CN110402287A - CRISPR/Cpf1***和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于CRISPR/Cpf1核酸内切酶***的重组AsCpf1和LbCpf1核酸和多肽,和编码重组的AsCpf1或LbCpf1多肽的哺乳动物细胞系。本发明包括包含合适的AsCpf1 crRNA的重组的核糖核蛋白复合物和CRSPR/Cpf1核酸内切酶***,所述合适的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA、化学修饰的AsCpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1 crRNA。还提供使用这些***和试剂进行基因编辑的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求依据35U.S.C.119于2016年11月22号提交的题为“CPF1CRISPRSYSTEMS AND METHODS”的美国临时专利申请序列号62/425,307和于2017年4月7号提交的题为“HEK293 CELLLINE WITH STABLE EXPRESSION OF ACIDAMINOCOCCUS SP.BV3L6CPF1”的美国专利临时申请序列号62/482,896的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表,其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于_____,名为IDT01-010-US_ST25.txt,大小为_____字节。
技术领域
本发明涉及基于Cpf1的CRISPR基因、由其编码的多肽、稳定表达Cpf1的哺乳动物细胞系、crRNA和这些材料在CRISPR-Cpf1***和方法的组合中的用途。
背景技术
规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)和相关Cas蛋白(CRISPR-Cas***)在用于位点特异性DNA切割的用途在很多生物应用中已显示出巨大潜力。CRISPR用于基因组编辑;转录抑制因子(CRISPRi)和激活因子(CRISPRa)对内源基因的基因组规模特异性靶向;和采用Cas酶的RNA指导的DNA靶向的其它应用。
CRISPR-Cas***对细菌和古细菌是天然的,并且提供针对病毒和质粒的适应性免疫。三类CRISPR-Cas***可以潜在地适应于研究和治疗试剂。II型CRISPR***具有在与合适的指导RNA(gRNA)的复合物中利用单个CRISPR相关(Cas)核酸酶(特别是Cas9)的期望特征。在细菌或古细菌中,Cas9指导RNA包括2种不同的RNA种类(species)。靶特异性CRISPR激活RNA(crRNA)指导Cas9/gRNA复合物结合并靶向特定的DNA序列。crRNA具有2种功能结构域,靶特异性的5’结构域和指导crRNA与反式激活crRNA(tracrRNA)结合的3’结构域。tracrRNA是一种与crRNA结合并介导gRNA复合物和Cas9结合的较长的通用RNA。tracrRNA的结合诱导Cas9结构从失活到具有活性的构象的改变。gRNA功能也可作为人工的单个指导RNA(sgRNA)提供,其中crRNA和tracrRNA融合成单个种(species)(参见Jinek,M.等,Science 337 p816-21,2012)。sgRNA形式允许来自单个转录单位的功能性gRNA的转录,所述单个转录单位可由含有转录启动子和sgRNA序列的双链DNA(dsDNA)盒提供。在哺乳动物***中,这些RNA已经通过转染含有在体外转录后驱动RNA转录、病毒载体和单链RNA的RNAPol III启动子(例如U6或H1)的DNA盒被导入(参见Xu,T.等,Appl Environ Microbiol,2014.80(5):p.1544-52)。在细菌***中,这些RNA作为原始免疫***的部分而表达,或可以从通过转化导入的质粒人工表达(参见Fonfara,I等,Nature,2016.532(7600):p.517-21)。
在CRISPR-Cas***中,以存在于化脓性链球菌(S.py.或Spy)中的***为例,天然crRNA为约42个碱基长并且包含与靶序列互补的长度为约20个碱基的5’区域(也称为crRNA的原型间隔子序列或原型间隔子结构域)和与tracrRNA序列的区域互补并且介导crRNA和tracrRNA的结合的长度通常为约22个碱基的3’区域。crRNA:tracrRNA复合物包含能够指导互补靶DNA的Cas9切割的功能性gRNA。天然tracrRNA为约85-90个碱基长并且具有包含与crRNA互补的区域的5’区域。tracrRNA的剩余3’区域包含介导crRNA:tracrRNA复合物与Cas9的结合的二级结构基序(本文称为“tracrRNA 3’尾”)。
Jinek等广泛研究了CRISPR-Cas***正常运作所需的crRNA和tracrRNA的物理结构域(Science,2012.337(6096):p.816-21)。他们设计了仍可以以CRISPR-Cas作用的截短的crRNA:tracrRNA片段,其中crRNA是野生型的42个核苷酸而tracrRNA被截短至75个核苷酸。他们还开发一个实施方式,其中crRNA和tracrRNA与接头环连接,形成在不同的实施方式中在99-123个核苷酸之间变化的单个指导RNA(sgRNA)。
至少有三组已经阐明化脓性链球菌Cas9(SpyCas9)的晶体结构。在Jinek,M.等中,结构未显示与指导RNA或靶DNA复合的核酸酶。他们进行了分子模型实验以揭示与RNA复合的蛋白质和DNA之间的预测性相互作用(Science,2014.343,p.1215,DOI:10.1126/science/1247997)。
在Nishimasu,H.等中,与sgRNA及其靶DNA复合的Spy Cas9的晶体结构以2.5埃分辨率显示(Cell,2014.156(5):p.935-49,其全部内容通过引用并入本文)。晶体结构鉴定了Cas9酶的两叶:识别叶(REC)和核酸酶叶(NUC)。sgRNA:靶DNA异源双链(带负电)位于这两叶之间的带正电的凹槽中。REC叶没有显示出与已知蛋白质相似的结构,因此可能是与彼此互补的crRNA和tracrRNA的部分相互作用的Cas9特定的功能结构域。
另一组,Briner等(Mol Cell,2014.56(2):p.333-9,其全部内容通过引用并入本文)鉴定并表征了天然crRNA:tracrRNA双链和sgRNA内的六个保守模块。Anders等(Nature,2014,513(7519)p.569-73)阐明了通过与sgRNA指导相关联的Cas9对原型间隔子相关基序(PAM)序列的DNA序列识别的结构基础。
CRISPR-Cas核酸内切酶***在基因组工程中应用如下:gRNA复合物(crRNA:tracrRNA复合物或sgRNA)与Cas9结合,诱导激活Cas9并打开DNA结合裂隙(cleft)的构象变化,crRNA(或sgRNA)的原型间隔子结构域与互补的靶DNA对齐,Cas9与PAM序列结合,启动靶DNA的解旋,之后将原型间隔子结构域退火至靶标,然后发生靶DNA切割。Cas9包含两个结构域,分别与核酸内切酶HNH和RuvC同源,其中HNH结构域切割与crRNA互补的DNA链并且RuvC样结构域切割非互补链。这导致基因组DNA中的双链断裂。当通过非同源末端连接(NHEJ)修复时,断裂通常以不精确的方式修复,导致DNA序列移位1个或多个碱基,造成天然DNA序列的破坏,并且在很多情况下,如果该事件发生在蛋白质编码基因的编码外显子中,则导致移码突变。断裂还可通过同源定向重组(HDR)修复,其允许基于与Cas9/gRNA复合物一起导入细胞的外源DNA的新遗传物质的***,其被导入到由Cas9切割产生的切割位点内。
虽然SpyCas9是最广泛使用的蛋白,它对其有效性确实存在一些障碍。SpyCas9识别基因组中被GG二核苷酸序列紧接其后的靶序列,并且该***因此限于基因组富含GC的区域。因此富含AT的种类或基因组区域通常不能用SpyCas9***靶向。此外,Cas9***包含具有crRNA和tracrRNA部分两者含有超过100个碱基的gRNA,这一事实意味着更多的RNA必须被优化和合成用于序列特异性靶向。因此,期望更短更简单的gRNA。
已经鉴定了指定为V型的第二个2类CRISPR***。该V型CRISPR相关***含有Cpf1,其为略小于来自化脓性链球菌的Cas9的~1300个氨基酸的蛋白。来自氨基酸球菌物种BV3L6(Acidaminococcus sp.BV3L6)或毛螺菌细菌ND2006(Lachnospiraceae bacteriumND2006)的Cpf1的PAM识别序列是TTTN,与化脓性链球菌的Cas9的NGG PAM识别结构域相反(图1)。具有靶向基因组的富含AT区域的能力将极大有益于操纵和研究在缺乏GG二核苷酸基序区域中的基因靶标。Cpf1***也非常简单,因为它不使用分开的tracrRNA而只需要指定靶DNA序列和指导RNA与Cpf1核酸酶的结合两者的40-45个碱基长的单个短crRNA。
与产生平末端切割产物的Cas9相反,Cpf1有助于具有4-5个核苷酸突出端的双链断裂。其优点是它可以确保正确的方向并在非同源末端连接(NHEJ)时提供微观同源性。这在倾向于对同源定向修复(HDR)具有抗性的非***细胞类型中也是有利的。此外,当Cpf1切割时,其比Cas9更远离PAM也更远离靶位点而切割。作为结果,原型间隔子,特别是原型间隔子的种子序列,不太可能被编辑,从而如果第一次没有发生期望的修复,保留第二轮切割的可能性。
Cpf1蛋白与单链RNA寡核苷酸形成复合物以介导靶DNA切割。单链指导RNA寡核苷酸由20nt的恒定区域和21-24nt的靶区域组成,总长度为41-44nt。在各种各样的不同的细菌和古细菌来源中存在很多已知的Cpf1直系同源物,它们在活性和靶标偏好方面不同,并且可以是用于在基因组编辑应用中使用的候选者。就本发明的目的而言,我们主要研究了作为代表性实例的来自A.s.(氨基酸球菌物种BV3L6)的Cpf1和L.b.(毛螺菌细菌ND2006)的Cpf1核酸酶,两者均已被证实在哺乳动物细胞中具有作为用于基因组编辑的工具的活性。值得注意的是,PAM识别序列是TTTN。Cpf1 crRNA的结构和RNA结合在基因组DNA中的PAM位点的关系如图1中所示。
自从发现Cpf1作为在哺乳动物细胞中具有用于基因组编辑的潜在用途的另一种CRISPR途径以来,多篇出版物已经证实该***在哺乳动物中起作用,可用于胚胎工程,同时已经描述了PAM位点识别的晶体结构和机制。该***还显示出在遗传易处理(tractable)的细菌物种例如大肠杆菌中用于筛选目的的用途。因此,该***已经证明实用性,并且开发优化试剂以使用Cpf1进行基因组编辑将是有益的。
先前在SpyCas9 crRNA和tracrRNA上所做的工作表明,天然存在的crRNA和tracrRNA种类的显著缩短可以在化学合成的RNA上进行,以及这种缩短的RNA是1)质量更高,2)制造成本更低,并且3)在哺乳动物基因组编辑中相比于野生型(WT)RNA展现出更高的性能。参见Collingwood,M.A.,Jacobi,A.M.,Rettig,G.R.,Schubert,M.S.,和Behlke,M.A.,“CRISPR-BASED COMPOSITIONAND METHOD OF USE”,于2015年12月18号提交的美国专利申请序列号No.14/975,709,于2016年6月23号公开的美国专利申请公开No.US2016/0177304A1和于2017年12月12日授予的美国专利No.9840702。
现有工作表明FnCpf1 crRNA的长度从3’末端缺失将22个碱基减少至18个碱基长度支持靶DNA的切割,但17或更短的长度显示出降低的活性。在通用环结构域中破坏碱基配对的缺失或突变破坏活性。参见Zetsche,B.,Gootenberg,J.S.,Abudayyeh,O.O.,Slaymaker,I.M.,Makarova,K.S.,Essletzbichler,P.,Volz,S.E.,Joung,J.,van derOost,J.,Regev,A.,Koonin,E.V.,和Zhang,F.(2015)Cpf1is a single RNA-guidedendonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.Cell 163:1-13。然而,FnCpf1核酸酶不在哺乳动物细胞中起作用进行基因组编辑。尚不清楚如对FnCpf1 crRNA所观察的相同的长度规则是否适用于AsCpf1 crRNA。在本文中我们建立了在哺乳动物基因组编辑应用中具有完全活性的AsCpf1 crRNA的最短版本。我们还建立了当在哺乳动物或原核细胞中使用时维持或改善合成Cpf1 crRNAs的功能的化学修饰模式。
发明内容
本发明涉及基于Cpf1的CRISPR基因、由其编码的多肽、稳定表达Cpf1的哺乳动物细胞系、和化学合成的Cpf1 crRNA以及它们在CRISPR-Cpf1***和方法的组合中的用途。显示使用来自氨基酸球菌物种BV3L6和毛螺菌细菌ND2006的Cpf1***的实例,然而这并不旨在限定范围,其扩展至Cpf1同源物或从其它物种分离的直系同源物。
在第一个方面,提供分离的核酸。所述分离的核酸编码经密码子优化以在智人中表达的如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:22所示的As Cpf1多肽,其包含核定位信号以及表位标签的使用。所述分离的核酸还编码经密码子优化以在大肠杆菌中表达的AsCpf1多肽,其包含SEQ ID NO:5并且可以与一个核定位信号、多个核定位信号、或编码能够通过抗体或其它方法检测的表位标签的序列和/或使得能够简单纯化从核酸表达的重组蛋白的亲和标签(如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:19所示的His标签)融合或连接。
在第二个方面,提供编码野生型As Cpf1蛋白的分离的多肽。在第一方面,所述分离的多肽包含SEQ ID NO:2。所述蛋白可以与一个核定位信号、多个核定位信号或编码能够通过抗体或其它方法检测的表位标签的序列和/或使得能够简单纯化从核酸表达的重组蛋白的亲和标签(如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:19所示的His标签)融合或连接。
在第三个方面,提供分离的核酸。所述分离的核酸编码经密码子优化以在智人中表达的如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:17所示的Lb Cpf1多肽,其包含核定位信号以及表位标签的使用。所述分离的核酸还编码经密码子优化以在大肠杆菌中表达的Lb Cpf1多肽,其包含SEQ ID NO:6并且可以与一个核定位信号、多个核定位信号、或编码能够通过抗体或其它方法检测的表位标签的序列和/或使得能够简单纯化从核酸表达的重组蛋白的亲和标签(如SEQ ID NO:13所示的His标签)融合或连接。
在第四个方面,提供编码野生型Lb Cpf1蛋白的分离的多肽。在第一方面,所述分离的多肽包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10。所述蛋白可以与一个核定位信号、多个核定位信号、或编码能够通过抗体或其它方法检测的表位标签的序列和/或使得能够简单纯化从核酸表达的重组蛋白的亲和标签(如SEQ ID NO:14所示的His标签)融合或连接。
在第五个方面,提供编码SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:17的分离的表达载体。所述分离的表达载体包含转录起始子元件,例如启动子和增强子,其可操作地连接至SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17以允许由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16编码的多肽的表达。
在第六个方面,提供包含编码SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQID NO:17的分离的表达载体的宿主细胞。所述编码SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:17的分离的表达载体可操作地连接至合适的启动子和其它遗传元件(必要时)以允许包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的多肽的表达。
在第七个方面,提供分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***。所述***包括AsCpf1多肽和合适的AsCpf1 crRNA。
在第八个方面,提供分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***。所述***包括表达AsCpf1多肽的人细胞系和合适的AsCpf1 crRNA。
在第九个方面,提供分离的AsCpf1 crRNA。所述分离的AsCpf1crRNA在规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸内切酶***中具有活性。提供包括优化用于哺乳动物细胞中的性能的种类和优化用于细菌中的性能的种类的crRNA的不同变体。
在第十个方面,提供进行基因编辑的方法。所述方法包括使候选编辑靶位点基因座与具有野生型AsCpf1多肽和合适的AsCpf1 crRNA的活性CRISPR/Cpf1核酸内切酶***接触。
附图说明
图1是Cpf1PAM识别位点和指导crRNA与靶DNA的对齐的图示。人HPRT1基因的基因组DNA序列显示于位点‘38595’。识别As Cpf1位点的“TTTN”PAM位点为高亮,并且指导结合位点的序列以下划线表示。DNA以大写字母显示,并且RNA以小写字母显示。在Cpf1 crRNA中,原型间隔子靶特异性结构域以下划线表示并且包含3’结构域。介导与Cpf1蛋白结合的通用发夹RNA序列包含5’结构域。
图2描绘设计以表达重组、合成、密码子优化的AsCpf1的质粒载体的图谱。
图3描绘显示用于产生AsCpf1稳定细胞系的最终质粒构建体的示意图。
图4描绘显示V5标签的蛋白质的表达的示例性Western印迹。来自稳定表达带有V5标签的Cas9的单克隆HEK细胞系的细胞提取物在泳道2中运行。来自表达V5标签的AsCpf1的新的多克隆HEK细胞培养物的细胞提取物在泳道3中运行。β-肌动蛋白被指出并代表质量加样对照。泳道1中运行质量标准标志物。
图5描绘在10个克隆转基因细胞系中标准化至内部对照HPRT1mRNA的AsCpf1 mRNA的示例性表达谱。RT-qPCR测定位置沿AsCpf1 mRNA而位置不同。阴性对照非转基因HEKl细胞显示在最右侧。
图6描绘显示在10个单克隆转基因细胞系中基于V5表位的检测的AsCpf1蛋白的相对表达水平的示例性Western印迹。β-肌动蛋白加样对照见AsCpf1条带下方。
图7描绘AsCpf1 crRNA在2个序列靶位点,HPRT1-38351(图(i))和HPRT1-38595(图(ii))处的修饰耐受性图谱,其中对于24-nt原型间隔子结构域(图(i.a)和(ii.a))和21-nt原型间隔子结构域(图(i.b)和(ii.b))显示通用5’环结构域的序列(5’-3’方向)。可变的3’靶特异性原型间隔子结构域的序列表示为“N”碱基,因为该序列对于每个靶标都变化。当在单个碱基步(walk)中被修饰为2’OMe RNA残基时未经受活性的丧失的位置以大写字母指示,而修饰后显示活性的丧失的位置以小写字母指示。在小写字母残基上方所示的箭头指示当相应RNA残基变为2’OMe RNA时活性丧失的相对大小,其中大箭头代表大的活性丧失,中等大小的箭头代表中等的活性丧失,而小箭头代表小的活性丧失。
图8描绘示例性的被修饰的变体AsCpf1 crRNA,其在哺乳动物细胞的基因组编辑应用中在多个靶位点上具有活性并因此为非位点特异性。通用5’环结构域的序列被显示(5’-3’方向)并以下划线指示。可变的3’靶特异性原型间隔子结构域的序列表示为“N”碱基,序列对于每个靶标都变化。2’OMe RNA修饰以大写字母表示并且RNA残基以小写字母表示。“X”表示末端非碱基修饰物,例如C3间隔子(丙二醇)或ZEN(萘基偶氮)基团。“*”表示硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键。
图9描绘通过T7EI错配核酸内切酶测定法比较对于具有低GC含量的HPRT基因的12个区域的LbCpf1与AsCpf1和SpyCas9的靶编辑活性的示例性结果。在该研究中,使用来自Lonza的Amaxa***通过核转染将所有酶和crRNA作为RNP复合物(5μΜ)递送至HEK293细胞中,48小时后提取DNA。通过T7E1错配核酸内切酶测定法确定编辑百分比。误差条代表平均值的标准误差。值得注意的是,LbCpf1的crRNA以天然的23mer核苷酸长度以及之前优化的21个碱基的AsCpf1长度进行了测试。
发明详述
本文所描述的本发明方法和组合物提供用于CRISPR/Cpf1***的野生型AsCpf1核酸和多肽。本发明描述在HEK293中具有稳定的低水平的AsCpf1表达并且可用作研究和优化***的核酸组分的平台的HEK293细胞系。AsCpf1通过扩展PAM序列(可从富含GC的区域(Cas9)靶向至基因组中富含AT的区域(Cpf1))的范围从而扩展可使用CRISPR基因组工程方法修饰的序列范围而为SpyCas9提供有用的互补。除具有富含T的PAM位点外,AsCpf1***相比于Cas9的另一个优点是使用单个短RNA分子。然而,不同于在人类基因组的大多数位点处显示活性的Cas9,AsCpf1在一半的TTTN PAM位点上显示很少至无活性。因此,基于序列上下文富集高活性位点的合适的预测软件的可用性将增强对AsCpf1CRISPR***的全部潜力的挖掘。稳定组成型Cpf1表达细胞系的使用相比于使用天然方法例如核糖核蛋白(RNP)复合物的电穿孔使算法的开发更容易开发,减少了工作量和成本。HEK293细胞是易于培养、传代和低温保存的永生化的细胞系。我们建立了组成型表达SpyCas9和AsCpf1的克隆细胞系作为合适测试载体用于算法开发或指导RNA的化学结构的快速测试/优化。本发明描述在基因组编辑中改善功能的AsCpf1和LbCpf1 crRNA的长度优化的变体的长度和化学修饰。
AsCpf1-编码基因、多肽、表达载体和宿主细胞
术语“野生型AsCpf1蛋白”(“WT-AsCpf1”或“WT-AsCpf1蛋白”)涵盖具有与天然存在的氨基酸球菌物种BV3L6 Cpf1(例如SEQ ID NO:2)具有相同的氨基酸序列并且当与合适的crRNA组合以形成具有活性的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***时具有生物化学和生物活性的蛋白。
术语“野生型LbCpf1蛋白”(“WT-LbCpf1”或“WT-LbCpf1蛋白”)涵盖具有与天然存在的毛螺菌细菌ND2006Cpf1(例如SEQ ID NO:4)相同的氨基酸序列并且当与合适的crRNA组合以形成具有活性的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***时具有生物化学和生物活性的蛋白。
术语“野生型CRISPR/Cpf1核酸内切酶***”意指包括野生型AsCpf1蛋白和合适的AsCpf1 crRNA作为指导RNA的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***。
术语“多肽”意指包含多于一个氨基酸的任意直链或支链的肽。多肽包括蛋白质或其片段或其融合物,如果这些蛋白质、片段或融合物保留有用的生物化学或生物活性。
融合蛋白通常包含对蛋白质非天然的另外的氨基酸信息,所述蛋白质与所述另外的氨基酸信息共价连接。这些另外的氨基酸信息可以包括使得能够纯化或鉴定融合蛋白的标签。这些另外的氨基酸信息可以包括能够使融合蛋白被转运到细胞中和/或转运到特定细胞内的特定位置的肽。用于这些目的的标签的实例包括:AviTag,其是允许被酶BirA生物素化所以蛋白质可以通过链霉亲和素分离的肽(GLNDIFEAQKIEWHE);钙调蛋白标签,其是被蛋白钙调蛋白结合的肽(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL);聚谷氨酸标签,其是有效结合阴离子交换树脂例如Mono-Q的肽(EEEEEE);E标签,其是被抗体识别的肽(GAPVPYPDPLEPR);FLAG标签,其是被抗体识别的肽(DYKDDDDK);HA标签,其是被抗体识别的来自红细胞凝聚素的肽(YPYDVPDYA);His标签,其通常是5-10个组氨酸并且可以直接结合镍或钴螯合物(HHHHHH);Myc标签,其是被抗体识别的衍生自c-myc的肽(EQKLISEEDL);NE标签,其是被单克隆IgG1抗体识别的新型的18个氨基酸的合成肽(TKENPRSNQEESYDDNES),其用于广泛的应用中,包括重组蛋白的Western印迹、ELISA、流式细胞术、免疫细胞化学、免疫沉淀和亲和纯化;S标签,其是衍生自核糖核酸酶A的肽(KETAAAKFERQHMDS);SBP标签,其是结合链霉亲和素的肽;(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP);Softag1,其用于哺乳动物表达(SLAELLNAGLGGS);Softag3,其用于原核表达(TQDPSRVG);Strep标签,其是结合链霉亲和素或称为链霉素的修饰的链霉亲和素的肽(Strep标签II:WSHPQFEK);TC标签,其是被FlAsH和ReAsH双砷化合物识别的四半胱氨酸标签(CCPGCC);V5标签,其是被抗体识别的肽(GKPIPNPLLGLDST);VSV标签,其是被抗体识别的肽(YTDIEMNRLGK);Xpress标签(DLYDDDDK);Isopeptag,其是共价结合pilin-C蛋白的肽(TDKDMTITFTNKKDAE);Spy标签,其是共价结合SpyCatcher蛋白的肽(AHIVMVDAYKPTK);Snoop标签,其是共价结合SnoopCatcher蛋白的肽(KLGDIEFIKVNK);BCCP(生物素羧基载体蛋白),其是被BirA生物素化使得能够被链霉亲和素识别的蛋白结构域;谷胱甘肽S转移酶标签,其是结合固定的谷胱甘肽的蛋白质;绿色荧光蛋白标签,其是自发荧光并可以被抗体结合的蛋白质;Halo标签,其是共价附着于反应的卤代烷底物以允许附着在各种各样的底物上的突变的细菌卤代烷脱卤酶;麦芽糖结合蛋白质标签,其是结合直链淀粉琼脂糖的蛋白质;Nus标签;硫氧还蛋白标签;和Fc标签,其衍生自免疫球蛋白Fc结构域,其允许二聚化和溶解并且可以用于蛋白质-A琼脂糖上的纯化。
核定位信号(NLS),例如从SV40获得的那些,允许蛋白质在进入细胞后立即被转运至细胞核。由于天然AsCpf1蛋白来源于细菌,因此不天然包含NLS基序,预期向重组AsCpf1蛋白加入一个或多个NLS基序将显示当在其中靶基因组DNA底物存在于细胞核的真核细胞中使用时提高基因组编辑活性。在HEK293细胞中的功能测试揭示,使用二分(bipartite)NLS(核质蛋白)相比于目前的商业设计(3 SV40NLS)以及在Cpf1蛋白中显示出前景的单或双OpT NLS的使用增加了编辑。可以设想包括二分的NLS元件的其它组合。值得注意的是,核质蛋白在哺乳动物细胞中作用最好,而SV40NLS似乎在几乎所有有核细胞中起作用。二分SV40NLS在Cas9和Cpf1两者中均起作用。具有两个不同的NLS结构域可以在广泛的物种中扩展有效性。
本领域技术人员将理解这些不同的融合标签技术,以及如何制造和使用包含它们的融合蛋白。
术语“分离的核酸”包括DNA、RNA、cDNA和编码它们的载体,其中DNA、RNA、cDNA和载体不含有可衍生自其或相关的其它生物材料,例如细胞组分。通常,分离的核酸将从可能衍生自其或相关的其它生物材料中纯化,例如细胞组分。
术语“分离的野生型AsCpf1核酸”是编码野生型AsCpf1蛋白的分离的核酸。分离的野生型AsCpf1核酸实例包括SEQ ID NO:l。
术语“分离的野生型LbCpf1核酸”是编码野生型LbCpf1蛋白的分离的核酸。分离的野生型LbCpf1核酸的实例包括SEQ ID NO:3。
在第一个方面,提供分离的核酸。所述分离的核酸编码经密码子优化以在智人中表达的As Cpf1多肽。在第一方面,所述分离的核酸包括包含核定位信号以及表位标签的使用的SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:22。所述分离的核酸还编码经密码子优化以在大肠杆菌中表达的As Cpf1多肽,其包含SEQ ID NO:5并且可与一个核定位信号、多个核定位信号、或编码能够通过抗体或其它方法检测的表位标签的序列和/或使得能够简单纯化从核酸表达重组蛋白的亲和标签(如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:19所示的His标签)融合或连接。
在第二个方面,提供编码野生型As Cpf1蛋白的分离的多肽。在第一方面,所述分离的多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19。
在第三个方面,提供编码SEQ ID NO:15的分离的表达载体。所述分离的表达载体包含转录起始元件,例如启动子和增强子,其可操作地连接至SEQ ID NO:15以允许由SEQID NO:16编码的多肽表达。所述分离的表达载体可以另外包含转录终止元件、转录后加工元件(例如剪切供体和受体序列和/或多腺苷酸化信号序列)、mRNA稳定性元件和mRNA翻译增强子元件。本领域技术人员将理解并使用这些遗传元件。
在第四个方面,提供包含编码SEQ ID NO:15的分离的表达载体的宿主细胞。所述编码SEQ ID NO:15的分离的表达载体可操作地连接至合适的启动子和其它遗传元件(必要时)以允许包含SEQ ID NO:16的多肽的表达。在第一方面,所述宿主细胞包括人细胞。在第二方面,所述人细胞包括永生化的细胞系。在第三方面,所述永生化的细胞系是HEK293细胞系。作为该第三方面的进一步阐述,所述永生化的细胞系包含分离的AsCpf1 crRNA,所述分离的AsCpf1 crRNA能够与包含SEQ ID NO:2的多肽形成核糖核蛋白复合物以形成野生型CRISPR/Cpf1核酸内切酶。
长度和化学结构优化的AsCpf1 crRNA
术语“长度修饰的”,当该术语修饰RNA时,意指缺少核苷酸序列的参考RNA的缩短或截短形式或包括另外的核苷酸序列的参考RNA的延长形式。
术语“化学修饰的”,当该术语修饰RNA时,意指含有共价连接至RNA的化学修饰的核苷酸或非核苷酸化学基团的参考RNA的形式。如本文所描述的化学修饰的RNA一般意指使用寡核苷酸合成方法制备的合成RNA,其中修饰的核苷酸在RNA寡核苷酸的合成过程中被整合。然而,化学修饰的RNA还包括在合成后被合适修饰剂修饰的合成RNA寡核苷酸。
有效的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***包括由分离的AsCpf1蛋白和由分离的AsCpf1crRNA组成的指导RNA形成的核糖核蛋白(RNP)复合物。在一些实施方式中,分离的AsCpf1crRNA的长度修饰和/或化学修饰形式与纯化的AsCpf1蛋白、编码AsCpf1蛋白的分离的mRNA或在表达载体中编码AsCpf1蛋白的基因组合。在某些测定中,分离的AsCpf1 crRNA的长度修饰和/或化学修饰形式可被导入到从编码AsCpf1基因的内源表达盒稳定表达AsCpf1蛋白的细胞系。
缩短不必要的碱基但没有太短而丧失功能结果的序列的合成RNA的合成是期望的。介导crRNA与Cpf1核酸酶结合的5’恒定区域显示如果截短至低于20个残基则活性丧失。包含赋予crRNA靶序列特异性的原型间隔子指导区域的3’可变结构域天然存在长达25个碱基。该结构域可被缩短至约20-21个碱基而不丧失功能活性。因此Cpf1 crRNA的优化长度是40-41个碱基,包含20个碱基的5’恒定结构域和20-21个碱基的3’可变结构域。
本发明提供合适的指导RNA用于触发AsCpf1核酸酶的DNA核酸酶活性。涉及crRNA的长度修饰和/或化学修饰形式两者的这些优化试剂在AsCpf1的任意应用中提供改善的基因组编辑。基于CRISPR的工具的应用包括但不限于:植物基因编辑、酵母基因编辑、敲除/敲入动物系的快速产生、产生疾病状态的动物模型、校正疾病状态、***报告基因和全基因组功能筛选。“工具箱”可以通过包括切口酶版本和AsCpf1的死亡突变体作为转录激活因子(CRISPRa)和抑制因子(CRISPRi)的融合蛋白进一步扩展。
由AsCpf1进行的RNA指导的DNA切割主要利用其靶向富含AT的基因区域的能力(相比于SpyCas9对富含GC的靶向)。新发现的AsCpf1 crRNA截短和修饰变体将适于促进AsCpf1介导的交错切割并有利于基因沉默、同源定向修复或外显子切除。本发明定义具有通过CRISPR/Cpf1核酸内切酶指导基因编辑的全部效能的最短的AsCpf1指导RNA。这可用于生产合成完全地作用的最短的化合物,达到更高质量、更低成本,同时最大化功能。
不像S.py.Cas9需要2种RNA的复合物(包含杂交的crRNA:tracrRNA对)以识别和剪切靶DNA序列或长的合成单个指导sgRNA,Cpf1核酸酶只需要短的单个crRNA种类(species)以指导靶识别。该RNA包含2个结构域,通用的并介导RNA种类与Cpf1蛋白的结合的20个RNA残基的5’结构域以及靶特异性的并介导RNP复合物和精确DNA序列的结合的21-24个RNA残基的3’结构域。有功能的核酸酶复合物包含以1:1摩尔比率组合形成活性复合物的单个crRNA(长度为41-44个碱基)和分离的Cpf1蛋白。指导crRNA种类可以在哺乳动物细胞中从表达质粒或病毒载体表达。crRNA还可以作为体外转录物(IVT)制备并作为纯的酶RNA种类分离。更优选地,crRNA可以作为合成化学RNA寡核苷酸制备。化学制备使得能够使用修饰的残基,其具有很多优点,如下所述。
合成核酸被细胞的核酸酶攻击,并在哺乳动物细胞或血清中被迅速降解。化学修饰可赋予合成核酸相关的核酸酶抗性并且延长它们的半衰期,从而显著改善功能性能和效力。作为进一步的并发症(complication),合成核酸经常被哺乳动物细胞中的抗病毒监视机器识别,所述抗病毒监视机器是先天免疫***的一部分并引起可导致细胞死亡的干扰素应答途径的激活。化学修饰可减少或消除不需要的对合成RNA的免疫应答。因此建立化学修饰旨在活细胞中使用的合成RNA寡核苷酸的方法是有用的。然而,与蛋白因子具有特异性相互作用的核酸种类不能被盲目修饰,因为化学修饰将改变核酸的三级结构并可以阻断核酸和氨基酸残基之间的关键连接点。例如,2’-O-甲基RNA修饰(2’OMe)将阻断RNA的2’-氧与氨基酸残基的相互作用,这反过来可以破坏修饰的RNA和蛋白质之间的功能相互作用。同样地,硫代磷酸酯修饰可以通过在磷酸盐处对非桥接氧的取代破坏沿着核酸的磷酸骨架的蛋白质结合。
2’OMe修饰在此背景中尤其有用,因为它先前已显示增加反义寡核苷酸(ASO)和siRNA的核酸酶稳定性,并在同一种类还可以降低化学合成RNA当导入哺乳动物细胞中时将触发先天免疫应答的风险。已经建立了允许该修饰的残基整合到ASO或siRNA并保留功能的特定的修饰模式。同样地,我们近期已经开发了改善在SpyCas9***中作为指导RNA的crRNA和tracrRNA的稳定性的化学修饰模式。2’OMe修饰的残基在CRISPR指导RNA中的使用改善RNA对核酸酶的稳定性并且在富含核酸酶的环境中提高编辑的整体效率,而同时减少与免疫原性触发相关的细胞死亡和毒性(如长的、未修饰的RNA中所见)。
本发明涉及定义用于AsCpf1 crRNA的在形成能够在哺乳动物细胞的基因组编辑中使用的活性RNP复合物中保留功能的化学修饰模式。进行其中在Cpf1 crRNA的每个位置放置单个2’OMe残基的修饰‘步’(walks)。对在基因组编辑中降低或杀死RNP复合物的功能的位点进行了鉴定。定义了与高效基因组编辑兼容的化学修饰模式。还证实了2’-氟代(2’F)和锁核酸(LNA)修饰在crRNA的‘能够修饰’(‘modification competent’)位置的效用。显示了使用硫代磷酸酯核苷酸间键修饰选择的位点以降低核酸酶敏感性,以及成功使用非碱基修饰物作为末端封闭(block)以减少核酸外切酶对合成RNA的攻击。总之,这些研究提供Cpf1 crRNA中适于化学修饰的位点‘图谱’以及证明在哺乳动物细胞中的预期应用中起作用的一组修饰化学物质。
修饰模式的特定实例如以下实例所示。20个碱基的5’恒定结构域可以被极大地修饰并且保留功能。具体地,使用20个碱基的5’恒定区域并从5’末端计数,在1、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、18和19位的RNA残基可以全部被2’OMe RNA残基取代而不丧失活性。这样的取代可以为单个、多个或全部14个残基被修饰,使得该区域的14/20残基从RNA改变为2’OMe RNA。21个碱基的3’可变结构域耐受的最大修饰模式随结构域的序列而改变。在该结构域内,残基21、22、23、28、29、30、32、34、35、39、40和41(从5’恒定区域的第一个碱基开始计数)可被2’OMe残基取代而不丧失活性。
只选择在21-24个碱基的3’靶特异性结构域内的可被修饰而不损失活性的位置。基于Cpf1的晶体结构,在恒定区域以及靶区域内存在很多蛋白质接触点。对于恒定区域的修饰,在比较Cpf1晶体结构接触点和鉴定的可被修饰的功能性位置时没有出现明显的相关性,这意味着无法从晶体结构预测良好的修饰模式。同样地,需要实证检测以确定靶区域的修饰模式。基于早期的2’OMe修饰检测,使用2’OMe修饰Cpf1 crRNA内的选择的区域以尝试缩小将耐受修饰的区域。在Cpf1 crRNA内对2’OMe修饰敏感的单个残基的位置如图7所示。是Cpf1介导的基因组编辑的有效触发子的高水平修饰模式如图8所示。2’F修饰可位于耐受2’OMe修饰的任意残基。此外,3’可变结构域相比于大块的2’OMe修饰更耐受大块的2’F修饰。因此,Cpf1 crRNA的高度修饰的版本包含3’结构域中的2’OMe修饰和5’结构域中的2’F修饰。对于中度或轻度修饰模式,可以在两个结构域中使用2’OMe或2’F(或两者)修饰。而且,LNA残基可被整合到crRNA而不丧失功能,如以下实例中所定义。
作为广泛使用2’OMe或其它被修饰糖的方法的的替代,用非碱基修饰物在3’末端和5’末端阻断核酸外切酶攻击与crRNA功能兼容并改善在细胞中的功能。小C3间隔子(丙二醇)或大ZEN基团对这种方法同样有效。此外,硫代磷酸酯核苷酸间键可置于选择的位点,例如在crRNA每个末端的末端2-3个碱基之间,但crRNA的完全PS修饰或环结构域或原型间隔子结构域的完全修饰显示降低的活性。
在由AsCpf1进行的RNA指导的dsDNA切割中需要指导RNA,所述切割引发在哺乳动物细胞的大多数CRISPR应用中涉及的后续修复事件。提供修饰的合成AsCpf1 crRNA作为AsCpf1基因组编辑的指导的使用。证实了2’OMe修饰的AsCpf1 crRNA、2’F修饰的AsCpf1crRNA、LNA修饰的AsCpf1 crRNA和末端封闭的AsCpf1 crRNA在哺乳动物细胞的CRISPR/Cpf1应用中的实用性。本领域技术人员将识别和理解基于本公开的其它化学修饰是可能的。预期根据本发明教导的模式这些碱基修饰基团中的很多将同样起作用。迄今为止,与Cpf1使用用于基因组编辑的所有crRNA是未修饰的RNA。在本发明中,提供改善AsCpf1crRNA的性质并且降低毒性风险的功能修饰模式。
AsCpf1 crRNA可在细胞中从RNA转录载体制备,如体外转录物(IVT),或通过化学合成。合成RNA寡核苷酸提供独特的优势,因为只有它们允许修饰碱基在分子的特定位点的精确***。本发明提供适于化学修饰的位置图谱,所述化学修饰可以用于改善AsCpf1crRNA在细胞中的性能。对一些应用,“最小修饰”方法将是足够的。在较高的核酸酶的环境中或在具有特别高的固有免疫反应性的细胞中使用时,“高度修饰”方法可能作用更好。本发明提供用于低度、中度或高度修饰需求的方法。
基于AsCpf1的工具的应用有很多且是变化的。它们包括但不限于:细菌基因编辑、植物基因编辑、酵母基因编辑、哺乳动物基因编辑、活体动物的器官中的细胞的编辑、胚胎的编辑、敲除/敲入动物系的快速产生、产生疾病状态的动物模型、校正疾病状态、***报告基因和全基因组功能筛选。
在第五个方面,提供分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***。所述***包括AsCpf1多肽和合适的AsCpf1 crRNA。在第一方面,所述AsCpf1多肽包含SEQ ID NO:2。在第二方面,所述合适的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA或化学修饰的AsCpf1 crRNA,或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1 crRNA。
在第六个方面,提供分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***。所述***包括表达AsCpf1多肽的人细胞系和合适的AsCpf1 crRNA。在第一方面,所述AsCpf1多肽包含选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:19的至少一个成员。在第二方面,所述合适的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA或化学修饰AsCpf1 crRNA,或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1 crRNA。
在第七个方面,提供分离的AsCpf1 crRNA。所述分离的AsCpf1crRNA在规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸内切酶***中具有活性。在第一方面,所述分离的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA、化学修饰的AsCpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1 crRNA。
在第八个方面,提供进行基因编辑的方法。所述方法包括使候选编辑靶位点基因座与具有野生型AsCpf1多肽和合适的AsCpf1 crRNA的活性CRISPR/Cpf1核酸内切酶***接触。在第一方面,所述野生型AsCpf1多肽包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:19的至少一个成员。在第二方面,所述合适的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA、化学修饰的AsCpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1crRNA。
在另一个方面,提供分离的核酸,所述分离的核酸编码经密码子优化以在智人中表达的Lb Cpf1多肽。在第一方面,所述分离的核酸包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:396。
在另一个方面,提供编码野生型Lp Cpf1蛋白的分离的多肽。在第一方面,所述分离的多肽包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24。
在另一个方面,提供编码SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:396的分离的表达载体。
在另一个方面,提供包含编码SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:396的表达载体的分离的宿主细胞。所述编码SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:396的分离的表达载体可操作地连接至合适的启动子以允许分别包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24的多肽的表达。在第一方面,所述宿主细胞包括人细胞。在第二方面,所述人细胞包括永生化的细胞系。在第三方面,所述永生化的细胞系是HEK293细胞系。在对该方面的进一步阐述中,所述宿主细胞包含分离的Lb Cpf1 crRNA,所述分离的Lb Cpf1 crRNA能够与选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQID NO:20和SEQ ID NO:24的多肽形成核糖核蛋白复合物以形成野生型CRISPR/Cpf1核酸内切酶。
在另一个方面,提供含有Lb Cpf1多肽和合适的Cpf1 crRNA的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***。在第一方面,所述CRISPR/Cpf1核酸内切酶***包括SEQ ID NO:14形式的Lb Cpf1多肽。在第二方面,所述分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***包括合适的Cpf1crRNA,所述合适的Cpf1 crRNA选自长度截短的Cpf1 crRNA或化学修饰的Cpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的Cpf1 crRNA。
在另一个方面,提供包括表达Lb Cpf1多肽的人细胞系和合适的Cpf1 crRNA的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***。在第一方面,所述Lb Cpf1多肽是SEQ ID NO:14或SEQID NO:24。在第二方面,所述合适的Cpf1 crRNA选自长度截短的Cpf1 crRNA或化学修饰的Cpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的Cpf1 crRNA。
在另一个方面,提供进行基因编辑的方法。所述方法包括使候选编辑靶位点基因座与具有野生型Lb Cpf1多肽和合适的Cpf1 crRNA的活性CRISPR/Cpf1核酸内切酶***接触。在第一方面,所述方法包括选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:24的野生型Lb Cpf1多肽。在第二方面,所述合适的Cpf1 crRNA选自长度截短的Cpf1crRNA、化学修饰的Cpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的Cpf1 crRNA。
在另一个方面,提供包括重组Cpf1融合蛋白和合适crRNA的CRISPR核酸内切酶***。在第一方面,所述重组Cpf1融合蛋白是分离的纯化的蛋白。在第二方面,所述重组Cpf1融合蛋白包含N末端的NLS、C末端的NLS和位于N末端或C末端的多个亲和标签。在一个优选的实施方式中,所述重组Cpf1融合蛋白包含N末端的NLS、C末端的NLS和3个N末端的FLAG标签和C末端的6x His标签。在第三方面,以1:1的化学计量比(即,等摩尔量)提供重组Cpf1融合蛋白和合适的crRNA。
具体实施方式
实施例1
如在分离的核酸载体中编码的野生型As Cpf1多肽的DNA和氨基酸序列
下表显示作为本发明所描述的多肽融合蛋白表达的野生型(WT)As Cpf1核酸酶。本领域技术人员将理解很多不同的DNA序列可以编码/表达相同的氨基酸(AA)序列,因为在很多情况下多于一种密码子可以编码相同的氨基酸。下文显示的DNA序列仅用作实施例,并且预期编码相同的蛋白质(例如相同的氨基酸序列)的其它DNA序列。还应理解的是,附加特征、元件或标签,例如NLS结构域等,可以被加入至所述序列。实施例显示了显示作为Cpf1单独和与C末端和N末端SV40NLS结构域和HIS标签两者融合的Cpf1的那些蛋白的氨基酸和DNA序列的WT AsCpf1。
代表NLS序列、结构域接头或纯化标签的氨基酸序列以粗体表示。
SEQ ID NO:l AsCpf1天然核苷酸序列
SEQ ID NO:2AsCpf1天然蛋白质序列
SEQ ID NO:5大肠杆菌优化的AsCpf1 DNA
SEQ ID NO:8AsCpf1人类密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:11具有位于侧翼的NLS、V5标签和6x His的大肠杆菌优化的As Cpf1-DNA
SEQ ID NO:12具有位于5’和3’侧翼的NLS、5’V5标签和3’6x His的大肠杆菌优化的As Cpf1
SEQ ID NO:15具有位于侧翼的NLS、V5标签和6x His的Hs优化的As Cpf1-DNA
SEQ ID NO:16具有位于5’和3’侧翼的NLS、5’V5标签和3’6x His的Hs优化的AsCpf1-AA
SEQ ID NO:18具有OpT NLS和6x His的大肠杆菌优化的As Cpf1-DNA
SEQ ID NO:19用于在大肠杆菌和人细胞两者中基因编辑的具有OpT NLS和6x His的As Cpf1融合子的氨基酸序列
SEQ ID NO:21具有OpT NLS和6x His的Hs优化的As Cpf1-DNA
SEQ ID NO:22具有OpT NLS和6x His的Hs优化的As Cpf1-AA
实施例2
制备表达编码人类密码子优化的AsCpf1多肽融合蛋白的核酸的分离的载体和稳定表达As Cpf1多肽融合蛋白的人细胞系。
AsCpf1的参考氨基酸已经发表。参见Zetsche,B.,Gootenberg,J.S.,Abudayyeh,O.O.,Slaymaker,I.M.,Makarova,K.S.,Essletzbichler,P.,Volz,S.E.,Joung,J.,vander Oost,J.,Regev,A.,Koonin,E.V.和Zhang,F.(2015)Cpf1 is a single RNA-guidedendonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell 163:1-13。编码人类密码子优化的AsCpf1、位于侧翼的核定位信号(NLS)和5’V5表位标签的质粒是由Integrated DNATechnologies的合成生物部门产生。表达盒的侧翼是5’XhoI和3’EcoRI限制酶位点(图2)。Cpf1质粒用XhoI和EcoRI(NEB)酶切,使用基于柱的纯化***(Qiagen)进行胶纯化并使用T4DNA连接酶(NEB)连接到来自Life Technologies的预酶切的哺乳动物表达载体,pcDNA3.1中(图3)。将得到的连接构建体转化到DH5α化学感受态大肠杆菌细胞中。将得到的菌落在LB培养基中于37℃下生长过夜并使用Promega miniprep质粒DNA试剂盒进行DNA分离。采用侧翼引物(T7正向和BGH反向)与10个内部Cpf1特定引物使用具有BigDyeTerminator试剂(ABI)的自动化Sanger测序进行正确***的序列验证。本文所使用的Cpf1克隆的核酸序列显示于SEQ ID NO:15中。表达的重组蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:16中。
将AsCpf1-pcDNA3.1载体用Pvul(NEB)(位于氨苄青霉素抗性基因内)线性化,并转染到HEK293细胞中。转染使用在转染前24小时铺板于100mm培养皿的500,000个HEK293细胞。使用转染试剂TransIT-X2(Minis)将含有AsCpf1和新霉素抗性基因的线性化载体复合并转染到贴壁细胞中。转染培养基在24小时后移除并且细胞在完全培养基中培养48小时。我们使用先前优化的用于产生含有稳定整合的pcDNA3.1(-)载体新霉素抗性的稳定的转基因HEK293细胞的方法在抗生素遗传霉素(Geneticin)(G418;Gibco)(新霉素的类似物)的存在下在完全培养基中培养转染细胞以选择已经转染有AsCpf1-pcDNA3.1(-)并因此对这种抗生素具有抗性的细胞。初始G418剂量是800μg/ml,周期性更换培养基直至存活细胞开始恢复并生长超过10天时间。亲本(parent)HEK293细胞系被证实对G418最低剂量敏感。对得到的显示G418抗性的多克隆AsCpf1-pcDNA3.1(-)细胞系使用有限稀释进行分离。将细胞用胰蛋白酶消化,重新悬浮于完全培养基中,计数以确定浓度并在96孔板中稀释至理论上每孔少于一个细胞的浓度。
此时,取出细胞等分试样并用蛋白质裂解缓冲液(RIPA)裂解以通过Western印迹确定AsCpf1是否表达。使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad)对细胞蛋白质进行定量,并将15μg总蛋白质加样到SDS-PAGE无染料的4-20%梯度凝胶(Bio-Rad)上。作为阳性对照的来自先前细胞系SpyCas9-pcDNA3.1(-)的蛋白质平行进行用于比较大小和表达。凝胶在180伏特下运行45分钟并通过Bio-Rad TransBlot持续7分钟转移至PVDF膜上。印迹随后在SuperBlock T20封闭缓冲液(Thermo)中封闭,然后在室温下用1:1000稀释的V5一抗(Abeam)和1:5000的β-肌动蛋白一抗(Abeam)持续1小时。之后,印迹在含有Tween-20的tris缓冲盐水(TBST)中洗涤3次每次持续15分钟。羊抗小鼠HRP二抗以1:3000稀释并与梯度(ladder)特异性的StrepTactin二抗一同使用,并且在室温下孵育1小时。然后将印迹在TBST中洗涤3次持续15分钟。使用Pierce West-Femto ECL(Thermo)底物进行发光检测,结果如图4所示,其证实了具有预期大小的重组蛋白的表达。
细胞在含有G418的培养基的选择下持续生长,并且允许单个细胞(单克隆集落)扩增。存活的集落通过RT-qPCR、Western印迹和crRNA指导的dsDNA切割的功能测试以表征AsCpf1的存在。设计四种RT-qPCR测定法以检测在大的AsCpf1mRNA内的不同位置。序列显示在下表1中。
表1:AsCpf1中的RT-qPCR测定
DNA碱基以5’-3’方向显示。位置在本文使用的AsCpf1基因构建体中指定。FAM-6羧基荧光素、HEX=六氯荧光素、IBFQ=Iowa Black暗淬灭剂和ZEN=内部ZEN暗淬灭剂。
将对G418有抗性的单克隆细胞系铺板在6孔板上并培养24小时。用含有GITC的缓冲液裂解细胞,并且在Corbett液体处理机器人上使用Wizard 96孔RNA分离结合板(Promega)分离RNA。使用液体处理机器人(Perkin Elmer)用SuperScriptll(Invitrogen)合成互补的DNA(cDNA),并使用Immolase(Bioline)与500nmol引物和250nmol探针(IDT)一起设置qPCR测定。qPCR板在AB7900-HT上运行并使用相关软件(Applied Biosystems)进行分析。图5显示一系列克隆系的标准化为HPRT1表达的AsCpf1mRNA表达的相对水平。不出所料,不同克隆显示出AsCpf1mRNA表达的不同水平。
将总蛋白质从在培养中并行生长的相同的AsCpf1表达单克隆细胞系中分离。细胞在存在蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。通过BCA测定法(Pierce)确定每个裂解物中的蛋白质浓度。将每个样品的十五微克总蛋白质加样到SDS-PAGE无染料4-20%梯度凝胶(Bio-Rad)上并在宽范围分子量标志物(Bio-Rad)旁在lx Tris/Glycine运行缓冲液中于180V下运行45分钟。使用Bio-Rad TransBlot转移单元持续7分钟将蛋白质转移至PDVF膜。印迹在SuperBlock T20封闭缓冲液(Thermo)中封闭,然后用1:1000稀释的V5一抗(Abeam)和1:5000的β-肌动蛋白一抗的(Abeam)在室温下孵育1小时。印迹在含有Tween-20的tris缓冲盐水(TBST)中洗涤3次每次持续15分钟。羊抗小鼠HRP二抗以1:3000稀释并与梯度(ladder)特异性的StrepTactin二抗一同使用,并且在室温下孵育1小时。然后将印迹在TBST中洗涤3次持续15分钟。使用Pierce West-Femto ECL(Thermo)底物进行发光检测。图6显示在10种单克隆细胞系中检测V5-标签的AsCpf1重组蛋白的表达水平。图6中观察到的蛋白质水平与图5中所示的来自相同细胞系的相应mRNA水平之间存在良好一致性。
扩增三种单克隆AsCpf1稳定细胞系(1A1、2A2和2B1)并检测支持AsCpf1指导的基因组编辑的能力。基于先前确定的AsCpf1mRNA和蛋白质水平,1Al是“高”表达系,2A2是“中等”表达系,而2B1是“低”表达系。用靶向人HRPT1基因外显子内不同位点的6种不同的crRNA转染细胞系,如下表2中所示。所述crRNA包含在5’末端的通用的20个碱基的Cpf1结合结构域和3’末端的24个碱基的靶特异性原型间隔子结构域。
表2:靶向人HPRT1的AsCpf1 crRNA
RNA碱基以5’-3’方向显示,RNA碱基以小写字母显示。位置在人HPRT1基因内以相对于所示正义编码链的方向指定(S=正义,AS=反义)。
以反向转染形式将多种抗HPRT1 crRNA分别与Lipofectamine RNAiMAX(LifeTechnologies)混合并转染到3种HEK-Cpf1细胞系的每一个中。以96孔板形式每孔40,000个细胞进行转染。以在0.75μL脂质试剂中30nM的最终浓度导入RNA。细胞在37℃下孵育48小时。使用QuickExtract溶液(Epicentre)分离基因组DNA。用KAPA HiFi DNA聚合酶(Roche)和靶向感兴趣的HPRT区域的引物(HPRT-低正向引物:AAGAATGTTGTGATAAAAGGTGATGCT(SEQID NO:394);HPRT-低反向引物:ACACATCCATGGGACTTCTGCCTC(SEQ ID NO:395))扩增基因组DNA。将PCR产物在NEB缓冲液2(New England Biolabs)中熔解并再退火以允许形成异源双链,之后用2单位T7核酸内切酶1(T7EI;New England Biolabs)在37℃下酶切1小时。将酶切产物在片段分析仪(Advanced Analytical Technologies)上显示。靶DNA的切割百分比以切割产物的平均摩尔浓度/(切割产物的平均摩尔浓度+未切割条带的摩尔浓度)×100计算。在3种细胞系中观察到的切割效率如下表3中所示。
表3:3种HEK-Cpf1细胞系中6HPRT1 crRNA的基因靶向效率
crRNA的位置在人HPRT1基因内以相对于所示正义编码链的方向指定(S=正义,AS=反义)。切割%表明在HPRT1基因座处进行Cpf1介导基因组编辑后的细胞系相对于野生型的序列改变。
如所预期,靶向HPRT1中的不同位点的不同crRNA显示出基因编辑活性的不同水平。在细胞系1A1中,其范围从18%到73%。“高”和“中等”Cpf1表达克隆1A1和2A2显示出近乎相同的基因编辑活性,表明两种克隆都表达足够水平的Cpf1以在每个位点达到最大的基因编辑活性。克隆2B1(“低”表达克隆)显示出降低的编辑活性。克隆1Al和2A2因此都适合用于Cpf1 crRNA优化和位点筛选。
实施例3
crRNA长度优化:测试5’20个碱基的通用环结构域的截短。
选择一组在人HPRT1基因中的6个位点来研究AsCpf1 crRNA的长度优化。合成均具有3’24个碱基的靶特异性原型间隔子结构域和代表一组自5’末端起连续1个碱基缺失的具有20、19、18和17个碱基的5’环结构域的一系列crRNA。合成在相同位点均具有3’21个碱基靶特异性原型间隔子结构域和同样地具有20、19、18和17个碱基的5’环结构域的第二组crRNA。
在这些研究中使用稳定表达AsCpf1核酸内切酶的HEK细胞系(实施例2)。以反向转染形式将抗HPRT1 crRNA分别与Lipofectamine RNAiMAX(Life Technologies)混合并转染到HEK-Cpf1细胞系中。以96孔板形式每孔40,000个细胞进行转染。以在0.75μL脂质试剂中30nM的最终浓度导入RNA。细胞在37℃下孵育48小时。使用QuickExtract溶液(Epicentre)分离基因组DNA。用KAPA HiFi DNA聚合酶(Roche)和靶向感兴趣的HPRT区域的引物(HPRT-低正向引物:AAGAATGTTGTGATAAAAGGTGATGCT(SEQ ID NO:394);HPRT-低反向引物:ACACATCCATGGGACTTCTGCCTC(SEQ ID NO:395))扩增基因组DNA。将PCR产物在NEB缓冲液2(New England Biolabs)中熔解并再退火以允许形成异源双链,之后用2单位T7核酸内切酶1(T7EI;New England Biolabs)在37℃下酶切1小时。将酶切产物在片段分析仪(AdvancedAnalytical Technologies)上显示。靶DNA的切割百分比以切割产物的平均摩尔浓度/(切割产物的平均摩尔浓度+未切割条带的摩尔浓度)×100计算。结果如下表4中所示,并表明长度为20和19个碱基的5’通用环结构域作用良好,但当使用18或17个碱基环结构域时观察到活性显著丧失。无论使用24个碱基还是21个碱基的原型间隔子结构域,观察结果近乎相同。
表4.具有24或21个碱基的3’原型间隔子结构域时5’环结构域中的截短的影响
RNA碱基以小写字母显示。位置在人HPRT1基因内以相对于所示正义编码链的方向指定(S=正义,AS=反义)。序列名称包含5’通用环结构域的长度(17-20个碱基)和3’靶特异性原型间隔子结构域的长度(24或21个碱基)。
实施例4
crRNA长度优化:测试3’24个碱基靶特异性原型间隔子结构域的截短。
使用在人HPRT1基因中的6个位点的相同组研究在3’原型间隔子(靶特异性)结构域中的截短的作用。合成均具有相同的5’20个碱基通用环结构域的一系列AsCpf1 crRNA。其与具有自3’末端起的连续缺失的21、19、18或17个碱基的3’靶特异性原型间隔子结构域配对。
在这些研究中使用稳定表达AsCpf1核酸内切酶的HEK细胞系(实施例2)。以反向转染形式将抗HPRT1 AsCpf1 crRNA分别与Lipofectamine RNAiMAX(Life Technologies)混合并转染到HEK-Cpf1细胞系中。以96孔板形式每孔40,000个细胞进行转染。以在0.75μL脂质试剂中30nM的最终浓度导入RNA。细胞在37℃下孵育48小时。使用QuickExtract溶液(Epicentre)分离基因组DNA。用KAPAHiFi DNA聚合酶(Roche)和靶向感兴趣的HPRT区域的引物(HPRT-低正向引物:AAGAATGTTGTGATAAAAGGTGATGCT(SEQ ID NO:394);HPRT-低反向引物:ACACATCCATGGGACTTCTGCCTC(SEQ ID NO:395))扩增基因组DNA。将PCR产物在NEB缓冲液2(NewEngland Biolabs)中熔解并再退火以允许形成异源双链,之后用2单位T7核酸内切酶1(T7EI;New England Biolabs)在37℃下酶切1小时。将酶切产物在片段分析仪(AdvancedAnalytical Technologies)上显示。靶DNA的切割百分比以切割产物的平均摩尔浓度/(切割产物的平均摩尔浓度+未切割条带的摩尔浓度)×100计算。结果如下表5中所示,并表明长度为21个碱基的3’原型间隔子(靶特异性)结构域作用良好,但当该结构域被截短时观察到以序列/位点依赖的方式的活性丧失。一些高活性位点(例如38351)即使在截短至17个碱基时依然保持活性,然而为保留在所有位点处的功能性的最大可能性,建议具有21个碱基的原型间隔子结构域。因此,AsCpf1 crRNA的谨慎最小长度是41个碱基,包含20个碱基的5’通用环结构域和21个碱基的3’原型间隔子靶特异性结构域。
表5.具有20个碱基的5’环结构域时3’原型间隔子结构域中的截短的影响
RNA碱基以小写字母显示。位置在人HPRT1基因中以相对于所示正义编码链的方向指定(S=正义,AS=反义)。序列名称包含5’通用环结构域的长度(20个碱基)和3’原型间隔子靶特异性结构域的长度(21、19、18或17个碱基)。
实施例5
贯穿两种AsCpf1 crRNA的单碱基2’OMe修饰步(walk)。
选择人HPRT1基因中的两个位点(38351和38595)来研究在AsCpf1 crRNA内的每个可能的位置以2’OMe-RNA残基取代单RNA残基的影响。考虑到对修饰的序列特异性耐受性的可能性,有必要在两个位点处进行该筛查。在单碱基步骤中合成在每个可能位置上具有单个2’OMe残基的一系列crRNA。所述crRNA的长度为44个碱基或41个碱基。全部具有5’末端20个碱基的通用环结构域,其后是3’末端21或24个碱基的原型间隔子靶特异性结构域。
在这些研究中使用稳定表达AsCpf1核酸内切酶的HEK细胞系(HEK-Cpf1)(实施例2)。以反向转染形式将抗HPRT1 crRNA分别与Lipofectamine RNAiMAX(LifeTechnologies)混合并转染到HEK-Cpf1细胞系中。以96孔板形式每孔40,000个细胞进行转染。以在0.75μL脂质试剂中30nM的最终浓度导入RNA。细胞在37℃下孵育48小时。使用QuickExtract溶液(Epicentre)分离基因组DNA。用KAPA HiFi DNA聚合酶(Roche)和靶向感兴趣的HPRT区域的引物(HPRT-低正向引物:AAGAATGTTGTGATAAAAGGTGATGCT(SEQ ID NO:394);HPRT-低反向引物:ACACATCCATGGGACTTCTGCCTC(SEQ ID NO:395))扩增基因组DNA。将PCR产物在NEB缓冲液2(New England Biolabs)中熔解并再退火以允许形成异源双链,之后用2单位T7核酸内切酶1(T7EI;New England Biolabs)在37℃下酶切1小时。将酶切产物在片段分析仪(Advanced Analytical Technologies)上显示。靶DNA的切割百分比以切割产物的平均摩尔浓度/(切割产物的平均摩尔浓度+未切割条带的摩尔浓度)×100计算。HPRT1位点38351的结果如下表6中所示,HRPTl位点38595的结果如下表7中所示。结果表明当2’OMe修饰取代RNA残基时Cpf1切割dsDNA的活性降低或完全失去的位点的位置。无论是使用24个碱基或21个碱基的原型间隔子结构域,结果近乎相同。
将在基因组编辑测定中2’OMe RNA残基取代RNA残基表现出的活性丧失的位点对应于在5’通用环结构域或3’靶特异性原型间隔子结构域中的位置。结果如图7中总结。通用环结构域内的残基A2、A3、U4、U11、G15和U20的修饰导致活性丧失,确定研究的全部4种crRNA类别(位点38351 44mer、位点38351 41mer、位点3859544mer和位点38595 41mer)的相同位点。与此相反,修饰效应的精确模式根据原型间隔子结构域内的位点而不同,这是预料之中的,因为修饰耐受性随序列上下文而变化是常见的并且原型间隔子结构域针对每个靶位点具有不同的序列。对于所研究的序列,位置5、6、13、16和18显示出对于所有4种crRNA类别由于修饰的活性丧失,因此确定是避免2’OMe RNA化学修饰的位置。
表6:贯穿HPRT1位点38351 AsCpf1 crRNA的单碱基2’OMe修饰步
寡核苷酸序列显示为5’-3’。小写字母=RNA;下划线小写字母=2’-0-甲基RNA。每一类的相对功能活性由T7EI异源双链测定法中的切割%表示。序列名称表示crRNA是具有24个碱基靶向结构域的44mer或具有21个碱基靶向结构域的41mer。具有环结构域(L)或靶向结构域(T)的2’OMe残基的位置被标出。
表7:贯穿HPRT1位点38595AsCpf1 crRNA的单碱基2’OMe修饰步
寡核苷酸序列显示为5’-3’。小写字母=RNA;下划线小写字母=2’-0-甲基RNA。每一类的相对功能活性由T7EI异源双链测定法中的切割%表示。序列名称表示crRNA是具有24个碱基靶向结构域的44mer或具有21个碱基靶向结构域的41mer。具有环结构域(L)或靶向结构域(T)的2’OMe残基的位置被标出。
实施例6
AsCpf1 crRNA中的序列块的修饰。
选择人HPRT1基因中的三个位点(38351、38595和38104)来研究在AsCpf1 crRNA内以2’OMe-RNA、2’F RNA或LNA残基取代RNA残基块的影响。还测试了用硫代磷酸酯键(PS)以及非核苷酸末端修饰物对核苷酸间键(linkage)的修饰。所述crRNA的长度是44个碱基或41个碱基。全部具有5’末端20个碱基通用环结构域,其后为3’末端21或24个碱基的原型间隔子靶特异性结构域。
在这些研究中使用稳定表达AsCpf1核酸内切酶的HEK细胞系(HEK-Cpf1)(实施例2)。以反向转染形式将抗HPRT1 crRNA分别与Lipofectamine RNAiMAX(LifeTechnologies)混合并转染到HEK-Cpf1细胞系中。以96孔板形式每孔40,000个细胞进行转染。以在0.75μL脂质试剂中30nM的最终浓度导入RNA。细胞在37℃下孵育48小时。使用QuickExtract溶液(Epicentre)分离基因组DNA。用KAPA HiFi DNA聚合酶(Roche)和靶向感兴趣的HPRT区域的引物(HPRT-低正向引物:AAGAATGTTGTGATAAAAGGTGATGCT(SEQ ID NO:394);HPRT-低反向引物:ACACATCCATGGGACTTCTGCCTC(SEQ ID NO:395))扩增基因组DNA。将PCR产物在NEB缓冲液2(New England Biolabs)中熔解并再退火以允许形成异源双链,之后用2单位T7核酸内切酶1(T7EI;New England Biolabs)在37℃下酶切1小时。将酶切产物在片段分析仪(Advanced Analytical Technologies)上显示。靶DNA的切割百分比以切割产物的平均摩尔浓度/(切割产物的平均摩尔浓度+未切割条带的摩尔浓度)×100计算。结果如下表8中所示。
通用5-环结构域的大块可被修饰并保留活性(14/20碱基)。然而,当2-3个连续2’OMe残基取代RNA残基时,靶特异性3’原型间隔子结构域显示出显著的活性丧失,即使这些位置在单碱基步中未显示出任何活性丧失(实施例5)。通常预期原型间隔子结构域的修饰模式受序列上下文影响,使得修饰模式对一个序列而不是另一个序列作用良好。图7中显示的修饰图谱展示了范围从修饰的最低到高水平的显示出在多个位点处的高性能并且可能可以无视序列上下文而使用的修饰模式。
2’F残基可以置于耐受2’OMe修饰的任意位置。LNA残基还可以置于AsCpf1 crRNA内,并且末端修饰物的使用如下表8中所示。硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键赋予核酸酶抗性并可置于crRNA末端以阻断核酸外切酶的攻击或在中央区域以阻断核酸内切酶的攻击。用PS间键修饰crRNA的大块(例如环结构域或原型间隔子结构域的整体修饰)与crRNA功能不兼容,并且当使用该修饰模式时观察到显著的活性丧失。可以有效地采用限制性使用,例如每个末端的2-3个核苷酸间键,同时该模式可用于阻断核酸外切酶的攻击。非碱基修饰物(例如C3间隔子丙二醇基团或ZEN修饰物萘基偶氮基团)可置于crRNA的一端或两端而不丧失活性,并且阻断核酸外切酶的攻击。
表8:AsCpf1 crRNA的广泛修饰的功能影响
寡核苷酸序列显示为5’-3’。小写字母=RNA;下划线小写字母=2’-O-甲基RNA;斜体小写字母=2’-氟代RNA;+a、+c、+t、+g=LNA;C3=C3间隔子(丙二醇修饰物);*=硫代磷酸酯核苷酸间键;ZEN-萘基偶氮修饰物。每一类的相对功能活性由T7EI异源双链测定法中的切割%表示。序列名称表示crRNA是具有24个碱基靶向结构域的44mer或具有21个碱基靶向区域的41mer,并且HPRT靶位点被指出(38104、38351或38595)。
实施例7
作为RNP复合物递送的修饰的crRNA与AsCpf1蛋白的用途
选择人HPRT1基因中的位点(38104)来研究使用化学修饰的crRNA与AsCpf1蛋白在HEK-293细胞中进行基因组编辑的能力(使用电穿孔以递送核糖核蛋白(RNP)复合物到细胞中)。
在该实施例中使用采用标准技术从大肠杆菌中分离的纯化的重组AsCpf1蛋白。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:12中所示。
将AsCpf1 crRNA加热至95℃持续5分钟,然后让其冷却至室温。将crRNA与AsCpf1蛋白以1.2:1RNA:蛋白的摩尔比在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中混合(对于单次转染,在6μL体积中202皮摩尔RNA和168皮摩尔蛋白)。在室温下持续15分钟使得形成RNP复合物。胰蛋白酶消化后将HEK293细胞重悬,并且在培养基中洗涤,并且在使用前在PBS中二次洗涤。细胞以在20μL Nucleofection溶液中3.5×105个细胞的最终浓度重悬。将20μL细胞悬浮液置于V底96孔板中,并向每孔中加入5μL Cpf1 RNP复合物(最终浓度5μΜ)和向每孔中加入3μL Cpf1电穿孔增强剂溶液(Integrated DNA Technologies)。将25μL最终混合物转移至96孔Nucleocuvette电穿孔模块的每个孔中。使用Amaxa 96孔穿梭指南、程序96-DS-150电穿孔细胞。在电穿孔后,将75μL培养基加入到每个孔中,并将25μL最终细胞混合物转移至96孔孵育板上的175μL预热培养基中(最终体积200μL)。细胞在37℃下孵育48小时。使用QuickExtract溶液(Epicentre)分离基因组DNA。用KAPA HiFi DNA聚合酶(Roche)和靶向感兴趣的HPRT区域的引物(HPRT-低正向引物:AAGAATGTTGTGATAAAAGGTGATGCT(SEQ ID NO:394);HPRT-低反向引物:ACACATCCATGGGACTTCTGCCTC(SEQ ID NO:395))扩增基因组DNA。将PCR产物在NEB缓冲液2(New EnglandBiolabs)中熔解并再退火以形成异源双链,之后用2单位T7核酸内切酶1(T7EI;New England Biolabs)在37℃下酶切1小时。酶切产物在片段分析仪(Advanced Analytical Technologies)上显示。靶DNA的切割百分比以切割产物的平均摩尔浓度/(切割产物的平均摩尔浓度+未切割条带的摩尔浓度)×100计算。结果如下表9中所示。如下所示,具有低或高水平的修饰的AsCpf1 crRNA与作为RNP复合物通过电穿孔递送以介导在哺乳动物细胞中的基因组编辑兼容。
表9:使用化学修饰的crRNA与重组AsCpf1作为RNP复合物在哺乳动物细胞中的编辑
寡核苷酸序列显示为5’-3’。小写字母=RNA;下划线=2’-O-甲基RNA;C3=C3间隔子(丙二醇修饰物);*=硫代磷酸酯核苷酸间键。每一种的相对功能活性由T7EI异源双链测定法中的切割%表示。序列名称表示crRNA是所有具有24个碱基靶向结构域的44mer。
实施例8
在大肠杆菌中使用修饰的crRNA与AsCpf1表达质粒。
将人HPRT1基因中的位点(38346)克隆到大肠杆菌质粒上,并用于研究使用化学修饰的crRNA以在大肠杆菌细胞中进行位点特异性切割的能力。AsCpf1由质粒表达。使用电穿孔递送AsCpf1表达质粒和化学合成的crRNA。
在该实施例中,AsCpf1蛋白由使用噬菌体T7启动子和标准大肠杆菌翻译元件的质粒表达。表达构建体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16)中所示。
将AsCpf1 crRNA加热至95℃持续5分钟,然后让其冷却至室温。将crRNA和AsCpf1质粒在TE中混合(对于单次转化,在5μL体积中60飞摩尔AsCpf1质粒与400皮摩尔RNA),并且直接加入到20μL感受态大肠杆菌细胞中。通过生长细胞至对数中期、在冰冷的10%甘油中洗涤3次并最终悬浮于1:100th体积的10%甘油中将存活与Cpf1的成功切割相关的细菌菌株制成感受态。通过向预冷的0.1cm电穿孔比色皿中加入25μL转化混合物并且脉冲1.8kV指数衰减而进行电穿孔。电穿孔之后,向电穿孔比色皿中加入980μLSOB培养基并混合,并且将得到的细胞悬浮液转移至无菌的15ml培养管中。细胞在37℃下震荡(250rpm)孵育1.5小时,此时加入IPTG(1mM),之后进一步在37℃下震荡孵育1小时。孵育后将细胞铺板在选择性培养基上以评估存活。
该实施例证实化学修饰的合成crRNA可以与Cpf1用于细菌中的基因编辑。然而,高效只见于使用已经更广泛地用核酸外切酶阻断的PS核苷酸间键修饰的RNA。在细菌细胞中作用最好的修饰模式在哺乳动物细胞中表现不佳(表10)。
表10:在细菌中与Cpf1功能兼容的化学修饰的crRNA
寡核苷酸序列显示为5’-3’。小写字母=RNA;下划线小写字母=2’-O-甲基RNA;C3=C3间隔子(丙二醇修饰物);*=硫代磷酸酯核苷酸间键。在人细胞中的相对功能活性由T7EI异源双链测定中的切割%表示,在细菌中通过Cpf1报告菌株中的存活%表示。序列名称表示crRNA是所有具有21个碱基靶向结构域的41mer。
实施例9
如在分离的核酸载体中编码的野生型Lb Cpf1多肽的DNA和氨基酸序列
下表显示作为本发明所描述的多肽融合蛋白表达的野生型(WT)Lb Cpf1核酸酶。本领域技术人员将理解很多不同的DNA序列可以编码/表达相同的氨基酸(AA)序列,因为在很多情况下多于一种密码子可以编码相同的氨基酸。下文显示的DNA序列仅用作实施例,并且预期编码相同的蛋白质(例如相同的氨基酸序列)的其它DNA序列。还应理解的是,附加特征、元件或标签,例如NLS结构域等,可以被加入至所述序列,。
实施例显示了显示作为LbCpf1单独和与N-末端V5标签、N末端SV40 NLS结构域、C末端SV40 NLS结构域和C末端6x His标签融合的Lb Cpf1的那些蛋白的氨基酸和DNA序列的WT LbCpf1。
SEQ ID NO:3LbCpf1天然DNA序列
SEQ ID NO:4LbCpf1天然蛋白质序列
SEQ ID NO:6大肠杆菌优化的Lb Cpf1 DNA
SEQ ID NO:7大肠杆菌优化的Lb Cpf1 AA
SEQ ID NO:9Hs优化的Lb Cpf1 DNA
SEQ ID NO:10Hs优化的Lb Cpf1 AA
SEQ ID NO:13具有位于侧翼的NLS、V5标签和6x His的大肠杆菌优化的Lb Cpf1-DNA
SEQ ID NO:14用于在大肠杆菌和人细胞两者中基因编辑的具有位于5’和3’侧翼的NLS、5’V5标签和3’6x His的LbCpf1融合子的氨基酸序列
SEQ ID NO:17具有位于侧翼的NLS、V5标签和6x His的Hs优化的Lb Cpf1-DNA
SEQ ID NO:20具有OpT NLS和6x His的大肠杆菌优化的Lb Cpf1-AA
SEQ ID NO:23具有OpT NLS和6x His的大肠杆菌优化的Lb Cpf1–DNA
SEQ ID NO:396具有OpT NLS和6x His的Hs优化的Lb Cpf1–DNA
SEQ ID NO:24具有OpT NLS和6x His的Hs优化的Lb Cpf1-AA
实施例10
作为RNP复合物递送的修饰的crRNA与LbCpf1蛋白的用途
选择人HPRT1基因中的12个位点:38094-S(SEQ ID No.358)、38104-S(SEQ IDNo.361)、38115-AS(SEQ ID No.364)、38146-AS(SEQ ID No.367)、38164-AS(SEQ IDNo.370)、38164-S(SEQ ID No.372)、38186-S(SEQ ID No.376)、38228-S(SEQ ID No.379)、38330-AS(SEQ ID No.382)、38343-S(SEQ ID No.385)、38455-S(SEQ ID No.388)和38486-S(SEQ ID No.391)(其中A和AS分别代表正义和反义链)来研究LbCpf1相对于AsCpf1和SpyCas9的靶编辑活性。通过比较使用化学修饰的crRNA与LbCpf1蛋白在HEK-293细胞中进行基因组编辑的能力(使用电穿孔以递送核糖核蛋白(RNP)复合物到细胞中)进行研究。
在该实施例中使用采用标准技术从大肠杆菌中分离的纯化的重组LbCpf1蛋白。重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:14中所示。
将LbCpf1 crRNA和AsCpf1对照crRNA加热至95℃持续5分钟,然后让其冷却至室温。将crRNA与LbCpf1或AsCpf1以1:1RNA:蛋白质的摩尔比在PBS中混合(对于单次转染,在10μL体积中5μΜRNP复合物)。在室温下持续15分钟使得形成RNP复合物。胰蛋白酶消化后将HEK293细胞重悬,并且在培养基中洗涤,并且在使用前在PBS中二次洗涤。细胞以在20μLNucleofection溶液中3.5×105个细胞的最终浓度重悬。将20μL细胞悬浮液置于V底96孔板中,并向每孔中加入5μL Cpf1RNP复合物(最终浓度5μΜ)和向每孔中加入3μM Cpf1电穿孔增强剂溶液(Integrated DNA Technologies)。将25μL最终混合物转移至96孔Nucleocuvette电穿孔模块的每个孔中。使用Amaxa 96孔穿梭指南、程序96-DS-150电穿孔细胞。在电穿孔后,将75μL培养基加入到每个孔中,并将25μL最终细胞混合物转移至96孔孵育板上的175μL预热培养基中(最终体积200μL)。细胞在37℃下孵育48小时。使用QuickExtract溶液(Epicentre)分离基因组DNA。用KAPA HiFi DNA聚合酶(Roche)和靶向感兴趣的HPRT区域的引物(HPRT-低正向引物:AAGAATGTTGTGATAAAAGGTGATGCT(SEQ ID NO:394);HPRT-低反向引物:ACACATCCATGGGACTTCTGCCTC(SEQ ID NO:395))扩增基因组DNA。将PCR产物在NEB缓冲液2(New England Biolabs)中熔解并再退火以形成异源双链,之后用2单位T7核酸内切酶1(T7EI;New England Biolabs)在37℃下酶切1小时。酶切产物在片段分析仪(Advanced Analytical Technologies)上显示。靶DNA的切割百分比以切割产物的平均摩尔浓度/(切割产物的平均摩尔浓度+未切割条带的摩尔浓度)×100计算。序列如下表10中所示,并且结果在图9中以图形表示。
表10:测试的修饰的AsCpf1和LbCpf1 crRNA的序列
RNA碱基以5’-3’的方向显示,RNA碱基以小写字母显示。位置在人HPRT1基因内以相对于所示正义编码链的方向指定(S=正义,AS=反义)。C3=C3间隔子(丙二醇修饰物)。Cpf1=Cpf1 crRNA对照。21和23代表每个crRNA的3’原型间隔子的长度。
生物材料保藏信息
本文所描述的细胞系(例如1A1、2A2和2B1)保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),其位于10801University Blvd,Manassas,VA 20110,在__________并分配以下登记号Nos.:____________
本文引用的所有参考文献,包括出版物、专利申请和专利均通过引用并入本文,其程度如同每份参考文献被单独和具体地指出通过引用并入并在本文中完整地阐述。
在描述本发明的上下文中,术语“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”以及类似指示物(特别是在下文权利要求的上下文中)的使用应被解释为涵盖单数和复数两者,除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另外说明,术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。除非本文另外说明,本文对数值范围的描述仅旨在用作单独指向落入该范围内的每个单独数值的简写方法,并且将每个单独的数值并入本说明书中,如同其在本文中单独引用一样。除非本文另外指出或明显与上下文矛盾,本文所描述的所有方法可以以任意合适的顺序进行。除非另外声明,本文提供的任意及所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好的阐述本发明,而不构成对本发明的范围的限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元件对本发明的实践是必不可少的。
在本文中描述本发明的优选实施方式,包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读前文描述后,这些优选实施方式的变体对本领域技术人员可以变得显而易见。发明人预期技术人员适当地采用这些变化,并且发明人希望本发明以不同于本文所具体描述的方式实施。因此,本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同。此外,除非本文另外指出或上下文明显矛盾,本发明涵盖上述元件的所有可能变形的任意组合。
Claims (46)
1.一种分离的核酸,其中所述分离的核酸编码经密码子优化以在智人中表达的AsCpf1多肽。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸,其中所述分离的核酸包含SEQ ID NO:15。
3.一种分离的多肽,其编码野生型As Cpf1蛋白。
4.根据权利要求3所述的分离的多肽,其中所述分离的多肽包含SEQ ID NO:12。
5.一种分离的表达载体,其编码SEQ ID NO:15。
6.一种宿主细胞,其包含编码SEQ ID NO:15的分离的表达载体,其中所述编码SEQ IDNO:15的分离的表达载体可操作地连接至合适的启动子以允许包含SEQ ID NO:12的多肽的表达。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞包括人细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞,其中所述人细胞包括永生化的细胞系。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞,其中所述永生化的细胞系是HEK293细胞系。
10.根据权利要求6所述的宿主细胞系,其进一步包含分离的AsCpf1 crRNA,所述分离的AsCpf1 crRNA能够与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:19的多肽形成核糖核蛋白复合物以形成野生型CRISPR/Cpf1核酸内切酶。
11.一种分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其包括:
AsCpf1多肽,和
合适的AsCpf1 crRNA。
12.根据权利要求11所述的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其中所述AsCpf1多肽包含SEQ ID NO:12。
13.根据权利要求11所述的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其中所述合适的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA或化学修饰的AsCpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1 crRNA。
14.一种分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其包括:
表达AsCpf1多肽的人细胞系和合适的AsCpf1 crRNA。
15.根据权利要求14所述的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其中所述AsCpf1多肽包含SEQ ID NO:12。
16.根据权利要求14所述的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其中所述合适的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA或化学修饰的AsCpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1 crRNA。
17.一种分离的AsCpf1 crRNA,其中所述分离的AsCpf1 crRNA在规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸内切酶***中具有活性。
18.根据权利要求17所述的分离的AsCpf1 crRNA,其中所述分离的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA、化学修饰的AsCpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1 crRNA。
19.根据权利要求17所述的分离的AsCpf1 crRNA,其中所述分离的AsCpf1 crRNA是包含长度为19至20个核苷酸的5’通用环结构域和长度为19至21个核苷酸的3’靶特异性原型间隔子结构域的长度截短的AsCpf1 crRNA。
20.根据权利要求17所述的分离的AsCpf1 crRNA,其中所述分离的AsCpf1 crRNA包含长度截短和化学修饰两者。
21.根据权利要求20所述的分离的AsCpf1 crRNA,其中所述化学修饰选自端基修饰(例如C3间隔子)、2’OMe修饰、2’-氟代修饰和LNA修饰。
22.一种进行基因编辑的方法,其包括:
使候选编辑靶位点基因座与具有野生型AsCpf1多肽和合适的AsCpf1 crRNA的活性CRISPR/Cpf1核酸内切酶***接触。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述野生型AsCpf1多肽选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:19。
24.根据权利要求22所述的方法,其中所述合适的AsCpf1 crRNA选自长度截短的AsCpf1 crRNA、化学修饰的AsCpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的AsCpf1crRNA。
25.一种分离的核酸,其中所述分离的核酸编码经密码子优化以在智人中表达的LbCpf1多肽。
26.根据权利要求25所述的分离的核酸,其中所述分离的核酸包含SEQ ID NO:17或SEQID NO:396。
27.一种分离的多肽,其编码野生型Lp Cpf1蛋白。
28.根据权利要求27所述的分离的多肽,其中所述分离的多肽包含SEQ ID NO:14或SEQID NO:24。
29.一种分离的表达载体,其编码SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:396。
30.一种宿主细胞,其包含编码SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:396的分离的表达载体,其中所述编码SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:396的分离的表达载体可操作地连接至合适的启动子以允许分别包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24的多肽的表达。
31.根据权利要求30所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞包括人细胞。
32.根据权利要求31所述的宿主细胞,其中所述人细胞包括永生化的细胞系。
33.根据权利要求32所述的宿主细胞,其中所述永生化的细胞系是HEK293细胞系。
34.根据权利要求30所述的宿主细胞系,其进一步包含分离的Lb Cpf1 crRNA,所述分离的Lb Cpf1 crRNA能够与选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24的多肽形成核糖核蛋白复合物以形成野生型CRISPR/Cpf1核酸内切酶。
35.一种分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其包括:
Lb Cpf1多肽,和
合适的Cpf1 crRNA。
36.根据权利要求35所述的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其中所述Lb Cpf1多肽包含SEQ ID NO:14。
37.根据权利要求35所述的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其中所述合适的Cpf1crRNA选自长度截短的Cpf1 crRNA或化学修饰的Cpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的Cpf1 crRNA。
38.一种分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其包括:
表达Lb Cpf1多肽的人细胞系和合适的Cpf1 crRNA。
39.根据权利要求38所述的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其中所述Lb Cpf1多肽包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24。
40.根据权利要求38所述的分离的CRISPR/Cpf1核酸内切酶***,其中所述合适的Cpf1crRNA选自长度截短的Cpf1 crRNA或化学修饰的Cpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的Cpf1 crRNA。
41.一种进行基因编辑的方法,其包括:
使候选编辑靶位点基因座与具有野生型Lb Cpf1多肽和合适的Cpf1 crRNA的活性CRISPR/Cpf1核酸内切酶***接触。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述野生型Lb Cpf1多肽选自SEQ ID NO:4、SEQID NO:14、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24。
43.根据权利要求41所述的方法,其中所述合适的Cpf1 crRNA选自长度截短的Cpf1crRNA、化学修饰的Cpf1 crRNA或包含长度截短和化学修饰两者的Cpf1 crRNA。
44.根据权利要求41所述的方法,其中所述合适的Cpf1 crRNA是包含长度为19至20个核苷酸的5’通用环结构域和长度为19至21个核苷酸的3’-靶特异性原型间隔子结构域的长度截短的Cpf1crRNA。
45.根据权利要求41所述的方法,其中所述合适的Cpf1 crRNA包含长度截短和化学修饰两者。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述化学修饰选自端基修饰(例如C3间隔子)、2’OMe修饰、2’-氟代修饰和LNA修饰。
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