CN110418846A - 细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型的控制 - Google Patents

细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型的控制 Download PDF

Info

Publication number
CN110418846A
CN110418846A CN201880018215.2A CN201880018215A CN110418846A CN 110418846 A CN110418846 A CN 110418846A CN 201880018215 A CN201880018215 A CN 201880018215A CN 110418846 A CN110418846 A CN 110418846A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell culture
initial
commercially available
brand name
sugar
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880018215.2A
Other languages
English (en)
Inventor
C.小黄
P.贝贝
M.胡尔希德
L.张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Inc
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of CN110418846A publication Critical patent/CN110418846A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation

Abstract

本文提供了调节由细胞培养物中的有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质的总去岩藻糖基化(TAF)糖型水平的方法。在示例性实施例中，这些方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期。本文还提供了包含糖基化蛋白质及其TAF糖型的相关组合物。

Description

细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型的控制
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月14日提交的美国临时专利申请号62/471,347的优先权，将其内容通过引用并入本文。
背景技术
糖基化是最常见但重要的翻译后修饰之一，因为它在多种细胞功能(包括例如蛋白质折叠、质量控制、分子运输和分选以及细胞表面受体相互作用)中起作用。糖基化影响重组蛋白药物的治疗功效，因为它影响治疗性糖蛋白的生物活性、药代动力学、免疫原性、溶解性和体内清除率。特别地，Fc糖型谱是重组抗体的重要产品质量属性，因为它们直接影响抗体的临床功效和药代动力学。
已经发现高甘露糖(HM)糖型含量影响某些治疗性抗体的药代动力学特性(Goetze等人,(2011)Glycobiology[糖生物学]21,949-59；Yu等人,(2012)MAbs 4,475-87)。HM糖型不仅影响抗体的血清清除率，而且除了去岩藻糖基化(afuco)糖型外的此类糖型还可以影响抗体效应子功能或抗体介导的靶细胞杀伤(也称为抗体相关细胞毒性(ADCC))。
许多因素影响聚糖结构，从而影响蛋白质的最终糖基化形式(糖型)。例如，表达抗体的细胞系、细胞培养基、进料培养基组成和细胞培养期间进料的时机可以影响蛋白质的糖型的产生。
虽然研究小组已经提出了许多方法来影响抗体特定糖型的水平，但是生物制药行业仍需要简单有效的方法来操纵和控制重组产生治疗性抗体期间总去岩藻糖基化(TAF)糖型水平。
发明内容
首次描述了如下数据，这些数据证明在初始细胞培养期(例如，接种后的前2、3、4、5或6天)期间维持所需初始pH(例如，初始设定点pH)对于调节重组产生的糖基化蛋白质的TAF糖型水平而言是重要的，而初始细胞培养期后的细胞培养物pH对TAF糖型水平的影响最小。初始pH而不是晚期pH影响TAF水平的发现是出乎意料的。不受特定理论的束缚，在初始细胞培养期(例如，接种后的前2、3、4、5或6天)期间控制初始pH(例如，初始设定点pH)允许重组产生具有所需或预定或预选水平的TAF糖型的糖基化蛋白质。因此，本发明涉及产生具有所需或预定或预选水平的TAF糖型的重组糖基化蛋白质(糖蛋白)的方法。
本发明提供了调节由细胞培养物中的有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质的TAF糖型水平的方法。在示例性实施例中，这些方法包括将细胞培养物维持在初始pH(例如，初始设定点pH)下持续初始细胞培养期。
在示例性方面中，初始细胞培养期是接种后约4天至约6天(例如，约4天、约5天、约6天)、或接种后约2天至约6天(例如约2天、约3天)、或接种后约48小时至约144小时、或接种后24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、81小时、82小时、83小时、84小时、85小时、86小时、87小时、88小时、89小时、90小时、91小时、92小时、93小时、94小时、95小时、96小时、97小时、98小时、99小时、100小时、101小时、102小时、103小时、104小时、105小时、106小时、107小时、108小时、109小时、110小时、111小时、112小时、113小时、114小时、115小时、116小时、117小时、118小时、119小时、120小时、121小时、122小时、123小时、124小时、125小时、126小时、127小时、128小时、129小时、130小时、131小时、132小时、133小时、134小时、135小时、136小时、137小时、138小时、139小时、140小时、141小时、142小时、143小时、144小时、145小时、146小时、147小时、148小时、150小时、151小时、152小时、153小时、154小时、155小时、156小时、157小时、158小时、159小时、160小时、161小时、162小时、163小时、164小时、165小时、166小时、166小时或其增量。
在示例性方面中，初始细胞培养期符合细胞培养物的特定活细胞密度(VCD)。在示例性方面中，初始细胞培养期是细胞培养物的VCD小于或约6.5x106个细胞/mL的接种后的时间。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下，直到细胞培养物达到约6.5x106个细胞/mL的VCD。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下，直到细胞培养物达到约6.9x106与约8.2x106之间的VCD。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下，直到细胞培养物达到约8.2x106与约1.94x107之间的VCD。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下，直到细胞培养物达到约1.21x107与约3.46x107之间的VCD。
在示例性方面中，初始设定点pH选自大于约6.5且小于约7.5的pH。
本发明还涉及包含糖基化蛋白质及其TAF糖型的组合物。
附图说明
图1是三种类型的N-聚糖和此类糖的常用符号的说明。
图2是示例性聚糖结构的表。
图3是将TAF(％)、HM(％)或AF(％)与初始pH或时间相关联的一组图。
图4是针对不同pH设定点的随时间变化的细胞培养物中存在的％TAF的图。
图5是描绘随细胞培养物的平均初始pH变化的(在指定时间期间)细胞培养物中存在的％TAF的一组图。(A)是％TAF的图；(B)是从第0天至第6天的％TAF的图；(C)是从第6天至第9天的％TAF的图，并且(D)是从第9天至第12天的％TAF的图。
图6是从第6天至第12天的随细胞培养物的pH变化的％TAF的图。
图7是随时间变化的pH或％TAF的一对图。
图8是将HM、afuco或TAF(％)与pH或变化后温度相关联的一组图。
具体实施方式
许多分泌的蛋白质经历翻译后糖基化，一种糖部分(例如，聚糖、糖)共价附接至蛋白质的特定氨基酸所凭借的过程。在真核细胞中，发生两种类型的糖基化反应：(1)N-连接糖基化，其中聚糖附接至识别序列Asn-X-Thr/Ser的天冬酰胺，其中“X”是除脯氨酸外的任何氨基酸；以及(2)O-连接糖基化，其中聚糖附接至丝氨酸或苏氨酸。不管糖基化类型如何(N-连接还是O-连接)，由于与每个位点(O或N)相关的大范围的聚糖结构，存在蛋白质糖型的微不均一性。
所有N-聚糖都具有共同的核心糖序列：Manα1–6(Manα1–3)Manβ1–4GlcNAcβ1–4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr(Man3GlcNAc2Asn)，并且被归类为以下三种类型之一：(A)高甘露糖(HM)或寡甘露糖(OM)类型，其由两个N-乙酰葡糖胺(GalNAc)部分和大量(例如，5、6、7、8或9个)甘露糖(Man)残基组成；(B)复合类型，其包含超过两个GlcNAc部分和任何数量的其他糖类型；或(C)杂合类型，其在分支的一侧包含Man残基而在复合分支的基部包含GlcNAc。图1(取自Stanley等人,第8章:N-Glycans,Essentials of Glycobiology[N-聚糖，糖生物学的要点],第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]；2009)显示了三种类型的N-聚糖。
N-连接聚糖通常包含半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖(GLc)、N-乙酰葡糖胺(ClcNAc)、葡糖胺(GlcN)、甘露糖(Man)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、甘露糖胺(ManN)、木糖(Xyl)、N0乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮基-3-脱氧壬酮酸(2-keto-3-doxynononic acid，Kdn)、岩藻糖(Fuc)、葡糖醛酸(GLcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、半乳糖醛酸(Gal A)、甘露糖醛酸(Man A)中的一种或多种单糖。此类糖的常用符号示于图1中。示例性聚糖及其身份示于图2中。
N-连接糖基化在内质网(ER)中开始，其中一组复杂反应导致基本上由两个GlcNAc残基和三个Man残基构成的核心聚糖结构的附接。ER中形成的聚糖复合物通过高尔基体中酶的作用来修饰。如果糖对于酶而言相对难以接近，则它通常保持原始的HM形式。如果酶可以接近糖，则许多Man残基被切除并且糖被进一步修饰，产生复合类型N-聚糖结构。例如，位于顺面高尔基体中的甘露糖苷酶-1可以切割或水解HM聚糖，而位于高尔基体中间膜囊(medial-Golgi)中的岩藻糖基转移酶FUT-8使聚糖岩藻糖基化(Hanrue Imai-Nishiya(2007),BMC Biotechnology[BMC生物技术],7:84)。
因此，聚糖结构的糖组成和结构构型根据ER和高尔基体中的糖基化机器、机械酶对聚糖结构的可及性、每种酶的作用顺序和蛋白质从糖基化机器中释放所处的阶段以及其他因素而不同。
本文提供的本发明涉及在由有糖基化能力的细胞重组产生期间调节蛋白质的不同糖基化形式(糖型)的水平的方法。不受特定理论的束缚，据信本发明的方法提供了用于定制组合物的手段，这些组合物包含给定重组蛋白的特定量的特定糖形式。
在示例性实施例中，调节总去岩藻糖基化(TAF)糖型的水平。如本文所用，“总去岩藻糖基化糖型”或“TAF糖型”或“TAF”或“最终TAF”是指高甘露糖糖型和去岩藻糖基化糖型的总量。如本文所用，术语“高甘露糖”或“HM”或“最终HM”包括包含5、6、7、8或9个甘露糖残基的糖型，分别缩写为Man5、Man6、Man7、Man8和Man9。如本文所用，术语“去岩藻糖基化糖型”或“afuco糖型”或“去岩藻糖基化聚糖”或“Afuco”或“AF”或“最终去岩藻糖基化”是指在参与与N-糖基化位点的Asn的酰胺键的GlcNAc残基上缺乏核心岩藻糖(例如，α1,6-连接的岩藻糖)的糖型。去岩藻糖基化糖型包括但不限于A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5。另外的去岩藻糖基化聚糖包括例如A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]、FO-N[H3N3]。参见例如，Reusch和Tejada,Glycobiology[糖生物学]25(12):1325-1334(2015)。在示例性方面中，TAF的水平、HM糖型和去岩藻糖基化糖型的量通过HILIC确定，如在本文的实例1中进一步描述的。在酶切割N-聚糖后，进行HILIC以获得具有几个峰的色谱图，其中的每个峰代表不同糖型的平均分布(量)。出于这些目的，％峰面积＝峰面积/总峰面积x100％，并且％总峰面积＝样品总面积/标准品总面积x100％。用于确定％TAF目的的计算可以如下进行：
％去岩藻糖基化糖型＝％A1G0+％A2G0+％A2G1a+％A2G1b+％A2G2+％A1G1M5。
％高甘露糖糖型＝％Man5(如果可检测)+％Man6(如果可检测)+％Man7(如果可检测)+％Man8(如果可检测)+％Man9(如果可检测)
本发明提供了调节重组糖基化蛋白质的TAF糖型水平的方法。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质由细胞培养物中的有糖基化能力的细胞产生。在示例性实施例中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期。如本文所用，术语“维持”意指将设定点pH设定为初始设定点pH并且在指定时间段期间不改变该设定点pH。如本文所用，术语“设定点pH”是指如由用户在pH控制***或仪器上设定的所需或靶pH值。如本文所用，术语“初始设定点pH”是指由用户在接种细胞培养物之前、期间或之后立即设定的设定点pH。如本领域普通技术人员认识到的，取决于特定pH控制***的校准极限，设定点pH可以与细胞培养物的实际pH不同。通常，细胞培养物的实际pH将是设定点pH的±0.05，并且在一些方面中，细胞培养物的实际pH将是设定点pH的±0.03或±0.02。在示例性方面中，将细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期意指细胞培养物的pH在初始细胞培养期期间相对于初始设定点pH变化不超过0.05。在示例性实施例中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期，其中初始设定点pH大于约6.5且小于7.5。例如，初始设定点pH是或大于6.50、6.52、6.54、6.56、6.58、6.60、6.62、6.64、6.66、6.68、6.70、6.72、6.74、6.76、6.78、6.80、6.82、6.84、6.86、6.88、6.90、7.10、7.12、7.14、7.16、7.18、7.20、7.22、7.24、7.26、7.28、7.30、7.32、7.34、7.36、7.38、7.40、7.42、7.44、7.46、7.48、7.50。例如，初始设定点pH是6.50、6.55、6.60、6.65、6.70、6.75、6.80、6.85、6.90、6.95、7.0、7.05、7.10、7.15、7.20、7.25、7.30、7.35、7.40、7.45、7.50。另外，初始设定点是或小于7.5。例如，初始设定点pH是或小于7.48、7.46、7.44、7.42、7.40、7.38、7.36、7.34、7.32、7.30、7.28、7.26、7.24、7.22、7.20、7.18、7.16、7.14、7.12、7.10、7.08、7.06、7.04、7.02、7.00、6.98、6.96、6.94、6.92、6.90、6.88、6.86、6.84、6.82、6.80、6.78、6.76、6.74、6.72、6.70、6.68、6.66、6.64、6.62、6.60、6.58、6.56、6.54、6.52、6.50。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.55且小于约7.5。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.60且小于约7.5。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.65且小于约7.5。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.7且小于约7.5。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.75且小于约7.5。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.80且小于约7.5。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.5且小于约7.45。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.5且小于约7.4。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.5且小于约7.35。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.5且小于约7.3。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.5且小于约7.25。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.5且小于约7.2。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.5且小于约7.15。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.5且小于约7.1。在示例性方面中，初始设定点pH大于约6.85且小于7.2。在示例性方面中，初始设定点pH在约7.0与7.1之间。在示例性方面中，初始设定点pH大于或约6.85至小于或约6.95。在示例性方面中，初始设定点pH是约6.95至7.15。
在示例性实施例中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期。如本文所用，短语“初始细胞培养期”是指接种后的时间或出于培养细胞的目的以用于重组蛋白生产而将有糖基化能力的细胞添加到细胞培养基后的时间。在示例性方面中，初始细胞培养期是约4天至约6天(例如，约4天、5天或约6天)或是约96小时至约144小时、或其增量。在示例性方面中，初始细胞培养期是约4天至约5天。在示例性方面中，初始细胞培养期是约4天。在示例性实施例中，初始细胞培养期根据细胞培养物的特定活细胞密度(VCD)来定义。在示例性方面中，初始细胞培养期是细胞培养物的VCD小于或约6.5x106个细胞/mL的接种后的时间。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下，直到细胞培养物达到约6.5x106个细胞/mL的VCD。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下，直到细胞培养物达到约8.2x106与约1.94x107之间的VCD。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下，直到细胞培养物达到约1.21x107与约3.46x107之间的VCD。
在示例性方面中，初始pH高于对照细胞培养物的对照pH。不受特定理论的束缚，相对于对照细胞培养物，维持较高的pH(相对于对照pH)导致TAF糖型的增加。因此，在示例性实施例中，本发明的方法涉及增加由细胞培养物中的细胞产生的蛋白质的TAF糖型的水平。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的HM糖型的水平增加。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9中的一种或多种的水平增加。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的去岩藻糖基化糖型的水平增加。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中的一种或多种的水平增加。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]和FO-N[H3N3]中的一种或多种的水平增加。
如本文所用，术语“增加”和自其起源的词语可以不是100％或完全增加。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在益处的不同程度的增加。在这方面，相对于对照细胞培养物，本发明的方法可以将TAF、HM或afuco糖型水平增加至任何程度或水平。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，由本发明的方法提供的增加是至少或约10％增加(例如，至少或约20％增加、至少或约30％增加、至少或约40％增加、至少或约50％增加、至少或约60％增加、至少或约70％增加、至少或约80％增加、至少或约90％增加、至少或约95％增加、至少或约98％增加)。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，由本发明的方法提供的增加超过100％，例如200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或甚至1000％。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平增加至少约1.5倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平增加至少约2倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平增加至少约3倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平增加至少约4倍或5倍。
在示例性方面中，早在接种后第1天就观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，早在接种后第2天就观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，早在接种后第3天就观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，早在接种后第4天就观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，在接种后约第5天后观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平增加。在示例性方面中，在从细胞培养物中收获蛋白质时，观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平增加。
在示例性方面中，观察到蛋白质的TAF糖型的水平增加长于细胞培养的第4天、第5天或第6天或超过初始细胞培养期。在示例性方面中，观察到蛋白质的TAF糖型的水平增加持续细胞培养(接种后)的7、8、9、10、11或12天或更长时间(例如，2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年)。在示例性方面中，在从细胞培养物中收获蛋白质时，观察到蛋白质的TAF糖型的水平增加。
在示例性方面中，初始pH低于对照细胞培养物的对照pH。不受特定理论的束缚，相对于对照细胞培养物，维持较低的pH(相对于对照pH)导致TAF糖型的减少。因此，在示例性实施例中，本发明的方法涉及降低由细胞培养物中的细胞产生的蛋白质的TAF糖型的水平。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的HM糖型的水平降低。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9中的一种或多种的水平降低。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的去岩藻糖基化糖型的水平降低。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中的一种或多种的水平降低。在示例性方面中，相对于对照细胞培养物，重组糖基化蛋白质的A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]和FO-N[H3N3]中的一种或多种的水平降低。
如本文所用，术语“降低”和自其起源的词语可以不是100％或完全降低。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在益处的不同程度的降低。在这方面，相对于对照细胞培养物，本发明的方法可以将TAF、HM或afuco糖型水平降低至任何程度或水平。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，由本发明的方法提供的降低是至少或约10％降低(例如，至少或约20％降低、至少或约30％降低、至少或约40％降低、至少或约50％降低、至少或约60％降低、至少或约70％降低、至少或约80％降低、至少或约90％降低、至少或约95％降低、至少或约98％降低)。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，由本发明的方法提供的降低超过100％，例如200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或甚至1000％。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平降低至少约1.5倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平降低至少约2倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平降低至少约3倍。在示例性实施例中，相对于对照细胞培养物，蛋白质的TAF、HM或afuco糖型的水平降低至少约4倍或5倍。
在示例性方面中，早在接种后第1天就观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，早在接种后第2天就观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，早在接种后第3天就观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，早在接种后第4天就观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，在接种后约第5天后观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平降低。在示例性方面中，在从细胞培养物中收获蛋白质时，观察到或可观察到或检测到或可检测到蛋白质的TAF糖型的水平降低。
在示例性方面中，观察到蛋白质的TAF糖型的水平降低长于细胞培养的第4天、第5天或第6天或超过初始细胞培养期。在示例性方面中，观察到蛋白质的TAF糖型的水平降低持续细胞培养(接种后)的7、8、9、10、11或12天或更长时间(例如，2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年)。在示例性方面中，在从细胞培养物中收获蛋白质时，观察到蛋白质的TAF糖型的水平降低。
关于本发明的方法，通过此类方法实现的调节、增加或降低是相对于“对照”或“对照细胞培养物”。这些术语在本文中可互换使用。在示例性方面中，对照是当不进行本发明方法的步骤时蛋白质的TAF糖型的水平。在示例性方面中，对照是当进行重组生产的已知方法时蛋白质的TAF糖型的水平。在示例性方面中，对照是当在重组生产期间维持已知的操作pH时TAF糖型的水平。如本文所用，术语“对照细胞培养物”意指除了在初始细胞培养期期间的pH外以与进行本发明方法的步骤(例如，本发明方法的细胞培养)的细胞培养物相同的方式维持的细胞培养物。在示例性方面中，对照细胞培养物是维持在已知的操作或标准参数(包括对照pH)下的细胞培养物。如本文所用，术语“对照pH”可以指已知的操作pH，例如在第一时间点或在进行本发明方法之前的时间点维持的细胞培养物的pH。在示例性方面中，对照pH是其TAF水平是已知的或确定的细胞培养物的pH。
本领域已知多种用于评估存在于含有糖蛋白的组合物中的糖型或用于确定包含糖蛋白的特定样品的糖型谱的方法。合适的方法包括阳离子MALDI-TOF分析、阴离子MALDI-TOF分析、弱阴离子交换(WAX)色谱、正相色谱(NP-HPLC)、外切糖苷酶消化、Bio-Gel P-4色谱、阴离子交换色谱和一维核磁共振光谱及其组合。参见例如，Mattu等人,JBC 273:2260-2272(1998)；Field等人,Biochem J[生物化学杂志]299(第1部分):261-275(1994)；Yoo等人,MAbs 2(3):320-334(2010)；Wuhrer M.等人,Journal ofChromatography B[色谱杂志B辑],2005,第825卷,第2期,第124-133页；Ruhaak L.R.,Anal Bioanal Chem[分析与生物分析化学],2010,第397卷:3457-3481以及Geoffrey,R.G.等人Analytical Biochemistry[生物分析化学]1996,第240卷,第210-226页。此外，本文所述的实例描述了用于评估存在于含有糖蛋白的组合物中的糖型的合适方法。
温度和其他细胞培养参数
在示例性实施例中，该方法还包括在初始细胞培养期期间以及任选地在初始细胞培养期之后的第二细胞培养期期间将细胞培养物维持在初始温度下，其中初始温度在30℃与40℃之间。在示例性实施例中，初始温度在约32℃至约38℃之间或在约35℃至约38℃之间。在示例性方面中，将细胞培养物维持在初始温度下是指在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在初始温度的±1℃内。在示例性方面中，将细胞培养物维持在初始温度下持续初始细胞培养期意指细胞培养物的温度在初始细胞培养期期间相对于初始温度变化不超过1℃。
关于本发明，可以根据适于重组蛋白生产的任何一组条件维持细胞培养物。例如，可以将细胞培养物维持在特定细胞密度、培养体积、溶解氧水平、压力、渗透压等下。在示例性方面中，将接种前的细胞培养物在CO2培养箱中在标准加湿条件下在5％CO2下振荡(例如，以70rpm)。在示例性方面中，在1.5L培养基中以106个细胞/mL的接种密度接种细胞培养物。在示例性方面中，该方法包括将渗透压维持在约200mOsm/kg至约500mOsm/kg之间。在示例性方面中，该方法包括将渗透压维持在约225mOsm/kg至约400mOsm/kg或约225mOsm/kg至约375mOsm/kg之间。在示例性方面中，该方法包括将渗透压维持在约225mOsm/kg至约350mOsm/kg之间。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的溶解氧(DO)水平维持在约20％至约60％氧饱和度下。在示例性实例中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的DO水平维持在约30％至约50％(例如，约35％至约45％)氧饱和度下。在示例性实例中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的DO水平维持在约20％、约30％、约40％、约50％或约60％氧饱和度下。
可以将细胞培养物维持在任何一种或多种培养基中。在示例性方面中，可以将细胞培养物维持在适于细胞生长的培养基中和/或可以为细胞培养物提供根据任何合适的进料方案的一种或多种进料培养基。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含葡萄糖、乳酸盐、氨、谷氨酰胺和/或谷氨酸盐的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度小于约1μM的锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含约0.25μM至约1μM锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含可忽略量的锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度小于或约50ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度小于或约40ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度小于或约30ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度小于或约20ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，培养基包含浓度大于或约5ppb或大于或约10ppb的铜。
在示例性实施例中，细胞培养的类型是补料分批培养或连续灌注培养。然而，本发明的方法有利地不限于任何特定类型的细胞培养。
初始细胞培养期后
在示例性实施例中，调节重组糖基化蛋白质的TAF糖型水平的本发明方法包括将细胞培养物维持在初始pH下持续初始细胞培养期。在示例性方面中，该方法还包括在初始细胞培养期后停止将细胞培养物维持在初始设定点pH下。出于本文的目的，“停止将细胞培养物维持在初始设定点pH下”的概念是指在初始设定点pH下控制细胞培养物所需的作用的停止。例如，可以改变pH控制***上的一个或多个设置以便有效地停止初始设定点pH的维持。在示例性方面中，“停止将细胞培养物维持在初始设定点pH下”可以指允许pH变化或改变。例如，“停止将细胞培养物维持在初始设定点pH下”可以指通过例如改变pH控制***上的设定点pH来使pH变化的有效步骤，或者可以指允许pH变化或停止控制或维持特定的pH或pH范围的无效步骤。在示例性方面中，在细胞培养的最初4至6天后，停止细胞培养物pH的维持或调节。在示例性方面中，调节由有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质的TAF糖型水平的方法包括将细胞培养物维持在初始pH下持续初始细胞培养期并且在初始细胞培养期后停止将细胞培养物维持在初始pH下，并且允许细胞培养物的pH变化例如超过0.05。出于本文的目的，“允许pH变化”的概念可以指通过例如改变pH控制***上的设定点pH来使pH变化的有效步骤，或者可以指允许pH变化或停止控制或维持特定的pH或pH范围的无效步骤。在示例性方面中，允许细胞培养物pH在初始细胞培养期后变化约0.05至约2.0。例如，在细胞培养的初始期后，允许pH变化约0.1至约1.5或约0.5至约1.0。在某些示例性方面中，从不允许pH在适于细胞培养物的细胞产生抗体的pH范围之外。例如，从不允许pH为9或更高或为4或更低。
在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期后的pH变化。在示例性方面中，该方法包括将pH控制***上的设定点pH从初始设定点pH改变为不同的设定点pH。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期后(任选地持续第二细胞培养期)使pH(例如，设定点pH)变化超过约0.05(相对于初始设定点pH)。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期后使pH(例如，设定点pH)变化约0.05至约2.0(相对于初始设定点pH)。在示例性方面中，pH变化是pH的增加(例如，相对于初始设定点pH)。在某些方面中，该方法包括使pH(例如，设定点pH)升高约0.1至约1.5或约0.15至约1.0。在示例性方面中，变化是pH的降低(例如，相对于初始设定点pH)。在某些方面中，该方法包括使pH(例如，设定点pH)降低约0.1至约1.5或约0.15至约1.0。
控制或维持细胞培养物的pH的方法以及使用包括pH监测***的完全仪器化的高通量生物反应器进行控制或维持的方法在本领域是已知的。参见例如，“Dissolved OxygenandpH Monitoring within Cell Culture Media using a Hydrogel Microarray Sensor[使用水凝胶微阵列传感器监测细胞培养基内的溶解氧和pH]”Seung Joon Lee的论文,2006年12月Texas A&M University[德州农工大学]；Adami等人,“Development of a pHSensor with Integrated Reference Electrode for Cell Culture Monitoring[用于细胞培养监测的具有集成参考电极的pH传感器的开发]”Sensors[传感器],第162卷LectureNotes in Electrical Engineering[电气工程讲义],第86章,第481-485页(2013)；美国专利号7,429,491；Ge等人,J Biotechnology[生物技术杂志]122:293-306(2006)；Weuster-Botz等人,Bioprocess.Biosyst.Eng.[生物过程与生物***工程]28(2):109-119(2005)；Maharbiz等人,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]85(4):376-381(2004)；Zanzotto等人,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]87(2):243-254(2005)；Hermann等人,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]81:178-186(2002)；EP3128319；US 2015/0376647。pH监测器是可商购的，并且包括例如Easyferm Plus ARC 225(哈密顿公司(Hamilton)，内华达州里诺市)。此外，本文在实例中描述了维持细胞培养物pH的方法。
在示例性方面中，调节重组糖基化蛋白质的TAF糖型水平的本发明方法包括将细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期，并且还包括在初始细胞培养期期间以及任选地在初始细胞培养期后的第二细胞培养期期间将细胞培养物维持在初始温度下，其中初始温度在30℃与40℃之间。在示例性方面中，该方法还包括在初始细胞培养期期间以及在初始细胞培养期后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天维持初始细胞温度。在示例性方面中，该方法还包括在初始细胞培养期后停止维持初始温度。在示例性方面中，该方法包括停止将细胞培养物维持在初始温度下并且允许温度在初始细胞培养期后变化约2℃或更多。在示例性方面中，在初始细胞培养期后，允许温度变化超过约2℃。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期后使温度变化超过约2℃。在本文的任何实施例中，第二细胞培养期可以是在初始细胞培养期后的另外1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间。
在示例性方面中，允许细胞培养物温度在初始细胞培养期后变化。在示例性方面中，在初始细胞培养期后，不再将温度维持在所选初始温度的±1℃之间。在示例性方面中，在初始细胞培养期后，允许温度变化约1℃至约6℃。例如，在细胞培养的初始期后，允许温度变化约1℃至约5℃或约1℃至约4℃或约2℃或约3℃。在某些示例性方面中，从不允许温度在适于细胞培养物的细胞产生抗体的温度范围之外。例如，从不允许温度高于40℃或低于30℃。
在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期后的温度变化。在示例性方面中，该方法包括在细胞培养的最初3至5天后使温度变化约1℃至约6℃。在示例性方面中，变化是温度的升高。在示例性方面中，变化是温度的降低。在某些方面中，该方法包括使温度升高或降低约1℃至约5℃或约1℃至约4℃或约2℃或约3℃。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始pH(例如，初始设定点pH)下持续至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、约3天至约6天、约4天至约6天或约4天至约5天的初始细胞培养期。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在初始pH(例如，初始设定点pH)下持续至少约72小时、约76小时、约80小时、约84小时、约88小时、约92小时、约96小时、约100小时、约104小时、约108小时、约112小时、约116小时、约120小时、约124小时、约128、约132小时、约136小时、约140小时或约144小时的初始细胞培养期。
在替代性实施例中，该方法不包括在初始细胞培养期后的温度变化。在示例性实例中，将细胞培养物的温度在细胞培养期的整个持续时间内维持在初始温度的±1℃内的温度下。在示例性实例中，将细胞培养物的温度在整个细胞培养期期间维持在初始温度的±1℃内的温度下，并且该方法包括将细胞培养物维持在初始pH(例如，初始设定点pH)下持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天或至少约6天的初始细胞培养期。在示例性方面中，将细胞培养物的温度在整个细胞培养期期间维持在初始温度的±1℃内的温度下，并且该方法包括将细胞培养物维持在初始pH(例如，初始设定点pH)下持续约24小时、约28小时、约32小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时、约52小时、约56小时、约60小时、约64小时、约68小时、约72小时、约76小时、约80小时、约84小时、约88小时、约92小时、约96小时、约100小时、约104小时、约108小时、约112小时、约116小时、约120小时、约124小时、约128、约132小时、约136小时、约140小时或约144小时的初始细胞培养期。
重组蛋白
在示例性实施例中，重组蛋白包含含有一个或多个下式的N-糖基化共有序列的氨基酸序列：
Asn-Xaa1-Xaa2
其中Xaa1是除Pro外的任何氨基酸，并且Xaa2是Ser或Thr。
在示例性实施例中，重组蛋白包含可结晶片段(Fc)多肽。如本文所用的术语“Fc多肽”包括衍生自抗体Fc区的天然和突变蛋白形式的多肽。还包括含有促进二聚化的铰链区的截短形式的此类多肽。包含Fc部分(和由其形成的寡聚体)的融合蛋白提供了通过蛋白A或蛋白G柱上的亲和层析进行简便纯化的优点。在示例性实施例中，重组蛋白包含IgG(例如，人IgG)的Fc。在示例性方面中，重组蛋白包含IgG1或IgG2的Fc。在示例性方面中，重组蛋白是抗体、肽体(peptibody)或Fc融合蛋白。
在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白质形式、包含重链和轻链、并且包含可变区和恒定区的蛋白质。例如，抗体可以是IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区通常是约100-110个或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。恒定区允许抗体募集免疫***的细胞和分子。可变区由每条轻链和重链的N末端区域构成，而恒定区由每条重链和轻链的C末端部分构成。(Janeway等人,“Structure of the Antibody Molecule and theImmunoglobulin Genes[Structure of the Antibody Molecule and theImmunoglobulin Genes]”,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫***],第4版Elsevier Science Ltd./GarlandPublishing[爱思唯尔科技有限公司/加兰出版社],(1999))。
本领域已经描述了抗体CDR的一般结构和特性。简而言之，在抗体支架中，CDR嵌入重链和轻链可变区的框架内，在其中它们构成主要负责抗原结合和识别的区域。可变区包含至少三个重链或轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences ofProteins ofImmunologicalInterest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],Public Health Service N.I.H.[国立卫生研究院公共卫生服务部],马里兰州贝塞斯达；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，在框架区(由Kabat等人,1991指定框架区1-4，即FR1、FR2、FR3和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)内。
人轻链被分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本发明的实施例包括抗体的所有此类类别或同种型。轻链恒定区可以是例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区，例如人α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，抗体是同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一种。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施例中，抗体包含与由哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)产生的天然存在的抗体基本上相似的序列。在这方面，抗体可以被认为是哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人抗体等。在某些方面中，重组蛋白是人抗体。在某些方面中，重组蛋白是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”在本文中用于指含有来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域，或更一般地含有来自至少两个物种的氨基酸序列段的抗体。当与抗体相关使用时，术语“人源化”是指至少具有来自非人来源的CDR区的抗体，其被工程化为具有比原始来源的抗体与真实的人抗体更相似的结构和免疫功能。例如，人源化可以涉及将来自非人抗体(如小鼠抗体)的CDR接枝到人抗体中。人源化还可以涉及选择氨基酸取代以使非人序列看起来更像人序列。
抗体可以通过酶(例如像木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)切割成片段。木瓜蛋白酶切割抗体以产生两个Fab片段和单个Fc片段。胃蛋白酶切割抗体以产生F(ab’)2片段和pFc’片段。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是保留至少一个糖基化位点的抗体片段，例如Fab、Fc、F(ab’)2或pFc’。
抗体架构已经被用于产生越来越多的替代抗体形式，其跨越至少12–150kDa的分子量范围和从单体(n＝1)、二聚体(n＝2)和三聚体(n＝3)到四聚体(n＝4)并且可能更高的化合价(n)范围；此类替代抗体形式在本文中称为“抗体蛋白质产物”。
抗体蛋白质产物包括基于保留完整的抗原结合能力的抗体片段(例如，scFv、Fab和VHH/VH)的那些。保留其完整抗原结合位点的最小抗原结合片段是Fv片段，其完全由可变(V)区组成。使用可溶的柔性氨基酸肽接头将V区连接至scFv(单链片段可变)片段以稳定分子，或者将恒定(C)结构域添加到V区以产生Fab片段。scFv和Fab都是可以在原核宿主中容易地产生的广泛使用的片段。其他抗体蛋白质产物包括二硫键稳定的scFv(ds-scFv)、单链Fab(scFab)、以及二聚体和多聚体抗体形式(如双抗体、三抗体和四抗体)、或包含由与寡聚化结构域连接的scFv组成的不同形式的迷你抗体(miniAb)。最小的片段是骆驼重链Ab的VHH/VH以及单结构域Ab(sdAb)。最常用于产生新颖抗体形式的构件是单链可变(V)结构域抗体片段(scFv)，其包含来自通过约15个氨基酸残基的肽接头连接的重链和轻链的V结构域(VH和VL结构域)。肽体或肽-Fc融合体是又另一种抗体蛋白质产物。肽体的结构由接枝到Fc结构域上的生物活性肽组成。肽体在本领域有充分描述。参见例如，Shimamoto等人,mAbs4(5):586-591(2012)。
其他抗体蛋白质产物包括单链抗体(SCA)；双抗体；三抗体；四抗体；双特异性或三特异性抗体等。双特异性抗体可以被分为五大类：BsIgG、附加的IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白和BsAb缀合物。参见例如，Spiess等人,Molecular Immunology[分子免疫学]67(2)第A部分:97-106(2015)。
在示例性方面中，重组蛋白包含这些抗体蛋白质产物中的任何一种。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是以下中的任何一种：scFv、Fab VHH/VH、Fv片段、ds-scFv、scFab、二聚体抗体、多聚体抗体(例如，双抗体、三抗体、四抗体)、miniAb、肽体、骆驼重链抗体的VHH/VH、sdAb、双抗体、三抗体、四抗体、双特异性或三特异性抗体、BsIgG、附加的IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白和BsAb缀合物。
重组蛋白可以是呈单体形式或者聚合体、寡聚体或多聚体形式的抗体蛋白质产物。在抗体包含两个或更多个不同的抗原结合区片段的某些实施例中，抗体被认为是双特异性的、三特异性的或多特异性的或者二价的、三价的或多价的，这取决于被抗体识别和结合的不同表位的数量。
关于本发明方法，抗体蛋白质产物可以缺乏抗体的某些部分。然而，通常，片段将包含在真核细胞中翻译后糖基化的抗体Fc区的至少一部分。
有利地，这些方法不限于抗体的抗原特异性。因此，抗体对几乎任何抗原都具有任何结合特异性。在示例性方面中，抗体与激素、生长因子、细胞因子、细胞表面受体或其任何配体结合。在示例性方面中，抗体与在免疫细胞的细胞表面上表达的蛋白质结合。在示例性方面中，抗体与选自下组的分化簇分子结合，该组由以下组成：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11A、CD11B、CD11C、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31,CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CDw128、CD129、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和CD182。
在示例性方面中，抗体是以下专利中描述的那些之一：美国专利号7947809和美国专利申请公开号20090041784(胰高血糖素受体)；美国专利号7939070、美国专利号7833527、美国专利号7767206和美国专利号7786284(IL-17受体A)；美国专利号7872106和美国专利号7592429(硬化蛋白)；美国专利号7871611、美国专利号7815907、美国专利号7037498、美国专利号7700742和美国专利申请公开号20100255538(IGF-1受体)；美国专利号7868140(B7RP1)；美国专利号7807159和美国专利申请公开号20110091455(肌生成抑制素)；美国专利号7736644、美国专利号7628986、美国专利号7524496和美国专利申请公开号20100111979(表皮生长因子受体的缺失突变体)；美国专利号7728110(SARS冠状病毒)；美国专利号7718776和美国专利申请公开号20100209435(OPGL)；美国专利号7658924和美国专利号7521053(血管生成素-2)；美国专利号7601818、美国专利号7795413、美国专利申请公开号20090155274、美国专利申请公开号20110040076(NGF)；美国专利号7579186(TGF-βII型受体)；美国专利号7541438(***生长因子)；美国专利号7438910(IL1-R1)；美国专利号7423128(备解素)；美国专利号7411057、美国专利号7824679、美国专利号7109003、美国专利号6682736、美国专利号7132281和美国专利号7807797(CTLA-4)；美国专利号7084257、美国专利号7790859、美国专利号7335743、美国专利号7084257和美国专利申请公开号20110045537(干扰素-γ)；美国专利号7932372(MAdCAM)；美国专利号7906625、美国专利申请公开号20080292639和美国专利申请公开号20110044986(淀粉样蛋白)；美国专利号7815907和美国专利号7700742(***I)；美国专利号7566772和美国专利号7964193(白介素-1β)；美国专利号7563442、美国专利号7288251、美国专利号7338660、美国专利号7626012、美国专利号7618633和美国专利申请公开号20100098694(CD40)；美国专利号7498420(c-Met)；美国专利号7326414、美国专利号7592430和美国专利号7728113(M-CSF)；美国专利号6924360、美国专利号7067131和美国专利号7090844(MUC18)；美国专利号6235883、美国专利号7807798和美国专利申请公开号20100305307(表皮生长因子受体)；美国专利号6716587、美国专利号7872113、美国专利号7465450、美国专利号7186809、美国专利号7317090和美国专利号7638606(白介素-4受体)；美国专利申请公开号20110135657(β-KLOTHO)；美国专利号7887799和美国专利号7879323(成纤维细胞生长因子样多肽)；美国专利号7867494(IgE)；美国专利申请公开号20100254975(α-4β-7)；美国专利申请公开号20100197005和美国专利号7537762(活化素受体样激酶1)；美国专利号7585500和美国专利申请公开号20100047253(IL-13)；美国专利申请公开号20090263383和美国专利号7449555(CD148)；美国专利申请公开号20090234106(激活素A)；美国专利申请公开号20090226447(血管生成素-1和血管生成素-2)；美国专利申请公开号20090191212(血管生成素-2)；美国专利申请公开号20090155164(C-FMS)；美国专利号7537762(激活素受体样激酶-1)；美国专利号7371381(甘丙肽)；美国专利申请公开号20070196376(***)；美国专利号7267960和美国专利号7741115(LDCAM)；US 7265212(CD45RB)；美国专利号7709611、美国专利申请公开号20060127393和美国专利申请公开号20100040619(DKK1)；美国专利号7807795、美国专利申请公开号20030103978和美国专利号7923008(骨保护素)；美国专利申请公开号20090208489(OV064)；美国专利申请公开号20080286284(PSMA)；美国专利号7888482、美国专利申请公开号20110165171和美国专利申请公开号20110059063(PAR2)；美国专利申请公开号20110150888(肝杀菌肽)；美国专利号7939640(B7L-1)；美国专利号7915391(c-Kit)；美国专利号7807796、美国专利号7193058和美国专利号7427669(ULBP)；美国专利号7786271、美国专利号7304144和美国专利申请公开号20090238823(TSLP)；美国专利号7767793(SIGIRR)；美国专利号7705130(HER-3)；美国专利号7704501(脊髓小脑共济失调蛋白-1样多肽)；美国专利号7695948和美国专利号7199224(TNF-α转化酶)；美国专利申请公开号20090234106(激活素A)；美国专利申请公开号20090214559和美国专利号7438910(IL1-R1)；美国专利号7579186(TGF-βII型受体)；美国专利号7569387(TNF受体样分子)；美国专利号7541438(***生长因子)；美国专利号7521048(TRAIL受体-2)；美国专利号6319499、美国专利号7081523和美国专利申请公开号20080182976(***受体)；美国专利申请公开号20080166352和美国专利号7435796(B7RP1)；美国专利号7423128(备解素)；美国专利号7422742和美国专利号7141653(白介素-5)；美国专利号6740522和美国专利号7411050(RANKL)；美国专利号7378091(碳酸酐酶IX(CA IX)肿瘤抗原)；美国专利号7318925和美国专利号7288253(甲状旁腺激素)；美国专利号7285269(TNF)；美国专利号6692740和美国专利号7270817(ACPL)；美国专利号7202343(单核细胞趋化蛋白-1)；美国专利号7144731(SCF)；美国专利号6355779和美国专利号7138500(4-1BB)；美国专利号7135174(PDGFD)；美国专利号6630143和美国专利号7045128(Flt-3配体)；美国专利号6849450(金属蛋白酶抑制剂)；美国专利号6596852(LERK-5)；美国专利号6232447(LERK-6)；美国专利号6500429(脑源性神经营养因子)；美国专利号6184359(上皮衍生的T细胞因子)；美国专利号6143874(神经营养因子NNT-1)；美国专利申请公开号20110027287(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶KEXIN 9型(PCSK9))；美国专利申请公开号20110014201(IL-18受体)；以及美国专利申请公开号20090155164(C-FMS)。出于其对可变结构域多肽、可变结构域编码核酸、宿主细胞、载体、制备编码所述可变结构域的多肽的方法、药物组合物以及治疗与含有可变结构域的抗原结合蛋白或抗体的相应靶标相关的疾病的方法的目的，将上述专利和公开的专利申请通过引用以其整体并入本文。
在示例性实施例中，抗体是以下之一：莫罗单抗-CD3(以商标名称Orthoclone市售的产品)、阿昔单抗(以商标名称市售的产品)、利妥昔单抗(以商标名称 市售的产品)、巴利昔单抗(以商标名称市售的产品)、达利珠单抗(以商标名称市售的产品)、帕利珠单抗(以商标名称市售的产品)、英利昔单抗(以商标名称市售的产品)、曲妥珠单抗(以商标名称市售的产品)、阿仑单抗(以商标名称市售的产品)、阿达木单抗(以商标名称市售的产品)、托西莫单抗-I131(以商标名称市售的产品)、依法利珠单抗(以商标名称市售的产品)、西妥昔单抗(以商标名称市售的产品)、替伊莫单抗(以商标名称市售的产品)、奥马珠单抗(以商标名称市售的产品)、贝伐单抗(以商标名称市售的产品)、那他珠单抗(以商标名称市售的产品)、兰尼单抗(以商标名称市售的产品)、帕尼单抗(以商标名称市售的产品)、依库珠单抗(以商标名称市售的产品)、培舍珠单抗(以商标名称市售的产品)、戈利木单抗(以商标名称市售的产品)、康纳单抗(以商标名称市售的产品)、卡妥索单抗(以商标名称市售的产品)、优特克单抗(以商标名称市售的产品)、托珠单抗(以商标名称市售的产品)、奥法木单抗(以商标名称市售的产品)、德尼单抗(以商标名称市售的产品)、贝利木单抗(以商标名称市售的产品)、瑞西巴库单抗、易普利姆玛(以商标名称市售的产品)以及帕妥珠单抗(以商标名称市售的产品)。在示例性实施例中，抗体是以下之一：抗TNFα抗体，如阿达木单抗、英利昔单抗、依那西普、戈利木单抗和培舍珠单抗；抗IL1β抗体，如康纳单抗；抗IL12/23(p40)抗体，如优特克单抗和布瑞吉努单抗(briakinumab)；以及抗IL2R抗体，如达利珠单抗。合适的抗癌抗体的实例包括但不限于抗BAFF抗体，如贝利木单抗；抗CD20抗体，如利妥昔单抗；抗CD22抗体，如依帕珠单抗；抗CD25抗体，如达利珠单抗；抗CD30抗体，如伊雷单抗(iratumumab)；抗CD33抗体，如吉妥珠单抗；抗CD52抗体，如阿仑单抗；抗CD152抗体，如易普利姆玛；抗EGFR抗体，如西妥昔单抗；抗HER2抗体，如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；抗IL6抗体，如司妥昔单抗(siltuximab)；以及抗VEGF抗体，如贝伐单抗；抗IL6受体抗体，如托珠单抗。
细胞
本发明涉及在由有糖基化能力的细胞产生期间调节蛋白质的不同糖基化形式的水平的方法。在示例性方面中，有糖基化能力的细胞是真核细胞，包括但不限于酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、藻类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。此类宿主细胞在本领域有描述。参见例如，Frenzel等人,Front Immunol[免疫学前沿]4:217(2013)。在示例性方面中，真核细胞是哺乳动物细胞。在示例性方面中，哺乳动物细胞是非人哺乳动物细胞。在一些方面中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞及其衍生物(例如，CHO-K1、CHO pro-3)、小鼠骨髓瘤细胞(例如，NS0、GS-NS0、Sp2/0)、被工程化为缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的细胞(例如，DUKX-X11、DG44)、人胚肾293(HEK293)细胞或其衍生物(例如，HEK293T、HEK293-EBNA)、绿色非洲猴肾细胞(例如，COS细胞、VERO细胞)、人***细胞(例如，HeLa)、人骨肉瘤骨上皮细胞U2-OS、腺癌人肺泡基底上皮细胞A549、人纤维肉瘤细胞HT1080、小鼠脑肿瘤细胞CAD、胚胎癌细胞P19、小鼠胚胎成纤维细胞NIH 3T3、小鼠成纤维细胞L929、小鼠神经母细胞瘤细胞N2a、人乳腺癌细胞MCF-7、视网膜母细胞瘤细胞Y79、人视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50、人肝癌细胞Hep G2、小鼠B骨髓瘤细胞J558L或幼仓鼠肾(BHK)细胞(Gaillet等人2007；Khan,Adv Pharm Bull[高级药物通报]3(2):257-263(2013))。
在示例性方面中，有糖基化能力的细胞是真核细胞。在示例性方面中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一些方面中，哺乳动物细胞是非人哺乳动物细胞。在示例性方面中，非人哺乳动物细胞选自下组，该组由以下组成：CHO细胞、CHO衍生物(例如，CHO-K1、CHO pro-3)、小鼠骨髓瘤细胞(例如，NS0、GS-NS0、Sp2/0)、被工程化为缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的细胞(例如，DUKX-X11、DG44)、绿色非洲猴肾细胞(例如，COS细胞、VERO细胞)、小鼠脑肿瘤细胞CAD、小鼠胚胎成纤维细胞NIH 3T3、小鼠成纤维细胞L929、小鼠神经母细胞瘤细胞N2a、人乳腺癌细胞MCF-7、视网膜母细胞瘤细胞Y79、人视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50、人肝癌细胞Hep G2、小鼠B骨髓瘤细胞J558L或幼仓鼠肾(BHK)细胞。没有糖基化能力的细胞也可以例如通过用编码糖基化所必需的相关酶的基因转染它们而转化为有糖基化能力的细胞。示例性酶包括但不限于寡糖基转移酶、糖苷酶、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、钙联蛋白/钙网蛋白、糖基转移酶、甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。
制备组合物的方法
本发明还提供了制备包含由细胞培养物中的细胞产生的蛋白质的TAF糖型的组合物的方法。在示例性实施例中，该方法包括(i)如本文所述的，将细胞培养物维持在初始pH下持续初始细胞培养期，和任选地(ii)扩增细胞培养物，以及(iii)收集包含由细胞产生的蛋白质的细胞培养物的上清液。在示例性方面中，该方法可以包括本文关于调节(增加或降低)由细胞培养物中的细胞产生的蛋白质的TAF糖型的水平的本发明方法描述的任何一个步骤。
该方法可以包括从细胞培养物或其上清液中纯化蛋白质以及优选地回收所纯化的蛋白质的一个或多个步骤。在示例性方面中，该方法包括一个或多个色谱步骤，例如亲和色谱(例如，蛋白A亲和色谱)、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱。在示例性方面中，该方法包括使用蛋白A亲和色谱树脂纯化蛋白质。
在示例性实施例中，该方法还包括配制所纯化的蛋白质的步骤等，从而获得包含所纯化的蛋白质的配制品。此类步骤描述于Formulation and Process DevelopmentStrategies for Manufacturing[制造用配制和工艺开发策略],编辑Jameel和Hershenson,John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子公司](新泽西州霍博肯市),2010中。
该方法还可以在细胞培养步骤前包括一个或多个上游步骤。在示例性实施例中，该方法包括产生表达蛋白质的宿主细胞的步骤。例如，在一些实例中，该方法包括向宿主细胞中引入包含核酸的载体，该核酸包含编码蛋白质的核苷酸序列。
组合物
本文提供了包含蛋白质的TAF糖型的组合物。在示例性实施例中，通过本文所述的制备包含由细胞培养物中的细胞产生的蛋白质的TAF糖型的组合物的本发明方法制备组合物。在示例性方面中，组合物中至少约10％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中至少约20％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中至少约30％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中至少约40％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中至少约50％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中至少约60％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中至少约70％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中至少约80％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中至少约90％的蛋白质是TAF糖型。在示例性方面中，组合物中大于约90％或大于约95％的蛋白质是TAF糖型。
在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约10％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约20％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约30％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约40％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约50％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约60％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约70％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约80％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约90％TAF糖型的糖型谱。在示例性方面中，本发明的组合物具有大于或约95％TAF糖型的糖型谱。
在示例性方面中，本发明的组合物是药物组合物。在示例性方面中，药物组合物包括药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲生理盐水溶液、水、乳液(如油/水或水/油乳液)以及各种类型的润湿剂。该术语还包括由美国联邦政府的管理机构批准或在美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何药剂。
药物组合物可以包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶推进剂、空气置换剂、碱化剂、抗结块剂、抗凝血剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂、碱、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、包衣剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳化稳定剂、填充剂、成膜剂、增味剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、造粒剂、保湿剂、润滑剂、粘膜粘合剂、软膏基质、软膏、油质运载体、有机碱、锭剂基质、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂(surface active agent)、表面活性剂(surfactant)、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张力剂、毒性剂、粘度增加剂、吸水剂、水混溶性助溶剂、水软化剂或润湿剂。参见例如，the Handbook of Pharmaceutical Excipients[药物赋形剂手册],第三版,A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press[医药出版社]，英国伦敦，2000)，将其通过引用以其整体并入。Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第十六版,E.W.Martin(Mack Publishing Co.[麦克出版公司]，宾夕法尼亚州伊斯顿，1980)，将其通过引用以其整体并入。
在示例性方面中，药物组合物包含在所用剂量和浓度下对接受者无毒的配制品材料。在特定的实施例中，药物组合物包含治疗有效量的蛋白质的TAF糖型和一种或多种药学上可接受的盐；多元醇；表面活性剂；渗透平衡剂；张力剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；增积剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；止痛剂；或另外的药剂。在示例性方面中，任选地除一种或多种赋形剂外，药物组合物还包含一种或多种多元醇和/或一种或多种表面活性剂，该一种或多种赋形剂包括但不限于药学上可接受的盐；渗透平衡剂(张力剂)；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；增积剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；和止痛剂。
在某些实施例中，药物组合物可以含有用于修饰、维持或保持组合物的例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制品材料。在此类实施例中，合适的配制品材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；增积剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；以及其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克(pluronic)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、氚核、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾；甘露糖醇山梨糖醇)；递送运载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明顿药物科学],第18版(A.R.Genrmo编辑),1990,MackPublishing Company[麦克出版公司]。
可以配制药物组合物以达到生理学上相容的pH。在一些实施例中，药物组合物的pH可以例如在约4或约5与约8.0或者约4.5与约7.5或者约5.0至约7.5之间。在示例性实施例中，药物组合物的pH在5.5与7.5之间。
给出以下实例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制其范围。
实例
实例1
这个实例证明，初始细胞培养物pH调节由细胞培养物中的细胞产生的重组糖基化蛋白质的特定糖型的水平，并且在初始细胞培养期后作出的pH的任何改变对糖型水平几乎没有影响。
材料与方法
细胞系、细胞培养和培养基
将表达同种型IgG1的重组抗体的CHO细胞系的细胞维持在具有1L工作体积的3L锥形摇瓶(康宁生命科技公司(Corning Life Sciences)，马萨诸塞州洛厄尔市)中。将细胞于36℃和5％CO2下在标准加湿条件下培养，并且在自动CO2培养箱(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆市)中以70rpm振荡。将所有细胞每三天在含有不同浓度的甲氨蝶呤(MTX)的培养基中传代培养，并且在接种到生物反应器之前转移、接种并在培养基中培养四天。将细胞培养生产培养基用作研究中的对照培养基。细胞培养基组分包括生长因子、氨基酸、缓冲液、营养素、微量元素、维生素、表面活性剂、盐、核苷酸、激素、脂质和其他有机化合物。
生物反应器灌注工艺
通过分批工艺或灌注工艺，并且在标准温度和溶解氧条件下进行培养。
细胞生长、代谢物和抗体滴度分析
使用Nova CDV(诺瓦生物医学公司(Nova Biomedical)，马萨诸塞州沃尔瑟姆市)确定活细胞密度和生存力。对于生物反应器样品，从Nova Flex(诺瓦生物医学公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆市)获得代谢物(包括葡萄糖、乳酸盐、氨、谷氨酰胺、谷氨酸盐)。
亲水性相互作用液相色谱(HILIC)聚糖图谱
使用HILIC确定酶促释放的N-连接聚糖的聚糖图谱。简而言之，将聚糖与包含PNG酶F和磷酸钠缓冲液(pH 7.5)的溶液在约37℃下一起孵育约2小时。然后将包含2-氨基苯甲酸(2-AA)和氰基硼氢化钠的标记溶液添加到PNG酶F处理的聚糖中，并且将混合物在约80℃下孵育约75分钟。孵育后，将混合物离心以获得沉淀蛋白质的沉淀。收集上清液并置于小瓶中。
通过与荧光检测器联机的HILIC分离聚糖：在高有机条件(流动相A和流动相B分别为甲酸铵和乙腈)下注射聚糖并与柱结合，然后用增加梯度的水性甲酸铵缓冲液洗脱。使用1.7μm小颗粒柱形式和150mm柱长实现高分辨率。总运行时间(包括柱再平衡)为155分钟。
实验设计
在三个初始设定点pH之一下培养产生IgG1抗体的CHO细胞组：6.85、6.95或7.1。在接种后的前6天维持该pH(其中接种发生在第0天)。对于至少两组细胞，使pH在第6天左右变化。一组细胞的pH从6.85变为6.95，并且至少另一组的pH从7.1变为6.95。对于至少三组细胞，pH没有变化并且pH维持在6.85、6.95或7.10下。
将细胞总共培养12天。在整个12天培养期测量活细胞密度(VCD)，并且结果显示在表1中。
表1
在细胞培养第4天后几天测量TAF水平、高甘露糖(HM)聚糖水平和去岩藻糖基化(AF)聚糖水平，并且观察结果和预期模型结果显示在表2中。
表2
示例性范围
TAF(％) 2.8-7.5
HM(％) 1.8-2.8
AF(％) 1.5-2.3
设定点pH 6.85-7.1
出乎意料的是，初始pH与TAF水平呈正相关(图3)。随着pH增加，TAF水平也增加。如图4所示，维持在7.1的pH下或维持在7.1然后在第6天左右变为6.95下的细胞培养物的TAF水平大于维持在较低pH 6.95或6.85下的其他组的TAF水平。观察到大约2倍或更多的增加。此外，如图4所示，维持在6.85的pH下或维持在6.85然后变为6.95下的细胞培养物的TAF水平低于维持在较高pH6.95和7.1下的其他组的TAF水平。
对这些结果进行了统计分析。图5展示了在细胞培养期期间第0-6天、第6-9天、第9-12天和第12天初始设定点pH与TAF的不同相关性。在每个时期初始pH与TAF的相关性很强。如图6所示，最终pH(初始细胞培养期后的pH)与TAF(初始细胞培养期后的TAF水平)的相关性较弱。
评估了最终pH(初始细胞培养期后的pH)的影响。将两组细胞培养12天。对于两组，将细胞在6.95的pH下培养细胞培养的最初5天。在第1组在随后的几天内维持在该pH下的同时，第2组的pH在第5天至第9天变为6.85，然后从第9天至第12天变为7.1。如图7所示，两组均展示出高度相似的TAF水平。这些结果表明在第5天后调节pH不影响TAF水平。
这个实例展示了初始细胞培养期期间的pH对TAF水平的影响。
实例2
这个实例提供了在初始细胞培养期期间细胞培养物pH如何影响TAF水平的另一个实例。
基本上如实例1中所述进行灌注工艺后生物反应器中的细胞培养，除了细胞表达重组IgG4抗体。培养的工作体积为1.5L，并且培养的持续时间为15天。初始温度为36℃或37℃，并且初始pH范围为6.65-6.9。在第5天后(第5天与第8天之间)，温度变为34℃与36℃之间的温度。表3概述了该研究的不同实验条件。
表3
如实例1中所述测量HM和去岩藻糖基化糖型的水平。计算两个水平的总和并标记为总去岩藻糖基化糖型。HM范围为1.4％-2.6％，并且去岩藻糖基化糖型为0.7-1.6。TAF水平范围为2.1-3.9。如图8所示，pH和最终温度都影响TAF。pH展现了正相关性，而最终温度展现了负相关性。
实例3
这个实例展示了初始细胞培养期的初始pH对TAF水平的影响以及初始细胞培养期后的pH变化对TAF水平的影响。
基本上如实例1中所述，遵循灌注工艺在生物反应器中培养表达IgG1抗体的细胞。将细胞总共培养12天并且维持在约36℃的温度下。在三个初始设定点pH(6.85、6.95或7.05)之一下培养细胞，并且在初始细胞培养期期间(在第1天)或在初始细胞培养期后(在第5天)使pH变化(向上或向下)。在7.05的初始设定点pH下培养A组的细胞，在6.85的初始设定点pH下培养B组的细胞，而在6.95的初始设定点pH下培养C组的细胞。A组的细胞被分为两个亚组：亚组A1和亚组A2。在7.05的初始设定点pH下培养亚组A1的细胞，并且在初始细胞培养期期间(在第1天)将pH变为6.95；而在7.05的初始设定点pH下培养亚组A2的细胞，并且在初始细胞培养期后(在第5天)将pH变为6.95。在初始细胞培养期后(在第5天)，将B组的细胞的pH升至6.95；并且在初始细胞培养期后(第5天)，将C组细胞的pH降至6.85。在一系列对照培养物中，在整个培养期持续时间内将pH设定并维持在6.95下(即没有pH变化)。
在12天培养期后，基本上如实例1中所述经由HILIC测量由每组产生的IgG1抗体的TAF糖型。由对照培养物产生的抗体的％TAF范围为约3.1％至约4.14％。相对于由对照培养物产生的抗体，由A组产生的抗体的平均％TAF较高，而由B组产生的抗体的平均％TAF较低。较高的初始pH与较高的％TAF相关，并且较低的初始pH与较低的％TAF相关。
有趣的是，由亚组A2的细胞产生的IgG1抗体的％TAF与由亚组A2产生的抗体的TAF高度相似，表明初始细胞培养期后的pH变化不影响TAF水平。这个观察结果进一步得到如下观察结果的支持，由C组的细胞产生的抗体的TAF水平与对照细胞培养物的TAF水平高度相似。即使C组细胞的pH向下变化，但是TAF与对照培养物大致相同，因为变化发生在初始细胞培养期后(在第5天)。
这个实例证明，在初始细胞培养期后发生的pH变化不显著影响TAF水平，并且较高的设定点pH趋向于较高的TAF水平，而较低的设定点pH趋向于较低的TAF水平。
本文引用的所有参考文献(包括出版物，专利申请和专利)均通过引用并入本文，其程度如同每个参考文献被单独且具体地指出通过引用并入并且在本文中完整地阐述。
除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则在描述本披露的上下文中(尤其是在以下权利要求书的上下文中)，术语“一个/一种(a和an)”和“该(the)”以及相似指代词的使用应被解释为涵盖单数和复数两者，。除非另外指出，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。
除非本文另外指示，否则在本文引证数值的范围仅旨在用作单独地提及落在该范围内的每个单独的数值以及每个端点的速记方法，并且每个单独的数值和端点被并入本说明书中就像它被单独地在本文引证一样。
除非本文另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地阐明本披露，而不对本披露的范围施加限制，说明。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于本披露的实践是必不可少的。
本文描述了本披露的优选实施例，包括已知诸位发明人用于进行本披露的最佳模式。在阅读前面的说明书后，那些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员来说可以变得清楚。诸位发明人期望技术人员适当地采用此类变化，并且诸位发明人意图以不同于本文具体描述的方式实践本披露。因此，本披露包括如适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则在所有可能的变化中上述元件的任何组合都包括于本发明中。

Claims (66)

1.一种调节由细胞培养物中的有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质的总去岩藻糖基化(TAF)糖型水平的方法，该方法包括(i)将该细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期以及(ii)在该初始细胞培养期后停止将该细胞培养物维持在该初始设定点pH下，其中该初始pH选自大于约6.50且小于7.5的pH，并且其中该初始细胞培养期是约4天至约6天。
2.一种调节由细胞培养物中的有糖基化能力的细胞产生的重组糖基化蛋白质的总去岩藻糖基化(TAF)糖型水平的方法，该方法包括将该细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期，其中该初始细胞培养期是该细胞培养物的活细胞密度(VCD)小于或约6.5x 106个细胞/mL的接种后的时间，其中该初始设定点pH大于约6.50且小于7.5。
3.一种包含糖基化蛋白质及其总去岩藻糖基化(TAF)糖型的组合物，其中该糖基化蛋白质及其TAF糖型由细胞培养物中的有糖基化能力的细胞产生，其中将该细胞培养物维持在初始设定点pH下持续初始细胞培养期，其中该初始pH大于约6.5且小于7.5，并且其中该初始细胞培养期是约4天至约6天或该细胞培养物的活细胞密度(VCD)小于或约6.5x 106个细胞/mL的接种后的时间。
4.如权利要求2所述的方法，该方法包括将该细胞培养物维持在该初始设定点pH下，直到该细胞培养物达到约6.9x 106与约8.2x 106之间的VCD。
5.如权利要求2所述的方法，该方法包括将该细胞培养物维持在该初始设定点pH下，直到该细胞培养物达到约8.2x 106与约1.94x 107之间的VCD。
6.如权利要求2所述的方法，该方法包括将该细胞培养物维持在该初始设定点pH下，直到该细胞培养物达到约1.21x 107与约3.46x107之间的VCD。
7.如权利要求2和4-6中任一项所述的方法，其中该初始细胞培养期是约4天至约6天。
8.如权利要求1、2和4-7中任一项所述的方法，该方法包括将该细胞培养物在该初始设定点pH下维持约4天或约5天。
9.如权利要求1、2和4-8中任一项所述的方法，其中该初始设定点pH大于约6.55且小于7.2。
10.如权利要求9所述的方法，其中该初始设定点pH大于约6.60且小于7.2。
11.如权利要求10所述的方法，其中该初始设定点pH大于约6.65且小于7.2。
12.如权利要求11所述的方法，其中该初始设定点pH大于约6.70且小于7.2。
13.如权利要求12所述的方法，其中该初始设定点pH大于约6.75且小于7.2。
14.如权利要求13所述的方法，其中该初始设定点pH大于约6.80且小于7.2。
15.如权利要求14所述的方法，其中该初始设定点pH大于约6.85且小于7.2。
16.如权利要求15所述的方法，其中该初始设定点pH在约7.0与约7.1之间。
17.如权利要求16所述的方法，其中该初始设定点pH大于或约6.85且小于6.95。
18.如权利要求1、2和4-17中任一项所述的方法，该方法还包括在该初始细胞培养期期间将该细胞培养物维持在初始温度下，其中该初始温度选自30℃与40℃之间的温度。
19.如权利要求18所述的方法，该方法还包括在该初始细胞培养期期间将该细胞培养物维持在初始温度下，其中该初始温度选自32℃与38℃之间的温度。
20.如权利要求19所述的方法，其中将该细胞培养物维持在初始温度下包括在该初始细胞培养期期间将该细胞培养物维持在该初始温度的±1℃内，或者其中在该初始细胞培养期期间该细胞培养物的温度相对于该初始温度变化不超过1℃。
21.如权利要求1、2和4-20中任一项所述的方法，其中该初始设定点pH高于对照细胞培养物的对照pH，并且相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的TAF糖型水平增加。
22.如权利要求21所述的方法，其中相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的高甘露糖(HM)糖型水平增加。
23.如权利要求22所述的方法，其中相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9中的一种或多种的水平增加。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的去岩藻糖基化糖型水平增加。
25.如权利要求24所述的方法，其中相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中的一种或多种的水平增加。
26.如权利要求1、2和4-25中任一项所述的方法，其中该初始pH低于对照细胞培养物的对照pH，并且相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的TAF糖型水平降低。
27.如权利要求26所述的方法，其中相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的高甘露糖(HM)糖型水平降低。
28.如权利要求27所述的方法，其中相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9中的一种或多种的水平降低。
29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的去岩藻糖基化糖型水平降低。
30.如权利要求29所述的方法，其中相对于该对照细胞培养物，在该初始细胞培养期后该重组糖基化蛋白质的A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5中的一种或多种的水平降低。
31.如权利要求1、2和4-30中任一项所述的方法，该方法包括在该初始细胞培养期后，停止将该细胞培养物维持在该初始设定点pH下并且允许该细胞培养物的pH变化超过0.05。
32.如权利要求1、2和4-31中任一项所述的方法，其中在该初始细胞培养期后，允许pH变化约0.05至约2.0。
33.如权利要求1、2和4-32中任一项所述的方法，该方法包括在该初始细胞培养期后，使pH变化超过约0.05。
34.如权利要求33所述的方法，其中使pH变化包括使pH降低。
35.如权利要求34所述的方法，该方法包括使pH降低约0.1至约1.5。
36.如权利要求35所述的方法，该方法包括使pH降低约0.15至约1.0。
37.如权利要求36所述的方法，其中使pH变化包括使pH升高。
38.如权利要求37所述的方法，该方法包括使pH升高约0.1至约1.5。
39.如权利要求38所述的方法，该方法包括使pH升高约0.15至约1.0。
40.如权利要求1、2和4-39中任一项所述的方法，该方法包括停止将该细胞培养物维持在该初始温度下并且允许温度在该初始细胞培养期后变化约2℃或更多。
41.如权利要求1、2和4-40中任一项所述的方法，其中在该初始细胞培养期后，允许温度变化超过约2℃。
42.如权利要求1、2和4-41中任一项所述的方法，该方法包括在该初始细胞培养期后使温度变化超过约2℃。
43.如权利要求42所述的方法，其中使温度变化包括使温度降低。
44.如权利要求43所述的方法，该方法包括使温度降低约2℃至约4℃。
45.如权利要求43所述的方法，其中使温度变化包括使温度升高。
46.如权利要求45所述的方法，该方法包括使温度升高约2℃至约4℃。
47.如权利要求1、2和4-46中任一项所述的方法，该方法包括在该初始细胞培养期期间将该细胞培养物维持在包含浓度小于约1μM的锰的培养基中。
48.如权利要求1、2和4-47中任一项所述的方法，该方法包括在该初始细胞培养期期间将该细胞培养物维持在包含浓度小于或约30ppb的铜的培养基中。
49.如权利要求48所述的方法，其中该培养基包含浓度大于或约5ppb的铜。
50.如权利要求1、2和4-49中任一项所述的方法，该方法包括在该初始细胞培养期期间将该细胞培养物的溶解氧(DO)水平维持在约50mmHg至约100mmHg的范围内。
51.如权利要求50所述的方法，该方法包括在该初始细胞培养期期间将该细胞培养物的溶解氧(DO)水平维持在约60mmHg至约75mmHg的范围内。
52.如权利要求1、2和4-51中任一项所述的方法，其中该重组糖基化蛋白质包含一个或多个下式的N-糖基化共有序列：
Asn-Xaa1-Xaa2
其中Xaa1是除Pro外的任何氨基酸，并且Xaa2是Ser或Thr。
53.如权利要求52所述的方法，其中该重组蛋白包含保留N-连接糖基化位点的可结晶片段(Fc)区的一部分。
54.如权利要求53所述的方法，其中该Fc区是IgG的Fc区。
55.如权利要求53所述的方法，其中该Fc区是IgG1或IgG4的Fc区。
56.如权利要求52至55中任一项所述的方法，其中该重组蛋白是抗体、肽体或Fc融合蛋白。
57.如权利要求1、2和4-56中任一项所述的方法，其中该重组蛋白是与以下结合的抗体：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11A、CD11B、CD11C、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31,CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CDw128、CD129、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD182、***、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、G-CSF、IL-15、GM-CSF、OSM、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、TNFβ、LTβ、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-BBL、TGFβ、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-10、IL-12、MIF、IL-16、IL-17、IL-18、胰高血糖素受体、IL-17受体A、硬化蛋白、IGF-1受体、肌生成抑制素、表皮生长因子受体、SARS冠状病毒、OPGL、血管生成素-2、NGF、TGF-βII型受体、***生长因子、备解素、CTLA-4、干扰素-γ、MAdCAM、淀粉样蛋白、***I、白介素-1β、c-Met、M-CSF、MUC18、白介素-4受体、成纤维细胞生长因子样多肽、α-4β-7、激活素受体样激酶-1、激活素A、血管生成素-1、血管生成素-2、C-FMS、甘丙肽、***、LDCAM、DKK1、骨保护素、OV064、PSMA、PAR2、肝杀菌肽、B7L-1、c-Kit、ULBP、TSLP、SIGIRR、HER-3、脊髓小脑共济失调蛋白-1样多肽、TNF-α转化酶、IL1-R1、TGF-βII型受体、TNF受体样分子、***生长因子、TRAIL受体-2、***受体、B7RP1、备解素、RANKL、碳酸酐酶IX(CA IX)肿瘤抗原、甲状旁腺激素、ACPL、单核细胞趋化蛋白-1、SCF、4-1BB、PDGFD、Flt-3配体、金属蛋白酶抑制剂、LERK-5、LERK-6、脑源性神经营养因子、上皮衍生的T细胞因子、神经营养因子NNT-1、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)、IL-18受体或C-FMS。
58.如权利要求1、2和4-57中任一项所述的方法，其中该重组蛋白是以下之一：莫罗单抗-CD3(以商标名称Orthoclone 市售的产品)、阿昔单抗(以商标名称市售的产品)、利妥昔单抗(以商标名称市售的产品)、巴利昔单抗(以商标名称市售的产品)、达利珠单抗(以商标名称市售的产品)、帕利珠单抗(以商标名称市售的产品)、英利昔单抗(以商标名称市售的产品)、曲妥珠单抗(以商标名称市售的产品)、阿仑单抗(以商标名称市售的产品)、阿达木单抗(以商标名称市售的产品)、托西莫单抗-I131(以商标名称市售的产品)、依法利珠单抗(以商标名称市售的产品)、西妥昔单抗(以商标名称市售的产品)、替伊莫单抗(以商标名称市售的产品)、奥马珠单抗(以商标名称市售的产品)、贝伐单抗(以商标名称市售的产品)、那他珠单抗(以商标名称市售的产品)、兰尼单抗(以商标名称市售的产品)、帕尼单抗(以商标名称市售的产品)、依库珠单抗(以商标名称市售的产品)、培舍珠单抗(以商标名称市售的产品)、戈利木单抗(以商标名称市售的产品)、康纳单抗(以商标名称市售的产品)、卡妥索单抗(以商标名称市售的产品)、优特克单抗(以商标名称市售的产品)、托珠单抗(以商标名称 市售的产品)、奥法木单抗(以商标名称市售的产品)、德尼单抗(以商标名称市售的产品)、贝利木单抗(以商标名称市售的产品)、瑞西巴库单抗、易普利姆玛(以商标名称市售的产品)、帕妥珠单抗(以商标名称市售的产品)、阿达木单抗、英利昔单抗、依那西普、戈利木单抗、培舍珠单抗；康纳单抗；优特克单抗、布瑞吉努单抗；达利珠单抗、贝利木单抗；依帕珠单抗；达利珠单抗；伊雷单抗、吉妥珠单抗、阿仑单抗；易普利姆玛；西妥昔单抗；曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；司妥昔单抗；贝伐单抗；以及托珠单抗。
59.如权利要求1、2和4-58中任一项所述的方法，其中这些有糖基化能力的细胞是真核细胞。
60.如权利要求59所述的方法，其中这些真核细胞是哺乳动物细胞。
61.如权利要求60所述的方法，其中这些哺乳动物细胞是非人哺乳动物细胞。
62.如权利要求61所述的方法，其中这些非人哺乳动物细胞选自下组，该组由以下组成：CHO细胞、NS0细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞。
63.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该细胞培养是补料分批培养或连续灌注培养。
64.如权利要求1、2和4-63中任一项所述的方法，该方法还包括将该细胞培养物维持至少10天的时间段，以及收集包含所述重组糖基化蛋白质的所述细胞培养物的上清液。
65.如权利要求64所述的方法，该方法还包括从该上清液中纯化该重组蛋白。
66.如权利要求65所述的方法，其中该重组蛋白包含Fc，并且纯化该重组蛋白包括使用蛋白A亲和色谱树脂。
CN201880018215.2A 2017-03-14 2018-03-14 细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型的控制 Pending CN110418846A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762471347P 2017-03-14 2017-03-14
US62/471347 2017-03-14
PCT/US2018/022388 WO2018170099A1 (en) 2017-03-14 2018-03-14 Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110418846A true CN110418846A (zh) 2019-11-05

Family

ID=61873969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880018215.2A Pending CN110418846A (zh) 2017-03-14 2018-03-14 细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型的控制

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20200131518A1 (zh)
EP (1) EP3596225A1 (zh)
JP (2) JP2020513813A (zh)
CN (1) CN110418846A (zh)
AU (2) AU2018235928B2 (zh)
CA (1) CA3056011A1 (zh)
IL (1) IL269197A (zh)
MA (1) MA47775A (zh)
SG (1) SG11201908328XA (zh)
WO (1) WO2018170099A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113584061A (zh) * 2021-07-30 2021-11-02 中国人民解放军空军军医大学 一种双途径拮抗pcsk9的重组基因、载体、外泌体及制备方法和应用
CN113684322A (zh) * 2021-09-09 2021-11-23 上海药明生物技术有限公司 一种降低抗体类蛋白高聚甘露糖型水平的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018115879A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
EP4034556A1 (en) * 2019-09-26 2022-08-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
WO2022081824A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013114167A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process of obtaining glycoform composition
WO2013114164A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for obtaining glycoprotein composition with increased afucosylation content
WO2016089919A1 (en) * 2014-12-01 2016-06-09 Amgen Inc. Process for manipulating the level of glycan content of a glycoprotein
CN106170554A (zh) * 2014-01-29 2016-11-30 美国安进公司 过表达n‑糖基化途径调节基因以调节重组蛋白的糖基化
US20160362714A1 (en) * 2014-02-25 2016-12-15 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process for modifying galactosylation and g0f content of a glycoprotein composition by glutamine supplementation

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5714465A (en) 1989-05-19 1998-02-03 Amgen Inc. Method of inhibiting tumor cell dissemination with a metalloproteinase inhibitor
US7144731B2 (en) 1989-10-16 2006-12-05 Amgen Inc. SCF antibody compositions and methods of using the same
US5574138A (en) 1993-03-08 1996-11-12 Immunex Corporation Epithelium-derived T-cell factor
US7211259B1 (en) 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
US7138500B1 (en) 1993-05-07 2006-11-21 Immunex Corporation Antibodies to human 4-1BB
US6630143B1 (en) 1993-05-24 2003-10-07 Immunex Corporation Antibodies against flt3 ligand
US7045128B2 (en) 1993-05-24 2006-05-16 Immunex Corporation Antibodies against flt3-ligand
US6303769B1 (en) 1994-07-08 2001-10-16 Immunex Corporation Lerk-5 dna
US5885574A (en) 1994-07-26 1999-03-23 Amgen Inc. Antibodies which activate an erythropoietin receptor
US5919905A (en) 1994-10-05 1999-07-06 Immunex Corporation Cytokine designated LERK-6
US6406901B1 (en) 1995-06-08 2002-06-18 Immunex Corporation TNF-a converting enzyme
SK1499A3 (en) 1996-07-19 1999-08-06 Amgen Inc Analogs of cationic proteins
DE69738841D1 (de) 1996-12-23 2008-08-28 Immunex Corp Ligand für rezeptor aktivator of nf-kappa b, ligand ist mitglied der tnf superfamilie
US5741772A (en) 1997-02-03 1998-04-21 Amgen Inc. Neurotrophic factor NNT-1
IL132304A0 (en) 1997-04-16 2001-03-19 Amgen Inc Osteoprotegerin binding proteins and receptors
US6316408B1 (en) 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ES2251120T3 (es) 1997-12-17 2006-04-16 Immunex Corporation Glicoproteinas de superficie celular asociadas a los linfomas b humanos-ulbp, adn y polipeptidos.
IL136696A0 (en) 1997-12-23 2001-06-14 Immunex Corp Sigirr dna and polypeptides
WO1999033878A1 (fr) 1997-12-25 1999-07-08 Japan Tobacco Inc. Anticorps monoclonal contre le facteur de croissance du tissu conjonctif et ses mises en applications medicales
IL137037A0 (en) 1998-01-23 2001-06-14 Immunex Corp Acpl dna and polypeptides
CA2337100C (en) 1998-08-07 2011-09-20 Immunex Corporation Polypeptides of lymphodendritic cell adhesion molecules (ldcams) and polynucleotides encoding the same
IL140938A0 (en) 1998-08-07 2002-02-10 Immunex Corp Molecules designated b7l-1
DE69936105T3 (de) 1998-11-13 2017-07-27 Immunex Corporation Menschliche tslp nukleinsäuren und polypeptide
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US7435796B1 (en) 1999-02-03 2008-10-14 Amgen Inc. Antibodies which bind B7RP1
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
JP2001206899A (ja) 1999-11-18 2001-07-31 Japan Tobacco Inc ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
US20030103978A1 (en) 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
ES2614260T3 (es) 2000-05-26 2017-05-30 Immunex Corporation Uso de anticuerpos contra el receptor de interleuquina-4 y composiciones de los mismos
JP2004508043A (ja) 2000-09-05 2004-03-18 アムジェン　インコーポレイテッド Ｔｎｆレセプター様分子およびその使用
HUP0302525A2 (hu) 2001-01-05 2003-10-28 Abgenix, Inc. Az inzulinszerű növekedési faktor I receptor elleni ellenanyagok
WO2003024389A2 (en) 2001-07-30 2003-03-27 Immunex Corporation T. reesei phytase enyzmes, polynucleides encoding the enzymes, vectors and host cells thereof, and methods of using
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
ES2559002T3 (es) 2001-10-23 2016-02-10 Psma Development Company, L.L.C. Anticuerpos contra PSMA
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
JP2005536180A (ja) 2001-12-03 2005-12-02 アブジェニックス・インコーポレーテッド 自己免疫疾患の治療および移植拒絶の処置に使用する抗ｃｄ４５ｒｂ抗体
WO2003048328A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibodies against carboxic anhydrase ix (ca ix) tumor antigen
ATE394121T1 (de) 2001-12-28 2008-05-15 Amgen Fremont Inc Verwendung von antikörpern gegen das muc18- antigen
ES2289174T3 (es) 2001-12-28 2008-02-01 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos contra el antigeno muc-18.
JP2005516965A (ja) 2001-12-28 2005-06-09 アブジェニックス・インコーポレーテッド 抗ｍｕｃ１８抗体を使用する方法
US7135174B2 (en) 2002-01-07 2006-11-14 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to PDGFD and uses thereof
ATE435239T1 (de) 2002-03-29 2009-07-15 Schering Corp Menschliche monoklonale antikörper gegen interleukin-5 sowie diese umfassende verfahren und zusammensetzungen
CA2481074A1 (en) 2002-04-05 2003-10-23 Amgen Inc. Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors
RU2339647C2 (ru) 2002-08-19 2008-11-27 Астразенека Аб Антитела против моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (мср-1) и их применение
DK2213685T3 (en) 2002-09-06 2014-03-03 Medarex Llc Therapeutic anti-IL-1R1 monoclonal antibody
WO2004034988A2 (en) 2002-10-16 2004-04-29 Amgen Inc. Human anti-ifn-ϝ neutralizing antibodies as selective ifn-ϝ pathway inhibitors
ES2347239T3 (es) 2002-12-02 2010-10-27 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos.
ES2344789T5 (es) 2003-05-15 2017-06-14 Wyeth Llc Alimentación restringida de glucosa para el cultivo de células animales
AU2004259398A1 (en) 2003-06-27 2005-02-03 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
NZ599196A (en) 2003-07-15 2014-01-31 Amgen Inc Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
MXPA06000974A (es) 2003-07-25 2006-08-31 Amgen Inc Antagonistas y agonistas de ldcam y metodos para su uso.
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
WO2005016111A2 (en) 2003-08-08 2005-02-24 Abgenix, Inc. Antibodies directed to parathyroid hormone (pth) and uses thereof
US7318925B2 (en) 2003-08-08 2008-01-15 Amgen Fremont, Inc. Methods of use for antibodies against parathyroid hormone
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
TWI356064B (en) 2003-11-07 2012-01-11 Immunex Corp Antibodies that bind interleukin-4 receptor
US7371381B2 (en) 2003-12-12 2008-05-13 Amgen Inc. Anti-galanin antibodies and uses thereof
DK2177537T3 (da) 2004-01-09 2011-12-12 Pfizer Antistoffer til MAdCAM
CA2561861A1 (en) 2004-04-23 2005-12-15 Amgen Inc. Antibodies to angiogenesis inhibiting domains of cd148
KR20070007884A (ko) 2004-04-23 2007-01-16 암젠 인크 Ｃｄ148의 혈관신생 억제 도메인의 항체
MX2007001221A (es) 2004-08-04 2007-03-23 Amgen Inc Anticuerpos para proteina dickkopf-1 (dkk-1).
US7423128B2 (en) 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
CA2587903A1 (en) 2004-11-17 2006-05-26 Amgen Fremont Inc. Fully human monoclonal antibodies to il-13
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
US7906625B2 (en) 2005-01-24 2011-03-15 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
AU2006208286A1 (en) 2005-01-26 2006-08-03 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
EP1868647A4 (en) 2005-03-24 2009-04-01 Millennium Pharm Inc OV064 BINDING ANTIBODIES AND METHOD FOR THEIR USE
MX2007013217A (es) 2005-04-25 2008-03-11 Pfizer Anticuerpos contra miostatina.
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
JP5142998B2 (ja) 2005-07-18 2013-02-13 アムジエン・インコーポレーテツド ヒト抗ｂ７ｒｐ１中和抗体
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
PL2960253T3 (pl) 2005-09-07 2018-11-30 Amgen Fremont Inc. Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko kinazie podobnej do receptora aktywiny-1
JP5302007B2 (ja) 2005-12-13 2013-10-02 アストラゼネカ アクチボラグ インスリン様増殖因子に特異的な結合タンパク質およびその使用
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US7888482B2 (en) 2006-02-10 2011-02-15 Amgen Inc. Antibodies that bind PAR-2
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
MX2008014710A (es) 2006-05-19 2009-02-12 Amgen Inc Anticuerpos para coronavirus del sars.
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
CL2007002668A1 (es) 2006-09-20 2008-05-09 Amgen Inc Proteina de union a antigeno que se une al receptor de glucagon humano; acido nucleico que la codifica; metodo de produccion; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar o prevenir la diabetes tipo 2.
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
PE20081899A1 (es) 2007-04-02 2009-01-26 Pfizer Anticuerpos anti-ige
CL2008001887A1 (es) 2007-06-29 2008-10-03 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno que se unen al receptor activado por proteasas 2 (par-2); acido nucleico que las codifica; vector y celula huesped; metodo de produccion; y composicion que las comprende.
CL2008002153A1 (es) 2007-07-24 2009-06-05 Amgen Inc Anticuerpo aislado o fragmanto de unión de antigeno del mismo que se une al receptor de il-18 (il-18r); molecula de ácido nucleico codificante; celula huesped que la comprende; composición farmaceutica; uso médico para tratar o prevenir una condición asociada con il-18r; método in vitro para inhibir la unión de il-18 al il-18r.
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
US7982016B2 (en) 2007-09-10 2011-07-19 Amgen Inc. Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin
EP2261254A3 (en) 2007-12-21 2011-04-13 Amgen, Inc Anti-amyloid antibodies and uses thereof
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
AU2009246946B2 (en) 2008-05-01 2013-09-26 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
EP2408816B1 (en) 2009-03-20 2019-09-04 Amgen Inc. Alpha-4-beta-7 heterodimer specific antagonist antibody
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2765197A1 (en) 2013-02-11 2014-08-13 ETH Zurich Designer pH sensor as universal transgene controller
WO2015128793A1 (en) * 2014-02-25 2015-09-03 Dr. Reddy’S Laboratories Limited A process for modifying high mannose and galactosylation content of a glycoprotein composition
CN106164662B (zh) 2014-03-31 2019-06-25 株式会社堀场制作所 电极、复合电极、液体分析仪

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013114167A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process of obtaining glycoform composition
WO2013114164A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for obtaining glycoprotein composition with increased afucosylation content
CN106170554A (zh) * 2014-01-29 2016-11-30 美国安进公司 过表达n‑糖基化途径调节基因以调节重组蛋白的糖基化
US20160362714A1 (en) * 2014-02-25 2016-12-15 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process for modifying galactosylation and g0f content of a glycoprotein composition by glutamine supplementation
WO2016089919A1 (en) * 2014-12-01 2016-06-09 Amgen Inc. Process for manipulating the level of glycan content of a glycoprotein

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113584061A (zh) * 2021-07-30 2021-11-02 中国人民解放军空军军医大学 一种双途径拮抗pcsk9的重组基因、载体、外泌体及制备方法和应用
CN113584061B (zh) * 2021-07-30 2022-09-23 中国人民解放军空军军医大学 一种双途径拮抗pcsk9的重组基因、载体、外泌体及制备方法和应用
CN113684322A (zh) * 2021-09-09 2021-11-23 上海药明生物技术有限公司 一种降低抗体类蛋白高聚甘露糖型水平的方法
CN113684322B (zh) * 2021-09-09 2024-01-23 上海药明生物技术有限公司 一种降低抗体类蛋白高聚甘露糖型水平的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20200131518A1 (en) 2020-04-30
CA3056011A1 (en) 2018-09-20
WO2018170099A1 (en) 2018-09-20
JP2023055711A (ja) 2023-04-18
SG11201908328XA (en) 2019-10-30
IL269197A (en) 2019-11-28
AU2023285706A1 (en) 2024-01-18
EP3596225A1 (en) 2020-01-22
JP2020513813A (ja) 2020-05-21
AU2018235928B2 (en) 2023-09-21
AU2018235928A1 (en) 2019-09-26
MA47775A (fr) 2020-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110418846A (zh) 细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型的控制
EP3050963B1 (en) Process for production of polypeptide by regulation of assembly
US20210079065A1 (en) Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
CN104797707A (zh) 用于产生糖蛋白的组合物和方法
US20220349898A1 (en) Methods of producing antibody compositions
IL262875A (en) Methods for regulating the galactosylation profiles of recombinant proteins
CA3222409A1 (en) Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
EA045782B1 (ru) Общие афукозилированные гликоформы антител, полученные в культуре клеток
US20240043501A1 (en) Relative unpaired glycans in antibody production methods
TW202325853A (zh) 治療性蛋白之生產
Das et al. Recombinant monoclonal antibody production in yeasts: Challenges and considerations
WO2023059607A1 (en) Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
JPWO2019161167A5 (zh)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination