CN110478379B - 一种石上柏总双黄酮前体脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石上柏总双黄酮前体脂质体及其制备方法，特别涉及于药物载体技术领域。本发明制备的石上柏总双黄酮前体脂质体主要由石上柏总双黄酮提取物（TBESD）、大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠、胆固醇和冻干保护剂组成。本发明采用薄膜分散‑超声法结合冷冻干燥技术，通过将TBESD包裹于脂质双分子层中制备石上柏总双黄酮前体脂质体（P‑TBESD），包封率高，呈表面粗糙的球形，粒径约为250 nm，该工艺能显著提高前体脂质体产品长期储存的稳定性。克服了TBESD中双黄酮化合物的溶解性差，提高了石上柏总双黄酮提取物（TBESD）的生物利用度及抑瘤作用，为TBESD作为抗肿瘤药物的研究与开发提供安全有效的载药***。

Description

一种石上柏总双黄酮前体脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于药物载体技术领域，具体是一种石上柏总双黄酮前体脂质体及其制备方法。

背景技术

肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病。随着肿瘤发病率和死亡率的逐年上升，恶性肿瘤已成为全球最大的公共卫生问题之一。当前化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时往往累及正常细胞，存在毒副作用大和易产生多药耐药等问题。中药具有悠久的用药历史，是中华民族的瑰宝，被认为是药物发现的巨大宝库。天然产物来源的紫杉醇、喜树碱、香菇多糖等抗肿瘤药物的发现及广泛应用，为我们提供了借鉴，从天然药物中寻找高效、低毒的抗肿瘤活性成分是当前的研究热点之一。

石上柏(SelaginelladoederleiniiHieron)亦名龙鳞草(深绿卷柏)，为蕨类植物门卷柏科属植物深绿卷柏的干燥全草，主要分布于我国南方地区。民间常用于各种癌症的治疗，国内临床上常将其与放疗结合用于鼻咽癌、肺癌、***等的治疗。药理学研究表明，石上柏醇提物对多种肿瘤细胞具有较强的体外增殖抑制作用。课题组前期研究也证实，石上柏总双黄酮提取物(TBESD)对多种肿瘤细胞体内外均有较强的生长抑制作用，能诱导肿瘤细胞发生凋亡和自噬性死亡，且未见明显毒副反应。TBESD已表现出高效、低毒的抗肿瘤特性，值得进一步研究开发。

经研究，石上柏总双黄酮提取物(TBESD)中的双黄酮类成分水溶性和脂溶性均较差，预实验表明其口服生物利用度低。有必要对TBESD进行剂型筛选与研究，以提高其溶解度，改善其口服生物利用度，为TBESD药用开发提供制剂基础。

脂质体(Liposome)是一种利用类脂质双分子层形成的囊泡包裹药物的一种新型缓释制剂。脂质体的类脂双分子层具有生物膜特性，作为一种药物载体，脂质体具有许多优点，近年来受到越来越多的研究者关注。如，具有两亲性和良好的组织相容性，能保护包封的药物、提高药物的稳定性，具有靶向性、起到增效减毒的作用，具有缓释作用等特点。脂质体为具有双分子层结构的封闭囊状体，能将药物包裹在磷脂形成的囊泡内，增强药物的脂溶性从而提高其生物利用度。

本发明旨在提供一种石上柏总双黄酮前体脂质体及其制备方法，以提高石上柏总双黄酮提取物(TBESD)的生物利用度，提高抑瘤作用、增强药效，为TBESD 作为抗肿瘤药物的研究与开发提供安全有效的载药***。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石上柏总双黄酮前体脂质体及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种石上柏总双黄酮前体脂质体，所述脂质体含有大豆卵磷脂、石上柏总双黄酮提取物(TBESD)、脱氧胆酸钠、胆固醇、冻干保护剂，所述大豆卵磷脂与石上柏总双黄酮提取物(TBESD)、脱氧胆酸钠、胆固醇的比例为 5～20:1～10:1～10:1～10。

优选地，所述大豆卵磷脂与石上柏总双黄酮提取物(TBESD)、脱氧胆酸钠、胆固醇的比例为10～20:1～10:1～10:1～10。

一种石上柏总双黄酮前体脂质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)精密称取石上柏总双黄酮提取物(TBESD)、浓度为10～50mg/ml的大豆卵磷脂和胆固醇于50mL圆底烧瓶，加入二氯甲烷超声溶解后于旋转蒸发仪 30～80℃水浴减压蒸发，直至无二氯甲烷溶剂残留，在圆底烧瓶内壁形成一层均匀的脂质薄膜；

(2)称取脱氧胆酸钠溶于50mL的磷酸盐缓冲溶液加入圆底烧瓶水化薄膜；将圆底烧瓶置于30～70℃水浴的磁力搅拌器上磁力搅拌10～50min使薄膜成分水化；随后将其置于冰水浴中进行超声处理，得石上柏总双黄酮提取物(TBESD) 脂质体混悬液；

(3)将石上柏总双黄酮提取物(TBESD)脂质体混悬液加入冻干保护剂，所述冻干保护剂与所述石上柏总双黄酮提取物(TBESD)脂质体混悬液的比例为1：1～5，完全溶解后进行冷冻冻干，即得石上柏总双黄酮前体脂质体 (P-TBESD)粉末将其置于4℃保存。

优选地，上述步骤(1)中大豆卵磷脂浓度为30mg/ml。

优选地，上述步骤(2)中的磷酸盐缓冲溶液的PH为7.4。

优选地，上述步骤(2)中超声处理的频率为10～100kHz，时间为5～20min。

优选地，上述步骤(3)中的冻干保护剂为双歧糖。

优选地，所述制备方法制得的石上柏总双黄酮前体脂质体(P-TBESD)在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点在于：本发明旨在提供一种石上柏总双黄酮前体脂质体及其制备方法，采用薄膜分散-超声法结合冷冻干燥技术，通过将TBESD包裹于脂质双分子层中制备石上柏总双黄酮前体脂质体(P-TBESD)，包封率高，呈表面粗糙的球形，粒径约为250nm，该工艺能显著提高前体脂质体产品长期储存的稳定性。克服了TBESD中双黄酮化合物的溶解性差，提高了石上柏总双黄酮提取物(TBESD)的生物利用度及抑瘤作用，为TBESD作为抗肿瘤药物的研究与开发提供安全有效的载药***。

附图说明

图1为空白脂质体阴性对照、混合对照品溶液和TBESD脂质体溶液的HPLC 色谱图；

图2为TBESD脂质体透射电镜图；

图3为TBESD脂质体粒径分布图；

图4为TBESD脂质体Zeta电位图；

图5为小鼠平均体重变化；

图6为小鼠移植瘤生长曲线；

图7为各组小鼠治疗后的荷瘤。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例中对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例

1、石上柏总双黄酮前体脂质体(P-TBESD)的制备和质量评价

1.1实验材料与仪器

穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2″,3″-二氢-3′,3″′-双芹菜素、3′,3″′-双柚皮素、Delicaflavone均由作者从石上柏中提取、分离、纯化获得，并经MS、UV、 IR、1H NMR、13CNMR数据确证，所有对照品纯度均大于98％。

大豆卵磷脂，胆固醇，脱氧胆酸钠，甲醇、乙腈均为色谱级，乙酸亦为色谱级，二氯甲烷、乙醇为分析级，TBESD由本实验室自制。超纯水由Milli-Q ***制备纯化。其他试剂均为分析纯。

Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪，Shimadzu SPD-M20A DAD检测器， Milli-Q超纯水***，Eppendorf Centrifuge 5424 R冷冻离心机，FEI Tecnai G2 F20 透射电子显微镜，Nano plus纳米粒度与Zeta电位分析仪，Netzsch STA449C同步热分析仪，Buchi R-300旋转蒸发仪，VGT-1990QTD超声波清洗仪，冷冻干燥机。

1.2 P-TBESD中双黄酮含量测定方法的建立

1.2.1仪器分析方法

Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪配有二元泵、自动进样器、柱温箱和 DAD检测器。色谱柱为

XB-C18柱(100mm×4.6mm i.d.,3.5μm；Welch Materials,Inc.,Ellicott,MD,USA)；采用0.5％醋酸-乙腈梯度洗脱；检测波长：270nm；流速：1ml/min；柱温30℃；进样量：10μL。

1.2.2供试品溶液的制备

称取P-TBESD粉末适量，置于10mL容量瓶中，加入甲醇超声破乳，放冷至室温后用甲醇定容至刻度，即得。

1.2.3方法学验证

1.2.3.1专属性实验

取2.2.5项下的混合对照品母液用甲醇配制成适宜浓度的混合对照品溶液；取P-TBESD粉末和空白前体脂质体粉末适量，经1.2.2项下处理后，取10μL 分别进HPLC分析。比较色谱峰保留时间，考察辅料对双黄酮检测的影响，验证方法专属性。

1.2.3.2标准曲线的建立

精密量取1.2.1项下的混合对照品母液，用甲醇逐级稀释配制梯度浓度的标准溶液。其中，穗花杉双黄酮浓度为1、2、10、50、100和200μg/mL；罗伯斯特双黄酮、2″,3″-二氢-3′,3″′-双芹菜素、3′,3″′-双柚皮素和Delicaflavone浓度为 0.5、1、5、25、50、100μg/mL，分别取10μL进HPLC分析，记录5个双黄酮峰面积，以各成分峰面积对双黄酮浓度作线性回归。

1.2.3.3精密度试验

配制高、中、低三个浓度的QC混合标准品溶液，按1.2.2项下色谱条件进 HPLC分析，每个浓度标准溶液重复进样6次，记录峰面积，考察方法精密度。

1.2.3.4重复性试验

精密称取26.0mg的同批次P-TBESD粉末6份，经1.2.2项下处理后，取10μL进HPLC分析，记录峰面积，计算6份供试品浓度的RSD值，考察方法重复性。

1.2.3.5加样回收率试验

取1.2.2项供试品溶液进HPLC分析，记录峰面积并计算5个双黄酮的药物浓度，记为W样。另外精密称取P-TBESD粉末26.0mg于10mL容量瓶，分别加入适量2.2.5项下的混合对照品母液，加甲醇超声破乳、定容，使穗花杉双黄酮浓度分别为60、40和20μg/mL；罗伯斯特双黄酮、2″,3″-二氢-3′,3″′-双芹菜素、3′,3″′-双柚皮素和Delicaflavone浓度为30、20和10μg/mL的三个浓度，每浓度配制3份，进HPLC分析，记录峰面积，计算供试品加入对照品后的药物浓度，记为W总。相对于对照品药物浓度，记为W标，按以下公式计算加样回收率。

加样回收率＝/W标×100％

1.2.3.6稳定性试验

取适量同批次P-TBESD粉末配制的供试品溶液，在进样盘上室温分别放置 0、4、8、12和24h后进HPLC分析，记录峰面积，考察样品稳定性。

1.2.3 P-TBESD包封率的测定

包封率是评价脂质体内在质量的一个重要指标。常见的包封率测定方法有葡聚糖凝胶过滤法、透析法、超滤法和超速离心法等。由于TBESD成分复杂，本章实验采用超速离心法利用高转速使游离药物和TBESD脂质体分离，达到测定重悬P-TBESD的包封率的目的。

1.2.3.1游离双黄酮的分离

称取适量的P-TBESD粉末，加入超纯水1mL涡旋3min重悬，在4℃条件下20.000rpm离心30min，吸取全部上清液于离心管，经1.2.2项下处理后，取10μL进HPLC分析，测定上清液5个游离双黄酮含量之和，记为W游；另取等量P-TBESD粉末，同样加入1mL超纯水重悬，经1.2.2项下处理后，进 HPLC分析，测定脂质体中5个双黄酮总含量，记为W总，按以下公式计算包封率。

EE％＝/W总×100％

1.2.3.2方法回收率

取1mL空白脂质体9份，分别加入适量2.2.5项下的混合对照品母液，配制高、中、低三个浓度的混合脂质体溶液各3份，经1.2.3.1项下处理分离游离双黄酮，取10μL进HPLC分析，计算方法回收率。

1.2.4 P-TBESD的制备及处方优化

1.2.4.1 P-TBESD的制备

本章采用薄膜分散-超声法[100]来制备TBESD前体脂质体。精密称取处方量的石上柏总双黄酮提取物、大豆卵磷脂和胆固醇于50mL圆底烧瓶，加入适量二氯甲烷超声溶解。于旋转蒸发仪40℃水浴减压蒸发，直至无二氯甲烷溶剂残留，在圆底烧瓶内壁形成一层均匀的脂质薄膜。称取处方量的脱氧胆酸钠溶于50mL的磷酸盐缓冲溶液加入圆底烧瓶水化薄膜；将圆底烧瓶置于50℃水浴的磁力搅拌器上磁力搅拌30min使薄膜成分水化。随后将其置于冰水浴中超声 10min，得TBESD脂质体混悬液。最后，将TBESD脂质体混悬液加入处方量的双歧糖，完全溶解后进行冷冻冻干，即得P-TBESD粉末将其置于4℃保存。

1.2.1.2P-TBESD的处方优化

据相关文献可知，正交设计实验是一种具有很好***性和统计性的实验方案优化方法，是最传统、常用的药物制剂处方及工艺筛选的方法。它能以最小的试验数量实验试验结果的最大覆盖率[55]。若在其他条件不变的情况下，对四种因素进行各3个水平的单因素考察，需总共设计81项试验；然而正交设计仅需9项试验就能有效、快速完成。因此，在本章实验中，我们拟对大豆卵磷脂浓度、大豆卵磷脂与药物、胆固醇和脱氧胆酸钠比例为考察因素，以包封率为主要考察指标设计正交实验，对P-TBESD的工艺进行优化，四种变量因素及水平见表1 -1。实验设计方案和结果见表1 -2。

表1 -1正交实验的影响因素

	A(mg/<u>mL</u>)	B	C	D
					1	10	15∶1	15∶1	15∶1
2	20	10∶1	10∶1	10∶1
					3	30	5∶1	5∶1	5∶1

表1 -2正交实验结果

	A	B	C	D	EE
						1	1	1	1	1	65.17
2	1	2	2	2	86.56
						3	1	3	3	3	68.93
4	2	1	2	3	69.55
						5	2	2	3	1	62.75
6	2	3	1	2	73.01
						7	3	1	3	2	80.81
8	3	2	1	3	87.67
						9	3	3	2	1	78.84
K<sub>1</sub>	220.65	215.53	225.85	206.76
						K<sub>2</sub>	205.31	236.98	234.94	240.38
K<sub>3</sub>	247.32	220.77	212.49	226.15
						k<sub>1</sub>(＝K<sub>1</sub>/3)	73.55	71.84	75.28	68.92
k<sub>2</sub>(＝K<sub>2</sub>/3)	68.44	78.99	78.31	80.13
						k<sub>3</sub>(＝K<sub>3</sub>/3)	82.44	73.59	70.83	75.38
R	14.00	7.15	7.48	11.21
						Optimal parameter	A<sub>3</sub>	B<sub>2</sub>	C<sub>2</sub>	D<sub>2</sub>

由表1 -2可知，四种变量因素对TBESD脂质体包封率影响的顺序为A＞D ＞C＞B。因此，当大豆卵磷脂浓度为30mg/mL，大豆卵磷脂与TBESD比例为 10：1，大豆卵磷脂与胆固醇和脱氧胆酸钠的比例亦为10：1时，将得到最大的包封率。由于该比例处方不在正交实验范围内，因此需要进行验证性实验。验证实验结果表明，最佳比例处方制备的TBESD脂质体的包封率为92.38％，说明该比例为此实验的最佳处方。

1.2.5P-TBESD的质量评价

1.2.5.1形态学特征

本章采用FEI Tecnai G2 F20透射电镜来观察P-TBESD的形态学特征。取制备好的TBESD脂质体混悬液适量，用超纯水稀释10倍后滴于铜载网上，在室温条件下自然挥干，然后滴加0.2％磷钨酸进行负染，挥干后置于透射电子显微镜下观察。

1.2.5.2粒径分布和Zeta电位

取3批最优处方制备的P-TBESD重悬后的脂质体混悬液，用Nano plus纳米粒度与Zeta电位分析仪对脂质体的粒径、多分散系数和Zeta电位进行测定。

1.2.5.3包封率及载药量

精密称取3批最优处方制备的P-TBESD，记为WL，包封率的测定方法同 1.2.3.1项下的内容；载药量按包封率计算的W总、W游值，按以下公式计算载药量。

DL％＝/WL×100％

1.2.5.4初步稳定性研究

脂质体具有热力学不稳定性，在制备和储存过程中易发生聚集、沉淀和渗漏等问题，对其稳定性进行考察具有重要意义。本章采用恒温加速法来考察 P-TBESD的储存稳定性，取3批最优处方制备的P-TBESD按市售药品密封包装。在40℃环境温度和75％相对湿度条件下保存，连续考察半月，每隔5天分别取样重悬，测定P-TBESD的粒径、Zeta电位和包封率。

1.3结果与讨论

1.3.1 P-TBESD中双黄酮含量测定的方法学验证

1.3.1.1专属性实验

方法专属性结果如附图1所示，对比双黄酮混标溶液、TBESD脂质体溶液和空白脂质体阴性对照溶液的色谱图，可发现阴性对照在穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2″,3″-二氢-3′,3″′-双芹菜素、3′,3″′-双柚皮素和Delicaflavone的出峰无干扰，脂质体供试品和混标对照品在相应保留时间有相应响应，表明在1.2.1 项色谱条件下可以有效检测P-TBESD中5个双黄酮成分，方法的专属性良好。

1.3.1.2标准曲线的建立

取1.2.3.2项下配制的梯度浓度的标准溶液，进HPLC分析。以各双黄酮标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到5个双黄酮的线性回归方程，见表1 -3，各成分在相应检测浓度范围内线性关系良好。

表1 -3双黄酮的标准曲线

1.3.1.3精密度试验

取1.2.3.2项下配制的QC混合标准品溶液，按1.2.2项下色谱条件进HPLC 分析，每个浓度标准溶液重复进样6次，5个双黄酮的精密度RSD值均小于 3.00％，结果表明方法的精密度良好。

表1 -4 P-TBESD中双黄酮的精密度和重复性

1.3.1.4重复性试验

取按1.2.3.4项下方法，平行制备的6份TBESD供试品溶液，进HPLC分析，5个双黄酮的重复性RSD值均小于3.00％，结果表明方法的重复性良好。 1.3.1.5加样回收率试验

双黄酮的的加样回收率测定结果见表1 -5，穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、 2″,3″-二氢-3′,3″′-双芹菜素、3′,3″′-双柚皮素和Delicaflavone低、中、高三个浓度的加样回收率范围在98-102％之间，RSD值小于2.00％，表明方法的准确度良好。

表1 -5 P-TBESD中双黄酮的回收率

1.3.1.6稳定性试验

按1.2.3.6项下操作，分别于0、4、8、12和24h时，进HPLC分析同一个供试品溶液，穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2″,3″-二氢-3′,3″′-双芹菜素、3′, 3″′-双柚皮素、Delicaflavone的RSD值分别为1.63％，1.12％，2.17％，1.93％， 2.31％，结果表明样品成分在24h稳定性良好。

1.3.2超速离心法测定P-TBESD的包封率

使用超速离心法分离P-TBESD重悬液中穗花杉双黄酮、罗伯斯特双黄酮、2″,3″-二氢-3′,3″′-双芹菜素、3′,3″′-双柚皮素和Delicaflavone三个浓度的方法回收率，实验结果见表1 -6。五种双黄酮的回收率范围在98.91-102.06％之间，其 RSD值均小于3.00％，实验结果表明方法的分离效果良好，此方法适用于测定 P-TBESD重悬所得的TBESD脂质体的包封率测定。

表1 -6超速离心法检测P-TBESD重悬脂质体中双黄酮的回收率(n＝3)

1.3.3 P-TBESD的质量评价

1.3.3.1形态学特征

将处理好的TBESD脂质体铜载网置于TEM下，在镜下可观察到最佳处方制备的TBESD脂质体呈球形或近球形微粒，表面较为粗糙，均匀分布，粒径约 250nm，结果见附图2。

1.3.3.2粒径分布和Zeta电位

按最佳处方制备的P-TBESD重悬后得到的TBESD脂质体，在室温条件下用Nanoplus纳米粒度仪测定其粒径分布和Zeta电位。如附图3和附图4所示，测定的TBESD脂质体粒径为249.77±15.68nm，与TEM镜下得到的结果相近； PDI为0.184±0.002，表明TBESD脂质体的粒度分布较均匀；Zeta电位为-21.89 ±1.51mV，表明TBESD脂质体的稳定性较好。

1.3.3.3包封率及载药量

按正交设计实验优化得到的最优处方制备三批P-TBESD重悬后，采用1.2.3 项和1.2.5.3项下的方法分别测定脂质体的包封率和载药量，其结果分别为91.39 ±0.88％和7.59±0.08％。实验结果表明最佳处方制备的脂质体对TBESD中的双黄酮成分具有较强的包载能力，载药量也较高。

1.3.3.4初步稳定性研究

三批P-TBESD在初步稳定期考察的15天后，粉末外观疏松，无明显变化；重悬后TBESD脂质体悬浮液无聚集、沉淀和分层等现象。三批P-TBESD在40℃环境温度和75％相对湿度条件下的稳定性结果见表1 -7，在此期间TBESD脂质体的粒径和粒度分布数据无显著性差异，但双黄酮的包封率在10天后略有下降，但变化不显著，结果表明P-TBESD使用恒温加速法在15天内样品有较好的贮存稳定性。

表1 -7 P-TBESD恒温加速实验稳定性

Time	Diameter(nm)	PDI	EE(％)
				5	249.77±15.68	0.184±0.002	91.39±0.88
10	250.63±12.16	0.189±0.014	90.83±0.91
				15	251.31±17.62	0.187±0.020	88.65±1.03

2、药理实验：石上柏总双黄酮前体脂质体的体内抗肿瘤的实验

2.1实验材料与仪器

石上柏总双黄酮提取物、氟尿嘧啶注射液，0.25g/支。

无水乙醇、PEG-400和丙二醇均为分析级，PBS缓冲液，生理盐水，RPMI1640 培养基，胰蛋白酶，胎牛血清，0.25％Trypsin-EDTA。便携式MT-8060pH计；游标卡尺；BBl6UV/BB5060UV型CO2培养箱；XDS-1B型倒置显微镜； LDZX-50KB型蒸汽灭菌器。

2.2实验动物与细胞株

雄性BALB/c裸鼠30只，SPF级，体重20±2g，饲养于福建医科大学实验动物中心，饲养条件：室温为24±2℃，湿度为55±5％，12h昼夜更替环境恒定的动物房内，并给予标准的大鼠食物和饮水。实验前适应性喂养一周，受试前禁食12h，全程不禁水。

细胞株：HT29细胞株。

2.3建立HT29结肠癌荷瘤小鼠模型

复苏冻存的人源性HT29结肠癌细胞，待其生长状态良好处于对数生长期时，用胰酶将其消化并配制成浓度为1×107个/mL的细胞悬浮液。待实验动物适应性喂养一周后，吸取0.2mL细胞悬浮液接种于6周龄BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下，待移植瘤生长至50-70mm3为建模成功。

2.4药物的配制

精密称取TBESD冻干粉末，溶解于混合溶剂丙二醇-乙醇-0.5MNaOH-生理盐水，配制成20mg/mL的TBESD混悬液。

精密称取P-TBESD粉末，用适量超纯水重悬，配制成20mg/mL的TBESD 脂质体溶液。

氟尿嘧啶用生理盐水稀释，配制成5mg/mL的氟尿嘧啶注射液。

2.5分组与给药

筛选肿瘤大小相对一致的裸鼠24只，将其随机分为：阴性对照组、阳性对照组、TBESD原药组和P-TBESD脂质体组，共4组，每组6只。TBESD原药组和P-TBESD脂质体组每天按小鼠体重灌胃给药，0.2mL/10g；阳性对照组经尾静脉给予氟尿嘧啶注射液25mg/kg，每3天给药一次，0.05mL/10g；阴性对照组每天经口给予等体积受试药物溶剂，连续给药14天。

2.6观察指标及测定

2.6.1一般情况观察

每天观察给药后小鼠的动物行为、活动反应、饮食及睡眠情况，隔天用电子秤记录其体重，绘制其生长曲线；用电子游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按以下公式计算瘤体积[108,109]。记录瘤体积变化并绘制肿瘤的生长曲线。

瘤体体积＝1/2×L(mm)×W2(mm2)

2.6.2抑瘤率

给药后第15天停药，颈椎脱臼处死小鼠，将腋窝皮下荷瘤完整剥离，用分析天平记录瘤块重量，并按以下公式计算抑瘤率。

抑瘤率＝×100％

2.7结果与讨论

2.7.1一般情况观察

在肿瘤药效学评价的实验过程中，小鼠的体重变化能一定程度反应药物的毒副作用。附图5结果表明，与阴性对照组相比，TBESD原药组和P-TBESD脂质体组的小鼠体重没有显著性差异；阳性对照组与阴性对照组相比，差异性显著。阳性组小鼠给予氟尿嘧啶注射液，药效实验过程中小鼠体重持续下降，表明氟尿嘧啶注射液具有相对高的毒性；而TBESD和P-TBESD脂质体给药后，小鼠体重无明显变化，表明在此剂量下无明显毒副作用。

由附图6可以观察到实验期内肿瘤体积随时间的变化趋势。实验结果显示，阴性对照组的肿瘤体积在实验结束时是其初始体积的4.97倍。与阴性对照相比， TBESD原药组、P-TBESD脂质体和阳性对照组均对体内肿瘤生长具有抑制作用。由结果可知，对体内肿瘤生长的抑制作用阳性对照组＞P-TBESD脂质体＞ TBESD原药组，各实验组结果与阴性对照组差异性显著。

2.7.2抑瘤率

给药周期结束后，将腋窝皮下荷瘤完整剥离并称重计算各组的抑瘤率，结果见表2。结果表明，阳性对照组、TBESD原药组和P-TBESD脂质体的瘤块质量均明显减少，与阴性对照组相比差异性显著，TBESD对结肠癌HT29细胞裸鼠皮下异种移植瘤具有明显的抑制作用，具有较好的体内抗肿瘤作用。TBESD 原药组、P-TBESD脂质体和氟尿嘧啶阳性对照组干预后裸鼠的平均肿瘤抑制率分别为：25.96％、48.41％和56.75％。TBESD原药组和P-TBESD脂质体两组差异性显著，结果说明P-TBESD脂质体可以显著提高TBESD的生物利用度及治疗效果。

表2 各组治疗前后小鼠的平均体重和肿瘤抑制率(Mean±SD,n＝6)

Groups	Dose(mg/kg)	<u>Tumorweights</u>(g)	<u>Tumorweight</u>-<u>inhibitions</u>(％)
				<u>Conrtol</u>	Solution	0.376±0.049	-
Fluorouracil	25mg/kg	0.163±0.059**	56.75
				TBESD	300mg/kg	0.278±0.035**	25.96
P-TBESD	300mg/kg	0.192±0.047**	48.85

Comparedwithcontrol：*p＜0.05，**p＜0.01

2.7.3移植瘤组织观察

给药周期结束后，将腋窝皮下荷瘤完整剥离，可观察到肿瘤组织呈球形或类球形，质地较硬，组织边界清晰且表面有毛细血管分布。由附图7明显可见，氟尿嘧啶阳性对照组、实验组与阴性对照组相比，瘤组织明显较小。

2.8小结

小鼠体内药效学评价可以反映药物药效与毒性的综合结果，是体外活性实验和其他检测方法所难以替代的。本章采用异种移植瘤模型考察了TBESD和 P-TBESD脂质体对HT29荷瘤小鼠的体内药效学评价。实验结果显示，TBESD 和P-TBESD脂质体对HT29荷瘤小鼠的平均抑瘤率分别为：25.96％和48.41％，两组的抑瘤结果显示差异性显著。由此可见，P-TBESD脂质体提高了TBESD 的生物利用度，其体内抑瘤作用明显提高、药效增强。同时，未见明显毒副反应。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种石上柏总双黄酮前体脂质体，其特征在于，所述脂质体含有大豆卵磷脂、石上柏总双黄酮提取物、脱氧胆酸钠、胆固醇、冻干保护剂，所述大豆卵磷脂与石上柏总双黄酮提取物、脱氧胆酸钠、胆固醇的比例为10~20:1~10:1~10:1~10，所述石上柏总双黄酮前体脂质体的制备方法包括以下步骤：

（1）精密称取石上柏总双黄酮提取物、浓度为30mg/ml的大豆卵磷脂和胆固醇于50mL圆底烧瓶，加入二氯甲烷超声溶解后于旋转蒸发仪30~80℃水浴减压蒸发，直至无二氯甲烷溶剂残留，在圆底烧瓶内壁形成一层均匀的脂质薄膜；

（2）称取脱氧胆酸钠溶于50mL的磷酸盐缓冲溶液加入圆底烧瓶水化薄膜，磷酸盐缓冲溶液的pH 为7.4；将圆底烧瓶置于30~70℃水浴的磁力搅拌器上磁力搅拌10~50min使薄膜成分水化；随后将其置于冰水浴中进行超声处理，超声处理的频率为10~100kHz，时间为5~20min，得石上柏总双黄酮提取物脂质体混悬液；

（3）将石上柏总双黄酮提取物脂质体混悬液加入冻干保护剂，所述冻干保护剂为双歧糖，所述冻干保护剂与所述石上柏总双黄酮提取物脂质体混悬液的比例为1：1~5，完全溶解后进行冷冻冻干，即得石上柏总双黄酮前体脂质体粉末将其置于4℃保存。

2.根据权利要求1所述的石上柏总双黄酮前体脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

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