CN101685083B

CN101685083B - 用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法

Info

Publication number: CN101685083B
Application number: CN2009100223969A
Authority: CN
Inventors: 贾正平; 王荣; 谢华; 张娟红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2029-04-30
Also published as: CN101685083A

Abstract

本发明涉及一种用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法，该方法包括以下步骤：(1)羟丙基-β-环糊精标准曲线溶液的制备；(2)羟丙基-β-环糊精质量控制溶液的制备；(3)样品处理；(4)分别对标准曲线溶液、质量控制溶液进行液相色谱-串联质谱分析，建立测定样品溶液中羟丙基-β-环糊精的方法。本发明操作简单、重现性好、可对HP-β-CD进行定量分析。

Description

用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法

技术领域

本发明涉及分析方法应用研究领域中的质谱测定方法，尤其涉及一种用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法(UFLC-MS/MS)。

背景技术

羟丙基-β-环糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin；HP-β-CD)是β-环状糊精的一种羟烷基化衍生物，是近几年有关制备方法、毒理试验、应用范围研究比较透彻的β-CD衍生物之一。HP-β-CD不但可以与β-CD一样对许多化合物具有优良的包络作用，可以提高被包络物质的稳定性，而且它还具有水溶性高和在生物体内提高被包络药物的释放速度和生物利用度，因此，HP-β-CD因其所具有的一些特殊的优良特性而使得应用范围更广，现已在医药上广泛应用。由于HP-β-CD的水溶性大于50％、流动性好、溶血活性低、对肌肉无刺激，并能增加药物的稳定性，因此许多药物已用HP-β-CD制备注射剂并取得满意的效果。

虽然目前对HP-β-CD制备注射剂已有研究，但集中在对其在体内的分布研究。该研究主要通过放射标记后口服¹⁴C-HP-β-CD后，研究在组织(主要是肝脏和肾脏)中的¹⁴C水平，由于HP-β-CD样品不纯及没有更有效的质量控制方法，用¹⁴C-HP-β-CD进行研究时对HP-β-CD真正的体内代谢研究证据不足，同时¹⁴C放射标记对人体研究有害。

为控制其质量和临床用药，同时为药动学研究和尿中的累计排除量计算，建立科学的测定HP-β-CD方法非常迫切，准确的定量测定方法建立有着重要的意义。目前关于HP-β-CD的特性及在应用方面的报道比较多，如1984-2009年中国专利数据库中的专利号为ZL02116766.4的《有机药物与倍他环糊精衍生物配合物及其制备方法》、申请号为02149146.1的《抗癌药紫杉醇自乳化固体纳米粒——注射用紫杉醇的制备方法》、专利号为ZL03825141.8的《以衍生环糊精稳定化的含有水性填充组合物的胶囊》等，但对其进行定量研究的色谱、质谱方法学却未见文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、重现性好、可进行定量分析的用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法。

为解决上述问题，本发明所述的一种用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法，包括以下步骤：

(1)羟丙基-β-环糊精标准曲线溶液的制备：将羟丙基-β-环糊精标准品用流动相定容至10μg/ml，得标准溶液，然后将该标准溶液依次用流动相稀释成浓度为50，100，250，500，1000，2000，2500ng/ml，即得标准曲线溶液；

(2)羟丙基-β-环糊精质量控制溶液的制备：将所述步骤(1)中的10μg/ml标准溶液用流动相依次稀释成浓度为50，100，800，2000ng/ml，即得质量控制溶液；

(3)样品处理：其中所述样品为含羟丙基-β-环糊精的冻干型多西他赛制剂或尿液；

(4)分别对标准曲线溶液、质量控制溶液进行液相色谱-串联质谱分析，建立测定样品溶液中羟丙基-β-环糊精的方法。

所述流动相为甲醇-水、甲醇-醋酸铵、乙腈-水、乙腈-水-乙酸中的任意一种。

所述甲醇-水的体积比为1∶1～9∶1；甲醇-醋酸铵的体积比为2∶1～4∶1；乙腈-水的体积比为4∶6～9∶1；乙腈-水-乙酸的体积比为40∶59∶1～60∶39∶1；其中醋酸铵的浓度为1～10mM。

所述步骤(3)中的含羟丙基-β-环糊精的冻干型多西他赛制剂的处理方法是指将样品用流动相稀释定容至100μg/ml得样品储备液，然后在样品储备液中加入流动相涡旋混匀，经离心后取上清液作为样品溶液的方法；其中样品储备液与流动相的体积比为1∶90～1∶110。

所述步骤(3)中的尿液处理方法是指在样品中依次加入样品体积的1∶1～1∶2的乙二胺四乙酸和1∶50～1∶55的氨水，涡旋混匀得混合液，然后在混合液中加入流动相，经离心后取上清液作为样品溶液的方法；其中混合液与流动相的体积比为1∶6～1∶7。

所述步骤(4)中的色谱分析是指在柱温为20～40℃的色谱柱中以0.1～10ml/min的流速进行检测。

所述步骤(4)中的质谱分析是指通过电喷雾离子化，采用多反应检测方式进行正离子检测；其中离子源为ESI；检测离子对为m/z1215.7→1215.7、m/z1273.4→1273.4、m/z 1331.6→1331.6、m/z 1389.8→1389.8、m/z 1447.5→1447.5、m/z 1506.7→1506.7、m/z 1563.5→1563.5、m/z 1622.4→1622.4。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用超快速液相色谱(UFLC)-串联质谱(MS/MS)法测定HP-β-CD，在对其质谱条件进行***优化后，并通过测定冻干型多西他赛注射剂中的HP-β-CD含量，考察了本发明的稳定性。

a、专属性：本发明对空白溶液(参见图2中的a)、1μg/ml HP-β-CD的标准溶液(参见图2中的b)溶液进行了分析，可知样品中其它成份不干扰HP-β-CD的测定。

b、基质效应：以冻干型多西他赛为研究对象，在多西他赛标准溶液中加入HP-β-CD标准溶液配成含HP-β-CD为1μg/ml的溶液来考察基质效应对测定HP-β-CD的影响。采用UFLC-MS/MS对所配制溶液进行分析，得峰面积A，保留时间为0.89min；采用UFLC-MS/MS对1μg/ml HP-β-CD标准溶液进行分析，得到相应的峰面积B，以A/B考察方法的基质效应，A/B≈1，结果表明本方法无基质效应(参见图3)。

c、标准曲线和检出限：分别对HP-β-CD浓度为50，100，250，500，1000，2000，2500ng/ml的标准曲线溶液进行UFLC-MS/MS分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行处理，结果表明在50～2500ng/mL范围内线形关系良好，y＝5.6x-158(r²＝0.9991)，权重为1/x²，最低检测线为50ng/mL(参见表1)。

表1：标准曲线的准确度和精密度

浓度(ng/ml)	平均值±标准偏差(n＝6)	准确度(％)	精密度(％)
				50	50.15±0.43	0.87	100.30
100	99.93±0.62	0.62	99.94
				250	251.00±2.71	1.08	100.00
500	487.33±6.07	1.25	97.53
				1000	949.67±12.63	1.33	95.07
2000	2026.67±20.55	1.01	101.32
				2500	2638.33±38.91	1.47	105.67

d、准确度和精密度：对质量控制样品(QC样品)进行分析，连续测定3天，每天重复6次，求算本发明的准确度和精密度，数据表明本发明符合分析要求。(参见表2)

表2：日内及日间精密度测定结果

e、加标回收率：分别取2μg/ml多西他赛标准溶液950、900、800μL，依次加入10μg/ml HP-β-CD标准溶液50、100、200μL，混匀后进行加标回收实验，回收率见表3。

表3：加标回收率结果

HP-β-CD标准溶液(μL)	浓度(ng/ml)	回收率(％)	准确度(％)
				50	500	100.67	0.87
100	1000	108.50	1.16
				200	2000	107.25	2.95

f、稳定性：对低、高浓度的QC样品进行分析，考察0h，样品池中放置6h，室温放置7h、24h、5d，3次反复冷冻-室温，4℃下保存5d条件下的稳定性，结果表明在上述条件下被测物稳定。(参见表4)

表4：稳定性测定结果

2、由于本发明具有特异性高、重现性好、灵敏度高、分析速度快，操作简单等特点，因此可适用于制剂中HP-β-CD质量的控制和体内HP-β-CD的代谢研究，为HP-β-CD药代动力学研究奠定了基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明的全离子扫描质谱图。

图2为本发明的专属性实验色图谱；其中a为空白标准溶液，b为1μg/mlHP-β-CD的标准溶液。

图3为本发明的基质抑制实验色图谱；其中A为1μg/ml HP-β-CD标准溶液，B为1μg/ml HP-β-CD的样品溶液。

图4为本发明的测定HP-β-CD标准品色图谱。

图5为本发明的测定多西他赛(冻干型)制剂中HP-β-CD色图谱。

图6为本发明的测定尿液中HP-β-CD色图谱。

具体实施方式

实施例1用超快速液相色谱(UFLC)-串联质谱(MS/MS)法测定制剂中HP-β-CD的含量，包括以下步骤：

(1)HP-β-CD标准曲线溶液的制备：精密称取NIHON SHOKUHIN公司生产的HP-β-CD标准品0.0050g于10ml容量瓶，用体积比为1∶1～9∶1的甲醇-水流动相定容，摇匀得500μg/ml HP-β-CD标准溶液作为储备液；吸取储备液200μl于另一10ml容量瓶，流动相定容，摇匀得10μg/ml HP-β-CD标准溶液。

取500μL、10μg/ml的HP-β-CD标准溶液于3ml离心管中，加流动相1500μL后放入涡旋混匀器(金坛市金城教学仪器厂)中涡流混匀，得2500ng/ml溶液；取800μL、2500ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相200μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得2000ng/ml溶液；取500μL、2000ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相500μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得1000ng/ml溶液；取500μL、1000ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相500μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得500ng/ml溶液；取500μL、500ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相500μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得250ng/ml溶液；取400μL、250ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相600μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得100ng/ml溶液；取500μL、100ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相500μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得50ng/ml溶液。上述50，100，250，500，1000，2000和2500ng/ml溶液即为标准曲线溶液。

(2)HP-β-CD QC溶液的制备：取200μL、10μg/ml的HP-β-CD标准溶液于1.5ml离心管中，加入流动相800μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得2000ng/ml溶液；取400μL、2000ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相600μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得800ng/ml QC溶液；取125μL、800ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相875μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得100ng/ml溶液；取500μL、100ng/ml溶液于1.5ml离心管中，加入流动相500μL后，放入涡旋混匀器中涡流混匀，得50ng/ml溶液。上述50，100，800，2000ng/ml溶液即为QC溶液。

(3)样品采用冻干型多西他赛制剂(山东齐鲁制药有限公司)，其处理方法是：精密称取冻干型多西他赛0.0010g于10ml容量瓶内，用体积比为1∶1～9∶1的甲醇-水流动相溶解，并稀释至刻度定容至10ml，摇匀得100μg/ml样品储备液；然后精密吸取样品储备液于5ml离心管中，加入流动相混匀，得1μg/ml样品溶液；将该1μg/ml样品溶液放入涡旋混匀器中涡旋混匀1min后，放入高速离心机(上海安亭科学仪器厂)中以5000r/min的速率离心5min后，用移液枪吸取上清液作为样品溶液放入进样瓶中备用。其中样品储备液与流动相的体积比为1∶90～1∶110。

(4)分别对标准曲线溶液、质量控制溶液采用超快速高效液相色谱仪(日本岛津)-三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司)进行液相色谱-串联质谱分析，得到全扫描离子图(参见图1)及色谱图4。

建立测定样品溶液中羟丙基-β-环糊精的方法，该方法的色谱分析条件如下：色谱柱：Shim-pack XR-ODS柱(直径3.0mm、长度75mm)(日本岛津公司)，流速：0.1～10ml/min，柱温：25℃，进样量：10μl，整个分析流程用时3min；质谱分析条件如下：通过电喷雾离子化，采用多反应检测方式进行正离子检测分析，离子源为ESI⁺和ESI^-；检测离子对为m/z1215.7→1215.7、m/z 1273.4→1273.4、m/z 1331.6→1331.6、m/z1389.8→1389.8、m/z1447.5→1447.5、m/z 1506.7→1506.7、m/z 1563.5→1563.5、m/z 1622.4→1622.4。同时对相应的参数DP、EP、TEM、CE等进行了优化——DP：70；EP：5；CE：100；CXP：9；CUR：10，CAD：1，IS：5500；TEM：260；GS1：50；GS2：60。

所测定样品中的HP-β-CD含量为19.8mg/ml。

实施例2用超快速液相色谱(UFLC)-串联质谱(MS/MS)法测定尿液中的HP-β-CD的含量为4.5mg/ml，并得到色谱图6。

其中HP-β-CD标准曲线溶液、HP-β-CD QC溶液的制备及液相色谱-串联质谱分析均同实施例1。

样品采用尿液，其处理方法是：用移液枪精密吸取受试者尿液，加入尿液体积的1∶1～1∶2的乙二胺四乙酸(EDTA)后，放入涡旋混匀器中涡旋混匀后加入尿液体积的1∶50～1∶55的氨水，涡旋混匀得混合液，然后在混合液中加入体积比为1∶1～9∶1的甲醇-水流动相，涡旋混匀2min，再放入高速离心机中以5000r/min的速率离心5min后，用移液枪吸取上清液作为样品溶液放入进样瓶中备用。其中混合液与流动相的体积比为1∶6～1∶7。

实施例3用于测定HP-β-CD的超快速液相色谱-串联质谱法，其中HP-β-CD标准曲线溶液、HP-β-CD QC溶液的制备及液相色谱-串联质谱分析均同实施例1。

样品的处理同实施例1或实施例2。

流动相为体积比为2∶1～4∶1的甲醇-醋酸铵；其中醋酸铵的浓度为1～10mM。

实施例4用于测定HP-β-CD的超快速液相色谱-串联质谱法，其中HP-β-CD标准曲线溶液、HP-β-CD QC溶液的制备及液相色谱-串联质谱分析均同实施例1。

样品的处理同实施例1或实施例2。

流动相为体积比4∶6～9∶1的乙腈-水。

实施例5用于测定HP-β-CD的超快速液相色谱-串联质谱法，其中HP-β-CD标准曲线溶液、HP-β-CD QC溶液的制备及液相色谱-串联质谱分析均同实施例1。

样品的处理同实施例1或实施例2。

流动相为体积比40∶59∶1～60∶39∶1的乙腈-水-乙酸。

上述实施例中的甲醇、醋酸铵、乙腈、乙酸均为德国默克公司生产的色谱纯；水采用西安京西双鹤药业有限公司生产的灭菌注射用水。

Claims

1.一种用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法，包括以下步骤：

(1)羟丙基-β-环糊精标准曲线溶液的制备：将羟丙基-β-环糊精标准品用流动相定容至10μg/ml，得标准溶液，然后将该标准溶液依次用流动相稀释成浓度为50，100，250，500，1000，2000，2500ng/ml，即得标准曲线溶液；所述流动相为甲醇-水、甲醇-醋酸铵、乙腈-水、乙腈-水-乙酸中的任意一种；所述甲醇-水的体积比为1∶1～9∶1；甲醇-醋酸铵的体积比为2∶1～4∶1；乙腈-水的体积比为4∶6～9∶1；乙腈-水-乙酸的体积比为40∶59∶1～60∶39∶1；其中醋酸铵的浓度为1～10mM；

含羟丙基-β-环糊精的冻干型多西他赛制剂的处理方法是指将样品用流动相稀释定容至100μg/ml得样品储备液，然后在样品储备液中加入流动相涡旋混匀，经离心后取上清液作为样品溶液的方法；其中样品储备液与流动相的体积比为1∶90～1∶110；

尿液处理方法是指在样品中依次加入样品体积的1∶1～1∶2的乙二胺四乙酸和1∶50～1∶55的氨水，涡旋混匀得混合液，然后在混合液中加入流动相，经离心后取上清液作为样品溶液的方法；其中混合液与流动相的体积比为1∶6～1∶7；

(4)分别对标准曲线溶液、质量控制溶液进行超快速液相色谱-串联质谱分析，建立测定样品溶液中羟丙基-β-环糊精的方法。

2.如权利要求1所述的用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法，其特征在于：所述步骤(4)中的色谱分析是指在柱温为20～40℃的色谱柱中以0.1～10ml/min的流速进行检测。

3.如权利要求1所述的用于测定羟丙基-β-环糊精的超快速液相色谱-串联质谱法，其特征在于：所述步骤(4)中的质谱分析是指通过电喷雾离子化，采用多反应检测方式进行正离子检测；其中离子源为ESI；检测离子对为m/z1215.7→1215.7、m/z 1273.4→1273.4、m/z 1331.6→1331.6、m/z 1389.8→1389.8、m/z 1447.5→1447.5、m/z 1506.7→1506.7、m/z 1563.5→1563.5、m/z1622.4→1622.4。