CN110467669A - 一种牡蛎中锌金属硫蛋白锌的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的一种牡蛎中锌金属硫蛋白的提取方法，包括以下步骤：取新鲜牡蛎，于冰盐水中浸泡24‑48h，剥壳取牡蛎肉，并剪切至直径为1‑3cm的碎片；加入组织裂解液、二硫苏糖醇，经玻璃匀浆器匀浆10‑20min得到匀浆液；加入脂肪水解酶、纤维素酶、多糖水解酶与匀浆液中，过滤；80℃水浴加热酶解混合物，过滤，在滤液中加入植酸调节pH至3.5‑4.5，得到植酸锌沉淀，再调节pH至1，过滤去除植酸镉，得金属硫蛋白溶液；利用分子筛凝胶层析法分离金属硫蛋白；取植酸锌沉淀，调整pH至8‑10，过滤，将所得滤液与所得金属硫蛋白混合，加热至50‑70℃，搅拌反应得锌金属硫蛋白，利用不同状态生物锌，得到锌金属硫蛋白螯合物，无重金属残留，纯度高、杂蛋白少、锌利用率高、提取率高。
Description
技术领域
本发明涉及牡蛎提取领域，具体涉及一种牡蛎中锌金属硫蛋白的提取方法。
背景技术
锌是我们人体不可缺少的微量元素，适于人体的补锌试剂经历了三种形态：如硫酸锌、氯化锌、硝酸锌等的无机锌，如萄糖酸锌、甘草锌、醋酸锌、柠檬酸锌、氨基酸锌、乳酸锌等的有机锌，再如蛋白质和锌的熬合物的生物锌，生物锌又叫锌蛋白、锌结合蛋白，顾名思义是蛋白质和锌的结合物，蛋白锌相较于无机锌、有机锌而言，对人体无任何副作用，可饭前服用，活性高，可有效促进人体对各种营养素的吸收和利用，且不会拮抗钙铁等营养素的吸收，从而最终达到使人体从膳食来补充各种营养素的效果，它们之间的连接既可以是以共价键结合的化合物形式，也可以是以配位键为主的螯合物形式，大自然中蛋白质的种类高达数百万种，因此从理论上讲，蛋白锌也可以有数百万种甚至更多，而锌金属硫蛋白（Zn-MT）是一种富含锌和巯基的低分子量蛋白质，在补锌的同时，其在重金属解毒、微量元素代谢、清除自由基、拮抗脂质过氧化等方面起着重要的作用。
牡蛎又名生蚝，也叫海蛎子，鲜牡蛎肉呈青白色，质地柔软细嫩，欧洲人称牡蛎“海中的牛奶”，是所有食物中含锌最丰富的，每100g牡蛎肉，含水87.1%，含锌71.2mg，如何把牡蛎中的锌作为生物锌提取供人体使用是一个重大课题，现有技术中，如专利CN201010234452公开了从牡蛎中同步提取牛磺酸、生物锌和多肽的方法，此方法的缺点是由于超声破碎法是利用高频机械波作用于溶液时产生气泡，气泡长大和破碎出现空化现象，而空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破裂，超声波本身引起冲击波和剪切力无方向性和分子裂解能力，故只能释放出游离生物锌，对于大部分以锌蛋白结构的生物锌无法释放出来，游离生物锌分子量不一，造成生物吸收利用率低、吸收慢等缺点，因此对该专利的改进专利CN105476014A利用物理研磨和酶解法提取游离的生物锌及锌蛋白，然而，而该方法只能得到氨基酸锌或多肽锌，氨基酸锌属于有机锌，它们是弱酸弱碱盐，和胃酸结合，依然能产生氯化锌，氯化锌是强腐蚀剂，对胃肠道有刺激作用，引起恶心呕吐等，因此有一定的副作用，且因含锌量较高，能拮抗钙铁等营养素的吸收，不能同补，长期服用能导致缺钙贫血等症状，另外该方法用分子筛分离生物锌，因分子筛只能作用于大分子分离，如多肽、蛋白质、核酸、多糖等，对于小分子如游离态的锌离子，会随着流动相进入凝胶的所有孔洞，最后从柱中流出，导致游离态的锌混合着酶水解产物等杂质损失，提取率低。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种牡蛎中锌金属硫蛋白的提取方法，利用不同状态的生物锌，针对性的得到锌金属硫蛋白螯合物，无重金属残留，纯度高、杂蛋白少、锌利用率高、提取率高。
本发明解决问题的技术方案是，提供一种牡蛎中锌金属硫蛋白的提取方法，包括以下步骤：（1）取新鲜牡蛎，于冰盐水中浸泡24-48h，剥壳取牡蛎肉，并剪切至直径为1-3cm的碎片；（2）加入组织裂解液、二硫苏糖醇，经玻璃匀浆器匀浆10-20min得到匀浆液；（3）加入脂肪水解酶、纤维素酶、多糖水解酶与匀浆液中，过滤，得到酶解液混合物；（4）80℃水浴加热酶解混合物，过滤，在滤液中加入植酸调节pH至3.5-4.5，得到植酸锌沉淀，再调节pH至1，过滤去除植酸镉，得金属硫蛋白溶液；（5）利用分子筛凝胶层析法分离金属硫蛋白；（6）取植酸锌沉淀，调整pH至8-10，过滤，将所得滤液与步骤（5）所得金属硫蛋白混合，加热至50-70℃，搅拌反应得锌金属硫蛋白。
优选地，所述组织裂解液包括50 mmol/L Ph 7.4的Tris-base、1%的Triton X-100、0.25%的去氧胆酸钠、150mmol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA、1μg/ml的亮抑酶肽、 1μg/ml的抑蛋白酶肽、1μg/ml的胃蛋白抑制剂、1mmol/L PMSF。
优选地，所述组织裂解液的加入量为750-1000ml，以100g牡蛎肉计。
优选地，所述二硫苏糖醇的加入量为10-20g，以100g牡蛎肉计。
优选地，所述脂肪水解酶活力为5-7U/g，加入量为5-10mg，所述纤维素酶活力为4-7U/g，加入量为1-5mg，所述多糖水解酶活力为20-30 U/g，加入量为2-8mg，其中加入量以100g牡蛎肉计。
优选地，所述分子筛凝胶层析法所用凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex G-25，所用洗脱液为Tris-甘氨酸。
优选地，所述步骤（3）和步骤（4）还包括步骤（3.1）：加入酶活力为10-20U/g 20mg的蛋白消化酶，以牡蛎肉为100g计。
牡蛎由于海洋环境的污染，存在重金属如Cd2+污染的情况，并连同自身存在的Zn2+诱导牡蛎体内金属硫蛋白的表达，因此牡蛎中存在含量丰富的金属硫蛋白，它含有61个氨基酸，其中21个氨基酸为半胱氨酸，这样每一个MT分子就可以最多结合七个金属原子，实际情况中，诱导合成的金属硫蛋白不会每一个分子都结合满金属离子，其以已鳌合金属离子的Zn-MT、Cd-MT形态及未鳌合金属离子的MT形态存在，其中，鳌合的锌或镉每分子数量不等，他们均属于可溶性金属蛋白，若直接提取含MT的蛋白，则容易将含重金属的MT摄入，引起人体中毒，因此需要去除与MT鳌合的Cd2+，且为了提高锌金属硫蛋白的提取率，尽可能的将牡蛎中的Zn2+完全提取并与金属硫蛋白鳌合并去除无关杂蛋白。
锌金属硫蛋白是一种正四面体金属巯基熬和族，结晶构相相当稳定，但它仍可通过提供锌而激活许多以锌为辅基的酶，能补充哺乳动物必需的微量元素锌和蛋白质，而且吸收好，拮抗有害微量元素铅、镉等，激活多种抗氧化酶，从而消除自由基的氧化损害，保持细胞膜的稳定；能增强哺乳动物的免疫功能，有促使内分泌正常的双向调节作用，在溶液状态或被氧化时极易产生二聚体或多聚形式，本方案对Zn-MT提取在低温环境下迅速完成，并加入二硫苏糖醇作为还原剂防止二聚体的形成。
MT不含α-螺旋和β-折叠片，存在非常坚固的构象，化学性质稳定，可以在80℃的水中存活30分钟，100℃的水中存活3分钟而不失活，具有很强的抗热性和抵抗蛋白酶消化的能力，本方案中利用该性质去除无关杂蛋白。
MT分子虽然本身耐酸、耐热，但MT-Zn在pH3.5-4.5时易解离，MT-Cd在pH小于1时易解离，而植酸具有羧基和磷酸基等大量活性基团，是一种金属多齿螯合剂，当与金属络合时，易形成多个鳌合环，所形成的络合物稳定性极强，即时在强酸环境中，植酸也可形成稳定的络合物，且植酸作用于金属离子还只局限于钙、镁、铁、铝，较少涉及重金属离子，本方案中植酸与MT竞争络合Zn2+，所得络合物为白色絮状沉淀，再通过分子筛凝胶法得到高纯度的MT分子，最大限度的利用了牡蛎中的锌和金属硫蛋白，得到锌金属硫蛋白。
本方案的有益效果为：
1. 低温环境诱导牡蛎中金属硫蛋白的合成，为后续完全利用生物锌提供足够量的载体，避免牡蛎中锌元素的浪费，同时盐水有杀菌的作用，避免微生物细菌对生物锌或牡蛎蛋白进行降解；
2．利用组织裂解液裂解牡蛎组织，匀浆器匀浆，避免使用超声等强性手段，更完整的得到生物锌及牡蛎中的蛋白成分，同时在匀浆过程中，加入二硫苏糖醇防止锌金属硫蛋白形成二局或多聚物，不便于锌与金属硫蛋白分离；
3. 脂肪水解酶、纤维素酶、多糖水解酶水解牡蛎组织匀浆物，充分释放生物锌，且便于后续步骤（6）用碱去除水解产物脂肪酸，并利用金属硫蛋白耐高温特性80℃变性杂蛋白，得到高纯度的金属硫蛋白；
4. 在pH小于3.5-4.5时，解离与金属硫蛋白鳌合的金属锌，形成植酸锌沉淀，再调节pH至1，解离金属硫蛋白与镉离子，去除植酸镉，得到未螯合金属离子的金属硫蛋白，及分离的植酸锌与植酸镉，防止提取过程中锌的损失，得到解离金属离子的金属硫蛋白；
5. 利用分子筛凝胶层析法分离金属硫蛋白，精度高，避免金属硫蛋白的流失及大分子杂质的混入；
6.提取全过程无毒无害，所得锌金属硫化物安全、健康。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
配置组织裂解液：50 mmol/L Ph 7.4的Tris-base、1%的Triton X-100、0.25%的去氧胆酸钠、150mmol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA、1μg/ml的亮抑酶肽、 1μg/ml的抑蛋白酶肽、1μg/ml的胃蛋白抑制剂、1mmol/L PMSF 混合即得RIPA组织裂解液。
收集新鲜牡蛎进行清洗，去除泥沙，剥壳取牡蛎肉，将100g牡蛎肉加入食盐溶液在冰水中浸泡24h，再用清水漂洗后沥干，将牡蛎肉切成直径为1cm的碎片，加入750ml RIPA组织裂解液，加入20g用以防止Zn-MT聚合的二硫苏糖醇，用玻璃匀浆器匀浆10min，得到牡蛎匀浆液，加入复合酶：脂肪酶，其中脂肪水解酶活力为5U/g，加入量为5mg，纤维素酶，其中纤维素酶活力为4U/g，加入量为5mg，多糖水解酶，其中多糖水解酶活力为30 U/g，加入量为8mg，30摄氏度酶解半小时，得酶解液混合物；
80℃水浴加热酶解混合物，过滤，加入1mol/L植酸调节匀浆液pH至4，使杂质蛋白发生不可逆失活，MT释放Zn2+、植酸与MT发生竞争，形成植酸锌沉淀，过滤，滤液再由1mol/L植酸调节pH至1，再过滤，取滤液，利用分子筛分离，所用凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex G-25以Tris-甘氨酸洗脱，得到金属硫蛋白，将所得植酸锌沉淀调节pH至8，植酸与Zn2+解离，过滤取Zn2+滤液，混合所述Zn2+滤液与金属硫蛋白，加热至50℃，搅拌反应得锌金属硫蛋白。
实施例2
收集新鲜牡蛎进行清洗，去除泥沙，剥壳取牡蛎肉，将100g牡蛎肉加入食盐溶液在冰水中浸泡48h，再用清水漂洗后沥干，将牡蛎肉切成直径为1cm的碎片，加入800ml RIPA组织裂解液，加入15g用以防止Zn-MT聚合的二硫苏糖醇，用玻璃匀浆器匀浆10min，得到牡蛎匀浆液，加入复合酶：脂肪酶，其中脂肪水解酶活力为6U/g，加入量为7mg，纤维素酶，其中纤维素酶活力为5U/g，加入量为2mg，多糖水解酶，其中多糖水解酶活力为25 U/g，加入量为5mg，30摄氏度酶解半小时，得酶解液混合物；
80℃水浴加热酶解混合物，过滤，加入1mol/L植酸调节匀浆液pH至4.5，使杂质蛋白发生不可逆失活，MT释放Zn2+、植酸与MT发生竞争，形成植酸锌沉淀，过滤，滤液再由1mol/L植酸调节pH至1，再过滤，取滤液，利用分子筛分离，所用凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex G-25以Tris-甘氨酸洗脱，得到金属硫蛋白，将所得植酸锌沉淀调节pH至8，植酸与Zn2+解离，过滤取Zn2+滤液，混合所述Zn2+滤液与金属硫蛋白，加热至50℃，搅拌反应得锌金属硫蛋白。
实施例3
收集新鲜牡蛎进行清洗，去除泥沙，剥壳取牡蛎肉，将100g牡蛎肉加入食盐溶液在冰水中浸泡48h，再用清水漂洗后沥干，将牡蛎肉切成直径为1cm的碎片，加入1000ml RIPA组织裂解液，加入15g用以防止Zn-MT聚合的二硫苏糖醇，用玻璃匀浆器匀浆10min，得到牡蛎匀浆液，加入复合酶：脂脂肪酶，其中脂肪水解酶活力为7U/g，加入量为10mg，纤维素酶，其中纤维素酶活力为7U/g，加入量为1mg，多糖水解酶，其中多糖水解酶活力为20 U/g，加入量为2mg，30摄氏度酶解半小时，得酶解液混合物；
80℃水浴加热酶解混合物，过滤，加入1mol/L植酸调节匀浆液pH至3.5，使杂质蛋白发生不可逆失活，MT释放Zn2+、植酸与MT发生竞争，形成植酸锌沉淀，过滤，滤液再由1mol/L植酸调节pH至1，再过滤，取滤液，利用分子筛分离，所用凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex G-25以Tris-甘氨酸洗脱，得到金属硫蛋白，将所得植酸锌沉淀调节pH至8，植酸与Zn2+解离，过滤取Zn2+滤液，混合所述Zn2+滤液与金属硫蛋白，加热至50℃，搅拌反应得锌金属硫蛋白。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种牡蛎中锌金属硫蛋白锌的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取新鲜牡蛎，于冰盐水中浸泡24-48h，剥壳取牡蛎肉，并剪切至直径为1-3cm的碎片；
（2）加入组织裂解液、二硫苏糖醇，经玻璃匀浆器匀浆10-20min得到匀浆液；
（3）加入脂肪水解酶、纤维素酶、多糖水解酶与匀浆液中，过滤，得到酶解液混合物；
（4）80℃水浴加热酶解混合物，过滤，在滤液中加入植酸调节pH至3.5-4.5，得到植酸锌沉淀，再调节pH至1，过滤去除植酸镉，得金属硫蛋白溶液；
（5）利用分子筛凝胶层析法分离金属硫蛋白；
（6）取植酸锌沉淀，调整pH至8-10，过滤，将所得滤液与步骤（5）所得金属硫蛋白混合，加热至50-70℃，搅拌反应得锌金属硫蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种牡蛎中锌金属硫蛋白锌的提取方法，其特征在于，所述组织裂解液包括50 mmol/L Ph 7.4的Tris-base、1%的Triton X-100、0.25%的去氧胆酸钠、150mmol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA、1μg/ml的亮抑酶肽、 1μg/ml的抑蛋白酶肽、1μg/ml的胃蛋白抑制剂、1mmol/L PMSF。
3.根据权利要求1所述的一种牡蛎中锌金属硫蛋白锌的提取方法，其特征在于，所述组织裂解液的加入量为750-1000ml，以100g牡蛎肉计。
4.根据权利要求1所述的一种牡蛎中锌金属硫蛋白锌的提取方法，其特征在于，所述二硫苏糖醇的加入量为10-20g，以100g牡蛎肉计。
5.根据权利要求1所述的一种牡蛎中锌金属硫蛋白锌的提取方法，其特征在于，所述脂肪水解酶活力为5-7U/g，加入量为5-10mg，所述纤维素酶活力为4-7U/g，加入量为1-5mg，所述多糖水解酶活力为20-30 U/g，加入量为2-8mg，其中加入量以100g牡蛎肉计。
6.根据权利要求1所述的一种牡蛎中锌金属硫蛋白锌的提取方法，其特征在于，所述分子筛凝胶层析法所用凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex G-25，所用洗脱液为Tris-甘氨酸。
7.根据权利要求1所述的一种牡蛎中锌金属硫蛋白锌的提取方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）还包括步骤（3.1）：加入酶活力为10-20U/g 20mg的蛋白消化酶，以牡蛎肉为100g计。
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