CN110386991A - 乌饭子多糖提取工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乌饭子多糖提取工艺及其应用。提取工艺包括如下步骤:取采集过来的新鲜乌饭子,洗净晾干、冷冻干燥并粉碎后过筛;然后用乙酸乙酯除去乌饭子粉末中的各种单糖及脂溶性色素类物质。以蒸馏水为抽提剂,进行超声波提取,冷冻离心、旋蒸浓缩、低温沉降及洗涤杂质和冷冻干燥后,得到乌饭子多糖。本发明通过单因素实验和Box‑Behnken中心组合响应面试验设计优化乌饭子多糖的提取工艺,筛选出最优提取工艺,并研究乌饭子多糖的抑菌作用。本发明首次对乌饭子多糖的提取工艺及其应用进行研究,方法操作方便,目的产物提取率和纯度较高。乌饭子多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、红酵母及青霉均具有较强的抑菌、杀菌活性,因而具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于提取分离领域,涉及一种多糖的提取工艺及其应用,特别是涉及一种乌饭子多糖的提取方法,以及该多糖物质的抗菌、抑菌应用。
背景技术
乌饭,又名南烛,拉丁学名为Vaccinium bracteatum Thunb。常绿灌木或小乔木,高2-6米;分枝多,幼枝被短柔毛或无毛,老枝紫褐色,无毛。叶片薄革质,椭圆形、菱状椭圆形、披针状椭圆形至披针形;叶柄长2-8毫米,通常无毛或被微毛。总状花序顶生和腋生,长4-10厘米,有多数花,序轴密被短柔毛稀无毛;苞片叶状,披针形,长0.5-2厘米,两面沿脉被微毛或两面近无毛,边缘有锯齿,宿存或脱落,小苞片2,线形或卵形,长1-3毫米,密被微毛或无毛;花梗短,长1-4毫米,密被短毛或近无毛;萼筒密被短柔毛或茸毛,稀近无毛,萼齿短小,三角形,长1毫米左右,密被短毛或无毛;花冠白色,筒状;花盘密生短柔毛。浆果直径5-8毫米,熟时紫黑色,外面通常被短柔毛,稀无毛。花期6-7月,果期8-10月。乌饭子有很高的药用价值,如:助阳补阴、明目壮肾、养血止血及涩肠固精等功效。
目前,有关乌饭子研究主要集中在乌饭子果酒、乌饭子牛奶饮料、乌饭子果酒等方面的研究。而有关乌饭子多糖的研究尚未见报道。本方法通过优化的乌饭子多糖提取工艺对乌饭子多糖进行提取、制备,并对其抗菌、抑菌作用进行科学评价,对于进一步开发和利用乌饭子这种优质植物资源具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供一种乌饭子多糖提取工艺,以乌饭子多糖得率为评价指标,通过单因素实验和响应面试验设计对超声波辅助提取乌饭子多糖的工艺进行优化,并对乌饭子多糖的抗菌、抑菌作用进行研究。旨在得到乌饭子多糖的最优提取工艺条件和应用范围,为其进一步开发应用提供科学依据。本发明所述的乌饭子多糖的提取工艺包括以下步骤:
(1)原料预处理:取新鲜乌饭子,洗净并晾干表面水后,冷冻干燥后粉碎,过筛,备用;
(2)原料中单糖和色素的去除:在步骤(1)所得的乌饭子粉末中加入与其液料比为10:1(mL/g)的乙酸乙酯,然后通过真空抽滤去除乙酸乙酯溶液,然后将乌饭子粉末进行冷冻干燥;
(3)乌饭子多糖超声提取:在步骤(2)蒸馏水与乌饭子粉末的液料比为(15~35):1,提取温度为35~75℃,超声波功率为60~300W,超声提取时间为10~50min;超声完成后将反应体系进行离心,得到乌饭子多糖粗提液;
(4)乌饭子多糖粗提液的分离纯化:将步骤(3)制得的乌饭子多糖粗提液进行旋蒸浓缩,然后在4℃低温沉析,真空抽滤并用丙酮和无水乙醇先后缓慢倒入,边抽滤边洗涤多糖沉淀物,最后将所得到的多糖进行冷冻干燥,得到高纯度的乌饭子多糖。
优选的,所述步骤(1)过筛时筛子目数为60目。
优选的,所述步骤(3)提取温度为45℃~65℃;蒸馏水与乌饭子粉末的液料比为20~30:1;超声波功率为120~240W;超声提取时间为30~50min。
优选的,所述步骤(3)中提取温度为64℃;
优选的,所述步骤(3)中乙醇溶液与乌饭子粉末的液料比为25:1;
优选的,所述步骤(3)中超声波功率为120W;
优选的,所述步骤(3)中超声提取时间为41min。
进一步的,本发明所述的提取工艺制得的乌饭子多糖。
进一步的,本发明所述的乌饭子多糖在制备抑菌或杀菌产品的应用。
本发明制得的抑菌或杀菌产品,可以应用于食品、药品、保健品中。
有益效果:本发明提供了一种乌饭子多糖提取工艺及其应用,本发明与现有技术相比,其显著优点在于:第一,本发明首次利用优化工艺提取分离、纯化得到高纯度的乌饭子多糖。第二,本发明首次对乌饭子多糖的抗菌、抑菌活性进行了研究,通过试验结果得出,本发明提取的乌饭子多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、红酵母及青霉均具有较强的抑菌、杀菌活性。第三,本发明采用目前最优的提取技术--超声波技术,并结合单因素和响应面设计方法优化乌饭子多糖提取工艺,确保了提取工艺条件准确可靠,具有安全、经济等特点,与传统浸提相比,提取效率明显提高,适用于大规模生产。
附图说明
图1 乌饭子多糖红外吸收光谱图
图2为乌饭子多糖提取工艺及分析的工艺流程图;
图3为超声波功率对乌饭子多糖得率的影响结果图;
图4为超声提取时间对乌饭子多糖得率的影响结果图;
图5为蒸馏水与乌饭子粉末的液料比对乌饭子多糖得率的影响结果图;
图6为提取温度对乌饭子多糖得率的影响结果图;
图7为超声波功率与超声提取时间交互作用对乌饭子多糖得率影响的响应面和等值线图;
图8为超声波功率与提取温度交互作用对乌饭子多糖得率影响的响应面和等值线图;
图9为超声波功率与液料比交互作用对乌饭子多糖得率影响的响应面和等值线图;
图10为超声提取时间与提取温度交互作用对乌饭子多糖得率影响的响应面和等值线图;
图11为超声提取时间与液料比交互作用对乌饭子多糖得率影响的响应面和等值线图;
图12为提取温度与液料比交互作用对乌饭子多糖得率影响的响应面和等值线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1:乌饭子多糖的提取工艺优化及成分分析
步骤1:取9月中旬采集的乌饭子,用清水洗净,在常温下晾干外表水,将其冷冻干燥并粉碎,过60目筛后备用;
步骤2:将步骤1所得乌饭子粉末中加入与其液料比为10:1的乙酸乙酯进行去除单糖和色素杂质。
步骤3:向步骤2所得乌饭子粉末中加入与其液固mL/g比分别为15:1、20:1、25:1、30:1、35:1的提取剂(蒸馏水);提取温度分别为35℃、45℃、55℃、65℃和75℃;超声波功率分别为60W、120W、180W、240W、300W的条件下,超声萃取10min、20min、30min、40min、50min,然后离心,将所得离心液旋蒸浓缩后进行冷冻干燥,得到乌饭子粗多糖,接着进行低温沉析,真空抽滤并用丙酮和无水乙醇先后缓慢倒入,边抽滤边洗涤多糖沉淀物,最后进行冷冻干燥,得到纯化后的乌饭子多糖。
步骤4:将步骤3初步优选出的各个多糖提取的影响因素:液料比为20:1、25:1、30:1,超声波功率为120W、180W、240W的条件下,超声萃取30 min、40 min、50min;提取温度为45℃、55℃、65℃,利用这些不同的影响因素的3个水平,采用响应面设计优化乌饭子多糖提取工艺。
步骤5:在单因素试验基础上,根据Box-Behnken的中心组合设计原理,以超声提取时间、超声波功率、提取温度和液料比四个因素为自变量(分别以A、B、C、D表示),以乌饭子多糖得率为响应值设计了四因素三水平共29个实验点的响应面分析实验,其中分为24个析因点和5个零点。
1.响应面试验
(1)响应面试验具体包括如下几个方面实验:
A:超声提取时间(30min~50min)对乌饭子多糖得率的影响
B:超声波功率(120W~240W)对乌饭子多糖得率的影响
C:提取温度(45℃~65℃)对乌饭子多糖得率的影响
D:液料比(20:1~30:1)对乌饭子多糖得率的影响
(2)响应面试验设计表:
表1 响应面分析试验设计表
Table1 Factors and their coded levels in response surface methodology
实验以随机次序进行,将实验所得的乌饭子多糖得率用Design-Expert 8.06程序进行分析,并得出回归拟合方程以及方差分析表及响应面分析图。响应面实验设计与结果见表2。
表2 响应面中心组合实验方案及结果
Table2 Experimental design and corresponding results for response surfacemethodology
(3)模型的建立与方差分析
根据Box-Behnken中心组合设计原理,利用Design-Expert.V8.0.6软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合,可得超声波功率、超声提取时间、液料比和超声提取温度乌饭子多糖得率R之间相互关系的二次多元回归方程:
R=0.095+2.639E-003*A-4.517E-003*B+3.511E-003*C-8.128E-003*D+2.608E-003*A*B-2.925E-003*A*C-1.667E-005*A*D+3.083E-004*B*C-5.650E-003*B*D-7.667E-003*C*D-7.438E-003*A2-5.971E-003*B2-6.396E-003* C2-5.472E-005* D2
式中A、B、C和D的各项系数的绝对值大小直接反映出各因素对乌饭子多糖得率的影响程度,系数的正负反映出乌饭子多糖得率增加或减小。对表2中的实验结果进行统计分析,分析结果如表3所示。
表3回归模型方差分析表
Table3 Analysis of variance for the fitted regression model
方差源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | Prob>F |
Model | 2.37E<sup>-03</sup> | 14 | 1.69E<sup>-04</sup> | 9.62 | < 0.0001*** Significant |
A-液料比 | 8.36E<sup>-05</sup> | 1 | 8.36E<sup>-05</sup> | 4.75 | 0.0468* |
B-提取时间 | 2.45E<sup>-04</sup> | 1 | 2.45E<sup>-04</sup> | 13.92 | 0.0022** |
C-提取温度 | 1.48E<sup>-04</sup> | 1 | 1.48E<sup>-04</sup> | 8.41 | 0.0116** |
D-超声波功率 | 7.93E<sup>-04</sup> | 1 | 7.93E<sup>-04</sup> | 45.08 | < 0.0001*** |
AB | 2.72E<sup>-05</sup> | 1 | 2.72E<sup>-05</sup> | 1.55 | 0.2339 |
AC | 3.42E<sup>-05</sup> | 1 | 3.42E<sup>-05</sup> | 1.95 | 0.1847 |
AD | 1.11E<sup>-09</sup> | 1 | 1.11E<sup>-09</sup> | 6.32E<sup>-05</sup> | 0.9938 |
BC | 3.80E<sup>-07</sup> | 1 | 3.80E<sup>-07</sup> | 0.022 | 0.8852 |
BD | 1.28E<sup>-04</sup> | 1 | 1.28E<sup>-04</sup> | 7.26 | 0.0174* |
CD | 2.35E<sup>-04</sup> | 1 | 2.35E<sup>-04</sup> | 13.37 | 0.0026** |
A^2 | 3.59E<sup>-04</sup> | 1 | 3.59E<sup>-04</sup> | 20.41 | 0.0005*** |
B^2 | 2.31E<sup>-04</sup> | 1 | 2.31E<sup>-04</sup> | 13.15 | 0.0027** |
C^2 | 2.65E<sup>-04</sup> | 1 | 2.65E<sup>-04</sup> | 15.09 | 0.0017** |
D^2 | 1.94E<sup>-08</sup> | 1 | 1.94E<sup>-08</sup> | 1.11E<sup>-03</sup> | 0.974 |
Residual | 2.46E<sup>-04</sup> | 14 | 1.76E<sup>-05</sup> | ||
Lack of Fit | 1.79E<sup>-04</sup> | 10 | 1.79E<sup>-05</sup> | 1.07 | 0.5185 Not significant |
Pure Error | 6.71E<sup>-05</sup> | 4 | 1.68E<sup>-05</sup> | ||
Cor Total | 2.61E<sup>-03</sup> | 28 |
备注:表3中Prob>F小于0.05时表示有显著影响,用*表示,Prob>F值小于0.01时表示有极显著影响,用**表示,Prob>F值小于0.001时表示有极显著影响,用***表示,而当Prob>F值大于0.05时,则表示影响不显著。
由表3可知,模型的四个一次项对乌饭子多糖得率都有显著影响,其中超声波功率(D)影响最显著,说明超声波功率直接关系到乌饭子多糖的得率,其次是超声提取时间(B),而液料比(A)和提取温度(C)对乌饭子多糖得率影响较小。二次项中的液料比(A2),超声提取时间(B2)和提取温度(C2)均对乌饭子多糖得率有显著影响,且其影响呈二次关系。由F值可知,各因素对乌饭子多糖得率的影响次序为:超声功率>超声提取时间>液料比>提取温度。整体模型的Prob>F值小于0.01,表明该回归模型达到极显著水平;回归模型的相关系数R2=0.9058(Radj2=0.8117),且失拟项不显著(Prob>F值为0.5185>0.05),说明模型与数据之间拟合度较好,因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。同时做出中心组合设计试验所得的6组响应面曲面图,参见附图。
(4)乌饭子多糖最佳提取条件的预测与检验
响应面图形是特定的响应值Y对应的因素A、B、C、D构成的一个三维空间在二维平面上的等高图,可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。图中可看到拟合曲面有最大值,对拟合方程求偏导,可得出模型最大值,即为最优的试验方案。
在实验范围内,通过Design- Expert.V8.0.6软件对回归方程分析预测,得出乌饭子多糖的最优提取工艺条件为:超声波功率为120W,超声提取时间为41min,液料比为25:1,超声提取温度为64℃,理论最高得率为10.81%。
为验证响应面分析法所得结果的可靠性,采用上述优化条件进行试验,按照前面所述提取分离纯化流程操作,最后乌饭子多糖得率的平均值为10.67%,与预测得率的误差为1.3%。说明了回归方程的预测值与试验值之间具有较好的拟合度。因此,基于Box-Behnken中心组合设计的响应面法所得的优化工艺参数准确可靠,具有较好的实用价值。
(5) 乌饭子总多糖分析
a、乌饭子中总多糖含量测定
以前面处理好的乌饭子粉末为原料,准确称取90.00g(三组重复,每组30g),在前面所得的优化工艺条件组合下下提取3次,将3次所得提取液旋转蒸发至近干,在4℃低温下沉析过夜,真空抽滤、洗涤除杂并冷冻干燥,得到乌饭子总纯多糖含量为乌饭子干物质的11.78%。
b、乌饭子多糖提取物纯度、得率及提取率测定
通过苯酚硫酸法,以葡萄糖为标准品,对实验所得的乌饭子多糖提取物的纯度进行了测定,测得其纯度为42%,符合多糖类保健食品及食品添加剂的要求。由乌饭子多糖提取物得率为10.67%,纯度为42%来计算,乌饭子总多糖的最后得率为干物重的4.48%,即:每100g乌饭子干物质,可得4.48g乌饭子总多糖。根据在最有工艺条件下乌饭子所得总多糖为干物质的10.67%,而由乌饭子中总多糖为干物质的11.78%可知,乌饭子总多糖的提取率达90.6%。
c、乌饭子多糖结构红外初步解析
乌饭子多糖的红外吸收光谱如图1所示。乌饭子多糖在3398cm-1处有吸收,这是多糖中O-H的伸缩振动,波峰较宽,可知分子间的羟基出现结合,并不处于游离状态;3200cm-1处的吸收的一组峰是糖类C-H伸缩振动;在1400cm-1左右处的吸收是C-H的变角振动,根据对以上波峰的分析,可基本确定该物质为糖类化合物。
此外,在1650cm-1左右处的吸收峰是-CHO的C=O的伸缩振动引起的,为肽键上酰胺羰基吸收峰,这说明乌饭子多糖是一种含有蛋白质的糖缀合物;在1200-1000cm-1处的吸收属于吡喃环中的伸缩振动,因此乌饭子多糖具有吡喃环结构。
图1 乌饭子多糖红外吸收光谱图
实施例2:乌饭子多糖抑菌作用
步骤1:乌饭子多糖制备
取乌饭子干燥粉末1000g,利用实施例1中所得的乌饭子多糖优化提取工艺(超声波功率为120W,超声提取时间为41min,液料比为25:1,超声提取温度为64℃,进行乌饭子多糖制备,分离纯化,多糖冷冻干燥后得到100.1g浅黄色多糖,乌饭子多糖的得率为10.01%。
步骤2:乌饭子多糖抑菌作用
(1)供试菌种:
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、红酵母及青霉(以上菌种均由苏州科技大学微生物实验室提供)。
(2)培养基:
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂1.5%~2.0%(液体培养基不含琼脂)、水1000mL,pH7.0~7.2(使用1.0mol/L的NaOH溶液调节pH)。
马铃薯葡萄糖培养基:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15~20g、蒸馏水1000 mL,自然pH。
(3)菌悬液的配制:
从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的液体培养基中,放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期。分别吸取以上培养时间的供试菌液0.5mL,加入无菌水倍比稀释到105~106mL-1,备用。
(4)供试药物:
阳性对照:头孢拉定和山梨酸钾;样品:实施例2所得的乌饭子多糖。
(5)抑菌活性的测定:
采用滤纸片法测定抑菌活性。使用打孔器,将定性滤纸制成小圆纸片(D=6mm),高压灭菌后备用。无菌条件下,在已灭菌的培养皿中倾入相应菌种的培养基25.00mL,冷却凝固后制成固体平板。将上述接种活化好的各种菌分别取适量初试菌悬液用生理盐水将其稀释成含菌量为106~107CFU/mL的菌悬液备用(其中真菌采用显微镜血球计数板计数,用接种环挑取真菌于无菌生理盐水中,调整稀释均匀后吸取一部分置于血球计数板中,使得其在显微镜下观测视野中每个中方格中孢子数为14~18个,成为106~107个/mL的孢子菌悬液)。
将灭完菌的干燥的滤纸片用镊子夹到配制好的溶液(用DMSO稀释配制)中浸泡30min,用无菌镊子在试管壁上弄去多余溶液,放到上述的各个含菌培养皿上,每个培养皿上放置三片滤纸片,细菌于37℃倒置培养24h,真菌于28℃倒置培养48h后观察结果。到培养时间后取出培养皿观察透明抑菌圈,采用十字交叉法用测微尺测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径大小,取其平均值(mm)为测定结果,每项抑菌实验均平行重复3次。以抑菌圈直径的大小来进行抑菌活性强弱的判定,抑菌圈表现得越大,则表明其抗菌活性也就越强。
(6)实验结果
抑菌活性测定结果如表4所示。
表4 乌饭子多糖对各种微生物作用的抑菌圈大小(mm)
菌种 | 乌饭子多糖浓度 | 乌饭子多糖的抑菌圈大小(mm) | 阳性对照物 | 阳性对照的抑菌圈大小(mm) | 阴性对照 |
大肠杆菌 | 15mg/mL | 27.12±0.7 | 头孢拉定 | 37.94±1.3 | 0 |
枯草芽孢杆菌 | 15mg/mL | 24.46±0.7 | 头孢拉定 | 37.20±0.9 | 0 |
金黄色葡萄球菌 | 15mg/mL | 26.68±0.4 | 头孢拉定 | 38.16±0.3 | 0 |
红酵母 | 100mg/mL | 16.20±0.9 | 山梨酸钾 | 18.78±1.2 | 0 |
灰绿青霉 | 100mg/mL | 14.22±0.4 | 山梨酸钾 | 17.58±0.6 | 0 |
由表4可知,实施例2所得的乌饭子多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均具有较强的抑菌活性,且对大肠杆菌的抑菌活性最强。同时,乌饭子多糖对红酵母及灰绿青霉也有一定的抑制作用。
通过以上实例可以发现,乌饭子多糖除具有一般营养物质活性以外,同时具有较好的抗菌、抑菌功能,对于乌饭子的研究开发具有重要的实践意义和应用前景。
Claims (10)
1.乌饭子多糖的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺包括以下步骤:
步骤1,取采集过来的新鲜乌饭子,洗净晾干、冷冻干燥并粉碎后过筛;
步骤2,在步骤(1)所得的乌饭子粉末中加入与其液料比为10:1(mL/g)的乙酸乙酯,然后通过真空抽滤去除乙酸乙酯溶液,然后将乌饭子粉末进行冷冻干燥;
步骤3,在步骤2所得乌饭子粉末中按15~35 mL/g的比例加入石油醚,提取温度为35℃~75℃,超声波功率为60W~300W的条件下,超声萃取时间为10~50min,真空抽滤,旋蒸浓缩,低温沉降,抽滤并除杂后冷冻干燥,得乌饭子多糖。
2.根据权利要求1所述的乌饭子多糖的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中乌饭子粉末中加入与其液料比为20~30 mL/g的石油醚;提取温度为45℃~65℃;超声波功率为120W~240W;超声萃取时间为30min~50min。
3.根据权利要求1所述的乌饭子多糖的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中液料比为25mL/g。
4.根据权利要求1所述的乌饭子多糖的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中超声波功率为120W。
5.根据权利要求1所述的乌饭子多糖的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中超声提取时间为41min。
6.根据权利要求1所述的乌饭子多糖的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中提取温度为64℃。
7.根据权利要求1至6任一所述的乌饭子多糖的提取工艺,其特征在于,所述的提取工艺中粉末过筛时筛子目数为60目。
8.根据权利要求1至6任一所述的乌饭子多糖的提取工艺制备得到的乌饭子多糖。
9.根据权利要求8所述的乌饭子多糖的抑菌或杀菌用途。
10.根据权利要求9所述的乌饭子多糖的抑菌、杀菌用途,其特征在于所述的乌饭子多糖在食品、化妆品、保健品等行业中的抑菌、杀菌用途。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20191029 |