CN110441411B - 一种烯丙孕素制剂的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种烯丙孕素制剂的高效液相色谱检测方法，采用如下的色谱条件进行检测：色谱柱采用氰基硅烷键合硅胶为填充物，具体为正相ZORBAX CN色谱柱(4.6*250mm，5μm)；流动相采用正己烷‑异丙醇，其中，正己烷的体积分数为90％‑97％(即正己烷的体积占正己烷和异丙醇总体积的90％‑97％)；流速0.8‑1.2ml/min；柱温是20‑40℃；稀释过程：加5ml异丙醇超声溶解后用正己烷定容至刻度。本方法具有简便、高效、精密度和准确度高的优点。

Description

一种烯丙孕素制剂的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明创造属于高效液相色谱分析检测技术领域，特别涉及一种烯丙孕素制剂的高效液相色谱检测方法。

背景技术

烯丙孕素(结构式见图1)是一种合成的三烯21碳甾体类孕激素，属于19-去甲基-***，是一种口服的活性孕激素。与所有类固醇一样，烯丙孕素通过自身脂溶性可以渗透入靶细胞中然后与特定受体结合来发挥作用，以类似于天然孕酮的作用模式来抑制***的释放。烯丙孕素通过抑制内源性***LH和FSH在血液中的浓度，使增大的卵泡(＞20～25毫米)退缩，进而阻断发情和***。在服药的后半阶段，当所有增大卵泡退缩后，紧跟着会出现一个FSH分泌的高峰，这将启动新一轮卵泡生长和成熟。在治疗后期会跟随着LH分泌的有规律的增加，促进卵泡的生长和成熟。这种内分泌作用可使受治疗的年幼母畜在停药后进入发情，因此烯丙孕素可用于家畜同期发情技术。同期发情可使家畜分娩时间集中，便于集中饲喂、集中断奶、全进全出、同期进入下一个繁殖周期，有效的提高家畜的繁殖率，减少病原的传播，实行严格的防疫制度和保证生物安全体系，利于规模化管理。

欧洲EMEA和美国FDA已批准了烯丙孕素溶液用于诱导母马和母猪的同步发情。由农业农村部第16号、第35号和第101号公告知，目前在我国兽医市场上已经有多家单位拿到了烯丙孕素口服液的新兽药证书。

烯丙孕素英文名为Altrenogest，CAS号为：850-52-2，分子式为C21H26O2，分子量为310.43，白色结晶性粉末，易溶于甲醇、乙腈、乙醇等有机溶剂，难溶于水，其在花生油、大豆油等植物油中有较大溶解度，另外植物油具有价格低廉适合大生产的优势，故烯丙孕素口服液常用植物油作为溶剂。如已上市的烯丙孕素内服制剂，商品名孕力宝，辅料为大豆油，含量规划为0.4％；烯丙孕素口服液，宁波第二激素厂生产，批号：180706，含量规格为450mL：1800mg，溶剂为花生油，包装规格为450mL/瓶；反相液相色谱方法常用水和一定比例的有机相或者盐溶液作为流动相来检测样品，但当制剂样品为油剂，则需将制剂样品经过复杂的前处理过程，如用***溶解后再用甲醇多次提取、HLB固相萃取小柱洗脱，以除去油剂。不仅需要经过繁琐的步骤，还耗费大量的有机溶剂，而且处理过程过多会造成样品损耗，进而导致测量误差，因此需要开发一种简便快捷准确的检测方法。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种烯丙孕素制剂的高效液相色谱检测方法。采用本发明的检测方法，直接将制剂样品溶解稀释即可进行检测，无需繁琐的前处理步骤，且本发明的检测方法步骤简单易操作，具有简便、高效、精密度和准确度高的优点。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种烯丙孕素制剂的高效液相色谱检测方法，包括：

采用如下色谱条件进行检测：

色谱柱的固定相为氰基硅烷键合硅胶；流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A的极性小于所述流动相B的极性。

在上述检测方法中，作为一种优选实施方式，所述色谱柱的规格为：内径为4.6mm，长度为150-250mm，填料粒径为5μm。进一步地，所述色谱柱为ZORBAX CN柱(4.6*250mm，5μm)和ZORBAX CN柱(4.6*150mm，5μm)；优选为ZORBAX CN柱(4.6*250mm，5μm)。由于现有技术中鲜有采用正相柱对烯丙孕素进行检测，因此选择合适的色谱柱和前处理方法至关重要；为此，本发明人经过大量的深入研究，在付出了充分的创造性劳动后，得到氰基硅烷键合硅胶正相柱使得被测样品具有更好的分离效果。

在上述检测方法中，作为一种优选实施方式，所述流动相A为正己烷；流动相B为异丙醇或乙醇，优选为异丙醇。

在某些具体实施方式中，所述流动相A为正己烷、流动相B为异丙醇，其体积比为90％：10％～97％：3％。

在某些具体实施方式中，正己烷与异丙醇的体积比为95％：5％。通过控制正己烷的体积含量，不仅能够很好地改善烯丙孕素口服液制剂在进液相前需要前处理提取步骤，还能在合适的保留时间内获得较好的出峰效果，有利于检测精度的提高。

在某些具体实施方式中，所述高效液相的流速为0.8-1.2mL/min；柱温是20-40℃；检测波长为230-240nm；优选地，流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为235nm。其中，流速与柱温的控制、结合上述流动相的选取，能够使得烯丙孕素制剂获得更好的分离并形成良好峰形，有利于提高检测精度。

在某些具体实施方式中，所述烯丙孕素制剂的溶剂为植物油；优选地，所述植物油为大豆油、花生油、蓖麻油、棕榈油中的一种。

在上述检测方法中，作为一种优选实施方式，还包括：

标准溶液的制备：精密称取烯丙孕素标准品适量，用异丙醇溶解，制成指定浓度的溶液，作为标准溶液；

供试品溶液的制备：取烯丙孕素口服液制剂样品，用适量异丙醇稀释后用正己烷定容至刻度，作为供试品溶液；

采用所述色谱条件分别对标准溶液、供试品溶液进行检测。

采用上述测定方法，无需对烯丙孕素制剂进行预处理，经过合适配比的溶剂进行简单稀释即可直接对其进行测试，不仅操作简单，且节省成本，易于工业化应用。

在某些具体实施方式中，对标准溶液、供试品溶液进行检测时，进样体积为10μl。

本发明的技术效果如下：

本发明采用HPLC、同时辅助使用紫外检测器对烯丙孕素制剂中烯丙孕素的含量进行直接测定，无需对烯丙孕素制剂进行预处理，经过合适配比的溶剂进行简单稀释即可直接对其进行测试，不仅操作简单，且节省成本，易于工业化应用。另外，经过精密度试验、线性关系试验和加样回收试验等对方法进行了验证，结果表明本发明的测定方法准确可靠，检测范围大，灵敏度高和准确性高。

附图说明

图1是烯丙孕素的结构式；

图2是实施例1中烯丙孕素标准溶液的HPLC检测图谱；

图3是实施例1中烯丙孕素口服液制剂的线性关系图与标准曲线方程。

具体实施方式

下面通过结合附图对本发明进行进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

本发明实施例所使用的ZORBAX CN柱、烯丙孕素口服液及化学试剂等均为市售商品。

实施例1

(1)色谱条件筛选

采用安捷伦1260高效液相色谱仪联合紫外检测器，检测波长235nm，色谱柱采用氰基硅烷键合硅胶为填充物的正相色谱柱，选用ZORBAX CN柱(4.6*250mm，5μm)；流动相是正己烷-异丙醇体系，发明人在筛选正己烷-异丙醇体系时发现：正己烷体积分数高则主峰出峰时间晚，测样效率比价低；体积分数过低出峰太快，空白溶剂峰(即烯丙孕素口服液制剂样品中的溶剂)和主峰还没分开；因此，最优的流动相体系中，正己烷的体积分数为95％；流速1.0ml/min；柱温是30℃；烯丙孕素口服液制剂样品稀释过程：加5ml异丙醇超声溶解后用正己烷定容至刻度；进样量10μl。

(2)标准曲线方程的获得

标准溶液的制备：精密称量烯丙孕素标准100mg，置于50ml棕色容量瓶中，用异丙醇溶解稀释并定容至刻度做为烯丙孕素标准溶液储备液，然后将烯丙孕素标准溶液储备液逐级稀释制成烯丙孕素浓度为400、450、500、550、600μg/ml的烯丙孕素标准溶液。

标准曲线方程的获得：将浓度分别为400、450、500、550、600μg/ml的烯丙孕素标准溶液分别注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱，进样量10μl。其中，500μg/ml的烯丙孕素标准溶液的HPLC检测图谱见图2。分别计算同一保留时间下的峰面积，以标准溶液浓度x为横坐标，以峰面积y为纵坐标，做出标准曲线方程y＝8569.5x+93.206，R²＝0.9998，见图3。然后将上述测试得到的峰面积y，代入标准曲线方程，计算结果表明烯丙孕素浓度在401-601μg/ml范围内，说明峰面积和浓度成以上标准曲线方程中的关系，进一步说明采用本发明的检测方法能够很好地拟合高效液相得到的峰面积与烯丙孕素浓度的关系，还进一步证明异丙醇作为标准溶液配制的溶剂能够很好地和流动相、检测波长相匹配，也为供试品溶液配置时溶剂的选择提供了依据。

(3)待测烯丙孕素口服液制剂(生产厂家：天津市中升挑战生物科技有限公司，规格：0.4％，溶剂：大豆油)中烯丙孕素的含量：

精密称取待测样品2.87812g至25ml棕色容量瓶中，用本专利中的方法稀释：先加入5ml异丙醇使溶解，再用正己烷定容至刻度，摇匀，得到待测烯丙孕素口服液制剂样品溶液，用0.45μm有机滤头过滤。注入步骤(1)设置的进入工作状态的HPLC装置的色谱柱，进样量10μl，计算与步骤(2)同一保留时间下的峰面积，代入步骤(2)所得的标准曲线方程y＝8569.5x+93.206，R²＝0.9998，计算出待测烯丙孕素口服液制剂样品溶液的浓度，再通过待测样品的密度和稀释比例计算出待测样品的烯丙孕素口服液制剂的含量。

(4)精密度考察

对同一待测样品(烯丙孕素口服液)，连续6次进样，峰面积如表1：

表1

次数	1	2	3	4	5	6	平均值
								峰面积	4413.7	4420.5	4417.7	4425.3	4429.4	4439.5	4424.35

(n为测定次数，每次测定值分别为x₁，x₂，...，x_B，

为测定值的算术平均值)为0.21％，结果表明，本发明HPLC法检测烯丙孕素口服液制剂样品含量精密度高，重现性好。

(5)加样回收试验

准确称取已知含量的烯丙孕素口服液制剂样品适量，再分别精密加入一定量的烯丙孕素口服液80％、100％、120％作为供试品，使供试品溶液中的烯丙孕素口服液制剂浓度分别在烯丙孕素标准曲线的低、中、高区域，按本发明项下进行操作，依法测定，

结果平均回收率为100.3％，RSD为0.67％，表明该本发明加样回收率好。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种烯丙孕素制剂的高效液相色谱检测方法，其特征在于，包括采用如下色谱条件进行检测：

采用安捷伦1260高效液相色谱仪联合紫外检测器，检测波长235nm，色谱柱采用氰基硅烷键合硅胶为填充物的正相色谱柱，选用ZORBAX CN柱，4.6*250mm，5μm；流动相是正己烷-异丙醇体系，正己烷的体积分数为95％；流速1.0ml/min；柱温是30℃；烯丙孕素口服液制剂样品稀释过程：加5ml异丙醇超声溶解后用正己烷定容至刻度；进样量10μl。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，烯丙孕素制剂的溶剂为植物油。

3.根据权利要求2所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述植物油为大豆油、花生油、蓖麻油、棕榈油中的一种。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于，还包括：

标准溶液的制备：精密称取烯丙孕素标准品适量，用异丙醇溶解，制成指定浓度的溶液，作为标准溶液；

供试品溶液的制备：取烯丙孕素口服液制剂样品，用适量异丙醇稀释后用正己烷定容至刻度，作为供试品溶液；

采用所述色谱条件分别对标准溶液、供试品溶液进行检测。

Images