CN110447765B - 一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法及其应用，属于发酵工程技术领域，包括：菌种活化、一级种子培养、白酒糟预处理、配制发酵培养基、固体发酵，得到纳豆芽孢杆菌培养物；本发明发酵过程采用固态发酵生产纳豆芽孢杆菌的方法，整个发酵过程遵循无菌操作规程，使纳豆芽孢杆菌的固态培养生产实现了纯种培养，可实现大规模放大生产。本发明涉及的发酵培养基解决了以白酒糟为主要原料发酵中存在的活菌数量低的问题，及液体培养中容易污染杂菌，营养利用率低，菌体及代谢物难分离的问题，大大提高了纳豆芽孢杆菌的产量。

Description

一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法及其应用
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，特别是涉及一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法及其应用。
背景技术
随着白酒工业的发展，白酒生产的副产品——白酒糟的利用已成为行业工作的重点。固态酒糟是白酒生产的主要副产物，也是白酒生产的主要污染物。由于一般采用高粱、小麦等原料，白酒糟的酸度高，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素以及各种微量元素。实践已经证明，白酒糟综合利用程度直接影响企业的发展，如果处理不好，对环境的压力是巨大的；而白酒糟加工饲料的水平又关系到国家饲料政策的落实。
长期以来，白酒糟主要是直接用作农村饲料，对促进农村饲养业的发展及生物链的良性循环，发挥了重要的作用。但是，鲜白酒糟的营养结构已经不能满足饲养业科学喂养的要求及规模发展的需要，特别是鲜白酒糟含水量高达65％以上，贮存极其困难，管理不好极易霉变，大量的白酒糟任意堆放严重污染环境，困扰了企业的发展。
现有技术中已有一些专利等公开的文献，利用白酒酒糟通过发酵制备培养物，并应用到饲料中，但是发酵过程中，一般采用多种类的混合菌：比如酵母菌、霉菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等中的多种混合发酵培养，由于多个菌种的培养条件不一致，需要采用不同的培养条件进行2-3期的培养才能获得最终的培养物，过程复杂和繁琐；另外，虽然采用了多种菌种混合进行发酵，但是最终的活菌含量并不高，经分析可能因为多种菌的适宜培养条件差异较大，可能在不同培养条件下，造成部分菌种不适应环境而死亡，因此最终的活菌数量并不高，进而导致在饲料中的应用价值有待考究；由于上述的原因，还可能导致酒糟的发酵不彻底，得到的发酵培养物的蛋白含量提高并不是很明显。因此，针对酒糟的特殊发酵条件，制备一种基于白酒糟的发酵培养物以高效的应用到动物饲料中很有必要。
目前，纳豆激酶芽孢杆菌作为一种新型微生态制剂，在家畜和水产养殖中的应用效果及作用机制引起了许多学者的广泛关注。而纳豆芽孢杆菌高密度液态发酵工业中，普遍使用蔗糖、酵母浸出物、胰蛋白胨，氯化钠等作为基础培养基，来进行纳豆菌的发酵，从生产角度来讲存在着单位培养基产生菌体数量的浓度较低、菌液分离的成本较高等缺点；同时，液态发酵结束后的菌体提纯一般要采用冷冻干燥或喷雾干燥的方法来保证高活菌数，但由于液态发酵所含的水分很多，所以需要复杂的预除水的环节，才能进行冷冻干燥或喷雾干燥工艺，这导致了成本极高。而固态发酵目前在纳豆芽孢杆菌发酵的研究与应用还不成熟，没有比较稳定的可以生产出优质纳豆芽孢杆菌产品的工艺的相关报道，且工业发酵方法中的固体发酵还有着生产环境要求严格，生产物料消毒困难繁琐，生产过程容易污染杂菌，营养利用率低，菌体及代谢物难分离等缺点。
而且，由于微生物发酵条件的复杂性，不同种类的微生物菌的发酵条件也存在着很大的不同，无法互相借鉴，因此，现亟需一种既可以利用白酒糟又可以得到纳豆芽孢杆菌活菌数高的专门针对纳豆芽孢杆菌的发酵方法以及条件。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基平板上划线，在温度为37-40℃的条件下培养20-24h；所述菌种为纳豆芽孢杆菌；
(2)一级种子培养：将活化的纳豆芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于液体种子培养基中，置于摇床中，震荡培养20-24h，制得一级种子菌；
(3)白酒糟预处理：将白酒糟与水按照质量比1:1-1:2混合均匀，加入碳酸氢钠调整pH值至6.5-7.0，接种一级种子菌，生料发酵，培养3-7天，得到预处理的白酒糟；
(4)配制发酵培养基；
(5)固体发酵：在所述发酵培养基中接种8-10％的一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度和温度，培养20-24h，得到二级种子菌；
(6)将所述二级种子菌，按照步骤(5)进一步发酵，得到纳豆芽孢杆菌培养物。
进一步地，所述纳豆芽孢杆菌，菌种名称为TK-1，分类名称Bacillius subtilis，保藏编号为：CGMCC No.4731，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北城西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
进一步地，在步骤(2)中，所述震荡培养条件为温度37-40℃和250rpm的条件。
进一步地，在步骤(3)中，所述生料发酵条件为通风量为15-30％、温度37-40℃。
进一步地，所述发酵培养基包括以下重量份的组分：经过预处理的白酒糟25-65份、蔗糖5-10份、葡萄糖3-9份、氯化钠3-5份，KH2PO4 2-4份、MnSO4·H2O 0.2-1.5份。
进一步地，所述发酵培养基的配制方法为：将所述发酵培养基各组分混合，按料液比1:0.3-0.8加入水，混合均匀，120-130℃高温高压灭菌20min。
进一步地，在步骤(5)中，所述温度为37-40℃，所述湿度为50-70％。
进一步地，上述步骤还包括：将所得纳豆芽孢杆菌培养物用密封袋密封包装，置于25℃以下条件储藏。
本发明还提供一种纳豆芽孢杆菌微生态制剂，将上述的方法制备的纳豆芽孢杆菌培养物加入重量比为5-9倍的玉米淀粉，混合均匀，于50-80℃的热风中干燥5-13h，粉碎，过40-60目筛，即制得纳豆芽孢杆菌微生态制剂。
本发明还提供一种纳豆芽孢杆菌培养物在动物饲料中的应用，将上述的方法制备的纳豆芽孢杆菌培养物按重量比6％-10％加入动物饲料中，混合均匀后用于饲喂动物。
本发明公开了以下技术效果：
本发明中的纳豆芽孢杆菌以白酒糟为原料发酵制备纳豆激酶，白酒糟是白酒生产的副产品，价格低廉，且白酒糟中含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素以及各种微量元素，利于菌体的生长。
本发明发酵过程采用固态发酵生产纳豆芽孢杆菌的方法，整个发酵过程遵循无菌操作规程，使纳豆芽孢杆菌的固态培养生产实现了纯种培养，可实现大规模放大生产。本发明涉及的发酵培养基解决了以白酒糟为主要原料发酵中存在的活菌数量低的问题，及液体培养中容易污染杂菌，营养利用率低，菌体及代谢物难分离的问题，大大提高了纳豆芽孢杆菌的产量，获得的发酵产品活菌数最高可以达到7.8×1012cfu/g，且具有较高的芽孢率，纳豆激酶酶活最高达到9450FU/g干基。
本发明发酵过程生产出富含纳豆芽孢杆菌和纳豆激酶的生物发酵产品，是制作微生态制剂的理想原料，由于纳豆芽孢杆菌具有芽孢，具有耐酸、耐碱、耐100℃高温及耐挤压，在制粒过程和酸性胃环境中均能保持稳定性，在肠道中不增殖，只在肠道上段迅速发育转变成具有新陈代谢的营养性细胞。纳豆芽孢杆菌能使肠道酸化而有利于铁、钙及维生素D等的吸收，促进动物生长，缩短生长周期，能明显提高蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，增强动物对植物性饲料的可利用种类；并且，纳豆芽孢杆菌属于需氧菌中的非致病菌，以自身的耗氧来促进双歧杆菌、乳酸杆菌和梭菌等厌氧菌的生长，有效抑制肠道中肠杆菌和肠球菌等需氧菌的生长，促进宿主肠道正常菌群生长，保持微生态平衡，提高机体免疫力。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例采用的纳豆芽孢杆菌，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。菌种名称为TK-1，分类名称Bacillius subtilis，保藏编号为：CGMCCNo.4731，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北城西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例1
一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基平板上划线，在温度为38℃的条件下培养22h；所述菌种为纳豆芽孢杆菌；
(2)一级种子培养：将活化的纳豆芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于液体种子培养基中，置于摇床中，在温度38℃和250rpm的条件下，震荡培养22h，制得一级种子菌；
(3)白酒糟预处理：将白酒糟与水按照质量比1:1.5混合均匀，加入碳酸氢钠调整pH值至6.8，接种一级种子菌，保持通风量为25％、温度38℃，生料发酵，培养5天，得到预处理的白酒糟；
(4)配制发酵培养基：发酵培养基包括以下重量份的组分：经过预处理的白酒糟50份、蔗糖6份、葡萄糖7份、氯化钠4份，KH2PO4 3份、MnSO4·H2O 0.9份；配制方法为：将所述发酵培养基各组分混合，按料液比1:0.5加入水，混合均匀，121℃高温高压灭菌20min；
(5)固体发酵：在所述发酵培养基中接种9％的一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度60％和温度39℃，培养23h，得到二级种子菌；
(6)将所述二级种子菌，按照步骤(5)进一步发酵，得到纳豆芽孢杆菌培养物。
上述实施例中，采用PCA平板检测法，测定得到纳豆芽孢杆菌的活菌总数为7.8×1012cfu/g，纳豆激酶酶活最高达到9450FU/g干基。
将上述方法制备的纳豆芽孢杆菌培养物加入重量比为6倍的玉米淀粉，混合均匀，于65℃的热风中干燥8h，粉碎，过50目筛，即制得纳豆芽孢杆菌微生态制剂。
实施例2
一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基平板上划线，在温度为37℃的条件下培养24h；所述菌种为纳豆芽孢杆菌；
(2)一级种子培养：将活化的纳豆芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于液体种子培养基中，置于摇床中，在温度37℃和250rpm的条件下，震荡培养24h，制得一级种子菌；
(3)白酒糟预处理：将白酒糟与水按照质量比1:1混合均匀，加入碳酸氢钠调整pH值至7.0，接种一级种子菌，保持通风量为15％、温度40℃，生料发酵，培养3天，得到预处理的白酒糟；
(4)配制发酵培养基：发酵培养基包括以下重量份的组分：经过预处理的白酒糟65份、蔗糖5份、葡萄糖9份、氯化钠3份，KH2PO4 4份、MnSO4·H2O 0.2份；配制方法为：将所述发酵培养基各组分混合，按料液比1:0.3加入水，混合均匀，120℃高温高压灭菌20min；
(5)固体发酵：在所述发酵培养基中接种10％的一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度50％和温度40℃，培养20h，得到二级种子菌；
(6)将所述二级种子菌，按照步骤(5)进一步发酵，得到纳豆芽孢杆菌培养物。
上述实施例中，采用PCA平板检测法，测定得到纳豆芽孢杆菌的活菌总数为6.5×1012cfu/g，纳豆激酶酶活最高达到8560FU/g干基。
将上述方法制备的纳豆芽孢杆菌培养物加入重量比为9倍的玉米淀粉，混合均匀，于50℃的热风中干燥13h，粉碎，过40目筛，即制得纳豆芽孢杆菌微生态制剂。
实施例3
一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基平板上划线，在温度为40℃的条件下培养20h；所述菌种为纳豆芽孢杆菌；
(2)一级种子培养：将活化的纳豆芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于液体种子培养基中，置于摇床中，在温度40℃和250rpm的条件下，震荡培养20h，制得一级种子菌；
(3)白酒糟预处理：将白酒糟与水按照质量比1:2混合均匀，加入碳酸氢钠调整pH值至6.5，接种一级种子菌，保持通风量为30％、温度37℃，生料发酵，培养7天，得到预处理的白酒糟；
(4)配制发酵培养基：发酵培养基包括以下重量份的组分：经过预处理的白酒糟25份、蔗糖10份、葡萄糖3份、氯化钠5份，KH2PO4 2份、MnSO4·H2O 1.5份；配制方法为：将所述发酵培养基各组分混合，按料液比1:0.8加入水，混合均匀，130℃高温高压灭菌20min；
(5)固体发酵：在所述发酵培养基中接种8％的一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度70％和温度37℃，培养24h，得到二级种子菌；
(6)将所述二级种子菌，按照步骤(5)进一步发酵，得到纳豆芽孢杆菌培养物。
上述实施例中，采用PCA平板检测法，测定得到纳豆芽孢杆菌的活菌总数为8.9×1011cfu/g，纳豆激酶酶活最高达到8279FU/g干基。
将上述方法制备的纳豆芽孢杆菌培养物加入重量比为5倍的玉米淀粉，混合均匀，于80℃的热风中干燥5h，粉碎，过60目筛，即制得纳豆芽孢杆菌微生态制剂。
实施例4
一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基平板上划线，在温度为39℃的条件下培养21h；所述菌种为纳豆芽孢杆菌；
(2)一级种子培养：将活化的纳豆芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于液体种子培养基中，置于摇床中，在温度39℃和250rpm的条件下，震荡培养21h，制得一级种子菌；
(3)白酒糟预处理：将白酒糟与水按照质量比1:1.3混合均匀，加入碳酸氢钠调整pH值至6.6，接种一级种子菌，保持通风量为18％、温度38℃，生料发酵，培养34天，得到预处理的白酒糟；
(4)配制发酵培养基：发酵培养基包括以下重量份的组分：经过预处理的白酒糟35份、蔗糖7份、葡萄糖5份、氯化钠4份，KH2PO4 3份、MnSO4·H2O 0.5份；配制方法为：将所述发酵培养基各组分混合，按料液比1:0.6加入水，混合均匀，126℃高温高压灭菌20min；
(5)固体发酵：在所述发酵培养基中接种8.5％的一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度55％和温度37℃，培养24h，得到二级种子菌；
(6)将所述二级种子菌，按照步骤(5)进一步发酵，得到纳豆芽孢杆菌培养物。
上述实施例中，采用PCA平板检测法，测定得到纳豆芽孢杆菌的活菌总数为8.3×1011cfu/g，纳豆激酶酶活最高达到8294FU/g干基。
将上述方法制备的纳豆芽孢杆菌培养物加入重量比为6倍的玉米淀粉，混合均匀，于75℃的热风中干燥7h，粉碎，过60目筛，即制得纳豆芽孢杆菌微生态制剂。
实验例1
该实验于河北省承德市某养殖户，选用30头体重相同的山羊做实验，随机分成均等三组，即A组、B组、C组，选用市面上购买的普通饲料，日粮采用玉米、稻草混合物，A组在日粮基础上添加普通饲料，B组在日粮基础上，添加混合6％实施例1制备的纳豆芽孢杆菌培养物的普通饲料，C组在日粮基础上，添加混合10％实施例1制备的纳豆芽孢杆菌培养物的普通饲料，喂养2个月后，与A组相比，B组和C组的日采食量分别增加0.32kg、0.28kg；同时发现，与A组相比，B组和C组的平均日增重增加0.18kg/头、0.15kg/头。
实验例2
选择健康活泼、体重相近的19日龄AA肉鸡3600只，试验鸡随机分为对照组和试验组，每组设4个重复，试验37天。饲养试验自由采食，自由饮水，各组饲养条件一致。各组管理按常规进行，每天观察记录鸡只的生长活动、健康与疾病情况等信息，在试验第37天(56日龄)空腹称重和试验分析。其中，试验组肉鸡全价配合饲料组成为玉米70％、豆粕25％、预混料5％、添加实施例1制备的纳豆芽孢杆菌微生态制剂为全价配合饲料量的5％；对照组的肉鸡全价配合饲料组成与试验组相同，但不添加纳豆芽孢杆菌微生态制剂。结果表明，试验组比对照组增重提高7.21％(P＜0.01)、饲料系数提高5.84％(P＜0.05)、存活率提高3.24％(P＜0.05)。说明本发明制备的纳豆芽孢杆菌微生态制剂能显著改善肉鸡的日增重、饲料系数和存活率。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基平板上划线，在温度为37-40℃的条件下培养20-24h；所述菌种为纳豆芽孢杆菌；
(2)一级种子培养：将活化的纳豆芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于液体种子培养基中，置于摇床中，震荡培养20-24h，制得一级种子菌；
(3)白酒糟预处理：将白酒糟与水按照质量比1:1-1:2混合均匀，加入碳酸氢钠调整pH值至6.5-7.0，接种一级种子菌，生料发酵，培养3-7天，得到预处理的白酒糟；
(4)配制发酵培养基：所述发酵培养基包括以下重量份的组分：经过预处理的白酒糟25-65份、蔗糖5-10份、葡萄糖3-9份、氯化钠3-5份，KH2PO42-4份、MnSO4·H2O 0.2-1.5份；
(5)固体发酵：在所述发酵培养基中接种8-10％的一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度和温度，培养20-24h，得到二级种子菌；
(6)将所述二级种子菌，按照步骤(5)进一步发酵，得到纳豆芽孢杆菌培养物；
在步骤(2)中，所述震荡培养条件为温度37-40℃和250rpm的条件；
在步骤(3)中，所述生料发酵条件为通风量为15-30％、温度37-40℃；
在步骤(5)中，所述温度为37-40℃，所述湿度为50-70％。
2.根据权利要求1所述的利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配制方法为：将所述发酵培养基各组分混合，按料液比1:0.3-0.8加入水，混合均匀，120-130℃高温高压灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的利用白酒糟制备纳豆芽孢杆菌培养物的方法，其特征在于，还包括：将所得纳豆芽孢杆菌培养物用密封袋密封包装，置于25℃以下条件储藏。
4.一种纳豆芽孢杆菌微生态制剂，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的方法制备的纳豆芽孢杆菌培养物加入重量比为5-9倍的玉米淀粉，混合均匀，于50-80℃的热风中干燥5-13h，粉碎，过40-60目筛，即制得纳豆芽孢杆菌微生态制剂。
5.一种纳豆芽孢杆菌培养物在动物饲料中的应用，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的方法制备的纳豆芽孢杆菌培养物按重量比6％-10％加入动物饲料中，混合均匀后用于饲喂动物。
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