CN110392575A

CN110392575A - 用于预防或治疗视网膜疾病的含枫叶提取物的药物组合物

Info

Publication number: CN110392575A
Application number: CN201780063585.3A
Authority: CN
Inventors: 马珍烈; 朴光一; 金妍希; 吴泰雨; 赵元卿; 金童乾; 朴恩嬉
Original assignee: KOREA INST OF ORIENTAL MEDICIN
Current assignee: KOREA INST OF ORIENTAL MEDICIN; Korea Institute of Oriental Medicine KIOM
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2019-10-29
Also published as: KR20180019802A; WO2018034465A1; US20190328808A1; US11564962B2; KR101951401B1

Abstract

本发明涉及用于预防或治疗视网膜疾病的包含枫叶提取物或其级分的药物组合物，使用该药物组合物预防或治疗视网膜疾病的方法，以及用于改善视网膜疾病的症状的包含枫叶提取物或其级分的食品组合物。根据本发明的药物组合物可有效用于治疗视网膜疾病，可以药学上用作预防或治疗视网膜疾病的组合物，并且还可以有利地用作健康功能食品。

Description

用于预防或治疗视网膜疾病的含枫叶提取物的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于预防或治疗视网膜疾病的含有枫叶提取物的药物组合物，更具体地，涉及用于预防或治疗视网膜疾病的含有枫叶提取物或其级分的药物组合物，使用该药物组合物预防或治疗视网膜疾病的方法，和用于改善视网膜疾病症状的含有枫叶提取物或其级分的食品组合物。

背景技术

枫树长到约100米的高度，有小而光秃的树枝，并有红棕色。此外，枫叶对生掌状裂有5到7个深裂的裂片。***的叶片具有宽的披针形形状，具有尖锐的末端和细长的边缘，长5厘米至6厘米。它们的叶柄是红色的，长3厘米到5厘米。雄蕊花和两性花在同一棵树上绽放。深红色的枫树花在五月开放，该花为开放在枝条末端的伞状花序。每朵花有带有柔毛的五个萼片、五个花瓣和八个雄蕊。

这些枫树的根茎和枝条被用作草药，被煮沸并用于因膝关节炎引起严重疼痛，并且通过与刺五加(也称为“多刺人参”)混合用于骨折，并且已知具有抗炎和解毒作用。

同时，视网膜是覆盖眼球最内部的透明神经组织，进入眼球的光穿过视网膜的内层，并被视网膜的视细胞检测到。视觉细胞将光信息转换回电信息，电信息通过视网膜内层的细胞穿过视神经并传递到大脑。视网膜由眼球外侧至内侧的十层组成。十个构成层对应于视网膜色素上皮层、感光层、外边界膜、外核层、外网层、内核层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层、以及内边界层。另外，黄斑是存在于视神经盘的略微外部下部的椭圆形凹陷，并且是视网膜的视神经细胞密集聚集的区域。识别视网膜中的视觉刺激的大多数功能是在黄斑处进行的，因此，在黄斑中发生病变，或黄斑的视神经细胞中发生损伤或缺陷的情况下，结果可能是失明或严重的视觉损害。

视网膜疾病(或视网膜障碍)包括由视网膜或黄斑缺失引起的所有疾病。视网膜疾病的具体实例如下。

在视网膜疾病中，属于视网膜循环障碍的疾病的实例包括视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、视网膜周围静脉炎、高血压性视网膜病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病等。

另外，代表性视网膜炎可包括由细菌或真菌引起的感觉神经视网膜炎症、在风疹感染的母亲所生的新生儿中鉴定的视网膜色素上皮的炎症等，并且这些疾病也属于由视网膜损伤引起的视网膜疾病。

另外，引起视网膜变性的疾病可包括色素性视网膜炎、血管样条纹、玻璃疣等，并且这些疾病也属于由视网膜损伤引起的视网膜疾病。

另外，随着视网膜的内感觉神经层与视网膜色素上皮的外层之间的距离增加，发生视网膜脱离。视网膜脱离主要分为孔源性视网膜脱离和非孔源性视网膜脱离，取决于它是否由视网膜撕裂引起，这些疾病也属于视网膜损伤引起的视网膜疾病。

其他视网膜疾病可能包括黄斑变性、黄斑营养不良、糖尿病视网膜病变、视网膜动静脉阻塞、高血压性视网膜病变、视网膜主动脉瘤、视网膜缺血综合征、放射性视网膜病变、早产儿视网膜病变、急性视网膜坏死、视网膜炎、视网膜脉络膜炎、视网膜脱离、视网膜肿瘤、由于创伤造成的视网膜损伤、由于光线引起的视网膜损伤等

尽管关于这些视网膜疾病的治疗的研究正在积极进行，但到目前为止尚未报道完整的治疗方法。特别是，存在的问题是手术仍然是视网膜疾病的唯一治疗方法，迄今为止，尚未报道有效预防或治疗这些视网膜疾病的药物组合物或药物治疗的技术。

同时，作为与本发明有关的现有技术文献，公开了韩国专利申请公开No.2012-0068432(专利文献1)。然而，专利文献1仅公开了一种用于预防和治疗糖尿病和肥胖症的组合物，其含有槭叶草(Aceriphyllum rossii)叶提取物的乙醇提取物，但没有公开任何关于使用枫叶提取物预防或治疗视网膜疾病的效果。

发明内容

[技术问题]

本发明人致力于开发有效预防或治疗视网膜疾病的新型物质。结果，已证实含有枫叶提取物的药物组合物具有预防或治疗视网膜疾病的作用，从而完成了本发明。

[技术方案]

本发明的主要目的是提供含有枫叶提取物或其级分的用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供一种治疗视网膜疾病的方法，包括将该药物组合物施用于受试者。

本发明的另一个目的是提供一种用于改善视网膜疾病症状的食品组合物，其含有枫叶提取物或其级分。

本发明的另一个目的是提供一种用于改善视网膜疾病症状的饲料组合物，其含有枫叶提取物或其级分。

[本发明的有益效果]

根据本发明的药物组合物可有效用于治疗视网膜疾病，可以药学上用作预防或治疗视网膜疾病的组合物，并且还可以有利地用作健康功能食品。

附图说明

图1显示了说明口服或眼部施用本发明枫叶提取物后观察到的免疫组织化学染色结果的图像，其中证实了口服给药显示出显著的视网膜保护作用。

图2显示了在口服或眼部施用根据本发明的枫叶提取物后观察到的免疫组织化学染色结果的图像，其中证实了当用OPNISW染色时乙醇枫提取物显示产生视网膜保护。

图3显示了说明在口服或眼部施用根据本发明的枫叶提取物后观察到的免疫组织化学染色结果的图像，其中证实了当用GFAP染色时用乙醇枫提取物处理的组中GFAP表达水平的降低。

图4显示荧光显微图像，其显示口服或眼部施用根据本发明的枫叶提取物后的TUNEL测定的结果。

图5显示了说明口服或眼部施用枫叶提取物后的蛋白质印迹分析结果的图像。

图6显示了在滴眼或眼部施用根据本发明的枫叶提取物后确认视网膜神经节细胞的细胞死亡的实验结果，其中，图6a显示荧光显微图像。图6b显示了说明该结果的图，其中计算在所选图像中显示阳性反应的细胞数，然后将其转换为对照组的平均值。

图7显示了实验结果，证实了在滴眼或口服施用根据本发明的枫叶提取物后抑制视网膜神经节细胞纤维的减少，其中，图7a显示荧光显微图像以及图7b显示对Tuj-1呈阳性反应的神经纤维表达水平的测量结果的图。

图8显示了证实在滴眼或口服施用根据本发明的枫叶提取物后抑制神经胶质细胞和星形胶质细胞活性的实验结果，其中，图8a显示荧光显微图像。图8b显示通过KIOM-2015EE在所有组中显著降低的表达水平的测量结果的图。

图9显示证实了根据本发明的滴眼剂或口服施用枫叶提取物后视网膜组织学的变化的实验结果，其中，图9a显示荧光显微图像以及图9b是显示在对所选图像中的神经节细胞层中剩余的细胞数进行计数后对照组的平均值的图。

图10显示荧光显微图像，其显示证实了在滴眼或口服施用根据本发明的枫叶提取物后视网膜组织的细胞死亡的抑制的实验结果。

具体实施方式

本发明人进行了各种研究以开发能够安全有效地治疗视网膜疾病的衍生自天然产物的制剂，结果发现枫叶提取物具有治疗视网膜疾病的效果。通常，已知枫树显示出各种药理作用。但是，没有关于使用枫树治疗视网膜疾病的报道。另外，除了目前可用的侵入性疗法之外，迄今尚未报道关于有效预防或治疗视网膜疾病的药物组合物和药物疗法的技术。

本发明人已经假设枫叶提取物将能够表现出治疗视网膜疾病的效果，并且基于该假设，本发明人进行了各种研究以鉴定可能与枫叶提取物的作用用于治疗视网膜疾病相关的活性成分，结果证实枫叶提取物具有治疗视网膜疾病的作用。也就是说，本发明人已经证实，枫叶提取物能够降低选自由切割的PARP、GFAP和巢蛋白所组成的组中的至少一种的表达，同时增加选自由OPNISW、Bm3a和Tuj-1中的至少一种的表达，从而表现出治疗视网膜疾病的效果。

如上所述，尚不知道枫叶提取物具有治疗视网膜疾病的效果，并且本发明人首先证实了这一事实。另外，本发明人还首次发明了具有治疗视网膜疾病效果的药物组合物。

为达到上述目的，本发明的一个方面提供了一种用于预防或治疗视网膜疾病的含有枫叶提取物或其级分的药物组合物。

另外，本发明的另一方面提供枫叶提取物或其级分用于预防或治疗视网膜疾病的用途。

在下文中，详细描述了用于预防或治疗视网膜疾病的含有本发明的枫叶提取物或其级分的药物组合物。

如本文所用，术语“枫树”是指生长至约100m高度的树，具有小而光秃的分枝，并且具有红棕色，并且枫树叶对生掌状裂有5至7个深裂的裂片。同时，枫树大致分为根、茎和叶，并且本发明的药物组合物可含有枫叶提取物或其级分。特别地，根据枫树的一部分，其提取物或级分可以实现预防或治疗视网膜疾病的效果，而对枫树的部分没有任何特别限制。

如本文所用，术语“提取物”是指使用适当的溶剂从枫叶中提取的提取物，并且提取物可包括例如枫叶的所有的热水提取物、极性溶剂可溶的提取物和非极性溶剂可溶的提取物。

作为从枫叶中提取提取物的合适溶剂，可以使用本领域可接受的任何溶剂，并且可以使用水或有机溶剂。例如，各种溶剂如纯净水，包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等的C_1-4醇，丙酮，***，苯，氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷，己烷，环己烷等，可以单独使用或组合使用，但溶剂不限于此。

作为提取方法，可以使用选自热水提取方法、冷沉淀提取方法、回流冷却提取方法、溶剂提取方法、蒸汽蒸馏方法、超声提取方法、洗脱方法、压制方法等的方法。另外，所需的提取物可以进一步进行常规的分级分离过程，或者可以使用常规的纯化方法进行纯化。制备本发明的枫叶提取物的方法没有限制，可以使用本领域已知的任何方法。

例如，通过经由热水提取方法或溶剂提取方法提取的初级提取物经由另外的方法(例如，真空蒸馏、冷冻干燥，喷雾干燥等)，可以将包含在本发明的组合物中的枫叶提取物制备成粉末。另外，可以使用各种色谱方法(例如，硅胶柱色谱、薄层色谱、高效液相色谱等)将初级提取物制备成进一步纯化的级分。

因此，在本发明中，枫叶提取物是包括在提取、分馏和纯化的每个步骤中获得的所有提取物、级分和纯化产物以及其稀释液、浓缩物或干燥产物的概念。

含有这种枫叶提取物作为活性成分的本发明组合物可以是药物组合物。

如本文所用，术语“级分”是指通过进行分馏以从含有各种组分的混合物中分离特定组分或特定组分组而获得的所得产物。

在本发明中，该级分可以是通过各种方法(例如，溶剂分级分离方法、超滤分级分离方法、色谱分级分离方法等)分馏枫叶提取物得到的产物。

获得该级分的方法没有特别限制，只要可以使用该方法获得表现出预防或治疗视网膜疾病的效果的级分即可，并且可以使用本领域中使用的常规方法。在一个实施方案中，可以使用溶剂分馏方法从热水枫树提取物中获得级分的方法。

在本发明中，用于获得该级分的级分溶剂的类型也没有特别限制，只要使用该溶剂可以获得具有预防或治疗视网膜疾病效果的级分即可，并且可以使用本领域中使用的任何常规方法。在一个实施方案中，作为馏分溶剂，可以单独或作为其中至少一种的混合物来使用极性溶剂(例如水、醇等)，非极性溶剂(例如己烷、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等)等。

如本文所用，术语“视网膜疾病”统称是指由于视网膜或黄斑的损伤或其变性而发生视力丧失或损伤的疾病。

同时，该药物组合物涉及改善视网膜疾病的症状。视网膜疾病的具体实例可包括视网膜动脉闭塞、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、高血压性视网膜病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、感觉神经视网膜炎症、视网膜色素上皮炎症、色素性视网膜炎、血管样条纹、玻璃疣、视网膜色素变性脱离、非孔源性视网膜脱离、黄斑变性、黄斑营养不良、糖尿病视网膜病变、视网膜动静脉闭塞、高血压性视网膜病变、视网膜主动脉瘤、视网膜缺血综合征、放射性视网膜病变、早产儿视网膜病变、急性视网膜坏死、视网膜炎、视网膜脉络膜炎、视网膜脱离、视网膜肿瘤、由于创伤引起的视网膜损伤、或由于光引起的视网膜损伤。

如本文所用，术语“预防”是指通过施用本发明的药物组合物来抑制或延迟视网膜疾病发作的所有活性，术语“治疗”是指通过施用本发明的药物组合物来改善或有利地改变视网膜疾病症状的所有活动。

用于预防或治疗视网膜疾病的本发明药物组合物，其含有枫叶提取物或其药学上可接受的盐作为活性成分，还可包括合适的载体(作为具体实例，非天然存在的)载体、赋形剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、助流剂、调味剂或稀释剂，其通常用于制备药物组合物。

另外，相对于100重量份的组合物的总重量，枫叶提取物或其级分可以特别地以1至80重量份，更具体地20至60重量份的量使用，但是枫叶提取物或其级分的量不特别限于此。当枫叶提取物或其部分的含量小于1重量份时，难以充分发挥本发明中预防或治疗视网膜疾病的效果，因此可能不予考虑作为本发明的示例性实施例。同时，当枫叶提取物或其部分的含量大于80重量份时，不可能将待制备的剩余材料的含量限制为用于药物应用的产品，因此这可能不被认为是本发明的示例性实施例。

同时，用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物可以特别地通过动脉内或静脉内、皮下、直肠内、鼻内或通过任意肠胃外途径给药，更具体地，动脉内或静脉内、口服或直接给予肌肉细胞，但是给药方法不特别限于此。

另外，选自组合物的剂量水平将取决于化合物的活性、给药途径、所治疗病症的严重程度、以及所治疗患者的病症和既往病史。然而，在本领域的知识范围内，化合物的剂量开始的水平低于实现所需治疗效果所需的水平，并逐渐增加直至达到所需效果。期望的剂量可以通过年龄、性别、体型和体重来确定。组合物可以在配制成药学上可接受的制剂之前进一步加工，具体地可以粉碎或抛光成较小的颗粒。另外，组合物可以根据病症和所治疗的患者而变化，但这可以在没有创造性的情况下确定。

另外，药物组合物可以具有选自片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、悬浮液、内用溶液、乳液、糖浆、无菌水溶液、非水溶剂、乳液、冻干制剂和栓剂中的任何一种制剂类型，并且可以以各种口服或肠胃外制剂类型制备。对于制剂，通常使用稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、表面活性剂等)。用于口服给药的固体制剂的实例可包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等。这些固体制剂通过将一种或多种化合物与至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)混合来制备。另外，除了简单的赋形剂之外，还可以使用润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石等)。用于口服给药的液体制剂可包括悬浮液、内用溶液、乳液、糖浆等，并且除常用的简单稀释剂(例如，水和液体石蜡)外，还可包括各种赋形剂(例如保湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等)。肠胃外给药的制剂可包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳液、冻干制剂和栓剂。非水溶液和悬浮液的实例可包括植物油(例如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油)，可注射酯(例如油酸乙酯)等。栓剂的基质的实例可包括Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂、甘草素等。

本发明的组合物可以以药学有效量给药。

如本文所用，术语“药学有效量”是指足以以适合于医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量的水平可以基于包括种类的因素来确定。受试者和疾病的严重程度、年龄、性别、疾病种类、药物活性、药物敏感性、给药时间、给药途径和溶出率、治疗时间、包括同时使用的药物的因素，以及其他在医疗领域众所周知的因素。本发明的组合物可以作为单独的治疗剂、与另一种治疗剂组合施用、或者与常规治疗剂依次或同时施用，并且可以施用一次或多次。重要的是，考虑到上述所有因素，药物组合物以能够获得最大效果的最小量施用而没有不利影响，并且本领域普通技术人员可以容易地确定药学有效量。本发明组合物的所需剂量可以根据患者的健康状况和体重、疾病的严重程度、药物类型、给药途径和持续时间而变化，并且可以在从业者正确的医学判断的范围内确定合适的总日剂量。通常，本发明的组合物可以分剂量给药一次或数次，剂量为0.001mg/kg至1,000mg/kg，特别是0.05mg/kg至500mg/kg，更具体地0.1mg/kg至500mg/kg。特别是，当本发明的药物组合物以100mg/kg至300mg/kg的量给药时，可以实现预防或治疗视网膜疾病的优异效果。组合物没有特别限制，但可以应用任何受试者，只要其是用于预防或治疗视网膜疾病的受试者即可。例如，该组合物可以应用于任何受试者，例如非人动物(例如，猴子、狗、猫、兔、土拨鼠、大鼠、小鼠、牛、绵羊、猪等)。给药方法可包括但不限于本领域的任何常规方法，例如，可以使用腹膜给药、眼部给药或口服给药，但给药方法不限于此。

同时，药物组合物可以是降低选自由切割的PARP、GFAP和巢蛋白所组成的组中的至少一种的表达的药物组合物。

另外，药物组合物可以是增加OPNISW、Bm3a、Tuj-1等的表达的药物组合物。

为了实现上述目的，本发明的另一方面提供了一种治疗视网膜疾病的方法，该方法包括将该药物组合物施用于受试者。

在本发明中，怀疑患有视网膜疾病的受试者是指具有或有发展视网膜疾病风险的所有动物，并且可以通过给予本发明药物组合物有效地治疗怀疑患有视网膜疾病的受试者。

如本文所用，术语“施用”是指将本发明的药物组合物以适当的方式引入怀疑患有视网膜疾病的受试者，并且该药物组合物可以通过各种口服和肠胃外途径施用，只要药物组合物可以到达靶组织即可。具体地，药物组合物可以通过腹膜、眼睛或口服给药，但给药途径不限于此。

本发明的又一方面提供了一种用于改善视网膜疾病症状的食品组合物，其包含枫叶提取物或其级分。

枫叶提取物或其级分可以习惯性地食用或者可以以食物的形式制备以改善视网膜疾病的症状。特别地，相对于食品组合物的总重量，食品中包含的枫叶提取物或其部分的量可以为0.001wt％至10wt％，更优选为0.1wt％至1wt％。但是枫叶提取物或其级分的量不限于此。当食物是饮料时，基于100mL饮料，视网膜提取物或其级分的含量可以为1g至10g，更优选为2g至7g。另外，该组合物可以进一步包括通常用于食品组合物中以改善气味，味道，视觉外观等的其他成分(例如，维生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、烟酸、生物素、叶酸、泛酸等)。另外，该组合物还可包括矿物质(例如，Zn、Fe、Ca、Cr、Mg、Mn、Cu等)。另外，组合物还可包含氨基酸(例如赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等)。此外，该组合物还可包括食品添加剂，例如防腐剂(例如山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢醋酸钠等)，消毒剂(例如漂白粉和高试验漂白粉，次氯酸钠等)，抗氧化剂(如丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)等)，着色剂(如焦油染料等)，固色剂(如亚硝酸钠、亚硝酸钠等)，漂白剂(例如亚硫酸钠)，调味剂(例如味精、谷氨酸钠等)，甜味剂(例如，甜晶(dulcin)、甜蜜素、糖精钠等)，香料(例如香草醛、内酯等)，发泡剂(例如，明矾、D-酒石酸氢钾等)，强化剂，乳化剂，增稠剂，粘合剂糊，胶基，消泡剂，溶剂和改善剂。可以根据食物的类型选择添加剂，并且可以以合适的量使用。

同时，可以使用含有枫叶提取物或其级分的食品组合物制备用于改善视网膜疾病症状的健康功能食物组合物。

在一个具体实施方案中，可以使用食物组合物制备可以改善视网膜疾病症状的加工食品。例如，可以以甜食、饮料、酒、发酵食品、罐装食品、加工乳制品、加工肉类食品或加工面条食品的形式制备健康功能食品。特别地，甜食可以包括饼干、馅饼、蛋糕、面包、糖果、果冻、口香糖、谷物(诸如谷物片等的代餐品等)等。饮料的实例可以包括饮用水、碳酸饮料、功能性离子饮料、果汁(如苹果、梨、葡萄、芦荟、橘子、桃子、胡萝卜、番茄汁等)、甜米饮料等。酒的例子可能包括精制米酒、威士忌、烧酒、啤酒，烈性酒、果酒等。发酵食品的实例可包括酱油、豆酱、红辣椒酱等。罐头食品的实例可包括罐装海产品(例如金枪鱼、鲭鱼、太平洋秋刀鱼、海螺等的罐头产品)，罐装肉制品(牛肉、猪肉、鸡肉、火鸡等罐头制品)，罐头农产品(玉米、桃子、菠萝等罐头制品)等。加工乳制品的例子可能包括奶酪、黄油、酸奶等。加工肉类食品的实例可包括猪排、牛排、鸡排、香肠、糖醋猪肉、鸡块、Neobiani等。面条可以包括密封湿面条等。另外，食品组合物可用于蒸煮食物、汤等。

如本文所用，术语“健康功能食品”，即用于特殊健康用途的食品(FoSHU)，是指具有高药效和医疗效果的食品，以便除了营养供应的功能之外还有效地表现出生物调节功能。可以以各种形式(例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体、丸剂等)制备保健功能食品，以获得改善视网膜疾病症状的有用效果。

为达到上述目的，本发明的另一方面提供一种用于改善视网膜疾病症状的饲料组合物，其含有枫叶提取物或其级分。

饲料组合物可以通过在怀疑患有视网膜疾病的受试者的饲料中加入枫叶提取物或其级分并将其喂食来预防或改善视网膜疾病的症状。

实施例

在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1：口服或眼部给药

<实施例1-1：实验动物和治疗方法>

将Balb/c小鼠(6周龄)用作实验动物。第1组的实验动物用下面的式1的N-乙基-N-亚硝基脲(ENU；600mg/kg)处理，并且第2组的实验动物在ENU之外还用乙醇枫树提取物和热水枫树提取物处理，其对视网膜疾病的保护作用得到了证实。

[式1]

如下表1所示，在枫叶提取物中，热水提取物以200mg/kg的浓度口服给药，而乙醇提取物以100mg/kg和200mg/kg的浓度口服给药。此外，除了上述给药之外，乙醇提取物的给药也通过直接眼部给药以2mg/kg(5天)的浓度进行。

【表1】

	条件(群体)	蛋白制剂	全眼
				1	正常(6)	6	6
2	ENU 600mg/kg(6)	6	6
				3	ENU 600mg/kg+KIOM-2015EE 100mg/kg(6)-P.O.	6	6
4	ENU 600mg/kg+KIOM-2015EE 200mg/kg(6)-P.O.	6	6
				5	KIOM-2015EE 100mg/kg(6)-P.O.	6	6
6	KIOM-2015EE 200mg/kg(6)-P.O.	6	6
				7	ENU 600mg/kg+KIOM-2015EW 200mg/kg(6)-P.O.	6	6
8	KIOM-2015EW 200mg/kg(6)-P.O.	6	6
				9	ENU 600mg/kg+KIOM-2015EE 2mg/kg(6)-E.D.	6	6
10	KIOM-2015EE 2mg/kg(6)E.D.	6	6

(KIOM-2015EW：水提取物，KIOM-2015EE：25％EtOH，E.D.：局部滴眼剂，P.O.：口服)

(滴眼给药每天进行3次：上午9:00，下午1:00，下午5:00；口服给药，每天下午3:00进行一次。)

<实施例1-2：免疫组织化学染色法>

将组织固定在10％中性***中，并以4μm的间隔连续切片石蜡包埋的组织，并用苏木精-伊红(H&E)染色一个组织切片，并将剩余的组织切片连接到载玻片上用于免疫组织化学染色。将组织切片用H₂O₂处理30分钟以除去内源性过氧化物酶。将抗PKCα、抗GFAP和抗GFAP抗体各自以1∶50的比例稀释，在4℃下培养过夜，并洗涤，然后用二抗标记并在显微镜下观察。

免疫组化染色方法的实验结果

用H&E染色的每种提取物均未显示任何毒性。在施用ENU的组中，证实实验动物的视网膜厚度变薄并且外核层和杆和锥体层的区域缺失。然而，在以200mg/kg的浓度施用乙醇枫提取物的组中，实验动物的视网膜的厚度维持在组织学上类似于对照组的水平(图1)。

另外，当通过免疫组织化学染色方法使用OPN1SW(即，感光细胞抗体)染色每种提取物时，证实实验动物的视网膜在乙醇枫叶提取物以200mg/kg浓度施用的组中受到保护，而在ENU给药组中未显示这种保护作用。另外，当每种提取物用PKCα染色(即双极细胞的指数)时，证实乙醇枫提取物的给药保护细胞体和轴突免受损伤(图2)。

另外，当使用GFAP(即，Muller细胞的指数蛋白)染色每种提取物时，证实在以200mg/kg的浓度的乙醇枫提取物处理的组中GFAP表达水平降低(图3)。

<实施例1-3：TUNEL测定>

使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-dUTP缺口末端标记测定试剂盒(罗氏诊断，德国曼海姆)通过原位方法进行分析。

将免疫组织化学染色方法中使用的组织脱石蜡，并在TUNEL反应混合物(末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-dUTP))中在37℃在暗室中反应1小时，并通过荧光显微镜观察(515nm至565nm，绿色，奥林巴斯光学，日本东京)。

TUNEL试验的实验结果

在通过TUNEL测定确认细胞死亡后，证实浓度为200mg/kg的乙醇枫叶提取物抑制细胞死亡(图4)。

<实施例1-4：蛋白质印迹>

从眼球中提取每个视网膜，用RIPA缓冲液提取其中的蛋白质，并通过在12,000rpm离心约10分钟沉淀，从而获得上清液。通过Bradford(Bio-Rad，Hercules，美国加州)定量上清液中的蛋白质，在7％至12％SDS PAGE上电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。首先用每种抗体处理硝酸纤维素膜，与缀合有过氧化物酶的二抗反应，并通过进行增强的化学发光(ECL，Amersham Biosciences，英格兰)进行分析。

Western blot的实验结果

通过蛋白质印迹检查蛋白质表达水平。结果证实，在给予乙醇枫叶提取物(左起第5和第6泳道：200mg/kg)的情况下，切割的PARP、GFAP和巢蛋白的表达水平降低。相反，证实了与ENU处理组相比，OPN1SW的表达水平显著增加(图5)。

实施例2：滴眼剂或口服给药

<实施例2-1：fMCAO手术的方法>

在手术期间，由大脑中动脉闭塞(MCAO)引起的缺血性中风的每只白大鼠模型在保持麻醉的同时保持体温为37.0±0.5℃。切除麻醉大鼠前颈中央部分的皮肤，露出颈部肌肉层。然后，定位左颈总动脉并仔细分离/解剖，以免损伤迷走神经。在固定颈总动脉后，小心地分离颈外动脉和颈内动脉的分支，并阻塞颈外动脉。然后，在暂时阻断颈总动脉的血流的同时，切除部分颈总动脉，并将尼龙缝合线***其中，以阻断大脑中动脉。90分钟后，小心地取出缝合线以重新开始血液流动，并从中诱导动物模型。

<实施例2-2：实验的条件和计划>

[表2]

(KIOM-2015EW：水提取物，KIOM-2015EE：25％EtOH，E.D.：局部滴眼剂，EO.：口服)

(滴眼给药每天进行3次：下午9点，下午1点，下午5点；口服给药，每天下午3点进行一次)

上表2(KIOM-2015EW：水枫叶提取物，KIOM-2015EE：25％乙醇枫叶提取物，E.D.：局部滴眼剂，P.O.：口服给药)显示了根据实验条件的药物施用模式。

同时，在下午9点、下午1点和下午5点每天进行3次滴眼剂给药，并且每天下午3点口服给药一次。将实验动物的眼睛暴露于药物总共5天，并在最后一次给药后第5天处死。

被指定用于缺血性视网膜病变患者的SK化学药物的Genexin-F片用作适用于缺血引起的视神经细胞损伤的模型的阳性对照药物，并且根据每日食用一次的食物量相对于体重(基于大鼠(300g)6mg/mL)计算剂量。

<实施例2-3：实施例2的实验结果>

实验结果证实KIOM-2015E在缺血性视网膜神经变性的动物模型中抑制视网膜神经节细胞的细胞死亡(在fMCAO诱导的缺血性损伤后KIOM-2015EE介导的RGC降解的保护作用)

提取在第5天处死的大鼠的眼球并在4％PFA中固定10分钟。然后，在解剖显微镜下仅分离视网膜组织，在四个边缘切割每个视网膜组织并压平，并固定和储存在MeOH中备用。除去MeOH用于染色，并将视网膜组织在TBS中洗涤两次，持续5分钟。然后，为了促进抗体顺利穿透细胞膜，同时防止抗体的非特异性结合，视网膜组织在室温下与0.3％Triton X-100+0.2％BSA+5％正常山羊血清/TBS反应60分钟。随后，使一抗、Brn3a(即神经节细胞标记物)在室温下反应1小时然后除去，然后进一步与Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(即二抗)反应。在室温下保持1小时。将得到的视网膜组织用DAPI进行核染色10分钟，并在通过荧光显微镜观察时成像。

图6显示了由此获得的结果。具体而言，图6a显示通过使视网膜组织构成细胞中的Bm3a(即视网膜神经节细胞(RGC)的特异性抗体)反应获得的图像。和图6b显示了说明从图像中随机选择五个图像并且计算每个所选图像中显示对Brn3a的阳性反应的细胞数的结果然后将其转换为对照组的平均值(％)的图像。从图6b中确认乙醇枫提取物可以比水枫提取物更好地抑制神经节细胞的细胞死亡，并且乙醇枫提取物显示出与阳性对照组相似的结果。以100×放大率拍摄图像。

实验证实KIOM-2015E在缺血性视网膜神经变性动物模型中抑制视网膜神经节细胞纤维减少(在fMCAO诱导的缺血性损伤后KIOM-2015E介导的RGC神经纤维降解的阻断)

以与实验实施例2-1中相同的方式进行免疫荧光染色。图7a显示了使用神经元特异性III类β-微管蛋白(Tuj-1)抗体进行荧光染色的结果的图像，所述抗体是神经元和神经纤维的标记物。通过荧光显微镜观察神经纤维并成像。

在图7b中，在MCAO手术的第5天，显示出Tuj-1阳性反应的神经纤维的表达降低了50％或更多。然而，证实了以2mg/mL的浓度比以1mg/mL的浓度下施用滴眼剂更有效，并且施用KIOM-2015EE(2mg/mL)的滴眼剂施用比KIOM-2015EW(2mg/mL)更有效。此外，证实口服给药在RGC神经纤维降解方面比滴眼剂给药更有效。图7b示出了说明从图像中随机选择五个图像并且使用ImageJ程序以像素值获得显示对Tuj-1的阳性反应的荧光密度的结果的图像，并且表示为相对于对照组的平均值(％)。以100×放大率拍摄图像。

实验证实KIOM-2015E在缺血性视网膜神经变性动物模型中抑制神经胶质细胞和星形胶质细胞的活性(在fMCAO诱导的缺血性损伤后KIOM-2015E介导的星形胶质细胞活化的阻断)

以与实验实施例2-1中相同的方式进行免疫荧光染色。图8a显示了使用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行荧光染色的结果的图像，所述抗体是神经胶质细胞和星形胶质细胞的标记物。通过荧光显微镜观察星形胶质细胞并成像。

星形胶质细胞和神经胶质细胞是在受损区域周围活化的神经胶质细胞。当组织中发生损伤时，这些细胞经常被激活，并且证实GFAP水平(即星形胶质细胞的标记物)的增加/减少。在MCAO手术后第5天，证实GFAP表达水平显著增加，并且还从图8b中确认表达水平由KIOM-2015E显著降低。图8b显示了说明从图像中随机选择五个图像的结果的图像，并且使用ImageJ程序以像素值获得显示对GFAP的阳性反应的荧光密度，并表示相对于对照组的平均值(％)。以100×放大率拍摄图像。

实验证实KIOM-2015E在缺血性视网膜神经变性的动物模型中视网膜组织学的变化(苏木精和伊红染色的视网膜切片的代表性显微照片)

为了确认视网膜的组织学变化，将收集的眼球固定在4％PFA溶液中，最后渗入石蜡以嵌入组织并使用切片机切成3μm的厚度。在干燥炉中1小时除去石蜡并随后水合后，将组织用苏木精和伊红溶液染色5分钟，洗涤并固定，并通过显微镜检查视网膜的形态学和组织学变化。

从图9a中观察到，在MCAO手术后第5天，由于内丛状层(IPL)的肿胀，视网膜组织的厚度增加，并且神经节细胞层(GCL)中的细胞数量显著减少。另外，证实了感光细胞层和外部区段的结构被移位或是不规则的。然而，观察到所有组中的这种变化都被抑制，包括滴眼剂给药组和KIOM-2015E的口服给药组(图9b)。图9b显示了从图像中随机选择五个图像并计算神经节细胞层中剩余的细胞数的结果的图，并表示相对于对照组的平均值(％)。以100×放大率拍摄图像。

实验证实KIOM-2015E在缺血性视网膜神经变性动物模型中抑制视网膜组织细胞死亡(TUNEL试验后视网膜的代表性图像和DAPI对比染色)

根据手册进行TUNEL测定(Roche Diagnostics，目录号11684795910)，以证实KIOM-2015E对MCAO手术诱导的细胞毒性和细胞死亡的影响，以及通过荧光显微镜获得TUNEL阳性细胞的图像。

从图10中观察到，在MCAO手术后第5天，除神经节细胞层外，还观察到TUNEL阳性反应的内核层和外核层。另外，证实了在包括KIOM-2015E的滴眼剂和口服用药的所有给药组中显示出TUNEL阳性应答的细胞数减少。以100×放大率拍摄图像。

从上述内容可以看出，枫叶提取物可以增加OPNISW、Brn3a和Tuj-1的表达水平，同时防止视网膜损伤和降低引起视网膜疾病的蛋白质的表达水平，并且确认了视网膜疾病使用根据本发明的药物组合物可以预防或治疗疾病。

综上所述，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本发明的技术概念或本质特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。在这方面，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，不应解释为限制本发明的范围。相反，本发明不仅要涵盖示例性实施例，还要涵盖可以包括在由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替换、修改、等同物和其他实施例。

Claims

1.一种用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，包含枫叶提取物或其级分。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述视网膜疾病是选自由视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、高血压性视网膜病变、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、感觉神经视网膜炎症、视网膜色素上皮炎症、视网膜色素变性、血管样条纹、玻璃疣、孔源性视网膜脱离、非孔源性视网膜脱离、黄斑变性、黄斑营养不良、糖尿病视网膜病变、视网膜动静脉闭塞、高血压性视网膜病变、视网膜主动脉瘤、视网膜缺血综合征、放射性视网膜病变、早产儿视网膜病变、急性视网膜坏死、视网膜炎、视网膜脉络膜炎、视网膜脱离、视网膜肿瘤、创伤造成的视网膜损伤和光线造成的视网膜损伤组成的组中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物降低选自由切割的PARP、GFAP和巢蛋白组成的组中的至少一种的表达。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物增加选自由OPNISW、Bm3a和Tuj-1组成的组中的至少一种的表达。

5.一种治疗视网膜疾病的方法，包括将根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物给予受试者。

6.一种用于改善视网膜疾病症状的食品组合物，包含枫叶提取物或其级分。

7.一种用于改善视网膜疾病症状的饲料组合物，包含枫叶提取物或其级分。