CN115251094B - 食品包装用箬叶抑菌活性提取物的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的食品包装用箬叶抑菌活性提取物及提取工艺，分别用水、pH4盐酸溶液、pH4乙酸溶液、pH10氨水溶液，30％、60％、80％、95％乙醇、乙酸乙酯9种提取溶剂，采取超声法、回流法和浸提法三种提取方法，获取箬叶不同提取物；采用改进的牛津标法做抑菌活性验证，通过比较，发现箬叶水提取物对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌的抑菌效果最好，且非常显著，且热稳定性和酸稳定性良好，作为食品添加剂、化妆品和日用化工原料，应用前景广阔，使用价值极高。
Description
技术领域
本发明涉及箬叶加工技术领域，尤其是指食品包装用箬叶抑菌活性提取物及提取方法。
背景技术
致病菌和腐败菌对人身体健康和食品安全有严重的影响，化学合成防腐剂如山梨酸、苯甲酸等过量使用存在一定的食品安全问题；人类生产和生活中抗生素的广泛使用，不但造成药物残留污染，而且使一些致病菌产生不同程度的耐药性。因此，植物源天然防腐抑菌剂越来越受人们青睐。
粽叶是深受人们欢迎的天然食品包装材料，主要是禾本科竹亚科箬竹属(Indocalamus Nakai)植物的叶，即箬叶。我国箬竹约有20种以上，主要分布在长江流域以南地区，资源非常丰富，湖南至少有粽叶生产企业131家。从食品包装角度分析，箬叶提取物具有一定的防腐抑菌功效，是很好的植物源天然防腐抑菌剂来源。
发明内容
本方案的食品包装用箬叶抑菌活性提取物及提取方法是在对箬叶传统认识和利用基础上，以常见致病菌(痢疾志贺氏菌和沙门氏菌)和腐败菌(枯草杆菌和铜绿假单胞菌)为试验菌，选择阔叶箬竹叶为材料，采用牛津杯法，通过测定抑菌圈直径的大小，研究提取物提取工艺及其抑菌活性。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：食品包装用箬叶抑菌活性提取物的提取方法，它包括有以下步骤：
第一步骤：菌悬液制备：
选取菌种，并接入菌种培养基，在34-40℃的温度下培养20-26h，使菌种复壮，按8-12倍稀释法，取适当稀释倍数的菌悬液；将菌悬液接种于菌悬液培养基中，在34-40℃的温度下培养20-26h，即成菌悬液；
第二步骤：抑菌培养基制备：
1)底层培养基制备
将抗生素检定培养基倒入注有蒸馏水的瓶中，加热溶解后置于不同的培养皿中，冷却凝固，即得底层培养基；
2)菌层培养基制备
按质量份取1)配制的底层培养基注入无菌瓶内，然后接入菌悬液，混匀，即成菌层培养基；
第三步骤：培养试验菌平板制备
在1)步骤的底层培养基中，加入与2)步骤制备的菌层培养基，迅速水平自流平铺均匀，冷却凝固，置于36-37℃中培养15-16h，即得培养试验菌平板；
第四步骤：箬叶处理
将待检箬叶洗净，50～55℃烘干，粉碎，过42目标准筛，封装备用；
第五步骤：提取物制备
1)溶剂提取：称取一定质量的箬叶粉未，加入12倍提取溶剂，回流15min，浸泡20-26h，再超声时间20-30min，重复2次；
2)提取物：合并1)的2次提取液，经旋转蒸发，减压浓缩，即成箬叶提取物。
本发明采取超声法、回流法和浸提法三种提取方法，获取箬叶不同提取物；通过比较研究，发现箬叶水提取物对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌的抑菌效果显著，且热稳定性和酸稳定性良好，应用前景广阔，使用价值极高。
附图说明
图1为本发明的正交试验的因素和水平。
图2为本发明的试验菌在4种培养基上的生长情况表。
图3为本发明的箬叶不同溶剂提取物的抑菌效果(抑菌圈直径/mm)。
图4为本发明的庆大霉素标准系列对4种试验菌的抑菌效果图表(抑菌圈直径/mm)。
图5为本发明的不同提取方法箬叶提取物的抑菌效果图表(抑菌圈直径/mm)。
图6为本发明的正交试验结果与分析图表(抑菌圈直径/mm)。
图7为本发明的最佳提取物最低抑菌浓度图表(抑菌圈直径/mm)。
图8为本发明的温度和酸碱度对最佳提取物抑菌效果的影响(抑菌圈直径/mm)。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明，本发明的较佳实施例为：
到目前为止，国内外对箬叶研究主要关注其营养物质和元素含量，以及挥发油、总黄酮、多糖等活性物质的提取、分离与测试，其中黄酮类、多糖、酚酸类、萜类、生物碱等都有着较强的抑菌杀菌作用，对提取物防腐抑菌的研究仍然不足，文献非常有限，研究方法局限。李俊超等研究了箬叶提取物对烟草病原真菌的抑制作用；孙克奎研究了箬叶多糖提取纯化及其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用；乐薇等和吉瑞冬等研究了箬叶总黄酮提取和对细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)、真菌(白色念珠菌、酿酒酵母菌、青霉菌)的抑菌效果；何舟等研究了箬叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活性的影响；邓龙兴等研究了箬竹叶粗提物对深绿木霉和烟草链格孢菌生长率的影响；Sun Jia等用95％乙醇溶液对箬叶抗菌成分进行提取、分离，发现其中10种化合物对金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有抗菌活性。上述抑菌文献研究方法单一，均为滤纸片法，滤纸片吸附性无定量指标，培养基专属性不强，试验菌种不多，没有覆盖铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌，在培养基上用涂布棒手工涂布菌膜，菌膜难以均匀，抑菌效果没有与抗生素作定量比较，研究方法非常局限。
本实施例以枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌为试验菌种对箬叶进行抑菌活性提取物，本实施例主要原料及设备为：
阔叶箬竹的叶，采自怀化市洪江区，用粉碎机粉碎，过42目标准筛，样品粉末用塑料袋封存，备用；牛津杯(8mm×6mm×10mm)；细胞培养皿，100mm。
供试菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501、铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginoda(Schroeter)Migula]ATCC9027-1、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)CMCC(B)51252和伤寒沙门氏菌(S.typhi)CMCC(B)50071，均为1代菌瓷珠，-80℃保存。
试剂，抗生素检定培养基1号(pH6.5-6.6)、抗生素检定培养基2号(pH7.8-8.0)、抗生素检定培养基3号(pH6.5-6.6)和抗生素检定培养基4号(pH7.8-8.0)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；营养琼脂培养基和营养肉汤培养基，北京陆桥技术股份有限公司；庆大霉素(国家药品标准物质，批号130326-201716，中国食品药品检定研究院)，用无菌水稀释成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL标准系列溶液。
95％乙醇(AR)，盐酸(GR)，氨水(GR)，冰醋酸(AR)，乙酸乙酯(色谱纯)，水为纯化水，0.85％生理盐水。
FD-15-T250A型中药材高速粉碎机，上海市闵行区舰艇工贸有限公司；S220型pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海雅荣生化仪器设备有限公司；LMQ.C-80E型立式灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；1374型Ⅱ级A2生物安全柜，赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；DW-HL388型超低温冰箱，中科美菱低温科技股份有限公司；SPX-150型生化培养箱，上海金慧科电子有限公司；9960B型超声清洗机，天津科贝尔光电技术有限公司；GZX-9140MBE电热恒温干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司。
本实施例的提取方法包括有以下步骤：
第一步骤：试验菌种复壮和菌悬液制备
取试验菌枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌菌种瓷珠各1颗，分别接入100mL营养肉汤培养基，36.5℃培养24h，使菌种复壮，按10倍稀释法，取适当稀释倍数的菌悬液，分别取1mL，接种于营养琼脂培养基中，36.5℃培养24h，通过菌落计数，测定菌悬液的细菌浓度，取浓度约1×107cfu/mL的菌悬液用于抑菌试验；
第二步骤：抑菌试验培养基的选择
1)制备底层培养基
分别称取29.5g抗生素检定培养基1号(pH6.5-6.6)、抗生素检定培养基2号(pH7.8-8.0)、抗生素检定培养基3号(pH6.5-6.6)和抗生素检定培养基4号(pH7.8-8.0)，于盛有1000mL蒸馏水的三角瓶中，加热溶解，115℃高压灭菌30min，各取约20mL于不同的培养皿中，冷却凝固，得4种底层培养基平板；
2)制备菌层培养基
取200mL无菌广口瓶16个，分成4组，每组依次加入1)配制的抗生素检定培养基1号(pH6.5-6.6)、抗生素检定培养基2号(pH7.8-8.0)、抗生素检定培养基3号(pH6.5-6.6)和抗生素检定培养基4号(pH7.8-8.0)4种培养基各100mL，再依次接入1mL浓度大约为1×107cfu/mL枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌的4种菌悬液，混匀，制成16种不同菌层培养基，趁热迅速接种；
第三步骤：制作和培养试验菌平板
在1)步骤的4种平板中，趁热依次加入5mL与底层培养基相对应的2)步骤的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌菌层培养基，迅速水平自流平铺均匀，冷却凝固，共得16个不同的试验菌平板，于36.5℃培养15～16h，观察不同培养基上试验菌的生长情况；
第四步骤：箬叶处理
将箬叶鲜叶洗净，50～55℃烘干，粉碎，过42目标准筛，封装备用；
第五步骤：提取物制备
不同溶剂提取：称取箬叶粉未10g于250mL三角瓶中，加入提取溶剂100mL，回流15min，浸提24h，再超声时间30min，重复2次，合并2次提取液，经旋转蒸发，减压浓缩，定容至10mL，相当于每毫升试液含1g干样，即含生药1g/mL的试样液，用不同溶剂提取箬叶提取物。
不同方法提取：称取3份箬叶粉未，每份10g，选一种提取溶剂，按1:10料液比，分别用超声法(频率40KHZ，功率400W，温度45℃，提取时间30min)、回流法(回流温度100℃，时间60min)和浸提法(室温，提取时间24h)三种方法，提取2次，提取液经旋转蒸发，减压浓缩，制成含生药1g/mL的试样液，获得同一溶剂不同方法的提取物。
第六步骤：抑菌试验
以枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌4种试验菌为指示菌，抑菌圈直径为评价标准，庆大霉素标准系列为对照，用牛津杯法，对第五步骤制备的提取物开展抑菌试验。用筛选的抗生素检定培养基，按第二步骤方法制备试验菌平板，用无菌镊子在平板中轻轻水平放置无菌牛津杯4个，在牛津杯中加入0.283mL提取物或对照品，操作中不能使试液溢出牛津杯，同时做试剂空白和平行试验，在36.5℃生化培养箱中培养15～16h，观察抑菌效果，测定抑菌圈直径，计算平均值。
选取因素料液比、超声时间和超声次数三个因素，分别用A、B、C表示，设定料液比为1∶10、1∶12、1∶16，超声次数2、3、4次，超声时间为35、45、55min，三个因素水平，如图1，按L9(33)正交试验提取箬叶抑菌提取物，制成含生药1g/mL的试样液，按第六步骤对试验提取物进行抑菌实验，测定抑菌圈直径，比较抑菌效果，找到最佳提取工艺参数，获取最佳提取物。
最低抑菌浓度的测定：
采用二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。从上述试验中得到的最佳提取物最初含生药浓度1.00g/mL，先用无菌水稀释十倍，得0.100g/mL的试液，再按二倍稀释法稀释得0.0500、0.0250、0.0125、0.00625、0.00312g/mL 5个提取物系列溶液系列。按第六步骤对最佳提取物系列溶液进行抑菌试验，以抑菌圈为考核指标，测定最低抑菌浓度。
取30mL最佳提取物试液，平均分成6份，分别装入无菌顶空瓶中，封口，其中3份分别于60、80、100℃恒温干燥箱中处理35min后，冷却到室温；另2份分别用盐酸溶液和氨水溶液调至pH4和pH10，剩余1份未处理，然后按第六步骤对处理前后试液进行抑菌试验，以抑菌圈直径为评价指标，分析最佳提取物的稳定性。
在第二步骤方法中，用4种抗生素检定培养基，在相同条件下对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌4种试验菌进行培养，试验菌的生长情况如图2。
图2结果显示，抗生素检定培养基4号(pH7.8-8.0)同时满足4种试验菌的生长要求，故选择其作为箬叶提取物抑菌试验培养基。
箬叶中黄酮、多糖、酚酸、萜类、生物碱等成分化学结构不同，极性大小有区别。黄酮醇、黄酮苷极性较大，易溶于水、稀乙醇、乙酸乙酯等，黄酮苷元极性小，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，天然黄酮类化合物多以苷类形式存在；多糖类溶于水，但不是真溶液，不溶于醇等有机溶剂；萜类物质极性中等偏小，溶于氯仿和乙酸乙酯等有机溶剂，萜苷类易溶于水，萜内酯溶于碱；酚酸溶于水；生物碱大部分不溶于水，可溶于氯仿、乙醇等有机溶剂，其盐易溶于水。因此本试验选择水、pH4盐酸溶液、pH4乙酸溶液、pH10氨水溶液、不同浓度乙醇和乙酸乙酯作提取溶剂，其极性大小为：水、pH4盐酸溶液和pH10氨水溶液>乙醇>乙酸乙酯。
按第五步骤方法，用9种提取溶剂，共获箬叶9种提取物。用1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#分别表示水、pH4盐酸溶液、pH4乙酸溶液、pH10氨水溶液、30％(V+V)乙醇、60％(V+V)乙醇、80％(V+V)乙醇、95％(V+V)乙醇和乙酸乙酯9种溶剂箬叶提取物，按第六步骤对4种试验菌进行抑菌试验，同时做空白和对照试验，结果如图3；对照品抑菌效果如图4。
图3结果显示，3#提取物抑菌效果最强，为pH4乙酸溶液提取物，其次是1#和9#，分别是水和乙酸乙酯提取物；试剂空白pH4乙酸溶液总抑菌圈值最大，说明pH4乙酸溶液抑菌作用最强，而试剂空白只有水、pH4盐酸溶液和pH10氨水溶液无抑菌作用；虽然pH4乙酸溶液提取物的总抑菌圈值最大，为81.5mm，但乙酸溶液试剂空白总抑菌圈值最大，为73.2mm，不能真实反映提取物的抑菌效果；水和乙酸乙酯的提取物抑菌作用相差不多，分别为66.1mm和65.4mm，但乙酸乙酯空白总抑菌圈值为34.2mm，乙酸乙酯提取液同样不能真实反映提取物的抑菌效果；故在超声提取条件下，水提取物对4种试验菌均有显著的抑菌效果，水是最好的提取溶剂。同时说明箬叶水提取物优于醇提取物。
图4结果显示，庆大霉素对4种试验菌抑菌作用显著，标准系列的抑菌结果曲线方程相关系数均大于0.95，说明在选定的浓度范围内，其对各试验菌的抑菌效果与浓度呈正相关性。
比较图3和图4，水提取物对枯草芽孢杆菌和伤寒沙门氏菌的抑菌效果与0.01g/mL庆大霉素相当，对铜绿假单胞菌的抑菌效果与0.05g/mL庆大霉素相当，对痢疾志贺氏菌的抑菌效果>0.05g/mL庆大霉素的效果，对4种试验菌的总抑菌效果相当于0.03g/mL庆大霉素。
本试验采用的牛津杯法抑菌试验更科学，结果可靠。首先，选定的培养基为抗生素检定培养基，专属性强；其次，制备的菌层培养基，均匀一致，在每皿底层培养基上定量加入5mL菌悬液，菌量充足，菌层水平自流平铺，厚度均匀一致；再者，在每个牛津杯精确加入供试液0.283mL，定量准确，无溢出。
用水、60％乙醇、pH4盐酸水溶液和pH10氨水溶液四种代表性提取溶剂，按第五步骤，选用超声法、回流法和普通浸提法3种提取方法，对箬叶中抑菌活性物质进行提取，各提取物对试验菌的抑菌效果如图5。
图5结果显示，提取溶剂为水时，超声法所得提取物的总抑菌圈最大，为67.4mm；提取溶剂为60％乙醇时，回流法所得提取物的总抑菌圈最大，为49.7mm；提取溶剂为pH4盐酸水溶液时，回流法所得提取物的总抑菌圈最大，为49.2mm；提取溶剂为pH10氨水溶液时，超声法所得提取物的总抑菌圈最大，为54.3mm。可见，水超声是最好的提取方法。
以水为提取溶剂，选择表1的因素和水平，按L9(33)正交试验设计，制备箬叶提取物，按第六步骤，对4种试验菌进行抑菌试验，分析在各提取条件下所获提取物的抑菌效果，结果如图6。
图6结果显示，从极差R值分析，三因素中B因素>A因素>C因素，即影响抑菌物质提取效果的因素主次顺序为超声次数>料液比>超声时间，超声次数是主要因素。从总抑菌圈的直径大小分析，8号提取物抑菌效果最好，条件为最优，所以8号试验A3B2C1(料液比1:16，超声次数3次，超声时间35min)是最佳提取工艺参数，此工艺条件下获得的提取物为最佳提取物。与图3相比较，最佳提取物8号对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为16.1mm，相当于0.01mg/mL庆大霉素的抑菌效果；对伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径为18.3mm，相当于0.04mg/mL庆大霉素的抑菌效果；对铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌的抑菌圈直径分别为23.3、21.8，均大于0.05mg/mL庆大霉素，对4种试验菌的总抑菌效果也大于0.05mg/mL庆大霉素。
因为牛津杯内径为6mm，所以，抑菌圈直径大于6mm的提取物显示有抑菌效果。抑菌圈直径大于6mm小于8mm为低度敏感，大于8mm小于14mm为中度敏感，大于14mm小于20mm为高度敏感，大于20mm为极度敏感。参照此标准，枯草芽孢杆菌和伤寒沙门氏菌对最佳提取物为高度敏感，铜绿假单胞菌和痢疾志贺氏菌对最佳提取物均为极度敏感。
按最低抑菌浓度的测定方法测定最佳提取物最低抑菌浓度，所得结果如图7。
图7结果显示，最佳提取物最初含生药浓度1.000g/mL(每毫升试液含1g干叶)时，其对枯草芽孢杆菌和痢疾志贺氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.025g/mL，对铜绿假单胞菌和伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.05g/mL。
热稳定性和酸碱稳定性试验
箬叶应用于食品包装时，主要作为蒸煮类食品的内包装材料，如粽子，人体胃和小肠内环境分别显酸性和碱性，所以选择考察箬叶提取物的热稳定性和酸碱稳定性。最佳提取物在60℃、80℃、100℃、pH4和pH10处理前后的抑菌效果如图8。
图8结果显示，最佳提取物经60、80、100℃加热处理和用盐酸溶液处理至pH4后，对4种试验菌的抑菌效果变化不显著，说明其抑菌活性稳定。但是，用氨水调至pH10后，提取物无抑菌效果，说明在碱性条件下水提取物中活性成分发生了化学变化，抑菌活性成分可能主要是酚羟基类和羧酸类物质，这有待于进一步研究。
通过上述方法表明，食品包装用箬叶水提取物对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌均有显著的抑菌效果，是最佳提取物；超声法是最有效的提取方法；最佳提取工艺参数为：料液比1:16、超声次数3次、超声时间35min；最佳提取物对枯草芽孢杆菌和痢疾志贺氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.025g/mL，对铜绿假单胞菌和伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.05g/mL，并且热稳定性和酸稳定性很好，应用前景广阔，使用价值极大。以上所述之实施例只为本发明之较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.利用食品包装用箬叶抑菌活性提取物的提取工艺提取活性物质用于抑菌的方法，其特征在于：所述抑菌的对象为痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌，所述方法包括有以下步骤：
第一步骤：菌悬液制备：
选取菌种，并接入菌种液体培养基，在36-37℃的温度下培养20-26h，使菌种复壮，按8-12倍稀释法，取适当稀释倍数的菌悬液；将菌悬液接种于固体培养基中，在36-37℃的温度下培养20-26h，通过计数，得准确浓度菌悬液；
第二步骤：抑菌培养基制备：
1)底层培养基制备
将抗生素检定培养基倒入注有蒸馏水的瓶中，加热溶解后置于不同的培养皿中，冷却凝固，即得底层培养基；
2)菌层培养基制备
按质量份取1)配制的底层培养基注入无菌瓶内，然后接入菌悬液，混匀，即成菌层培养基；
第三步骤：试验菌平板制备
在1)步骤的底层培养基中，加入与2)步骤制备的菌层培养基，迅速水平自流平铺均匀，冷却凝固，即得培养试验菌平板；
第四步骤：箬叶处理
将待检箬叶洗净，50～55℃烘干，粉碎，过42目标准筛，封装备用；
第五步骤：提取物制备
1)溶剂提取：称取一定质量的箬叶粉未，加入12倍质量的超纯水，浸润，回流15min，浸提20-26h，超声时间20-30min，过滤，重复2次；
2)提取物：合并1)的2次提取液，经旋转蒸发，减压浓缩，即成箬叶提取物；
第六步骤：提取物抑菌活性验证
以痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌的试验菌为指示菌，抑菌圈直径为评价标准，抗生素标准系列为对照，用改进的牛津杯法，对第五步骤制备的提取物开展抑菌试验；按第二、三步骤制备试验菌平板，用无菌镊子在平板中轻轻水平放置4个无菌牛津杯，在牛津杯中加入提取物或对照品，同时做试剂空白和平行试验，经36-37℃培养15～20h，观察抑菌效果，测定抑菌圈直径。
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| 箬叶中抑菌成分的提取及抑菌试验;何舟等;武汉工业学院学报;第32卷(第1期);35-39 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115251094A (zh) | 2022-11-01 |
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