培养基同上，此时仅添加RA+SAG或RA+Purmorphamine的不同组合化合物；之后隔日全量换液。诱导分化第9天，收集分化的神经球，离心1000转/分钟、1分钟，弃去上清；加入1ml/管的Accutase消化液，37℃水浴8分钟；加入8ml DMEM/F12终止消化，离心1000转/分钟、1分钟，弃去上清；加入1ml/管的上述分化培养基，吹打3-4次，静置3分钟；吸取上层细s胞悬液接种至已用多聚鸟氨酸(0.1mg/ml)、层粘连蛋白(40ug/ml)及基质胶(1：50稀释)包被处理过的玻片于24孔板内，40μL/玻片；置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中，以促使贴壁。2小时后补足培养基，0.5ml/孔，另额外添加小分子化合物DAPT，以促进运动神经元的成熟，直至培养至诱导分化第12天为止。
具体分组如下：
(1)DMH1(2μM)+SB431542(2μM)+CHIR99021(3μM)+RA(0.1μM)+Purmorphamine(1μM)+DAPT(10μM)，简称DP组；
(2)LDN193189(0.3μM)+SB431542(2μM)+CHIR99021(3μM)+RA(0.1μM)+Purmorphamine(1μM)+DAPT(10μM)，简称LP组；
(3)DMH1(2μM)+SB431542(2μM)+CHIR99021(3μM)+RA(0.1μM)+SAG(0.5μM)+DAPT(10μM)，简称DS组；
(4)LDN193189(0.3μM)+SB431542(2μM)+CHIR99021(3μM)+RA(0.1μM)+SAG(0.5μM)+DAPT(10μM)，简称LS组；
另外，传统四步骤脊髓运动神经元的诱导分化步骤大致如下：
当人iPS细胞生长至70％-85％融合度时，用0.5mM将其消化离壁并悬浮培养于装有神经诱导分化培养基(包含DMEM/F12培养基、1x N2添加物、非必需氨基酸)的培养皿(广州洁特生物过滤制品有限公司，中国)内。此时计为第0天(Day 0)，之后每日半量换液。诱导分化第7天时，将其促贴壁培养于基质胶包被处理过的培养皿(Corning公司，美国)内，隔日半量换液。并从第10天起开始添加小分子RA(0.1μM)。诱导分化第15天时，直接吹打离壁克隆，并再次悬浮培养，同时额外再添加小分子Purmorphamine(1μM)。诱导分化第25天时，Accutase消化悬浮克隆并再次接种至已用多聚鸟氨酸、层粘连蛋白及基质胶包被处理过的玻片内贴壁培养。
鉴定：
每日在倒置显微镜下连续观察克隆的形态变化。在诱导分化第12天时，进行终止，用新鲜4％多聚甲醛进行固定。对上述细胞用免疫荧光染色方法检测诱导后第12天脊髓运动神经元HB9及ISLET1(有丝***后的运动神经元特异性标志物)的表达。一抗为山羊抗人HB9抗体(1:50)及小鼠抗人ISLET1抗体(1:100)。由双人、双盲法计数3个随机视野/每次试验，独立重复试验3次。运动神经元分化效率＝HB9及ISL1共标的阳性细胞数/DAPI标记的阳性细胞数。采用SPSS16.0统计软件，单因素方差分析，结果用平均数±标准误表示。
结果：
人iPS细胞在加入不同组合的小分子化合物(DP组、LP组、DS组与LS组)进行脊髓运动神经元的诱导分化过程中：第2天均可形成典型的EB球(图6-9.A)；持续悬浮培养至第9天时，均可形成体积大、遮光性强、透亮度大的神经球(图6-9.B)；贴壁后第3天(诱导分化第12天)，均可形成典型的运动神经元形态，明显的突起及交织成网络状结构(图6-9.C)。各组细胞在诱导分化第12天的免疫荧光染色，可见阳性颗粒信号均位于细胞核内，参见图6-9.D-F。其中，图6.D-F显示DP组HB9及ISLET1免疫荧光阳性细胞；图7.D-F显示LP组HB9及ISLET1免疫荧光阳性细胞；图8.D-F显示DS组HB9及ISLET1免疫荧光阳性细胞；图9.D-F显示LS组HB9及ISLET1免疫荧光阳性细胞(具体详见表1)。显然，LS组的小分子组合诱导方案获得的脊髓运动神经元率最高，并且并未出现运动神经元标志物HB9与ISLET1的分离现象(表1)。
另外，在与经典传统的诱导方法(四步法，悬浮-贴壁-悬浮-贴壁，图10)比较中发现，本申请发明的诱导方法无论在简便性(两步法，悬浮-贴壁)上还是在分化效率方面都具有明显的优势(表1)。
综上结果显示，本申请的发明人建立了一种安全、可靠、高效的脊髓运动神经元诱导分化方案。而高纯度脊髓运动神经元的简便、高效获得，将有利于疾病表型模拟的应用，甚至是今后的细胞移植治疗。
实施例3诱导脊髓运动神经元快速成熟化后的应用
原代星型胶质细胞培养：
取出生后1天内的C57BL/6品系小鼠，75％酒精充分消毒后，快速取脑。在解剖显微镜下剥除脑膜和血管等纤维成分后，将其移至15ml离心管内(广州洁特生物过滤制品有限公司，中国)，用0.25％胰酶-EDTA于37℃水浴下消化10分钟。DMEM完全培养基(含20％FBS)终止消化，轻轻吹打数次，制成单细胞悬液。静置沉淀5分种，吸取上清接种到预先基质胶(1:100稀释)包被处理过的T75培养瓶(Corning)中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24小时后，用力振荡培养瓶以除去位于星形胶质细胞上的其他细胞层及细胞碎片等，换新鲜的DMEM完全培养基(含20％FBS)，继续培养3-5天。待其生长密度约为80-90％时，进行消化传代。DMEM培养基洗涤1次，加入5ml 0.25％胰酶-EDTA于37℃培养箱内孵育3分钟。完全培养基终止消化，并轻轻吹打数次离壁细胞。将细胞悬液移至15ml离心管内，离心1500rpm，2分钟。吸弃上清，DMEM完全培养基(含20％FBS)重悬，以1：4比例接种至新的10cm培养皿(Corning)内，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
星型胶质细胞条件培养基培养脊髓运动神经元：
以DMEM完全培养基(含20％FBS)为基础培养基，将培养扩增后第3代的星型胶质细胞以5x 104细胞/cm2密度接种至包被有基质胶(1:100稀释)的10cm培养皿(Corning)内，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中。第3天，吸弃原先培养基，DMEM培养基洗涤3次，并加入新鲜的神经元诱导分化培养基(包含1:1DMEM/F12:Neurobasal培养基、0.5x N2添加物、0.5x B27添加物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸)。之后每日进行收集，并更换新鲜的神经元诱导分化培养基。
将诱导分化第9天(Day 9)的神经球进行消化，以0.1x 104细胞/cm2密度接种至预先包被有多聚鸟氨酸(0.1mg/ml)、层粘连蛋白(40ug/ml)及基质胶(1：50稀释)的玻片上，以星型胶质细胞条件培养基作为基础培养基，并同时添加小分子化合物DAPT(10μM)。每3天，半量更换新鲜培养基一次，直至诱导分化第31天为止。
脊髓运动神经元与骨骼肌肌管细胞共培养：
将诱导分化第9天(Day 9)的神经球短暂消化后，以小克隆形式接种至预先培养有肌管细胞的共聚焦专用培养皿内(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，培养基更换为神经元诱导分化培养基(包含1:1DMEM/F12:Neurobasal培养基、0.5x N2添加物、0.5x B27添加物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸)，同时添加小分子化合物DAPT(10μM)。每2-3天，半量更换新鲜培养基一次，直至共培养第14天为止。同时以培养皿内单独接种肌管细胞为阴性对照，采用相同培养体系。
鉴定：
每日在倒置显微镜下连续观察传代培养后星型胶质细胞的形态变化、诱导分化来源的脊髓运动神经元生长情况及脊髓运动神经元与肌管细胞形成神经肌肉接头后，支配肌管的收缩情况。上述细胞利用免疫荧光染色检测标志物表达情况。一抗为兔抗人GFAP抗体(1:500)、山羊抗人CHAT(1:300)、小鼠抗人SMI32(1:500)、兔抗人TUJ1(1:10000)、小鼠抗人Synaptophys in(1:2000)、兔抗人MAP2(1:10000)、BTX(1：500)、鼠抗人MHC(1：2000)以及兔抗人Synaps in(1:2000)。同时，利用膜片钳技术对成熟的脊髓运动神经元和收缩的骨骼肌肌管细胞进行电生理记录。
结果：
1.免疫荧光染色：可见传代扩增培养的星型胶质细胞生长贴壁紧密(图11.A)，并表达阳性信号位于细胞质的特异性标志物GFAP(图11.B-D)。在以成分多样、价格低廉的星型胶质细胞条件培养基替代传统昂贵的神经营养因子培养脊髓运动神经元约2周后(Day22)，其开始表达成熟运动神经元特异性标志物CHAT、SMI32与TUJ1，其阳性信号均位于细胞质(图12.A-D)。持续贴壁约3周后(Day 31)，开始表达功能性运动神经元特异性标志物：阳性信号位于细胞膜的Synaptophys in与阳性信号位于细胞质的TUJ1(图13.A-C)。
2.功能性脊髓运动神经元的膜片钳电生理记录：在室温条件(22℃–24℃)下，进行全细胞膜片钳记录诱导分化第31天的功能性成熟脊髓运动神经元电生理特性。将培养有运动神经元的玻片至于电极外液(Mm：NaCl 135,KCl 3,CaCl2 2,MgCl2 1,Glucose1 1,Sucrose 10与HEPES10,NaOH调节pH值至7.4，渗透压310mOsm/L)中。冲灌记录电极内液(mM：KCl 140,NaCl 9,MgCl2 1,EGTA 0.2,ATP-Mg 2,GTP-Na 0.25与HEPES10,KOH调节pH值至7.2，渗透压290mOsm/L)，电极电阻3-5MΩ。在倒置显微镜(Nikon公司，日本)直视下(40X镜)，对记录细胞进行高阻封接、破膜和记录(图14.A)。采用电流钳模式记录参数：-200pA→+250pA(以50pA为步阶)，每个刺激间隔1ms，刺激持续时间：duration A 200ms，duration B200ms，duration C 100ms；采用电压钳模式记录参数：钳制电压-70mV，-70mV→+30mV(以10mV为步阶)，每个刺激间隔1ms，刺激持续时间：duration A 100ms，duration B 400ms，duration C 100ms。数据由Axon Multiclamp 700B放大器，Digidata1440A数据采集板以及Clampex 10.2软件(Molecular Devices，美国)采集记录。信号采样频率10kHz，低通滤波频率1kHz。电容和串联电阻补偿值30％。
膜片钳记录最终结果显示：在电流钳模式下，经注入步阶电流刺激后可诱发产生连续、成串的动作电位，并且随着注入电流的增大，动作电位发放的频率也随之增加(图14.B)；在电压钳模式下，经注入步阶电压刺激后可诱发产生快速激活-失活型的钠通道电流(内向电流)与钾通道电流(外向电流)(图14.C)。由此推断，早期获得的功能性成熟脊髓运动神经元具备兴奋性特质。
3.成熟脊髓运动神经元支配骨骼肌肌管细胞的记录：脊髓运动神经元与骨骼肌肌管细胞共培养2周后，实时拍摄(20X镜)记录到骨骼肌肌管细胞在成熟脊髓运动神经元的支配下发生节律收缩(图片15)；而单纯培养肌管细胞的培养皿内未见任何收缩的肌管细胞。同时，免疫染色可见神经肌肉接头形成(图片16)。另外，也对收缩的肌管细胞给予了全细胞膜片钳记录。体系同神经元记录，参数采用gap-free(不给予任何外源刺激)。结果显示可记录到自主连续发放的动作电位(图17)，进一步证实了存在神经接头结构的形成。
以上结果说明，根据本发明方法在短期内高效获得的成熟运动神经元初步具备在体脊髓运动神经元所特有的功能。
通过以上内容可以确认，本发明提供了一种无外源血清等成分不明确物质干扰的人iPS细胞培养方案及建立了一种简便、快速、高效的脊髓运动神经元诱导分化方案，并且获取的成熟运动神经元经鉴定符合在体脊髓运动神经元的功能特性。该类细胞将可用于疾病表型的模拟和发病机制的探讨，为今后有效治疗候选药物的筛选提供理论依据；甚至可应用于今后的细胞移植治疗。
上述内容已经描述了许多本发明的具体实施方式，但本发明不应该被认为局限于这些具体实施方式。应该理解，除非另有说明，这里所提供的任何或所有的实例、或典型的术语都仅仅是出于更好地说明本发明的目的，而并不限制本发明的范围。不过，应该理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，可以作出很多不同的修改。因此，应该明了，本发明不限于具体描述的实施方式，而仅由权利要求的范围所限定。

Claims (1)

1.基于人iPS细胞高效获取功能性脊髓运动神经元的方法，其特征在于该方法主要步骤为：
一、重编程获得人iPS细胞
微创获取人皮肤成纤维细胞，经携带重编程因子hOct3/4、hSox2、hKlf4与hc-Myc的仙台病毒感染后，于DMEM完全培养基中培养7天；再用完全培养基重悬，并以1:5比例重新接种至玻连蛋白包被处理过的孔板内培养24小时；之后更换为E8干细胞培养基，并从次日起每日进行全量换液，直至2周后即可获得iPS细胞；挑取iPS细胞单克隆，接种至预先包被有玻连蛋白或基质胶的孔板内进行扩增培养并用于之后的运动神经元的诱导分化；
二、运动神经元的诱导分化
(1)将培养至70％-85％融合度的人iPS细胞消化并悬浮培养于含有小分子化合物组合I的神经元诱导分化培养基中2天；
(2)将细胞移至含有小分子化合物组合II的神经元诱导分化培养基中继续悬浮培养2天；
(3)将细胞移至含有小分子化合物组合III的神经元诱导分化培养基中持续悬浮培养5天；
(4)将细胞消化贴壁培养3天即可获得运动神经元，此间神经元诱导分化培养基中只加入小分子化合物DAPT；
所述步骤(1)的神经元诱导分化培养基为混合成分，分别含有1：1的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5x B27添加剂、0.5x N2添加剂、1x谷氨酰胺和1x非必需氨基酸；
所述步骤(1)所添加的小分子化合物组合I组成及浓度为：DMH1 2μM+SB431542 2μM+CHIR9902 3μM或LDN193189 0.3μM+SB431542 2μM+CHIR99021 3μM；
所述步骤(2)的神经元诱导分化培养基中额外添加的小分子化合物组合II组成及浓度如下：小分子化合物组合I+RA 0.1μM+SAG 0.5μM；
所述步骤(3)的神经元诱导分化培养基中额外添加的小分子化合物组合III组成及浓度如下：RA 0.1μM+SAG 0.5μM；
所述步骤(4)中首先使用Accutase酶消化，再将神经元接种至包被有多聚鸟氨酸、层粘连蛋白及基质胶包被处理过的玻片上；细胞贴壁完全后，加入含有小分子化合物DAPT的神经元诱导分化培养基；
三、功能性运动神经元的培育
将步骤二(3)中悬浮培养结束的神经元进行消化，再接种至预先包被有多聚鸟氨酸、层粘连蛋白及基质胶玻片上，以星型胶质细胞条件培养基作为基础培养基，并同时添加小分子化合物DAPT 10μM；每3天，半量更换新鲜培养基一次，直至诱导分化第31天为止；
所述星形胶质细胞条件培养基的制备过程为：采用DMEM完全培养基培养星形胶质细胞3天，再加入新鲜的神经元诱导分化培养基，之后每日进行收集，并更换新鲜的神经元诱导分化培养基。
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