JP2018513681A - 細胞または生物のゲノムへのDNA配列の標的化組み込みのためのCas9レトロウイルスインテグラーゼおよびCas9レコンビナーゼ系 - Google Patents
細胞または生物のゲノムへのDNA配列の標的化組み込みのためのCas9レトロウイルスインテグラーゼおよびCas9レコンビナーゼ系 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、全ての目的のためにそれぞれの内容全体が参照により組み込まれる、2015年3月31日提出の米国仮特許出願第62,140,454号明細書、2015年8月27日提出の米国仮特許出願第62,210,451号明細書および2015年10月12日提出の米国仮特許出願第62,240,359号明細書の利益を主張する。
本明細書中で記載される場合、内因性核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主生物との関連において定められる。内因性核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主生物において天然に生じるものである。
本明細書中で記載される場合、外来性核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主生物との関連において定められる。外来性核酸、ヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主生物において天然に生じないか、または宿主生物において異なる位置にあるものである。
(例えば、ランダム挿入または相同組み換えによって)外来性核酸が宿主生物中に形質転換され、その結果、(例えば、欠失、挿入によって)遺伝子が破壊される場合、遺伝子がノックアウトされたとみなされる。
修飾された生物は、非修飾生物と異なる生物である。例えば、修飾された生物は、標的遺伝子配列のノックアウトを引き起こす本開示の融合タンパク質を含み得る。修飾された生物は、修飾されたゲノムを有し得る。
いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモーターおよび/または転写終結因子などの1つ以上の調節エレメントに操作可能に連結されるポリヌクレオチドを含む。核酸配列が別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、核酸配列は操作可能に連結されている。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、プレ配列または分泌リーダーに対するDNAがポリペプチドに対するDNAに操作可能に連結され、配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に操作可能に連結され、または翻訳を促進するように置かれる場合、リボソーム結合部位が操作可能にコード配列に連結される。操作可能に連結される配列は近接し得、分泌リーダーの場合、近接し得、リーディングフェーズ(reading phase)にある。
宿主細胞は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は多細胞生物の一部である。他の実施形態において、宿主細胞は単細胞生物として培養される。
本開示のタンパク質は当技術分野で公知の何らかの方法により作製され得る。固相ペプチド合成を使用するか、または液相ペプチド合成としても知られる古典的な溶液ペプチド合成によるかの何れかでタンパク質を合成し得る。Val−Pro−Pro、出発鋳型としてエナラプリルおよびリシノプリルを使用し、固相または液相ペプチド合成を使用して、いくつかの一連のペプチド類似体、例えばX−Pro−Pro、X−Ala−ProおよびX−Lys−Proなど(式中、Xは何らかのアミノ酸残基に相当する)を合成し得る。可溶性のオリゴマー支持体にカップリングされたペプチドおよびオリゴヌクレオチドのライブラリの液相合成を行うための方法は既に記載されている。Bayer,Ernst and Mutter,Manfred,Nature 237:512−513(1972);Bayer,Ernst,et al.,J.Am.Chem.Soc.96:7333−7336(1974);Bonora,Gian Maria,et al.,Nucleic Acids Res.18:3155−3159(1990)。液相合成法は、固相への反応物質の連結に適切な第1の反応物質上に存在する構造を必要としないという点で固相合成法を上回る長所がある。また、液相合成法は、固相と第1の反応物質(または中間体産物)との間の結合を切断し得る化学的条件を回避する必要がない。さらに、均一溶液中での反応は、固相合成中に存在するものなど、不均一な固相/液相系で得られるものよりも良好な収率および完全な反応を与え得る。
コードポリヌクレオチドの1つ以上のコドンは、宿主生物のコドン使用を反映させるために「偏向」または「最適化」され得る。例えば、コードポリヌクレオチドの1つ以上のコドンは、葉緑体コドン使用または核コドン使用を反映させるために「偏向」または「最適化」され得る。殆どのアミノ酸は、2つ以上の異なる(縮重)コドンによりコードされ、様々な生物が他よりも優先して一定のコドンを利用することはよく認識されている。「偏向」または「最適化」コドンは、本願全体を通して交換可能に使用され得る。コドン偏向は、タバコと比較した場合、例えば藻類を含め、様々な植物において様々に歪められ得る。一般に、選択されるコドン偏向は、本開示の核酸で形質転換されている植物(またはその中の小器官)のコドン使用を反映する。
核酸またはポリペプチド配列間でパーセント配列同一性または配列類似性を決定するための適切であるアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムであり、これは、例えば、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403−410(1990)に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公開されている。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、初期設定として、ワード長(W)11、期待値(E)10、カットオフ100、M=5、N=4および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、初期設定として、ワード長(W)3、期待値(E)10およびBLOSUM62スコアリングマトリクス(例えば、Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915に記載のとおり)を使用する。パーセント配列同一性を計算することに加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計学的分析も行い得る(例えば、Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,90:5873−5787(1993)に記載のとおり)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性のある目安は、最小和確率(smallest sum probability)(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約0.1未満、約0.01未満、および約0.001未満である場合、参照配列と同様とみなされる。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本開示において交換可能に使用される。これらは、あらゆる長さのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの何れかのヌクレオチドのポリマー形態またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、何らかの三次元構造を有し得、既知または未知の何らかの機能を発揮し得る。以下のものはポリヌクレオチドの非限定例である:遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定められる遺伝子座(複数の遺伝子座)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、短い干渉RNA(siRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、ミクロRNA(miRNA)、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何らかの配列の単離DNA、何らかの配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などを含み得る。存在する場合、ポリマーのアセンブリ前または後にヌクレオチド構造に対する修飾が与えられ得る。ヌクレオチドの配列には非ヌクレオチド構成要素が割り込み得る。ポリヌクレオチドは、標識化構成成分との抱合反応などによってポリマー化後にさらに修飾され得る。
本開示の態様において、「キメラRNA」、「キメラガイドRNA」、「ガイドRNA」、「単ガイドRNA」および「合成ガイドRNA」という用語は、交換可能に使用され、ガイド配列、tracr配列およびtracrメート(tracr mate)配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「ガイド配列」という用語は、標的部位を規定するガイドRNA内の約20bp(12〜30bp)配列を指し、「ガイド」または「スペーサー」という用語と交換可能に使用され得る。「tracrメート配列」という用語は、「ダイレクトリピート」という用語とも交換可能に使用され得る。
本明細書中で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者により理解される当技術分野の用語であり、突然変異体または変異体形態と区別される場合、天然で生じるような生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
本明細書中で使用される場合、「変異体」または「突然変異体」という用語は、天然に生じるものから逸脱するパターンを有する質の提示を意味するものと解釈すべきである。遺伝子と関連して、これらの用語は、とりわけ、一塩基多型(SNP)、挿入、欠失、遺伝子シフトを含め、それを野生型遺伝子と異なるものとする遺伝子における多くの変化を示す。
「非天然」または「改変」という用語は、交換可能に使用され、人為的な技術の関与を指す。これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、核酸分子またはポリペプチドが、それらが自然界で天然に結び付き、かつ天然で見られるような少なくとも1つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
「相補性」とは、古典的なワトソン−クリックまたは他の非古典的タイプの何れかにより、核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第2の核酸配列と水素結合を形成し得る(例えば、ワトソン−クリック塩基対)核酸分子中の残基のパーセンテージを指す(例えば、10個のうちの5、6、7、8、9、10個は、50%、60%、70%、80%、90%および100%相補的である)。「完全に相補性」とは、核酸配列の全ての近接残基が第2の核酸配列中の同じ数の近接残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補性」とは、本明細書中で使用される場合、少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは100%または8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50またはそれを超えるヌクレオチドの領域にわたる間のパーセンテージである相補性の度合いを指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する2個の核酸を指す。
正式名称、3文字コード、1文字コード
アスパラギン酸 Asp D
グルタミン酸 Glu E
リジン Lys K
アルギニン Arg R
ヒスチジン His H
チロシン Tyr Y
システイン Cys C
アスパラギン Asn N
グルタミン Gln Q
セリン Ser S
スレオニン Thr T
グリシン Gly G
アラニン Ala A
バリン Val V
ロイシン Leu L
イソロイシン Ile I
メチオニン Met M
プロリン Pro P
フェニルアラニン Phe F
トリプトファン Trp W
I.小さい脂肪族、非極性または僅かに極性のある残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性、負荷電残基およびそれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gin;
III.極性、正荷電残基:
His、Arg、Lys;
IV.大きい脂肪族、非極性残基:
Met、Leu、He、Val、Cys(Ile;オートコレクトはリテレート(literate)ではない)
V.大きい芳香族残基:
Phe、Tyr、Tip(同様にTrp)
細胞または組織において融合インテグラーゼを発現させ、かつ関心のあるDNA(または遺伝子)を宿主種または細胞のゲノムに組み込むためのインテグラーゼまたはレコンビナーゼに必要とされる適切な部位がある関心のあるDNA配列(または遺伝子)を提供するために遺伝子発現ベクター(DNAに基づくかまたはウイルス性)を使用する。多くの遺伝子発現ベクターが当技術分野で公知である。ベクターは、関心のある遺伝子(または関心のあるDNA配列)に対する使用である。当技術分野で公知の多くの制限酵素を用いてベクターを切断し得る。
CRISPR/Cas9は、米国特許第8697359号明細書、同第8889356号明細書およびRan et al(Nature Protocols,2013,volume 8,pages 2281−2308)に記載されている。Cas9タンパク質は、ゲノム中のDNAの特異的な配列に結合するためにRNAガイドを利用する。RNAガイド(ガイドRNA)は、10〜40、12〜35、15〜30または例えば18〜22または20ヌクレオチド長になるように設計され得る。ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)からのCas9を使用する、Hsu et al,Nature Biotechnology,September 2013,volume 31,pages 827−832を参照されたい。別の重要なCas9は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus Aureus)由来(S.ピオゲネス(S pyogenes)よりも小さいCas9)である。Cas9タンパク質は、DNA配列の特異的領域に結合するためにガイドRNAを利用する。
Cpf1は、ゲノムDNA中の特異的な配列に結合するためにガイドRNAを使用する別のタンパク質である。Cpf1はまた、DNAを切断し、ねじれ型の切断にする。Cpf1は、切断能について触媒的に不活性にされ得る。
これらは、特異的なDNA配列を標的とするために、かつそれらがDNA切断能を有するか否かにかかわらずガイドRNAを利用するタンパク質である。これらのタンパク質の一部は他の酵素/触媒機能を天然に有し得る。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合させることによって作製される制限酵素との融合タンパク質である。これらの試薬は、効率的でプログラム可能であり、特異的なDNA切断を可能にし、インサイチューでのゲノム編集のための強力なツールとなる。実際に何らかのDNA配列に結合するように転写活性化因子様エフェクター(TALE)を迅速に改変し得る。TALENという用語は、本明細書中で使用される場合、別のTALENからの支援なく2本鎖DNAを切断し得る単量体のTALENを広く含む。TALENという用語は、一緒に作用して同じ部位でDNAを切断するために改変されるTALENのペアの一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に作用するTALENは、左−TALENおよび右−TALENと呼ばれ得、これはDNAの硬さに言及する。米国特許第8,440,432号明細書を参照されたい。
DNA結合のためのジンクフィンガータンパク質およびそれらの設計は、米国特許第7928195号明細書、米国特許出願公開第2009/0111188号明細書および米国特許第7951925号明細書に記載されている。ジンクフィンガータンパク質は、DNAの特異的配列に結合するために、指定の順序でいくつかの連結されるジンクフィンガードメインを利用する。ジンクフィンガータンパク質エンドヌクレアーゼはよく確立されている。
本タンパク質は、様々な生物のゲノムDNA中の特異的な配列に結合し得る、ジンクフィンガータンパク質、TALENおよびCRISPRタンパク質と無関係なものを含む。これらは、転写因子、転写リプレッサー、メガヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼDNA結合ドメインなどを含み得る。
インテグラーゼおよびそのエンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、米国特許出願公開第2009/0011509号明細書に記載されている。導入されるインテグラーゼは、レンチウイルスインテグラーゼおよびHIV1(ヒト免疫不全ウイルス1)インテグラーゼである。本開示は、使用者により選択されるゲノム中のDNAの特異的な領域にインテグラーゼを標的化するため、触媒能のない(または触媒活性のある)Cas9、TALEまたはジンクフィンガータンパク質をインテグラーゼに融合させる。
Cre、Flp、R、Dre、KwおよびGinレコンビナーゼを含むレコンビナーゼは、米国特許第8816153号明細書および米国特許出願公開第2004/0003420号明細書に記載される。Creレコンビナーゼなどのレコンビナーゼは、ゲノムから配列を切り出すためにLoxP部位を使用する。レコンビナーゼは、それらの組み換え活性に対して構成的に活性となるように、およびまた部位特異性が低くなるようにも修飾され得る。したがって、本開示の融合タンパク質にそれらを組み込むことにより、ゲノム中のDNAの特異的配列に対する配列特異性がないこのような構成的に活性のあるレコンビナーゼタンパク質を標的とすることが可能である。このように、CRISPR/Cas9、TALEまたはジンクフィンガータンパク質ドメインは、レコンビナーゼがその組み換え活性に寄与するDNA配列を指定する。このようなレコンビナーゼタンパク質は、野生型であるか、構成的に活性であるか、またはレコンビナーゼ活性について不活性であり得る。Cas9−GinまたはCas9−CreなどのCas9−レコンビナーゼは、リンカー配列の使用または直接的な融合により作製され得る。
(「NLS」とも呼ばれる)シグナルペプチドドメインは、例えば、酵母GAL4、SKI3、L29またはヒストンH2Bタンパク質、ポリオーマウイルスラージTタンパク質、VP1またはVP2カプシドタンパク質、SV40 VP1またはVP2カプシドタンパク質、アデノウイルスE1aまたはDBPタンパク質、インフルエンザウイルスNS1タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原または哺乳動物ラミン、c−myc、max、c−myb、p53、c−erbA、jun、Tax、ステロイド受容体またはMxタンパク質(Boulikas,Crit.Rev.Eucar.Gene Expression,3,193−227(1993)を参照されたい)、サルウイルス40(「SV40」)T−抗原(Kalderon et al,Cell,39,499−509(1984))または既知の核局在化がある他のタンパク質由来である。NLSは、例えば、SV40T−抗原由来であるが、当技術分野で公知の他のNLS配列であり得る。タンデムNLS配列が使用され得る。
合成される融合タンパク質/ペプチド間で使用される様々なリンカーはアミノ酸から構成される。DNAレベルにおいて、これらは、遺伝暗号において知られるように3塩基対(bp)コドンにより表される。リンカーは、1〜1000アミノ酸長およびこの間の何れかの整数であり得る。例えば、リンカーは、1〜200アミノ酸長であるか、またはリンカーは1〜20アミノ酸長である。
遺伝子の発現をもたらすために多くの核酸が細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、核酸という用語は、DNA、RNAおよび核酸類似体および2本鎖もしくは1本鎖(すなわちセンスまたはアンチセンス1本鎖)である核酸を含む。例えば、核酸の安定性、ハイブリッド形成または溶解度を改善するために塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で核酸類似体を修飾し得る。塩基部分での修飾には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジンおよびデオキシシチジンに対する5−メチル−2’デオキシシチジンおよび5−ブロモ−2’−ドキシシチジン(doxycytidine)を含む。糖部分の修飾は、2’−O−メチルまたは2’−O−アリル糖を形成させるためのリボース糖の2’ヒドロキシルの修飾を含む。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が6員のモルホリノ環に連結されるモルホリノ核酸またはデオキシリン酸骨格が擬ペプチド骨格により置換され、4個の塩基が保持されるペプチド核酸を生成させるために修飾し得る。Summerton and Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3):187;およびHyrup et al.(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、例えばホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステル骨格と置換され得る。核酸配列は、プロモーターなどの制御領域に操作可能に連結され得る。制御領域はあらゆる種由来であり得る。本明細書中で使用される場合、操作可能に連結されるとは、標的核酸の転写を可能にするかまたは促進するような核酸配列に対する制御領域の配置を指す。あらゆるタイプのプロモーターが核酸配列に操作可能に連結され得る。プロモーターの例としては、組織特異的なプロモーター、構成的プロモーターおよび特定の刺激に対して応答性または非応答性であるプロモーター(例えば、誘導性プロモーター)が挙げられるが限定されない。
1)ガイドRNAとともにABBIE1タンパク質を温置し;
2)前開始複合体を形成させるために部分的LTRを有するドナーDNAとともにABBIE1/ガイドRNAを温置し;
3)編集される遺伝子(例えば、CXCR4)を含有するプラスミドとともに前開始複合体を温置し;および
4)ドナーDNA組み込みに対するPCRおよびDNA配列決定を確認する。
12、15、18、21、24、27または30bpスペーサー(Cas9とインテグラーゼとの間のリンカーとしての4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸をコードする)およびHIV1インテグラーゼを用いて、触媒能のないCas9のDNA配列を発現ベクターに組み込む。他の実験において、インテグラーゼではなく、細菌またはファージ起源のレコンビナーゼを使用する。これらには、何れかの他の部位でDNA組み換えを可能にする突然変異があるかまたはないHinレコンビナーゼ(配列番号25)およびCreレコンビナーゼ(配列番号26)が含まれる。融合タンパク質を単離するためにHisまたはcMycタグ(またはタンパク質精製に有用な他の配列)が含まれ得る。発現ベクターは、ベクターとともに提供される細胞中で活性化されるプロモーターを使用する。CMV(サイトメガロウイルスプロモーター)は哺乳動物細胞用の発現ベクターに対して一般的に使用される。U6プロモーターも一般的に使用される。T7プロモーターは、一定の実施形態においてインビトロ転写のために使用され得る。
関心のあるDNA配列を適切な発現ベクターに挿入し、関心のあるDNA配列に部位が適切に付加され、HIV1インテグラーゼがゲノムへの組み込みのための配列を認識する。これらの部位はatt部位(U5およびU3 att部位)と呼ばれる(Masuda et al,Journal of Virology,1998,volume72,pages 8396−8402を参照されたい)。ゲノム中の標的部位に対する相同アームは、関心のあるDNA(遺伝子)配列の5’および3’末端に隣接する領域に含まれ得る(Ishii et al,PLOS ONE,September 24,2014,DOI:10.1371/journal.pone.0108236を参照されたい)。レコンビナーゼを使用する場合、インテグラーゼ認識部位は含まれなくてもよい。関心のあるDNA配列の挿入について調べ、かつゲノム中でのランダム挿入についてのアッセイを補助するために薬物耐性マーカー(例えば、ブラストサイジンまたはピューロマイシン)などのマーカーが含まれる。これらの耐性マーカーは、標的化ゲノム着地パッド(landing pad)からそれらを取り出すように改変され得る。例えば、LoxP部位を有するピューロマイシン耐性遺伝子に隣接することおよび外因的に発現されるCREの導入により、LoxP部位を含有する瘢痕を残す内部配列が除去される。
逆転写酵素はまた、ベクター中の関心のある設計されたDNA配列(遺伝子)がRNAとして発現され、インテグラーゼ酵素による組み込みのためにDNAに戻されなければならないような系で同時発現され得る。逆転写酵素はウイルス起源(例えば、HIV1などのレトロウイルス)であり得る。これは関心のあるDNA配列と同じベクター内に組み込まれ得る。
ゲノム中の標的部位に対して必要とされるCas9 RNAガイドと一緒に、上記のベクターに対して細胞にエレクトロポレーションを行った。一部の実験において、構成要素の全て(融合Cas9/インテグラーゼ(またはレコンビナーゼ)、Cas9 RNAガイドおよびインテグラーゼ認識部位があり、相同アームがあるかまたはない関心のあるDNA配列)を発現するベクターを作製した。ベクター中の関心のある設計されるDNA配列(遺伝子)がRNAとして発現されるようになり、インテグラーゼ酵素による組み込みのためにDNAに戻されなければならないような系において、逆転写酵素も同時発現させ得る。逆転写酵素はウイルス起源(例えば、HIV1などのレトロウイルス)であり得る。他の実験において、細胞への導入前に関心のあるDNA配列を直線化する。標準的な分子生物学プロトコールによる使用前に、Cas9 RNAガイド配列および関心のあるDNA配列を設計し、ベクターに挿入しなければならない。
関心のある遺伝子が含まれる上記ベクターを用いて、特定の遺伝子の発現が失われている細胞、例えば一定の遺伝子に対してノックアウトが起こるように遺伝子操作されているノックアウトマウスモデルまたは細胞からのマウス胚線維芽細胞などに対して形質移入またはエレクトロポレーションを行う。挿入される遺伝子および隣接ゲノム配列を包含するように設計されたキメラプライマーセットを使用して、編集された細胞の最初のプールをスクリーニングする。次に、単一クローン性を確実にするために限界希釈クローニング(LDC)およびまたはFACS分析を行う。単離クローンが設計される編集に対して均一であることを確実にするため、最終的な品質管理段階として次世代配列決定(NGS)または一塩基多型(SNP)分析を行う。スクリーニングのための他の機序としては、qRT−PCRおよび適切な抗体を用いたウエスタンブロッティングが挙げられ得るが限定されない。タンパク質が細胞のある種の表現型に付随している場合、その表現型のレスキューについて細胞を調べ得る。DNA挿入の特異性について、および存在する場合にはオフターゲット挿入の相対数を見出すためにその細胞のゲノムをアッセイする。
大腸菌(E coli)または昆虫細胞での遺伝子発現のために設計されたベクターを大腸菌(E coli)または昆虫細胞に組み込み、所与の時間にわたり発現させる。Cas9(または不活性Cas9)連結型インテグラーゼタンパク質を作製するためにいくつかの設計を利用する。本ベクターはまた、高純度および高収率でのタンパク質の最終的な単離のためのHisまたはcMycタグに限定されないタグも組み込む。キメラタンパク質の調製には、標準的なクロマトグラフィー技術が含まれるが限定されない。タンパク質は、1つ以上のNLS(核局在化シグナル配列)および/またはTAT配列を用いても設計され得る。核局在化シグナルにより、タンパク質が核に移行できるようになる。TAT配列により、タンパク質がより容易に細胞に移行できるようになる(これは、細胞透過性ペプチドである)。当技術分野での他の細胞透過性ペプチドも考慮され得る。発現のための十分な時間の経過後、タンパク質溶解液を細胞から回収し、使用したタグに依存して、適切なカラムにおいて精製する。次に、精製タンパク質を適切な緩衝溶液に入れ、−20または−80℃の何れかで保存する。
本開示は、ノックアウト細胞株または生物を作製するための方法を含む。1、3、6、10、15または20個の連続停止コドンが標的遺伝子のためのATG開始部位の直後に置かれる関心のあるDNA配列とともに、上記の系を使用する。ATG開始部位の直後の停止コドンに到達したときに転写/翻訳が停止されるため、これにより有効な遺伝子ノックアウトが作製される。さらなる停止コドンは、トランスクリプターゼの可能性のある通り抜け(トランスクリプターゼが最初の停止コドンを迂回する場合)を防ぐことを促進する。
適切な緩衝液中でウイルスLTR領域を有する挿入可能/組み込み可能なDNAとともに、Abbie1単離タンパク質(レトロウイルスインテグラーゼに連結される他の特異的なDNA配列結合タンパク質)を温置する(その場合に依存する四量体または他の多量体の形成のため)。あるいは、ガイドRNAを伴う単離Abbie1タンパク質の予め作製された組成物を挿入可能なDNA配列と組み合わせ得る。ガイドRNAを含み、ガイドRNAを組み込むために温置する。Abbie1/DNA標品を細胞に形質移入またはエレクトロポレーション(または細胞にタンパク質を提供する他の技術)する。ゲノム/DNA編集が行われる時間を考慮に入れる。細胞のゲノムDNAの特異的部位への、設計された挿入可能なDNA配列の挿入について調べる。PCRおよびDNA配列決定により、非特異的な挿入について調べる。
標的DNA配列に対するCRISPRに基づくアプローチのために配列特異的なジンクフィンガードメイン、TALEまたはガイドRNAを設計する。最適なオンライン設計ソフトウェアを使用する。
1.ドナーDNAを適切なLTRドメインおよび挿入可能配列および融合タンパク質と混合し、10分間温置する(あるいはRNP複合体形成後、ドナーDNAを添加する)。
2.ヌクレアーゼ不含IDTE緩衝液中で各RNAオリゴ(crRNAおよびtracrRNA)を懸濁する。例えば、100μMの最終濃度を使用する。
3.滅菌微量遠心管中で等モル濃度でこの2種類のRNAオリゴを混合する。例えば、以下の表を使用して、3μMの最終2本鎖濃度にする:構成要素量100μM crRNA 3μL、100μM tracrRNA 3μL、ヌクレアーゼ不含2本鎖緩衝液94μL、最終体積100μL。
4.95℃で5分間加熱する。
5.熱から除去し、卓上で室温(15〜25℃)まで冷却する。
6.必要に応じて、ヌクレアーゼ不含2本鎖緩衝液中で作業濃度(例えば、3μM)まで2本鎖化RNAを希釈する。
7.作業用緩衝液(20mM HEPES、150mM KCl、5%グリセロール、1mM DTT、pH7.5)中で作業濃度(例えば、5μM)に融合タンパク質を希釈する。
8.各形質移入に対して、Opti−MEM培地中で1.5pmolの2本鎖化RNAオリゴ(段階A5)を1.5pmolの融合タンパク質(段階A6)と合わせ、12.5μLの最終体積とする。
9.RNP複合体を組み立てるために室温で5分間温置する。
1.以下のものを室温で20分間温置して形質移入複合体を形成させる:構成要素の量 RNP(段階A8)12.5μLリポフェクタミン(登録商標)RNAiMAX形質移入試薬、1.2μL Opti−MEM(登録商標)培地11.3μL総体積25.0μL。
2.温置(段階B1)中、抗生物質なしの完全培地を使用して培養細胞を細胞400,000個/mLに希釈する。
3.温置が完了したら、25μLの形質移入複合体(段階B1より)を96ウェル組織培養プレートに添加する。
4.125μLの希釈細胞(段階B2より)を96ウェル組織培養プレートに添加する(細胞50,000個/ウェル、RNPの最終濃度は10nMとなる)。
5.組織培養インキュベーター(37℃、5%CO2)中で48時間、形質移入複合体および細胞を含有するプレートを温置する。オンターゲット突然変異を検出するため、適切なプライマー(ドナー配列内のプライマーおよび標的挿入部位を囲むプライマー)とともにPCRを使用する。
ビオチンに連結されるdCas9(DNA切断不活性Cas9)を作製する(dCas9−ビオチン)。Cas9(S.ピオゲネス(s pyogenes)、S.アウレウス(s aureus)など)。ビオチン化方法は以下に記載する。
結合部位を同定するためにDNA配列決定を行う(オンターゲット対オフターゲット)。
図5は、ガイドNrF2−sgRNA2およびsgRNA3を用いたNrf2のエクソン2を標的とするAbbie1遺伝子編集を示す。PCRは、Abbie1編集を介したノックアウトについて、エクソン2標的化Nrf2遺伝子座に対するスクリーニングを行う。ガイドNrF2−sgRNA2および3を使用したNrf2のエクソン2を標的とするAbbie1形質移入は、標的化領域でドナーの組み込みを示した。特有のバンドを1〜8とする。
図10は、CXCR4エクソン2を標的とするAbbie1遺伝子編集を示す。PCRは、Abbie1を介して編集されたCXCR4のエクソン2の標的化をスクリーニングする。関心のある領域に対して4セットのプライマーを設計した。セット番号2および4は、関心のある領域でのドナーDNAの組み込みを示唆する特有のバンドを生成したと思われる。
注記:1回の反応に対して500ngタンパク質および120ngのsgRNAを使用する。DNAの量はドナーコンストラクトのサイズに依存する。細胞に対して提供/形質移入/エレクトロポレーションを行う前、その最中またはその後にドナーDNA(LTR配列があるDNA)をABBIE1とともに温置し得る。全反応物を滅菌バイオセイフティーキャビネット中で調製する。
チューブ1:
室温で10分間、1:1モル比の血清減少形質移入培地(OptiMEM、Life Technologies)中の精製ABBIE1タンパク質(配列番号58)およびドナーDNA(配列番号101)。sgRNAを1.3倍モル過剰(およそ120ng)までタンパク質/DNA複合体に添加し、室温でさらに10分間温置を継続する。この混合物の体積は25μLである。
2μLの形質移入試薬(RNAiMAX、Life Technologies)を23μLのOptiMEMに添加した。室温で10分間温置した。
NrF2アイソフォームに対して、55kDアイソフォームおよび98kDアイソフォームを標的とする一次抗体(55kDアイソフォームに対するものはSanta Cruz Biotechnology,sc−722)(98kDアイソフォームに対するものはAbcam、ab−62352)を使用して、標準的なウエスタンブロット分析を行った。GAPDH(Santa Cruz Biotechnology、sc−51907)。
ヒトNrf2に対する受入番号
Uniprot:Q16236
Ensembl遺伝子ID:ENSG00000116044
GCGACGGAAAGAGTATGAGC TGG
TATTTGACTTCAGTCAGCGA CGG
TGGAGGCAAGATATAGATCT TGG
プライマーセット1:プライマー1:5’−GTGTTAATTTCAAACATCAGCAGC−3’、プライマー2:5’−GACAAGACATCCTTGATTTG−3’
プライマーセット2:プライマー1:5’−GAGGTTGACTGTGTAAATG−3’、プライマー2:5’−GATACCAGAGTCACACAACAG−3’
プライマーセット3:プライマー1:5’−TCTACATTAATTCTCTTGTGC−3’、プライマー2:5’−GATACCAGAGTCACACAACAG−3’
Uniprot P61073
Ensembl遺伝子ID:ENSG00000121966
GGGCAATGGATTGGTCATCC TGG
プライマーセット1:プライマー1:5’−TCTACATTAATTCTCTTGTGC−3’、プライマー2:5’−GACAAGACATCCTTGATTTG−3’
プライマーセット2:プライマー1:5’−TCTACATTAATTCTCTTGTGC−3’、プライマー2:5’−GATACCAGAGTCACACAACAG−3’
プライマーセット3:プライマー1:5’−GAGGTTGACTGTGTAAATG−3’、プライマー2:5’−GACAAGACATCCTTGATTTG−3’
プライマーセット4:プライマー1:5’−GAGGTTGACTGTGTAAATG−3’、プライマー2:5’−GATACCAGAGTCACACAACAG−3’
斜字体セクション=制限部位/リンカー
第2の下線セクション=aviタグ(ビオチン化部位にハイライト)
全長融合タンパク質(配列番号57)を含有する発現コンストラクトの形質転換。
−80℃冷凍庫からコンピーテント大腸菌(E.coli)細胞を取り出す。
水浴にスイッチを入れ、42℃にする。
コンピーテント細胞を1.5mLチューブ(エッペンドルフまたは同様のもの)に入れる。DNAコンストラクトの形質転換を行うために50μLのコンピーテント細胞を使用する。
チューブを氷上で維持する。
50ngの環状DNAを大腸菌(E.coli)細胞に添加する。氷上で10分間温置して、コンピーテント細胞を凍結融解する。
DNAおよび大腸菌(E.coli)入りのチューブを42℃の水浴に45秒間入れる。大腸菌(E.coli)細胞に対するダメージを減少させるためにチューブを氷上に2分間戻す。
1mLのLB(抗生物質添加なし)を添加する。チューブを37℃で1時間温置する(チューブを30分間温置し得る)。
適切な抗生物質入りのLBプレート上に約100μLの得られた培養物を広げる。
約12〜16時間後にコロニーを拾う。
LBおよび抗生物質を含有する1Lフラスコに接種する。
0.6ODに到達するまで細菌培養物を増殖させ、次いで1mM最終濃度のイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導する。
6〜8時間にわたり培養物を増殖させ、最低2000Gの力で10分間、懸濁細菌培養物を遠心分離する。
後のさらなる処理のためにペレットを−80℃で凍結させる。
全段階を室温で行う。
以下で提供される各配列に対して以下の情報が提供される:配列のタイプ(核酸またはアミノ酸)、起源(例えば、大腸菌(E.coli))、長さおよび識別番号(可能な場合)。
名称:gi|357584860|gb|EHJ52063.1|CRISPR関連タンパク質Cas9/Csn1、サブタイプII/NMEMI[ストレプトコッカス・マカカ(Streptococcus macacae)NCTC11558]
配列:
名称:gi|409693032|gb|AFV37892.1|CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー[ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)A20]
配列:
名称:gi|459981|gb|AAA47841.1|インテグラーゼ、部分的[サルT−リンパ球向性ウイルス1]
配列:
LVERSNGILKTLLYKYFTDKPDLPMDNALSIALWTINHLNVLTHCH
名称:gi|321156784:1−1509ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)組み込みおよび接合エレメントICESpn11930、株11930
配列:
名称:gi|43090:VII型ジヒドロ葉酸レダクターゼに対する1−436大腸菌(E.coli)(Tn5086)dhfr VII遺伝子およびsul I遺伝子、5’末端(インテグラーゼ)
配列:
Ginレコンビナーゼ
>gi|657193240|sp|Q38199.2|GIN_BPD10 RecName:Full=セリンレコンビナーゼgin;別名:Full=G−セグメントインベルターゼ;略称=Gin
これらは、本発明に記載のような、インテグラーゼまたはレコンビナーゼへの連結での使用のためのTALEリピートモジュールをコードするポリヌクレオチドの代表的な配列である。
>gb|AYLT01000127.1|:11804−12046スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)亜種アウレウス(aureus)SK1585コンティグ000127、全ゲノムショットガン配列
>gi|669035130|gb|KFD30483.1|仮説的タンパク質D484_02234[スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)亜種アウレウス(aureus)SK1585]−S.アウレウス(s aureus)cas9
名称:リンカー2のdna
配列:
agcggcagcgaaaccccgggcaccagcgaaagcgcgaccccggaaagc
名称:GGSリンカーヌクレオチド
配列:
GGGGGAAGT
名称:U3att
配列:
ACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAA
名称:U5att
配列:
GACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGT
NLS−リンカー1−インテグラーゼ−リンカー2−dCas9またはインテグラーゼ−リンカー1−NLS−リンカー2−dCas9またはインテグラーゼ−リンカー2−dCas9−リンカー1−NLSまたはインテグラーゼ−リンカー2−dCas9−NLS
リンカー1=GGS
名称:リンカー2
配列:
SGSETPGTSESATPES
名称:MMTVインテグラーゼcDNA、gb|AF071010.1|:16−1113マウス乳癌ウイルス推定インテグラーゼ、envポリタンパク質およびスーパー抗原mRNA、完全cds
配列:
名称:gb|AXUN02000059.1|:5116−8850ヨウンギイバクター・フラジリス(Youngiibacter fragilis)232.1コンティグ_151、全ゲノムショットガン配列−レコンビナーゼ
配列:
名称:gi|571264543:16423−16770クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)トランスポゾンTn6218、株Ox42トランスポサーゼ
配列:
名称:gb|CP009444.1|:1317724−1320543フランシセラ・フィロミラジア(Francisella philomiragia)株GA01−2801、完全ゲノムCpf1
配列:
名称:gi|754264888|gb|AJI57252.1|CRISPR関連タンパク質Cpf1、サブタイプPREFRAN[フランシセラ・フィロミラジア(Francisella philomiragia)]
配列:
名称:gi|545612232|ref|WP_021736722.1|V型CRISPR関連タンパク質Cpf1[アシダミノコッカス属(Acidaminococcus sp.)BV3L6]
配列:
名称:gi|489130501|ref|WP_003040289.1|V型CRISPR関連タンパク質Cpf1[フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)]
配列:
名称:gi|739008549|ref|WP_036890108.1|V型CRISPR関連タンパク質Cpf1[ポルフィロモナス・クレビオリカニス(Porphyromonas crevioricanis)]
配列:
名称:gi|517171043|ref|WP_018359861.1|V型CRISPR関連タンパク質Cpf1[プロフィロモナス・マカカ(Porphyromonas macacae)]
配列:
ジンクフィンガータンパク質を特徴付けるタンパク質ドメイン
CX(2−4)CX(12)HX(3−5)H(X(2−4)は、例えばXXまたはXXXまたはXXXXを意味する)
細胞のゲノムへのneoの挿入のためのオリゴ(5’および3’HIV LTRの全配列を使用)
最初の5’LTRに下線を付し、標準文字はneoであり、3’LTRは太字(1179bp)とする。
Genbankタンパク質ID:WP_021736722.1
NRデータベースまたはローカルGIからのNCBIタンパク質GI(WGSデータベース由来のタンパク質に対する):545612232
WGSデータベースにおけるコンティグID:AWUR01000016.1
コンティグの記述:アシダミノコッカス属(Acidaminococcus sp.)BV3L6コンティグ00028、全ゲノムショットガン配列
タンパク質完全性:完全
実験的に分析したタンパク質:8
非重複セット:nr
生物:アシダミノコッカス属(Acidaminococcus_sp.)_BV3L6
分類:
細菌、ファーミキューテス(Firmicutes)、ネガティビキューテス(Negativicutes)、セレノモナダレス(Selenomonadales)、アシダミノコッカス科(Acidaminococcaceae)、アシダミノコッカス(Acidaminococcus)、アシダミノコッカス属(Acidaminococcus sp.)BV3L6
Genbankタンパク質ID:WP_044919442.1
NRデータベースまたはローカルGIからのNCBIタンパク質(WGSデータベース由来のタンパク質に対する):769142322
WGSデータベースにおけるコンティグID:JQKK01000008.1
コンティグの記述:ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌MA2020 T348DRAFT_scaffold00007.7_C、全ゲノムショットガン配列
タンパク質完全性:完全
実験的に分析したタンパク質:9
非重複セット:nr
生物:ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)_細菌_MA2020
分類:細菌、ファーミキューテス(Firmicutes)、クロストリジア(Clostridia)、クロストリジアレス(Clostridiales)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、未分類ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌MA2020
配列番号254
GCGACGGAAAGAGTATGAGC TGG
配列番号255
TATTTGACTTCAGTCAGCGA CGG
配列番号256
TGGAGGCAAGATATAGATCT TGG
プライマーセット1:
配列番号257
プライマー1:5’−GTGTTAATTTCAAACATCAGCAGC−3’、
配列番号258
プライマー2:5’−GACAAGACATCCTTGATTTG−3’
プライマーセット2:
配列番号259
プライマー1:5’−GAGGTTGACTGTGTAAATG−3’、
配列番号260
プライマー2:5’−GATACCAGAGTCACACAACAG−3’
プライマーセット3:
配列番号261
プライマー1:5’−TCTACATTAATTCTCTTGTGC−3’、
配列番号262
プライマー2:5’−GATACCAGAGTCACACAACAG−3’
Uniprot P61073
Ensembl遺伝子ID:ENSG00000121966
配列番号263
GGGCAATGGATTGGTCATCC TGG
プライマーセット1:
配列番号264
プライマー1:5’−TCTACATTAATTCTCTTGTGC−3’、
配列番号265
プライマー2:5’−GACAAGACATCCTTGATTTG−3’
プライマーセット2:
配列番号266
プライマー1:5’−TCTACATTAATTCTCTTGTGC−3’、
配列番号267
プライマー2:5’−GATACCAGAGTCACACAACAG−3’
プライマーセット3:
配列番号268
プライマー1:5’−GAGGTTGACTGTGTAAATG−3’、
配列番号269
プライマー2:5’−GACAAGACATCCTTGATTTG−3’
プライマーセット4:
配列番号270
プライマー1:5’−GAGGTTGACTGTGTAAATG−3’、
配列番号271
プライマー2:5’−GATACCAGAGTCACACAACAG−3’
Claims (25)
- 操作可能な連結において、
a)Cas9、不活性Cas9もしくはCpf1またはその一部をコードする第1のポリヌクレオチド配列と、
b)インテグラーゼ、レコンビナーゼもしくはトランスポサーゼまたはその一部をコードする第2のポリヌクレオチド配列と、
c)核酸リンカーをコードする第3のポリヌクレオチド配列と
を含む核酸コンストラクトにおいて、
前記第1のポリヌクレオチド配列が5’および3’末端を含み、かつ前記第2のポリヌクレオチド配列が5’および3’末端を含み、および前記第1のポリヌクレオチドの前記3’末端が前記核酸リンカーによって前記第2のポリヌクレオチドの前記5’末端に連結され、かつ前記第1および第2のポリヌクレオチドが細胞または生物において融合タンパク質として発現されることが可能であることを特徴とする、核酸コンストラクト。 - 請求項1に記載の核酸コンストラクトにおいて、前記第1のポリヌクレオチド配列が配列番号1、3、5、7、9、11、13、27〜46、49、56もしくは68の何れか1つ、またはそれと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
- 請求項1に記載の核酸コンストラクトにおいて、前記Cas9、不活性Cas9またはCpf1が配列番号2、4、6、8、10、12、14、50、52、69、72〜78もしくは86〜92の何れか1つ、またはそれと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
- 請求項1に記載の核酸コンストラクトにおいて、前記第2のポリヌクレオチド配列が配列番号15、17、19、21、23、47、55、62、64、66、70もしくは79の何れか1つ、またはそれと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
- 請求項1に記載の核酸コンストラクトにおいて、前記インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼが配列番号16、18、20、22、24、25、26、48、63、65、67、71もしくは80の何れか1つ、またはそれと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
- 生物において、請求項1に記載の核酸コンストラクトを含むことを特徴とする、生物。
- 請求項1に記載の融合タンパク質を含む生物において、修飾されたゲノムを有することを特徴とする、生物。
- a)Cas9、不活性Cas9もしくはCpf1またはその一部をコードする第1のポリヌクレオチド配列と、
b)インテグラーゼ、レコンビナーゼもしくはトランスポサーゼまたはその一部をコードする第2のポリヌクレオチド配列と、
c)核酸リンカーをコードする第3のポリヌクレオチド配列と
を含む生物において、
前記第1のポリヌクレオチド配列が5’および3’末端を含み、かつ前記第2のポリヌクレオチド配列が5’および3’末端を含み、および前記第1のポリヌクレオチドの前記3’末端が前記核酸リンカーによって前記第2のポリヌクレオチドの前記5’末端に連結され、かつ前記第1および第2のポリヌクレオチドが細胞または生物において融合タンパク質として発現されることが可能であることを特徴とする、生物。 - 融合タンパク質において、
a)触媒能のないCas9、Cas9、TALEタンパク質、ジンクフィンガータンパク質またはCpf1タンパク質である第1のタンパク質であって、標的DNA配列を標的とする第1のタンパク質と、
b)インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼである第2のタンパク質と、
c)前記第1のタンパク質を前記第2のタンパク質に連結するリンカーと
を含むことを特徴とする、融合タンパク質。 - 請求項9に記載の融合タンパク質において、前記第2のタンパク質がインテグラーゼであることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項10に記載の融合タンパク質において、前記インテグラーゼがHIV1インテグラーゼまたはレンチウイルスインテグラーゼであることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項9に記載の融合タンパク質において、前記リンカー配列が1以上のアミノ酸長であることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項9に記載の融合タンパク質において、前記第1のタンパク質が触媒能のないCas9であることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項9に記載の融合タンパク質において、前記リンカー配列が4〜8アミノ酸長であることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項14に記載の融合タンパク質において、前記第1のタンパク質がTALEタンパク質であることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項9に記載の融合タンパク質において、前記第1のタンパク質がジンクフィンガータンパク質であることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項15または16に記載の融合タンパク質において、前記標的DNA配列が約16〜約24塩基対長であることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項9に記載の融合タンパク質において、前記第1のタンパク質がCas9または触媒能のないCas9であり、1つ以上のガイドRNAが約16〜約24塩基対の標的DNA配列の標的化のために使用されることを特徴とする、融合タンパク質。
- DNA配列をゲノムDNAに挿入する方法において、
a)前記ゲノムDNAにおいて標的配列を同定することと、
b)前記ゲノムDNAにおいて前記標的配列に結合するように請求項1に記載の融合タンパク質を設計することと、
3)前記ゲノムDNAに組み込むための関心のあるDNA配列を選択することと、
d)細胞または生物に対して、前記細胞または生物への前記融合タンパク質および関心のあるDNA配列の移行を可能にする技術によって前記融合タンパク質および前記関心のあるDNA配列を提供することと
を含み、前記関心のあるDNA配列が前記ゲノムDNA中の前記標的配列において組み込まれるようになることを特徴とする、方法。 - a)標的DNA配列に結合するように改変されている、Cas9、触媒能のないCas9、TALEタンパク質、ジンクフィンガータンパク質またはCpf1タンパク質である第1のタンパク質に対する第1のコード配列と、
b)インテグラーゼ、レコンビナーゼまたはトランスポサーゼである第2のタンパク質に対する第2のコード配列と、
c)前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質との間でアミノ酸リンカーを形成する、前記第1のコード配列と前記第2のコード配列との間のDNA配列と、
d)任意選択により、インテグラーゼによって認識されるatt部位によって取り囲まれる発現された関心のあるDNA配列および任意選択により1つ以上のガイドRNAと
を含むヌクレオチドベクターにおいて、前記第1のタンパク質が、決定されたDNA配列を標的とし、前記第1のタンパク質が前記アミノ酸リンカー配列によって前記第2のタンパク質に連結されることを特徴とする、ヌクレオチドベクター。 - 細胞または生物において遺伝子転写を阻害する方法において、
a)遺伝子においてATG開始コドンを同定することと、
b)前記遺伝子の前記ATG開始コドンの直後の標的配列に結合するように、請求項1に記載の融合タンパク質を用いて融合タンパク質系を設計することと、
c)1つ以上の連続停止コドンである関心のあるDNA配列を設計することと、
d)細胞または生物に対して、前記細胞または生物への前記融合タンパク質および関心のあるDNA配列の移行を可能にする技術によって前記融合タンパク質および前記関心のあるDNA配列を提供することと
を含み、前記関心のあるDNA配列がゲノムDNA中の前記標的配列において組み込まれるようになり、前記遺伝子の転写が阻害されることを特徴とする、方法。 - 請求項9に記載の融合タンパク質において、前記第2のタンパク質がレコンビナーゼであることを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項22に記載の融合タンパク質において、前記レコンビナーゼがCreレコンビナーゼまたはその修飾型であり、前記修飾型のCreレコンビナーゼが構成的なレコンビナーゼ活性を有することを特徴とする、融合タンパク質。
- 請求項20に記載のベクターにおいて、細胞中で発現される逆転写酵素遺伝子をさらに含むことを特徴とする、ベクター。
- DNA結合タンパク質/インテグラーゼ融合物の精製タンパク質と、約15〜約100塩基対長のRNAとを含む組成物において、前記DNA結合タンパク質が、ゲノム中の標的化DNA配列に対して改変されているCas9、Cpf1、TALENおよびジンクフィンガータンパク質から選択され、前記インテグラーゼがHIVインテグラーゼ、レンチウイルスインテグラーゼ、アデノウイルスインテグラーゼ、レトロウイルスインテグラーゼまたはMMTVインテグラーゼであることを特徴とする、組成物。
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