CN110418835A - 细胞或组织包埋装置 - Google Patents
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Abstract
本发明的技术问题在于,在制备含有活细胞或生物组织的PVA凝胶的工序中,通过抑制活细胞或生物组织的减少,提供一种生理活性物质的供给能力高的细胞或组织包埋装置。其中,将间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂作为成分,构成用于形成细胞或组织包埋装置的免疫隔离层的水性凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于形成细胞或组织包埋装置的免疫隔离层的水性凝胶,所述细胞或组织包埋装置通过对患者移植产生和/或分泌对生物体有用的激素或蛋白质等生理活性物质的生物组合物或者具有对有害物质进行解毒的作用的生物组合物,从而在对内分泌疾病、代谢疾病等包括人的、动物的疾病的预防和/或治疗中发挥效果。
背景技术
细胞或组织包埋装置含有活细胞或生物组织等,其目的在于通过代替患有疾病的人或动物的脏器等而向患者供给与代谢功能相关的激素或蛋白质等生理活性物质等,或对有害物质进行解毒,从而预防和/或治疗患者的疾病。细胞或组织包埋装置可通过免疫隔离层而从生物体的防御机制中保护活细胞或生物组织,因此与生物脏器移植相比,不需要给药免疫抑制剂,因此不用担心由免疫抑制剂造成的副作用、手术为微创,且不仅能够进行来自遗体器官捐献者的同种人工脏器移植,还能够进行各种再生干细胞或异种人工脏器移植,就这些点而言,具有可解决器官捐献者不足的能力,十分优异。
近年来,对组合了通用高分子或金属、陶瓷等材料与活细胞或生物组织及具有该活细胞或生物组织的细胞制剂的细胞或组织包埋装置进行了研究,通过改变其中所含有的细胞等的种类,能够应对各种疾病的治疗。
例如,在生物人工胰岛中具有胰岛素分泌细胞(例如,胰岛细胞),其用于向患者供给分泌自胰岛细胞的胰岛素激素,以谋求纠正血糖值。
除此之外,还在对血友病、垂体性侏儒症、甲状旁腺功能减退症、帕金森病等疾病的治疗中,研究了凝血因子生产型生物人工脏器、生长激素生产型生物人工脏器、甲状旁腺激素产生型生物人工脏器、多巴胺产生型生物人工脏器等生物人工脏器。
细胞或组织包埋装置具有各种各样的形状,作为所述包埋装置的一个例子,可列举出使用了以高分子聚合物包裹活细胞或生物组织而成的微胶囊型或大胶囊型的制剂(例如,细胞制剂)的包埋装置。这些细胞或组织包埋装置的特征在于,通过高分子聚合物所具有的牢固的交联结构,从生物体的防御机制中保护其中所含有的细胞或组织,进一步利用高分子聚合物所具有的分子透过性能,对生物体供给分泌自细胞或组织的激素等。
作为用于使用了大胶囊型细胞制剂的生物人工脏器等的高分子聚合物,近年来聚乙烯醇(以下,也简称为PVA)受到了瞩目。
PVA为安全性高的材料,通过实施化学或物理处理而进行凝胶化,PVA凝胶的凝胶强度较高,能够成型为各种形状。作为化学处理,例如可使用在含有PVA的水溶液中添加戊二醛(交联剂)及盐酸(催化剂)的方法等(例如,参考非专利文献1)。此外,作为物理处理,例如可使用在约-20℃这种低温下快速冷却含有PVA的水溶液而进行凝胶化的方法等(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平10-43286号公报
专利文献2:日本特开2004-331643号公报
非专利文献
非专利文献1:Krystyna Burczak et.Al,Long-term in vivo performance andbiocompatibility of PVA hydrogelmacrocapsules for hybrid-type artificialpancreas,Biomaterials,1996年,第17卷,p2351-2356.
发明内容
本发明要解决的技术问题
在上述基于化学处理的凝胶化方法中,存在以下问题:残留在PVA凝胶中的交联剂或催化剂的添加造成了低pH化等,其导致细胞受到损伤,活细胞数的减少或生理活性物质的供给能力的下降,由此得不到所期望的治疗效果。
另一方面,在基于物理处理的凝胶化方法中,虽然不使用药剂,没有交联剂或催化剂所造成的损伤,但由于以低温进行快速冷却,因此引起活细胞数的减少或生理活性物质的供给能力下降。
作为解决这些问题的方法,公开了一种在以低温制备PVA凝胶时,使活细胞与细胞保存液同时存在的方法(专利文献2)。然而,在该方法中,由于为了制备PVA凝胶而依然以低温(-80℃)处理24小时,因此,无法充分解决活细胞数的减少与伴随于此的生理活性物质的供给能力下降的问题。
鉴于上述现状,本发明的技术问题在于,在制备含有活细胞或生物组织的PVA凝胶的工序中,通过抑制活细胞或生物组织的减少,供给一种生理活性物质的供给能力高的细胞或组织包埋装置。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人为了达成上述目的而进行了认真研究,结果发现,若使用能够在-5℃以上的温度形成凝胶的、主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料,则能够不使用交联剂且以所期望的(即,包埋的活细胞或生物组织不易受到损伤的)pH、温度进行凝胶化,因此能够在最适宜的条件下、在活细胞或生物组织中凝胶化。在使用了作为最优选形态之一的、具有特定的间同立构规整度的PVA树脂(优选间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的PVA树脂)的实证中,确认到得到了PVA凝胶中细胞或组织的存活率及生理活性物质的供给能力高的PVA凝胶细胞(或组织)制剂,经过进一步研究,从而完成了本发明。
即,本发明涉及以下的(1)~(23)。
(1)一种细胞或组织包埋装置,其具有水性凝胶作为免疫隔离层,所述水性凝胶含有间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂(A)作为成分。
(2)根据所述(1)所述的细胞或组织包埋装置,其特征在于,水性凝胶具有在-5℃以上的凝胶化履历。
(3)根据所述(1)或(2)所述的细胞或组织包埋装置,其特征在于,水性凝胶具有0.3~30kPa的应力。
(4)根据所述(1)~(3)中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其中,聚乙烯醇树脂(A)的皂化度为90~99.99摩尔%,聚合度为100~10000。
(5)根据所述(1)~(4)中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其中,聚乙烯醇树脂(A)为以特戊酸乙烯酯为聚合成分的聚合物的皂化物,含有特戊酸乙烯酯单元。
(6)根据所述(1)~(5)中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其在免疫隔离层中包封有生物组合物(B)及细胞培养成分(C)。
(7)根据所述(6)所述的细胞或组织包埋装置,其中,生物组合物(B)为选自由胰岛细胞、胰管细胞、肝脏细胞、神经细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、脾细胞、脂肪细胞、骨髓细胞、间充质干细胞、ES细胞及iPS细胞组成的组中的一种以上。
(8)根据所述(6)所述的细胞或组织包埋装置,其中,生物组合物(B)为胰岛细胞或肝脏细胞。
(9)根据所述(6)~(8)中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其中,细胞培养成分(C)为含有选自由Na、K、Cl、Ca及葡萄糖(Glucose)组成的组中的一种以上的乙酸或磷酸缓冲液。
(10)根据所述(1)~(9)中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其含有支撑基材(D)。
(11)根据所述(10)所述的细胞或组织包埋装置,其中,支撑基材(D)的原料为选自由PET、PE、PP、Teflon(注册商标)及金属组成的组中的一种以上。
(12)根据所述(1)~(11)中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其特征在于,其具有0.3~30kPa的应力。
(13)一种所述(6)~(12)中任一项所述的细胞或组织包埋装置的制造方法,其包括以下工序:在将含有聚乙烯醇树脂(A)的水溶液与细胞培养成分(C)混合后,混合生物组合物(B)而得到混合物,使该混合物凝胶化。
(14)根据所述(13)所述的细胞或组织包埋装置的制造方法,其中,将制备水性凝胶时的温度设为-5℃以上。
(15)一种细胞或组织包埋装置的免疫隔离层形成剂,其含有水性凝胶,所述水性凝胶含有间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂(A)。
(16)根据所述(15)所述的制剂,其中,聚乙烯醇树脂(A)的皂化度为90~99.99摩尔%,聚合度为100~10000。
(17)根据所述(16)所述的制剂,其中,聚乙烯醇树脂(A)为以特戊酸乙烯酯为聚合成分的聚合物的皂化物,含有特戊酸乙烯酯单元。
(18)一种细胞或生物组织包埋装置,其具有水性凝胶作为免疫隔离层,其特征在于,含有聚乙烯醇树脂(A),使包封的生物组合物(B)的分泌成分透过,且抑制免疫相关的细胞或免疫相关的物质的透过(其中,生物组合物(B)的分泌成分优选为对生物体有用的激素或蛋白质等生理活性物质)。
(19)一种(1)~(12)及(15)~(17)中任一项所述的水性凝胶的应用,其用于制造所述(1)~(12)中任一项所述的装置。
(20)一种人或动物的疾病的预防或治疗方法,其特征在于,对人或动物施与所述(1)~(12)中任一项所述的装置。
(21)根据(1)~(12)中任一项所述的装置,其用于人或动物的疾病的预防或治疗。
(22)一种混合物,其含有间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂(A)、生物组合物(B)及细胞培养成分(C),其特征在于,其具有在-5℃以上进行凝胶化的性质。
(23)一种针对产生生理活性物质的细胞或组织的保护凝胶层的形成方法,其中,直接对产生生理活性物质的细胞或组织、或者对用支撑材料进行了支撑的产生生理活性物质的细胞或组织适用保护凝胶层形成材料的水溶液或溶胶,然后以-5℃以上的温度形成凝胶,所述保护凝胶层形成材料的溶液或溶胶含有主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料。
发明效果
本发明的细胞或组织包埋装置由于使用了主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料,因此在应用于生物体内时,能够得到长期的装置寿命,同时不需要交联剂成分,此外,包埋的活细胞或生物组织不易受到损伤,或能够以可抑制包埋的活细胞或生物组织死亡的pH、温度(优选为-5℃以上)形成水性PVA凝胶,因此对患者而言有用的激素或蛋白质等生理活性物质的供给能力高。另外,主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料可根据期望使用交联剂成分而进行交联。
即,本发明的细胞或组织包埋装置耐受长期使用,被包埋的细胞或组织的存活率高。
此外,通过向患者施与本发明的细胞或组织包埋装置,能够进行内分泌疾病、代谢疾病、糖尿病、神经变性疾病、血友病、骨病、癌症等疾病的预防和/或治疗,并能够以稳定的状态长期在生物体内保有细胞或组织,因此可实现高治愈率并同时降低细胞或组织包埋装置的移植频率。
进一步,作为本发明的代表性形态的水性PVA凝胶等水性凝胶(在本说明书中,也称为本发明的水性凝胶)不仅能够阻碍白细胞或抗体等的透过,还能够阻碍补体的透过,因此不仅能够隔离参与免疫的细胞或抗体,还能够隔离辅助免疫作用的补体。即,由于本发明的水性PVA凝胶具有如下选择性,因此可作为免疫隔离层使用,具有优异的免疫抑制作用:使在应透过的氧、无机有机的营养成分、各种激素中被设想为最大的直径为5nm左右的分子(例如包含胰岛素等激素的生理活性物质)透过,而不允许在应阻止透过的免疫相关的细胞或免疫相关的物质中被设想为最小的直径为50nm左右的分子(例如抗体、补体等)透过的选择性。
附图说明
图1为示出移植了实施例1的生物人工胰岛装置的糖尿病模型动物的血糖值的经时变化的图。
图2为示出移植了比较例1~5的冻结融解式胰岛装置的糖尿病模型动物的血糖值的经时变化的图。
图3为示出移植了比较例6~11的冻结融解式胰岛装置的糖尿病模型动物的血糖值的经时变化的图。
图4图解性记载了从胰脏中取得胰岛细胞的方法的一种方式。
图5示出具有水性凝胶作为免疫隔离层的、细胞或组织包埋装置的一种形态,其中,所述水性凝胶含有聚乙烯醇树脂(A)作为成分。
图6示意性地示出将本发明的装置施与并收纳于新生血管内的状态的一种形态。
具体实施方式
以下,对本发明进行详细说明。
本公开包含一种具有水性凝胶作为免疫隔离层的细胞或组织包埋装置,所述水性凝胶包含凝胶形成高分子材料、代表性地包含间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂(A)作为成分,所述凝胶形成高分子材料可在制备时制成水溶液或溶胶、能够在-5℃以上的温度下形成凝胶、主链不被生物体内的酶切断。
本发明的水性凝胶的代表性形态为:含有在制备时为水溶液或溶胶、通过降至-5℃以上的温度而进行了凝胶化且控制了间同立构规整度的PVA树脂(进一步,间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的PVA树脂)作为成分,用于形成细胞或组织包埋装置的免疫隔离层的水性凝胶。
在本公开中,溶胶优选为水溶胶。
[主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料]
在本发明中使用的主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料,其与用于相同目的的作为水性凝胶形成材料的明胶或海藻酸等不同,优选为主链不被生物体内的酶切断的高分子材料,例如,若为主要部分不被切断的材料,则能够另外含有一个末端或者两个末端被切断的主链。作为这种材料的代表例,可列举出具有乙烯结构作为重复单元的主链的聚合物,特别是可列举出聚乙烯醇类树脂或聚丙烯酸类树脂,其中优选在其侧链上具有水溶性及进行凝胶形成的功能性官能团的材料。在使用这种材料时,即使长时间存在于生物体内,主链也不会被生物体内的酶切断,因此能够长时间保持装置形状。
此外,优选在本发明中使用的、主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料为如下的凝胶形成高分子材料:只要暂时制成水溶液或者溶胶的状态,则在应用于活细胞时的温度下、即0~60℃之间的任意温度下可作为水溶液或溶胶而进行操作,然后能够通过放置于-5℃以上的温度成为凝胶状态的凝胶形成高分子材料。众所周知,温度变化所引起的水性凝胶的形成,是通过高分子材料侧链的功能性官能团之间的物理性相互作用所引起的交联形成而产生的。作为物理性相互作用,代表性的为具有活性氢的极性基团之间的氢键、特别是基于羟基之间的氢键的物理性相互作用,除此之外,还有使用由亲水性高分子内所含的疏水基团造成的疏水性相互作用的情况等。
可根据功能性官能团相对于树脂整体的存在量、或树脂之间的结构性相互作用的促进等来进行凝胶形成温度的调控,对于PVA树脂,除了在侧链上加入进行相互作用的特殊官能团的方法以外,还能够通过调控树脂主链的立构规整度而使树脂的羟基间的相互作用容易发生,以较高温度形成凝胶。
以下,对作为本发明代表性形态的、使用了间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂的情况进行具体说明。
[PVA树脂(A)]
在本发明中使用的、作为主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料的代表性形态的PVA树脂(A),其间同立构规整度以三单元组表示,通常为32~40%,优选为33~39%,进一步优选为34~38%。间同立构规整度若为32%以上,则容易变成水性凝胶,若为40%以下,则容易制备水性凝胶。
另外,三单元组表示的间同立构规整度可通过使PVA树脂(A)溶解于氘代DMSO,并根据由质子NMR测定得到的羟基的峰求出。
只要三单元组表示的间同立构规整度为32~40%,则本发明中使用的PVA树脂(A)的制备方法没有特别限定,可通过对使用以往公知的方法得到的乙烯酯聚合物进行皂化的方法而容易地得到。即,本发明中使用的PVA树脂为乙烯酯聚合物的皂化物。
作为乙烯酯聚合物的制备方法,只要为聚合乙烯酯类单体的方法,则没有特别限定,可遵循以往公知的方法。
在聚合时,聚合容器的形状、聚合搅拌机的种类以及聚合温度或聚合容器内的压力等均使用公知的方法即可。作为聚合方法,可以为以往公知的本体聚合、溶液聚合、悬浮聚合、乳液聚合等各种聚合方法。考虑到聚合度的调控或在聚合后进行的皂化反应等,优选将醇作为溶剂的溶液聚合或者将水或水及醇作为分散介质的悬浮聚合,但不限于此。
作为乙烯酯类单体,例如可列举出脂肪酸乙烯酯、非脂肪酸类乙烯酯(例如,甲酸乙烯酯、芳香族羧酸乙烯酯等)等乙烯酯等,从可得到间同立构规整度高的PVA等的角度出发,可列举出C3-15脂肪酸乙烯酯[例如,丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、特戊酸乙烯酯等直链或支链的C3-15脂肪酸乙烯酯,可优选列举出C3-10脂肪酸乙烯酯(例如,直链或支链的C3-10脂肪酸乙烯酯等)等]、具有取代基(例如,卤素基团)的C3-15脂肪酸乙烯酯[例如,三氟乙酸乙烯酯、三氯乙酸乙烯酯等]、甲酸乙烯酯等。这些乙烯酯可单独使用一种或组合使用两种以上。
作为PVA树脂(A)的制备方法的一个例子,具体而言,可列举出对具有大体积侧链的丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、特戊酸乙烯酯等乙烯酯进行均聚或共聚后,通过碱催化剂而进行皂化的方法,或者对甲酸乙烯酯、三氟乙酸乙烯酯、三氯乙酸乙烯酯等高极性的乙烯酯进行均聚或共聚后,通过碱催化剂而进行皂化的方法。其中,优选使用在对特戊酸乙烯酯进行聚合后通过碱催化剂而进行皂化的方法。下述实施例中记载了以三单元组表示的间同立构规整度为37.1%的制备例。例如,可通过下述方式使以三单元组表示的间同立构规整度小于37.1%:在聚合特戊酸乙烯酯时,使乙酸乙烯酯共存来得到特戊酸乙烯酯与乙酸乙烯酯的共聚物、或者提高聚合温度。此外,例如可通过降低上述制备例的聚合温度而使以三单元组表示的间同立构规整度大于37.1%。在任意一种情况下,所得到的PVA树脂(A)的以三单元组表示的间同立构规整度均能够通过将PVA树脂(A)溶解于氘代DMSO,并根据由质子NMR测定得到的羟基的峰而求出,因此可适当地在32~40%的范围中选择并在本发明中使用。
此外,除了上述乙烯酯以外,在不阻碍本发明效果的范围内,乙烯酯聚合物也可含有能够与乙烯酯共聚的其他不饱和单体。
作为其他不饱和单体,例如可列举出选自含羧基不饱和单体[例如,(甲基)丙烯酸、马来酸、马来酸酐、富马酸、巴豆酸、衣康酸、十一烯酸等]、不饱和二元酸单烷基酯类(例如,马来酸单甲酯、衣康酸单甲酯等)、含酰胺基不饱和单体(例如,丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、二甲氨基乙基丙烯酰胺、二乙基丙烯酰胺、二甲氨基丙基丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-乙烯基乙酰胺等)、卤代乙烯类(例如,氯乙烯、氟乙烯等)、具有缩水甘油基的不饱和单体(例如,烯丙基缩水甘油醚、甲基丙烯酸缩水甘油酯等)、含内酰胺基的不饱和单体{例如,N-乙烯基吡咯烷酮类[例如,N-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-乙烯基-烷基吡咯烷酮(例如,N-乙烯基-3-丙基-2-吡咯烷酮、N-乙烯基-5-甲基-2-吡咯烷酮、N-乙烯基-5-乙基-2-吡咯烷酮、N-乙烯基-5,5-二甲基-2-吡咯烷酮、N-乙烯基-3,5-二甲基-2-吡咯烷酮等的N-乙烯基-单或二C1-4烷基吡咯烷酮)等]、N-烯丙基吡咯烷酮类(例如,N-烯丙基-2-吡咯烷酮等)、N-乙烯基哌啶酮类[例如,N-乙烯基-2-哌啶酮、N-乙烯基-烷基哌啶酮(例如,N-乙烯基-6-甲基-2-哌啶酮、N-乙烯基-6-乙基-2-哌啶酮等的N-乙烯基-单或二C1-4烷基哌啶酮)等]、N-乙烯基己内酰胺类[例如,N-乙烯基-ε-己内酰胺、N-乙烯基-烷基己内酰胺(例如,N-乙烯基-7-甲基-2-己内酰胺、N-乙烯基-7-乙基-2-己内酰胺等的N-乙烯基-单或二C1-4烷基己内酰胺等)]}、烷基乙烯基醚类[例如,C1-20烷基乙烯基醚(例如,甲基乙烯基醚、正丙基乙烯基醚、异丙基乙烯基醚、正丁基乙烯基醚、异丁基乙烯基醚、叔丁基乙烯基醚、月桂基乙烯基醚(lauryl vinyl ether)、十二烷基乙烯基醚、十八烷基乙烯基醚等)]、腈类(例如,丙烯腈、甲基丙烯腈等)、含羟基不饱和单体[例如,C1-20单烷基烯丙醇(例如,烯丙醇、异丙烯基烯丙醇等)、C1-20二烷基烯丙醇(例如,二甲基烯丙醇等)、羟基C1-20烷基乙烯基醚(例如,羟基乙基乙烯基醚、羟基丁基乙烯基醚等)]、含乙酰基不饱和单体[例如,C1-20烷基烯丙基乙酸酯(例如,烯丙基乙酸酯、梨醇酯、异丙烯基烯丙基乙酸酯等)等]、(甲基)丙烯酸酯类{例如,(甲基)丙烯酸烷基酯[例如,(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸正丁酯等的(甲基)丙烯酸C1-20烷基酯]等}、乙烯基硅烷类(例如,三甲氧基乙烯基硅烷、三丁基乙烯基硅烷、二苯甲基乙烯基硅烷等)、聚氧化烯(甲基)丙烯酸酯类[例如,聚氧乙烯(甲基)丙烯酸酯、聚氧丙烯(甲基)丙烯酸酯等]、聚氧化烯(甲基)丙烯酰胺类[例如,聚氧乙烯(甲基)丙烯酰胺、聚氧丙烯(甲基)丙烯酰胺等]、聚氧化烯乙烯基醚类(例如,聚氧乙烯乙烯基醚、聚氧丙烯乙烯基醚等)、聚氧化烯烷基乙烯基醚类(例如,聚氧乙烯烯丙醚、聚氧丙烯烯丙醚、聚氧乙烯丁基乙烯基醚、聚氧丙烯丁基乙烯基醚等)、α-烯烃类(例如,乙烯、丙烯、正丁烯、1-己烯等)、丁烯类(例如,3,4-二羟基-1-丁烯、3,4-二酰氧基-1-丁烯、3-酰氧基-4-羟基-1-丁烯、4-酰氧基-3-羟基-1-丁烯、3,4-二酰氧基-2-甲基-1-丁烯等)、戊烯类(例如,4,5-二羟基-1-戊烯、4,5-二酰氧基-1-戊烯、4,5-二羟基-3-甲基-1-戊烯、4,5-二酰氧基-3-甲基-1-戊烯等)、己烯类(例如,5,6-二羟基-1-己烯、5,6-二酰氧基-1-己烯等)、胺类不饱和单体[例如,N,N-二甲基烯丙基胺、N-烯丙基哌嗪、3-哌啶基丙烯酸乙酯、2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶、2-甲基-6-乙烯基吡啶、5-乙基-2-乙烯基吡啶、5-丁烯基吡啶、4-戊烯基吡啶、2-(4-吡啶)烯丙醇等]、具有季铵化合物的不饱和单体(例如,丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、二甲胺基丙基丙烯酰胺氯化铵、N,N-二甲氨基丙基丙烯酰胺苯磺酸季盐等)、芳香族类不饱和单体(例如,苯乙烯等)、含有磺酸基的不饱和单体(例如,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸或其碱金属盐、铵盐或有机胺盐;2-丙烯酰胺-1-甲基丙磺酸或其碱金属盐、铵盐或有机胺盐;2-甲基丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸或其碱金属盐、铵盐或有机胺盐;乙烯基磺酸或其碱金属盐、铵盐或有机胺盐;烯丙基磺酸或其碱金属盐、铵盐或有机胺盐;甲基丙烯磺酸或其碱金属盐、铵盐或有机胺盐等)、(烯丙氧基)丙二醇、2,3-二乙酰氧基-1-烯丙氧基丙烷、2-乙酰氧基-1-烯丙氧基-3-羟基丙烷、3-乙酰氧基-1-烯丙氧基-3-羟基丙烷、3-乙酰氧基-1-烯丙氧基-2-羟基丙烷、甘油单乙烯基醚、甘油单异丙烯基醚、丙烯酰吗啉、乙烯基碳酸乙烯酯、乙烯基咪唑、乙烯基咔唑等中的一种以上等。其他不饱和单体的含量没有特别规定,例如,相对于100摩尔的乙烯酯类单体,为10摩尔以下即可。
此外,在进行聚合时可使用聚合催化剂。作为聚合催化剂,没有特别限定,通常可使用偶氮类化合物或过氧化物。
此外,在进行聚合时,以防止脂肪族乙烯酯的水解为目的,可添加酒石酸、柠檬酸、乙酸等有机酸。
此外,对于聚合的终止没有特别限定,可使用聚合终止剂。聚合终止剂没有特别限定,例如可列举出间二硝基苯等。
聚合温度没有特别的限定,使用公知的聚合温度即可,但从容易得到间同立构规整度高的PVA树脂的角度出发,例如为-50~200℃,优选为-50~150℃,进一步优选为0~120℃等。
可通过所述方式得到乙烯酯聚合物。得到的聚合物的皂化反应方法没有特别限定,可根据以往公知的方法,例如能够应用使用了以往公知的氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠等碱性催化剂或盐酸、硫酸、对甲苯磺酸等酸性催化剂的醇解或水解反应。另外,在皂化反应的前后,通常聚合物的间同立构规整度几乎不变。
作为在皂化反应中使用的溶剂,可列举出甲醇、乙醇等醇类;乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类;丙酮、甲基乙基酮等酮类;苯、甲苯等芳香族烃类;四氢呋喃等,这些溶剂可单独使用或组合使用两种以上。此外,皂化温度、时间等没有特别限制。
此外,皂化物的干燥、粉碎、清洗方法也没有特别限制,可使用公知的方法。
由此得到乙烯酯聚合物的皂化物,即得到本发明的PVA树脂(A)。在不阻碍本发明的效果的范围内,也可使用公知的方法,通过缩醛化、氨基甲酸酯化、醚化、接枝化、磷酸酯化、乙酰乙酰基化、阳离子化等反应对得到的PVA树脂(A)进行后改性。
PVA树脂(A)的皂化度优选为90~99.99摩尔%,更优选为98~99.99摩尔%(例如98.0~99.97摩尔%),进一步优选为99~99.99摩尔%(例如99~99.95摩尔%)。另外,PVA树脂的皂化度可通过在氘代DMSO溶液中测定1H-NMR而求出。
PVA树脂(A)的聚合度优选为100~10000,更优选为500~8000,进一步优选为1000~5000,从较容易操作的点出发,特别优选为1000~3000。例如,作为PVA树脂的聚合度,例如可列举出包含于1000~2000、2000~3000、3000~4000、4000~5000的范围内的值等。若聚合度为100以上,则树脂强度(应力)高,容易制备具有形状保持性(shape-retainability)的水性凝胶。若聚合度为10000以下,则水溶液容易处理。另外,聚合度为皂化前的树脂在JIS K 6725中记载的苯溶液中且在30℃下的聚乙酸乙烯酯换算的聚合度。
本发明的水性PVA凝胶的交联率、孔隙率和/或平均孔径只要在不阻碍效果的范围内进行适当调节即可,所述效果为具有如下选择性的效果:使在应透过的氧、无机有机的营养成分、各种激素中被设想为最大的直径为5nm左右的分子(例如包含胰岛素等激素的生理活性物质)透过,而不允许在应阻止透过的免疫相关的细胞或免疫相关的物质中被设想为最小的直径为50nm左右的分子(例如抗体、补体等)透过的选择性。作为有助于调节的方法,可列举出补体透过抑制试验等。
本发明的水性PVA凝胶的平均孔径例如为5nm以上且小于500nm,优选为5nm以上且小于200nm,进一步优选为5nm以上且小于50nm以下。
对于所述平均孔径,例如,使用扫描电子显微镜(Hitachi S-4000型,Hitachi,Ltd.制造)拍摄凝胶表面的照片(SEM照片,倍率1,000倍~5,000倍),使用图像处理装置(本体名称:Nippon Avionics Co.,Ltd.制造,TV Image processor TVIP-4100II,控制软件名称:Ratoc System Engineering Co.,Ltd.制造,TV Image processor image command4198)读入照片而得到图像,在得到图像中测定规定数目的孔径,通过对其进行算术处理,可求出平均孔径。
或者可通过大气压扫描电子显微镜(例如,Hitachi High-TechnologiesCorporation.制造的AeroSurf 1500,JEOL Ltd.制造的JASM-6200)、动态光散射法(例如HORIBA,Ltd.制造的nano Partica SZ-100Plus)或扫描显微镜动态光散射法(SMILS)等求出。
[生物组合物(B)]
通过在本发明的水性凝胶中包封生物组合物(B),能够形成细胞或组织包埋装置。
作为生物组合物(B),没有特别限定,可根据制备的细胞或组织包埋装置的使用目的进行适当选择。
作为生物组合物(B),若为能够在本发明的、优选制备水性凝胶的温度(即,-5~60℃)下稳定保存的细胞(优选为活细胞)或生物组织,则无论细胞或生物组织的种类如何,都能够得到生理活性物质的供给能力高的细胞或组织包埋装置,因而优选。
作为这样的细胞,例如可使用来自外胚层、中胚层或内胚层的分化细胞或干细胞等。
作为分化细胞,例如可使用表皮细胞、平滑肌细胞、骨细胞、骨髓细胞、软骨细胞、骨格肌成肌细胞、胰腺实质细胞、胰岛细胞、胰腺内分泌细胞、胰腺外分泌细胞、胰管细胞、肝脏细胞(例如,肝细胞)、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、脾细胞、松果体细胞、肾脏细胞(肾细胞)、脾细胞、前叶细胞、生长激素分泌细胞、产生多巴胺的细胞、血细胞、心肌细胞、骨格肌细胞、成骨细胞、神经细胞、色素细胞、脂肪细胞等。上述细胞不仅可以为从生物体中分离的细胞,也可以为后文所述的由干细胞分化诱导的细胞。
对于干细胞(iPS细胞等)等可被分化诱导的细胞,可以在将被分化诱导的细胞放入装置并进行施与后、在生物体内使其分化诱导,也可以将已分化诱导的细胞放入装置中使用。
此外,作为干细胞,可使用组织干细胞(例如,表皮干细胞、毛囊干细胞、胰腺干细胞〃胰腺前驱细胞、肝干细胞、神经干细胞、视网膜干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等)、胚胎干细胞(ES细胞)、iPS细胞(诱导性多功能干细胞)等,但不限于这些细胞。
这些细胞来自人、猪、大鼠或小鼠等哺乳动物,优选为产生和/或分泌对患者等生物体有用的激素或蛋白质等生理活性物质的细胞,细胞的种类选择可根据移植的患者等生物体的疾病种类来决定。此外,在这些细胞为除人细胞以外的细胞的情况下,其可以为为了治疗目的而导入了人基因的细胞。另外,对生物体有用的激素可例示出胰岛素、促甲状腺激素、甲状腺激素、甲状旁腺激素、生长激素、甲状腺素、糖皮质激素、胰高血糖素、***或睾酮等。对生物体有用的蛋白质具体而言可例示出凝血因子、补体、白蛋白、球蛋白、各种酶(代谢酶或淀粉酶、蛋白酶或脂肪酶等消化酶)。作为其他生理活性物质的例子,例如可列举出多巴胺等神经递质等。
具体而言,优选胰腺细胞(胰岛细胞)、肝细胞、产生多巴胺的细胞及这些细胞的干细胞〃前驱细胞,更优选胰腺细胞(胰岛细胞)、肝细胞及这些细胞的干细胞〃前驱细胞,更优选胰腺细胞(胰岛细胞)及胰前驱(干)细胞。
在本发明中使用的上述生物组合物(B)可以为确定为实验室用的细胞或生物组织、或由生物组织中分离的细胞等中的任一种,优选为已分化的非***细胞。另外,该分离方法没有特别限定,可遵循以往公知的方法。此外,期望由生物组织分离的细胞去除了病原性病毒等病原体。
在本发明的细胞或组织包埋装置中,生物组合物(B)的含量可根据生物组合物(B)的种类进行适当变更,没有特别限定,相对于1mm3的凝胶装置包埋空间,例如为1000~1000000细胞数,优选为10000~100000细胞数,更优选为20000~50000细胞数。
剂量由医师考虑患者的年龄、性别、症状、副作用等而确定,不能一概而论,通常成人每人可在体内移植约1~10个装置。例如在针对糖尿病患者的情况下,相对于患者的每1kg体重,通常能够移植含有1000~100000IEQ(胰岛当量的国际单位:将直径为150μm的胰岛的体积定义为1IEQ)的胰岛的装置,优选移植含有5000~40000IEQ的胰岛的装置,更优选移植含有10000~20000IEQ的胰岛的装置。
装置的形状没有特别限定。包括圆盘状、球状、圆柱状、椭球状等,优选为圆盘状。在装置为圆盘状时,若以厚度与直径的积表示,则厚度通常为0.1mm~10cm,优选为0.1~5mm,更优选为0.5~2mm,直径通常为1mm~50cm,优选为1mm~10cm,更优选为2~4cm左右。
材质可使用以往公知的材质。
另外,作为本发明中的生物组合物(B),除了所述的细胞或生物组织以外,还可以含有来自其他生物体的成分。
此外,本公开包含排除如下情况的情况:本发明的细胞或组织包埋装置中的细胞或组织来自微生物活菌的情况。
[细胞培养成分(C)]
可通过将细胞培养成分(C)与生物组合物(B)一同包封在本发明的水性凝胶中而形成细胞或组织包埋装置。
作为细胞培养成分(C)没有特别限定,例如可列举出含有Na、K、Cl、Ca、葡萄糖等的乙酸或者磷酸缓冲液等。
当细胞培养成分(C)含有Na时,优选将Na浓度调节为20~150mEq/L,更优选调节为80~140mEq/L。
当含有K时,优选将K浓度调节为2.5~130mEq/L,更优选调节为3.5~40mEq/L。
当含有Cl时,优选将Cl浓度调节为15~170mEq/L,更优选调节为100~150mEq/L。
当含有Ca时,优选将Ca浓度调节为0.5~5mEq/L,更优选调节为1~3mEq/L。
当含有葡萄糖时,优选将葡萄糖浓度调节为1~11mM,更优选调节为3~7mM。
作为细胞培养成分(C),没有特别限定,例如可列举出公知的细胞培养基(例如,HBSS(Hank’s平衡盐溶液)等)、市售的保存液(例如,Euro-Collins溶液、cell banker、UW液(University of Wisconsin solution)等)、细胞保护成分(例如,二甲基亚砜(DMSO)、血清白蛋白等)、防止杂菌混入的成分(例如,抗生素等)、维持细胞活性的成分(例如,烟酰胺等维生素类等)等,优选公知的细胞培养基等。这些细胞培养成分可单独使用一种或同时使用两种以上。
此外,细胞培养成分(C)可与其他成分(例如,缓释性赋予剂、等渗剂、pH调节剂等)组合使用。
在本发明的装置中,由于PVA树脂(A)及细胞培养成分(C)以接触的状态存在,因此在制备装置时添加细胞培养成分(C)的情况下,细胞培养成分(C)以浓缩至“含有聚乙烯醇树脂(A)的水溶液的体积及细胞培养成分(C)的体积的和/细胞培养成分(C)的体积”倍的状态添加即可。
这种状态的细胞培养成分(C)的含量没有特别限定,优选为不抑制细胞或生物组织的增殖、存活和/或生理活性物质的分泌等的范围、且为不损害本发明的目的的范围。
相对于100质量份的PVA树脂(A),上述状态的细胞培养成分(C)的添加量例如为100~2000质量份,优选为150~1000质量份(例如,200~300质量份、175~300质量份等)左右。
例如,相对于9mL的PVA树脂(A)的水溶液,可以添加1mL的10倍浓度的细胞培养成分(C)。
进一步,在细胞或组织包埋装置的制备中,可使用除PVA树脂(A)、生物组合物(B)及细胞培养成分(C)以外的其他成分。
作为其他成分,例如可列举出作为促进或调控活细胞增殖的物质的细胞生长因子、作为产生自细胞的活性物质的细胞因子、其他生理活性物质、促进对细胞或组织包埋装置的血流的血流促进物质、神经营养因子等。这些成分可单独使用一种或同时使用两种以上。
作为细胞生长因子,例如可列举出血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素等。
作为细胞因子,例如可列举出造血因子(例如,白细胞介素类、趋化因子类、集落刺激因子等)、肿瘤坏死因子、干扰素类等。
作为其他生理活性物质,例如可列举出氨基酸(例如,甘氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等)、维生素类(例如,生物素、泛酸、维生素D等)、血清白蛋白、抗生素等。
作为血流促进物质,例如可列举出瓜氨酸或其盐、辣椒碱(capsaicin)、辣椒素(capsaicinoid)类。
作为神经营养因子,例如可列举出NGF(nerve growth factor;神经生长因子)、BDNF(brain-derived neurotrophic factor;脑源性神经营养因子)、NT-3(neurotrophin-3;神经营养因子-3)、NT-4(neurotrophin-4;神经营养因子-4)、GDNF(Glial-Cell DerivedNeurotrophic Factor;胶质细胞源性神经营养因子)、神经秩蛋白(neurturin)、自分泌神经营养因子(artemin)、外周营养因子(persephin)等。
另外,所述其他成分的添加量没有特别限定。
[水性凝胶]
作为本发明的细胞或组织包埋装置中使用的水性凝胶,只要使用在水性溶剂中对PVA树脂(A)进行溶液化(溶解)而凝胶化的水性凝胶,则能够不受特别限定地进行制备。PVA树脂(A)的溶解方法没有特别限定,例如,可通过进行加热或搅拌等而进行溶解。此外,溶解可在密闭下进行,也可根据需要进行加压。另外,作为水性溶剂,通常使用水。
本发明的水性凝胶例如可通过在水性溶剂中将PVA树脂(A)加热至90℃以上以进行溶液化,然后冷却而得到。
溶液化的条件只要为PVA树脂(A)溶解于水的条件则没有特别限定,加热温度例如为90~250℃,优选为105~230℃,更优选为110~200℃。若加热温度为100℃以上,则PVA树脂容易溶解。此外,若为250℃以下,则不易引起PVA树脂的分解。
此外,溶液化的时间可根据温度或压力、溶液浓度而进行适当变更,例如为1分钟~12小时、30分钟~10小时等。
本发明的水性凝胶在溶解于水时可使用任意的装置。具体而言,可使用能够加热的搅拌型或旋转型的压热器,在水的含量少时也可使用挤出机等。
生物组合物(B)可在制备水性凝胶后与水性凝胶混合,也可以在PVA树脂(A)的水溶液中添加并混合生物组合物(B)。
可在制备水性凝胶后使水性凝胶浸渍于含有细胞培养成分(C)的液体中,也可为了抑制活细胞数的减少而在凝胶化前将细胞培养成分(C)与PVA树脂(A)的水溶液(以及根据需要的生物组合物(B))混合而进行制备。
作为水性凝胶的制备方法,可例示出将PVA树脂(A)的水溶液及细胞培养成分(C)混合后,混合生物组合物(B)而得到混合物(可以为溶胶状态),使得到的混合物凝胶化的形式。
此外,可用于本发明的所述其他成分能够与生物组合物(B)和/或细胞培养成分(C)一同添加混合或分别添加于PVA树脂(A)、含PVA树脂(A)的水溶液和/或水性凝胶中并进行混合。
此外,PVA树脂(A)的水溶液期望通过压热处理、UV或γ射线处理等以往公知的方法进行灭菌处理,在与生物组合物(B)混合时或在之后的细胞或组织包埋装置的制造中,期望在不混入杂菌的环境下进行操作或保管。
PVA树脂(A)(以及根据需要混合了生物组合物(B)和/或细胞培养成分(C))的混合液的pH优选使用HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)等缓冲液调节至6.0~8.0,更优选为6.2~7.7,进一步优选为6.5~7.5。若为所述范围,则包埋在细胞或组织包埋装置内的活细胞或生物组织不易受到损伤,活细胞数的减少少,因而优选。
在水性凝胶的制备中,可放置PVA树脂(A)的水溶液(根据需要混合有生物组合物(B)和/或细胞培养成分(C)的状态)。
作为放置温度,只要为适合保存活细胞的温度则没有特别限制,例如为-5℃以上,优选为-5~60℃(例如,0~60℃),更优选为-3~50℃(例如,0~50℃),进一步优选为0~40℃。若为所述范围,则活细胞数的减少少,故而优选。此外,放置温度优选为不使PVA树脂(A)水溶液(可以为溶胶状态)或水性凝胶冻结、能够使用该水溶液或凝胶包埋活细胞或生物组织的温度。在本发明中,通过使用具有特定的间同立构规整度的PVA树脂(A),能够以适合保存活细胞或生物组织的较低温度(例如,上述范围的温度)制备水性凝胶。
制备水性凝胶时的放置时间可根据PVA树脂(A)的浓度、放置温度等进行适当选择,通常为1小时~3、4天左右,优选为1小时~2天左右,进一步优选为2~12小时左右。从将细胞或组织包埋装置留置于体内时不易崩解等角度出发,优选为1小时以上。
水性凝胶或者细胞或组织包埋装置中的活细胞数相对于包封于水性凝胶之前的生物组合物(B)的活细胞数总体的比例,大于不含在本发明中使用的PVA树脂(A)作为成分的、水性凝胶或者细胞或组织包埋装置中的活细胞数的所述比例时,可判断本发明的细胞或组织包埋装置所包埋的细胞或组织的存活率高。
水性凝胶或者细胞或组织包埋装置中的活细胞数相对于包封于水性凝胶之前的生物组合物(B)的活细胞数总体的比例例如为60~100%,优选为70~100%,更优选为80~100%。活细胞数例如可通过利用荧光素二乙酸盐试剂的细胞质染色及利用碘化丙啶的细胞核染色来进行测定(有时也缩写为FDA/PI测定)。
水性凝胶的固体成分浓度例如为0.3~20%,优选为0.5~10%,更优选为1~8%(例如,3~8%)。从将细胞或组织包埋装置移植至动物后,能够在体内长期维持装置形态,保持免疫隔离性能等角度出发,优选为所述范围。在本说明书中,固体成分浓度的测定方法没有特别限定,例如可以为如后文所述的实施例中记载的方法那样的、使用加热干燥式水分计(A&D Company,MS-70)等的方法。
得到的水性凝胶具有以下结构:能够作为后文所述的免疫隔离层发挥作用,在稳定地保持细胞的同时,使氧或葡萄糖、胰岛素等对生物体有用的激素、其他生理活性物质透过,不允许免疫类的蛋白质透过的结构。
此外,水性凝胶通常具有在移植时不容易崩解的强度(应力)。应力因PVA树脂(A)的聚合度、立构规整度及水性凝胶的固体成分浓度而异,不能一概而论,例如应力为0.3~30kPa,优选为0.4~25kPa,更优选为0.5~20kPa,进一步优选为0.5~15kPa。
水性PVA凝胶的应力例如可使用Shimadzu Corporation制造的小型台式试验机EZTest EZ-SX并按照其使用说明书进行测定。
水性凝胶的形状没有特别限制,例如可列举出片状、板状、盘状、棒状、管状、珠状等。
此外,作为该水性凝胶的成型方法,例如可列举出在进行凝胶化前将含有PVA树脂(A)(以及根据需要而优选含有生物组合物(B)及细胞培养成分(C))的水溶液(可以为溶胶状态)注入至目标形状的模具中的方法、使用刀片等将得到的凝胶加工成目标形状的方法等。
另外,通常含有PVA树脂(A)(以及根据需要而优选含有生物组合物(B)及细胞培养成分(C)等)的水溶液在达到凝胶状态之前,经过溶胶状态。可理解为这样的溶胶状态也作为本发明的水性凝胶等同物而属于本发明的范围内。
含有PVA树脂(A)的水溶液(可以为溶胶状态)的固体成分浓度例如为0.3~20%,优选为0.5~10%,更优选为1~8%。从将细胞或组织包埋装置移植至动物后,能够在体内长期维持装置形态,保持免疫隔离性能等的角度出发,优选为所述范围。
[细胞或组织包埋装置]
本发明的水性凝胶能够用作细胞或组织包埋装置的免疫隔离层。
“免疫隔离层”是指例如使葡萄糖;胰岛素、促甲状腺激素、甲状腺激素、甲状旁腺激素、生长激素、甲状腺素、糖皮质激素、胰高血糖素、***或睾酮等激素;凝血因子、白蛋白、球蛋白、各种酶(代谢酶或淀粉酶、蛋白酶或脂肪酶等消化酶)等蛋白质;多巴胺等神经递质等透过,而不允许例如抗体、补体或白细胞等免疫类的蛋白质透过的层。
细胞或组织包埋装置只要包埋或含有生物组合物(B)即可,例如可以为生物人工脏器等。
细胞或组织包埋装置的制造方法没有特别限定,例如可通过在0~40℃(例如,4℃)下,在目标形状的模具中保存(例如,保存1小时~3、4天左右、2~48小时或3~24小时左右)含有包含生物组合物(B)及细胞培养成分(C)的所述PVA树脂(A)的水溶液或水性凝胶,由此制造细胞或组织包埋装置。
细胞或组织包埋装置通常具有在移植时不易崩解的强度(应力)。应力因PVA树脂(A)的聚合度、立构规整度、细胞培养成分(C)的添加量及组织包埋装置的固体成分浓度而异,不能一概而论,但例如应力为0.3~30kPa,优选为0.4~25kPa,更优选为0.5~20kPa,进一步优选为0.5~15kPa。
细胞或组织包埋装置的应力例如可使用Shimadzu Corporation制造的小型台式试验机EZTest EZ-SX并按照其使用说明书进行测定。
本发明的细胞或组织包埋装置可以含有支撑基材(D)。
为了简化水性凝胶的补强和/或操作性,可组合使用作为补强材料而有用的支撑基材(D)。
例如,在将水性凝胶制成薄膜片状时,为了简化其补强和/或操作性,可固定在树脂制筛网片等基材(补强材料)上来进行凝胶化。
支撑基材(D)的原料不受限定,例如可列举出高分子[例如,PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PE(聚乙烯)、PP(聚丙烯)、Teflon(注册商标)等]、金属等,优选该原料在生物体内不分解、变质,但也可在经过一定期间后在生物体内分解。
为了使在应透过的氧、无机有机的营养成分、各种激素中被设想为最大的直径为5nm左右的分子(例如包含胰岛素等激素的生理活性物质)透过,而不允许在应阻止透过的免疫相关的细胞或免疫相关的物质中被设想为最小的直径为50nm左右的分子(例如抗体、补体等)透过,筛网片的筛网(网眼)尺寸通常为5~100nm,优选为10~50nm,更优选为20~30nm。
作为本发明的细胞或组织包埋装置的一个形态,例如为下述的优选实施形态:将含有包含所述细胞培养成分(C)的PVA树脂(A)的水溶液或水性凝胶放置在载玻片上,在其上覆盖PET筛网(例如,SANPLATECCO.,LTD.制造,商品名称:PET筛网片(名称TN120)等)等支撑基材(D),在该PET筛网上放置使生物组合物(B)混悬在包含PVA树脂(A)的水溶液或水性凝胶中而得到的悬浊液,使用凝胶加样吸嘴(gel loading chip)等,在PET筛网上扩散该悬浊液,进一步以夹持该悬浊液的方式在上面覆盖PET筛网,并在PET筛网上放置含有包含所述细胞培养成分(C)的PVA树脂(A)的水溶液或水性凝胶,在上面覆盖载玻片进行构建后去除载玻片而成的结构。另外,细胞或组织包埋装置在去除所述载玻片之前,优选在0~40℃(例如,4℃)下静置2~48小时,更优选静置3~24小时。
本发明的细胞或组织包埋装置能够通过留置在包括人在内的动物的皮下、筋膜下、肝表面、脾表面、大网膜内或者腹腔内等体内而进行移植。该留置方法没有特别限定,可遵循以往公知的方法。例如,移植用机器也可以为公知的机器。
通过将本发明的细胞或组织包埋装置移植至具有内分泌疾病(例如,甲状腺疾病、甲状旁腺疾病、肾上腺疾病、垂体疾病、松果体疾病等)、代谢疾病(例如,鸟胺酸氨甲酰基转移酶缺乏症、高氨血症、高胆固醇血症、高胱氨酸尿症、糖原病、先天性葡萄糖醛酸转移酶缺乏症等、威尔逊病)、糖尿病(例如,I型糖尿病、II型糖尿病、胰源性糖尿病等)、神经退行性疾病(例如,帕金森病、阿尔茨海默氏症、肌萎缩侧索硬化症、脊髓小脑变性症等)、血友病、骨病(例如,骨质疏松症)、癌症(例如,白血病等)等疾病的包括人在内的动物中,能够进行这些疾病的预防和/或治疗。本发明的细胞或组织包埋装置能够以稳定的状态长期在生物体内保有细胞,因此能够以高治愈率治疗这些疾病,并且能够降低细胞或组织包埋装置的移植频率。
此外,本发明的水性凝胶除了能够阻碍粒径为5~50μm的颗粒[例如,白细胞(例如,巨噬细胞等)、淋巴细胞(例如,T淋巴细胞)等]的透过以外,还能够阻碍粒径为0.1~1μm的颗粒(例如,补体等)的透过,因此本发明的细胞或组织包埋装置能够隔离参与免疫的细胞及补体,能够用作优异的免疫隔离层。
作为优选实施方式,例如对细胞为胰岛细胞的情况进行说明。
如图4所示,从胰脏中分离优质的胰岛细胞,准备移植用胰岛(参考图4)。为了防止胰岛细胞彼此的聚集,用上述筛网(2片)固定胰岛细胞。使用通过上述方式准备并固定的胰岛细胞与PVA树脂(A)制造本发明的装置,最内层为胰岛细胞,分泌并扩散胰岛素。第二层用筛网层支撑细胞。最外层为凝胶表面,形成免疫隔离膜。该免疫隔离膜的生物相容性高,使胰岛素通过,但不允许免疫相关的物质通过(参考图5)。
本发明的装置可直接应用于生物体内,例如,被收纳于根据公知技术、使用容易设置的新生血管而构建的网中,发挥医疗效果。装置可容易地取出或更换(参考图6)。
该装置能够发挥下述特征中的至少一个。
(1)将所包埋的细胞的质量维持得较高。
(2)将移植的胰岛与宿主患者的免疫***适当隔离。
(3)供给氧〃葡萄糖,且能够进行适当的胰岛素应答。
(4)能够微创移植,能够根据需要容易地取出至体外或更换。
本发明的细胞或组织包埋装置优选不具有半透膜。
实施例
以下列举实施例对本发明进行进一步具体说明,但本发明不受这些实施例的任何限定,在本发明的技术构思内,本领域技术人员能够进行多种变形。另外,只要没有特别指定,则例子中的“份”及“%”表示“质量份”及“质量%”。
[PVA树脂(A)的物性]
(1)间同立构规整度
在d6-DMSO溶液中测定1H-NMR,求出三单元组表示的间同立构规整度(%)。
另外,三单元组表示的间同立构规整度(%)是指根据4~5ppm的3个羟基质子(由低磁场侧起为全同立构[I]、杂同立构[H]、间同立构[S])的比率并基于下述计算公式求出的值。
三单元组表示的间同立构规整度(%)=[S]/([I]+[H]+[S])×100
(2)皂化度
在d6-DMSO溶液中测定1H-NMR,求出皂化度(摩尔%)。
(3)聚合度
测定在JIS K 6725中记载的苯溶液中、在30℃下的聚乙酸乙烯酯换算的聚合度。
(PVA树脂(A)的制备)
[合成例1]
在具备搅拌机、温度计、滴液漏斗及回流冷凝器的烧瓶中,加入800份特戊酸乙烯酯、190份甲醇,在进行了体系内的氮气置换后,将夹套加热至80℃,在产生回流的时间点添加将0.07份2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)溶解于10份甲醇中而成的溶液,引发聚合,在6小时后添加作为聚合终止剂的间二硝基苯,停止聚合。聚合收率为58%。
从得到的反应物中去除甲醇、特戊酸乙烯酯后,加入丙酮,溶解聚特戊酸乙烯酯,得到40%丙酮溶液。
在250份该40%丙酮溶液中加入110份氢氧化钾的25%甲醇溶液,充分混合,以50℃进行2小时皂化反应。粉碎得到的凝胶状物质,在150份丙酮、340份氢氧化钾的25%甲醇溶液中进一步以50℃进行4小时皂化反应。在反应后使用乙酸中和,进行固液分离,使用甲醇、水清洗,干燥后得到30g的PVA树脂1。
得到的PVA树脂1的皂化前的聚合度为1450,皂化度为99.91摩尔%。此外,以三单元组表示的间同立构规整度为37.1%。
[合成例2]
除了将800份特戊酸乙烯酯变更为685份特戊酸乙烯酯、并追加115份乙酸乙烯酯以外,以与合成例1相同的方式制备PVA树脂2。另外,摩尔比(特戊酸乙烯酯/乙酸乙烯酯)为80/20。得到的PVA树脂2的皂化前的聚合度为1510,皂化度为99.90摩尔%。此外,以三单元组表示的间同立构规整度为35.7%。
[合成例3]
除了将800份特戊酸乙烯酯变更为553份特戊酸乙烯酯、并追加247份乙酸乙烯酯以外,以与合成例1相同的方式制备PVA树脂3。另外,摩尔比(特戊酸乙烯酯/乙酸乙烯酯)为60/40。得到的PVA树脂3的皂化前的聚合度为2030,皂化度为99.89摩尔%。此外,以三单元组表示的间同立构规整度为34.0%。
[合成例4]
在具备搅拌机、温度计、滴液漏斗及回流冷凝器的烧瓶中,加入2000份特戊酸乙烯酯、38份甲醇,在进行体系内的氮气置换后,将夹套加热至80℃,在产生回流的时间点添加将0.03份2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)溶解于2份甲醇中而成的溶液,引发聚合,在3小时后添加作为聚合终止剂的间二硝基苯,停止聚合。聚合收率为17%。
从得到的反应物中去除甲醇、特戊酸乙烯酯后,加入丙酮,溶解聚特戊酸乙烯酯,得到25%丙酮溶液。
在200份该25%丙酮溶液中加入54份氢氧化钾的25%甲醇溶液,充分混合,以50℃进行2小时皂化反应。粉碎得到的凝胶状物质,在150份丙酮、168份氢氧化钾的25%甲醇溶液中进一步以50℃进行4小时皂化反应。在反应后使用乙酸中和,进行固液分离,使用甲醇、水清洗,干燥后得到17g的PVA树脂4。
得到的PVA树脂4的皂化前的聚合度为4440,皂化度为99.86摩尔%。此外,以三单元组表示的间同立构规整度为36.7%。
[合成例5]
除了将2000份特戊酸乙烯酯变更为1600份特戊酸乙烯酯、并追加268份乙酸乙烯酯以外,以与合成例4相同的方式制备PVA树脂5。另外,摩尔比(特戊酸乙烯酯/乙酸乙烯酯)为80/20。得到的PVA树脂5的皂化前的聚合度为4530,皂化度为99.93摩尔%。此外,以三单元组表示的间同立构规整度为35.5%。
(溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液A的制备)
作为溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液A,制备两种含有细胞培养成分(C)的溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液。在后文中,将制备得到的溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液记作溶胶A-1及溶胶A-2。
[溶胶A-1]
将1.425g的上述PVA树脂1与23.575g蒸馏水混合,以不产生焦糊的方式在160℃、35rpm下旋转搅拌3小时以进行溶解,冷却至90℃后,将得到的溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液回收至预先升温至90℃的玻璃制西林瓶中,以90℃保温。然后,将制备的溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液放入42度的水浴中,向8.8mL溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液中加入1.0mL的10倍浓度HBSS(Hank’s平衡盐溶液)、0.2mL的1M HEPES,对离心管进行上下振荡搅拌。然后,使用离心机(KUBOTA Corporation.制造,商品名称:混合高速冷冻离心机6200)进行快速离心(spin down),在42℃下静置,由此得到溶胶A-1(PVA树脂浓度:5w/v%)。将得到的溶胶A-1转移至3.5cm的皿中。
[溶胶A-2]
将1.135g的上述PVA树脂1与23.865g蒸馏水混合,以不产生焦糊的方式在160℃、35rpm下旋转搅拌3小时以进行溶解,冷却至90℃后,将得到的溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液回收至预先升温至90℃的玻璃制西林瓶中,以90℃保温。然后,将制备的溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液放入42℃的水浴中,向8.8mL溶胶状态的PVA树脂(A)水溶液中加入1.0mL的10倍浓度HBSS(Hank’s平衡盐溶液)、0.2mL的1M HEPES,对离心管进行上下振荡搅拌。然后,使用离心机(KUBOTA Corporation.制造,商品名称:混合高速冷冻离心机6200)进行快速离心,在42℃下静置,由此得到溶胶A-2。将得到的溶胶A-2移入3.5cm的皿中。
(溶胶A-1及A-2的固体成分浓度测定)
对于上述制备的溶胶A-1及A-2,按照下述方式测定固体成分浓度。
溶胶的固体成分浓度使用加热干燥式水分计(A&D Company,MS-70)进行测定。在水分计的试样皿中放置玻璃纤维片,使约1g各溶胶均匀地浸润至片中,在试样皿温度为120℃、测定时间(加热时间)为15分钟的条件下测定各溶胶的固体成分。测定时的水分计的显示内容选择固体成分(%)。计算固体成分的计算公式为干燥后质量/干燥前质量×100(%)。计算出溶胶A-1的固体成分浓度为6.5质量%,溶胶A-2的固体成分浓度为5.5质量%。
(胰岛细胞的制备)
将11~14周龄的雄性Lewis大鼠(Japan SLC,Inc.)用于胰岛分离。将从大鼠总胆管注入了溶解有0.8mg/mL胶原酶V型(collagenase type V)(Sigma-Aldrich Co.LCC制造)的冷Hank’s缓冲液(HBSS)的胰脏在37℃下消化12分钟,从胰腺组织中分离胰岛。使用Histopaque-1119(Sigma-Aldrich Co.LCC制造)与Lymphoprep(AXIS-SHIELD,Norway)进行浓度梯度离心,回收胰岛。将胰岛在含有5.5mmol/L葡萄糖与10%胎牛血清(Fetal BovineSerum:FBS)的RPMI1640培养基中,在37℃、5%CO2下培养整夜后,用于实施例及比较例的研究。
(胰岛包埋装置的制备)
在载玻片上放置60μL置于上述皿上的上述已制备的溶胶A-1或A-2,在4℃下静置10分钟。在其上覆盖直径为15mm的圆形PET筛网(SANPLATEC CO.,LTD.制造,商品名称:PET筛网片(名称TN120)),使从上述制备的胰岛细胞中尽可能去除了培养基成分的物质在60μL的溶胶A-1或A-2中混悬,将得到的悬浊液放置在上述PET筛网上。使用凝胶加样吸嘴,在PET筛网上扩散胰岛细胞的悬浊液,以夹持胰岛细胞的悬浊液的方式进一步在其上覆盖PET筛网。进一步在PET筛网上放置250μL的溶胶A-1或A-2,在其上覆盖载玻片。将通过上述方式构建的溶胶留置在湿箱中,在4℃下静置3小时,得到胰岛包埋装置(水性凝胶)。另外,上述胰岛包埋装置的胰岛量均为800IEQs。
(胰岛包埋装置的保存工序)
[实施例1]
将以上述方式构建的使用了溶胶A-1的胰岛包埋装置(水性凝胶)从载玻片上取下,在6孔板中以5mL/孔的比例浸渍在保存培养基(将葡萄糖浓度调节至5.5mM、且含有10%FBS的RPMI1640培养基)中,在4℃下保存2小时。
试验例1(移植试验1)
通过在链脲佐菌素诱发糖尿病C57BL/6J小鼠的皮下留置使用了上述在4℃下保存2小时后的溶胶A-1的胰岛包埋装置(水性凝胶),从而进行移植。
(糖尿病治愈评价)
在上述移植后,经时测定血糖值,确认治愈效果(n数=4)。将其平均值±标准偏差示于图1及表1。另外,将血糖值为200mg/dl以下的判定为○(糖尿病得以治愈),将超过200mg/dl的判定为×(糖尿病状态)。
如图1所示,移植了本发明的胰岛包埋装置的糖尿病模型动物中,在刚移植后确认到了血糖值的下降,在移植后经过185天的时间点,在糖尿病模型动物中也确认到了血糖值的改善。
此外,在留置于皮下180天后尝试取出胰岛包埋装置,在实施例1的n数为4时的任意一种情况下,装置均不崩解,形态得到了良好保持,确认到本发明的细胞或组织包埋装置即使在体内也难以分解,十分坚固。
在将PVA树脂(A)设为6w/v%时,也在刚移植后确认到了血糖值的下降,在移植后经过185天的时间点,在糖尿病模型动物中也确认到了血糖值的改善。
[比较例1]
(PVA溶液组成)
使用聚合度为5000、皂化度为99.3摩尔%、以三单元组表示的间同立构规整度为29.5%的PVA,以使PVA为3%、FBS(Fetal bovine serum:胎牛血清)为10%、Dimethylsulfoxide(二甲基亚砜)为5%、Nicotinamide(烟酰胺)为10mM的方式,溶解于ETK(ET-Kyoto)溶液,将得到的PVA溶液用于冻结融解式胰岛装置的制备。
(胰岛细胞的包埋工序)
仅将尽可能去除了培养基成分的Lewis大鼠的胰岛细胞放入1.5mL离心管中,加入1.0mL的4℃的CellBanker(TOSC Japan Ltd.制造),混悬胰岛细胞,在冰冷却下放置1分钟后,去除CellBanker。在带有1mm隔片的载玻片上,放置涂布有上述PVA溶液的PET筛网(SANPLATECCO.,LTD.制造,商品名称:PET筛网片(名称TN120),10×15mm),在该PET筛网上扩散仅将胰岛细胞混悬于160μL的PVA溶液而得到的悬浊液,进一步,覆盖涂布有PVA溶液的PET筛网。在其上放置载玻片,制备厚度为1mm的冻结融解式胰岛装置。
(冻结〃融解〃保存工序)
将制备的冻结融解式胰岛装置在-80℃下静置24小时后,从模具中取出,在冰冷UW溶液(University of Wisconsin solution,脏器保存溶液)中融解。进一步,在冰冷UW溶液中浸渍3次、每次5分钟,将凝胶内的溶液组成置换为UW溶液后,在UW溶液中以4℃保存24小时。
(培养工序)
使用10mL冰冷却的胰岛培养用培养基(RPMI1640培养基:含5.5mM葡萄糖、10%FBS、抗生剂)清洗装置表面的UW溶液,然后在培养基(冰冷却)中浸渍3次、每次5分钟,将凝胶内的溶液组成置换为培养基后,在3mL的培养基中以37℃培养24小时。
(移植工序)
通过在已知移植生长比皮下更为容易的链脲佐菌素诱发糖尿病C57BL/6J小鼠的腹腔内留置上述保存后的冻结融解式胰岛装置,从而进行移植。
(糖尿病治愈评价)
在移植后,以与实施例1相同的方式经时测定血糖值,评价治愈效果。将该结果示于表1及图2。
[比较例2~18]
除了如表2所示对移植胰岛量及移植装置的个数进行变更以外,以与比较例1相同的方式制备冻结融解式胰岛装置并进行移植,对糖尿病治愈进行评价。将该结果示于表1、图2及图3。
另外,在表1中,对于实施例1,示出移植185天后的血糖值,在比较例1~18中,示出移植28天后的血糖值。
[表1]
[表2]
关于比较例1~18的冻结融解式生物人工胰岛装置,在冻结融解PVA凝胶的时间点,已经引起了包埋在其中的胰岛细胞的形态的崩解,在实际尝试实施对糖尿病模型动物的移植实验时,虽然如图2及图3所示,存在在刚移植后确认到因移植崩解造成的一过性血糖值下降的例子,但在移植后2周,全部例子中的血糖值再度上升,确认到了冻结融解式胰岛装置无法治愈糖尿病。
此外,如表1明确所示,实施例1的本发明的细胞或组织包埋装置通过包埋胰岛细胞而表现出了糖尿病治疗效果,与此不同,在比较例1~18中完全未确认到糖尿病治疗效果。在比较例1~18中,由于在移植时胰岛移植受到了显著阻碍,因此即使移植于已知移植效果最好的移植部位、即腹腔内,也完全未确认到糖尿病治疗效果。另一方面,特别值得提及的是,实施例1的本发明的细胞或组织包埋装置虽然移植于众所周知的最难以产生移植效果的移植部位、即皮下,但仍表现出了糖尿病治疗效果。
另外,实施例1的结果显示免疫隔离性能得到确保,包埋细胞的活性良好地得到保持,因此即使在使用其他细胞或生物组织作为生物组合物(B)时,也能够得到确保免疫隔离性能、保持包埋细胞活性的效果。
试验例2(移植试验2)
在溶胶A-1的制备方法中,除了使用PVA树脂2或3来代替PVA树脂1以外,以相同的方式得到胰岛包埋装置(水性凝胶)。在使用得到的水性凝胶、以与试验例1相同的方式进行移植试验后,在使用任意一种水性凝胶时,均得到了与使用PVA树脂1时实质相同的效果。
试验例3(移植试验3)
此外,在溶胶A-1的制备方法中,除了使用以使三单元组表示的间同立构规整度成为36.5%或39.1%的方式变更了聚合温度而制备的PVA树脂来代替PVA树脂1以外,以相同的方式得到胰岛包埋装置(水性凝胶)。在使用得到的水性凝胶、以与试验例1相同的方式进行移植试验后,在使用任意一种水性凝胶时,均得到了与使用PVA树脂1时实质相同的效果。
[实施例2~5]
(FDA/PI测定)
如表3所示,变更树脂(A)、浓度,以与实施例1中使用的胰岛装置相同的方法制备胰岛装置,使用3mL/孔的PBS(室温)清洗2次、每次3分钟。向放入6孔板的3mL PBS中添加15μL使用丙酮(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,东京,日本)溶解为5mg/mL的荧光素二乙酸盐(FDA:Calbiochem,San Diego,USA)、20μL使用蒸馏水溶解为0.5mg/mL的碘化丙啶(PI:Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA),将其作为FDA/PI染色溶液,向其中移入使用PBS清洗过的胰岛装置,在暗处进行5分钟染色后,使用3mL的PBS溶液清洗3分钟。将胰岛装置放置在盖玻片(Matsunami Glass Ind.,Ltd.,大阪,日本)上,使用荧光显微镜(BZ-900:KEYENCECORPORATION.,东京,日本),观察FDA(激发波长470/40nm,吸收波长525/50)与PI(激发波长540/25nm,吸收波长605/60)在胰岛内的定位。
在所有实施例中,在FDA测定(染色)中确认到了活细胞的存在(FDA(+)),几乎未发现死细胞。另一方面,在PI测定中,细胞核未被染色(PI(-)),与FDA染色的结果相同,明确了几乎不存在死细胞。
[表3]
PVA树脂(A)浓度…装置中的PVA树脂(A)的浓度(w/v%)
FDA/PI测定评价基准FDA:(+)存在活细胞、(-)细胞质死亡PI:(+)细胞核死亡、(-)存在活细胞
[比较例19]
以与实施例相同的方法对比较例1中制备的胰岛装置进行FDA/PI测定。在FDA测定中无法确认染色图像的存在,在PI测定中发现了清晰的细胞核的染色,由两个测定结果可确认到,比较例中的装置内的胰岛广泛地坏死。
[实施例6]
(水性凝胶、细胞或组织包埋装置的固体成分浓度、应力测定)
使用PVA树脂1与水,以160℃溶解,冷却至90℃后,填充至直径为34mm的圆柱容器内,然后在42℃下放置30分钟,在4℃下放置3小时,由此制备直径34mm×高度17mm的水性凝胶。
得到的水性凝胶的固体成分浓度(PVA树脂1浓度)为5.0%,20℃下的应力为0.7kPa。
固体成分浓度使用加热干燥式水分计(A&D Company,MS-70)进行测定。在水分计的试样皿中放置玻璃纤维片,使约1g的水性凝胶均匀地浸润至片中,在试样皿温度为120℃、测定时间(加热时间)为15分钟的条件下测定水性凝胶的固体成分。测定时水分计的显示内容选择固体成分(%)。计算固体成分的计算公式为干燥后质量/干燥前质量×100(%)。
应力测定使用Shimadzu Corporation制造的小型台式试验机EZTest EZ-SX,按照其使用说明书进行测定。具体而言,对直径34mm×高度17mm的水性凝胶使用直径为20mm的圆柱夹具,求出20%挤压时的应力。
[实施例7~11]
如表4所示,除了适当变更了PVA树脂(A)的种类、浓度,变更了4℃下的放置时间以外,以与实施例6相同的方式制备水性凝胶,求出固体成分浓度、应力。
[表4]
[实施例12~14]
如表5所示,除了适当变更了PVA树脂(A)的种类、浓度,使用了HBSS(Hank’s平衡盐溶液),变更了4℃下的放置时间以外,以与实施例6相同的方式制备细胞或组织包埋装置,求出固体成分浓度、应力。
[表5]
PVA树脂(A)浓度…装置中的PVA树脂(A)的浓度(wt%)
HBSS添加量…混合液中的Hank’s平衡盐溶液浓度(wt%)
工业实用性
根据本发明,能够在包埋的活细胞或生物组织不易受到损伤的pH、温度条件下,使用毒性低的成分简便地形成维持坚固结构的水性凝胶,因此能够提供一种对患者有用的激素或蛋白质等生理活性物质的供给能力高、且将所含的细胞或生物组织与生物体的防御功能隔离的细胞或组织包埋装置。
Claims (20)
1.一种细胞或组织包埋装置,其具有水性凝胶作为免疫隔离层,所述水性凝胶含有间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂(A)作为成分。
2.根据权利要求1所述的细胞或组织包埋装置,其特征在于,水性凝胶具有在-5℃以上的凝胶化历史。
3.根据权利要求1或2所述的细胞或组织包埋装置,其特征在于,水性凝胶具有0.3~30kPa的应力。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其中,聚乙烯醇树脂(A)的皂化度为90~99.99摩尔%,聚合度为100~10000。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其中,聚乙烯醇树脂(A)为以特戊酸乙烯酯为聚合成分的聚合物的皂化物、含有特戊酸乙烯酯单元。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其在免疫隔离层中包封有生物组合物(B)及细胞培养成分(C)。
7.根据权利要求6所述的细胞或组织包埋装置,其中,生物组合物(B)为选自由胰岛细胞、胰管细胞、肝脏细胞、神经细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、脾细胞、脂肪细胞、骨髓细胞、间充质干细胞、ES细胞及iPS细胞组成的组中的一种以上。
8.根据权利要求6所述的细胞或组织包埋装置,其中,生物组合物(B)为胰岛细胞或肝脏细胞。
9.根据权利要求6~8中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其中,细胞培养成分(C)为含有选自由Na、K、Cl、Ca及葡萄糖组成的组中的一种以上的乙酸或磷酸缓冲液。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其含有支撑基材(D)。
11.根据权利要求10所述的细胞或组织包埋装置,其中,支撑基材(D)的原料为选自由PET、PE、PP、Teflon(注册商标)及金属组成的组中的一种以上。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的细胞或组织包埋装置,其特征在于,其具有0.3~30kPa的应力。
13.一种权利要求6~12中任一项所述的细胞或组织包埋装置的制造方法,其包括以下工序:在将含有聚乙烯醇树脂(A)的水溶液与细胞培养成分(C)混合后,混合生物组合物(B)而得到混合物,使该混合物凝胶化。
14.根据权利要求13所述的细胞或组织包埋装置的制造方法,其中,将制备水性凝胶时的温度设为-5℃以上。
15.一种细胞或组织包埋装置的免疫隔离层形成剂,其含有水性凝胶,所述水性凝胶含有间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂(A)。
16.根据权利要求15所述的剂,其中,聚乙烯醇树脂(A)的皂化度为90~99.99摩尔%,聚合度为100~10000。
17.根据权利要求16所述的剂,其中,聚乙烯醇树脂(A)为以特戊酸乙烯酯为聚合成分的聚合物的皂化物、含有特戊酸乙烯酯单元。
18.一种细胞或生物组织包埋装置,其具有水性凝胶作为免疫隔离层,其特征在于:(1)含有聚乙烯醇树脂(A);(2)使包封的生物组合物(B)的分泌成分透过、且抑制免疫相关的细胞或免疫相关的物质的透过。
19.一种混合物,其含有间同立构规整度以三单元组表示为32~40%的聚乙烯醇树脂(A)、生物组合物(B)及细胞培养成分(C),其特征在于,其具有在-5℃以上进行凝胶化的性质。
20.一种针对产生生理活性物质的细胞或组织的保护凝胶层的形成方法,其中,直接对产生生理活性物质的细胞或组织、或者对用支撑材料进行了支撑的产生生理活性物质的细胞或组织适用保护凝胶层形成材料的溶液或溶胶,然后以-5℃以上的温度形成凝胶,所述保护凝胶层形成材料的溶液或溶胶含有主链不被生物体内的酶切断的凝胶形成高分子材料。
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