CN110372781A - 恩夫韦肽的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及恩夫韦肽技术领域，具体提供一种恩夫韦肽的合成方法和应用。该合成方法包括：以氨基树脂为载体树脂依次与恩夫韦肽第1～25个氨基酸对应的Fmoc‑氨基酸进行偶联反应、酸解，得到多肽片段SEQ ID NO：2；以羧基树脂为载体树脂依次与恩夫韦肽第26～36个氨基酸对应的Fmoc‑氨基酸进行偶联反应并接入乙酰基，酸解，得到多肽片段SEQ ID NO：3；将SEQ ID NO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合、脱除保护基，得到多肽片段SEQ ID NO：4；将SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：4进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽。本合成方法得到的恩夫韦肽具有纯度高、无消旋的特点。

Description

恩夫韦肽的制备方法和应用
技术领域
本发明属于恩夫韦肽技术领域，尤其涉及一种恩夫韦肽的合成方法和应用。
背景技术
恩夫韦肽是人工合成的由36个氨基酸组成的链状多肽，其主要物理性质如下：白色或灰白色非晶型固体，在纯水中几乎不溶，但在pH＝7.5的缓冲液中溶解度达到82～142g/mL。分子式为C204H301N51O64，分子量为4492.01，其结构式为：
CH3CO-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2。
结构序列为：SEQ ID NO:1
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2。
2003年3月13日，美国FDA经加快审批，宣布批准恩夫韦肽用于成人及6岁以上儿童的抗艾滋病治疗。该药由瑞士Roche公司与美国Trimeris公司联合研制开发，其商品名为Fuzeon，原名“T-20”，CAS Number:为159519-65-0。
恩夫韦肽是近年来抗艾滋病治疗药的先锋，是第一个融合抑制剂。其它抗艾滋病药物是作用于细胞内部，阻止病毒在细胞内部复制，而这一药物却是通过阻止病毒与T细胞等免疫细胞的接触融合，干扰HIV-1进入T细胞，防止艾滋病患者的免疫***遭受病毒破坏来发生作用，因此又称为融合抑制剂。
现有恩夫韦肽制备工艺主要为固相与液相相结合的片段缩合工艺。具体是先使用二氯三苯甲基氯树脂制备每个片段肽树脂，经弱酸酸解，水沉淀过滤后得到保护的肽片段，在通过液相片段缩合，酸解，高效液相色谱纯化得到纯度为93-95％的产品。该方法片段缩合时存在溶解度低，易消旋等问题，每个片段需要纯化，杂质多，不适合规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种恩夫韦肽的合成方法，以解决现有恩夫韦肽合成过程中存在的片段溶解度低、易消旋且杂质多，不易纯化等问题。
进一步地，本发明还提供将该恩夫韦肽用于制备融合抑制剂的应用。
本发明是这样实现的：
一种恩夫韦肽的合成方法，包括以下步骤：
步骤S01.以氨基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到全保护的多肽片段，酸解得到脱保护基后的多肽片段SEQID NO：2；
步骤S02.以羧基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，偶联反应结束接入乙酰基，酸解切割，得到多肽片段SEQ IDNO：3；
步骤S03.将多肽片段SEQ ID NO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应，随后酸解脱除保护基，得到多肽片段SEQ ID NO：4；
步骤S04.将多肽片段SEQ ID NO：2与多肽片段SEQ ID NO：4溶于吡啶和醋酸的混合溶剂中进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽；
其中，所述第1个至第25以及第26个至第36个氨基酸是指恩夫韦肽从CONH2端顺次至Ac端的各个氨基酸；
SEQ ID NO：2为：
H2N-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2；
SEQ ID NO：3为：
AcHN-YTSLIHSLIEE—COOH；
SEQ ID NO：4为：
AcHN-YTSLIHSLIEE—COO—Ph—CHO。
相应地，上述制备方法得到的恩夫韦肽在制备融合抑制剂的应用。
本发明的有益效果如下：
相对于现有技术，本发明提供的恩夫韦肽的合成方法，以两个片段进行丝氨酸多肽连接法制得产品，该方法两个片段的多肽连接溶解度好，反应条件温和，不需添加任何缩合试剂和活化试剂，只需要简单沉降过滤，即可得到高纯度的两条多肽片段，无消旋，中间体无需经过高效液相色谱纯化，制得的恩夫韦肽粗品纯度高达85％以上，最后经过分离，可得大于98％纯度的恩夫韦肽；本发明提供的方法生产工艺简单，更适合规模化工业化生产。
本发明提供的恩夫韦肽在制备融合抑制剂中的应用，由于其使用的恩夫韦肽具有98％以上的纯度，因而得到的融合抑制剂纯度高，药效好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的恩夫韦肽的合成路线示意图；
Fmoc表示9-芴甲氧碳基；tBu表示叔丁基；OtBu表示氧叔丁基；Trt表示三苯甲基；Boc表示丁氧羰基；SPPS表示固相多肽合成；pyridine表示吡啶；Aceticacid表示乙酸。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明提供一种恩夫韦肽的合成方法。该合成方法包括以下步骤：
步骤S01.以氨基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到全保护的多肽片段，酸解得到脱保护基后的多肽片段SEQID NO：2；
步骤S02.以羧基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，偶联反应结束接入乙酰基，酸解切割，得到多肽片段SEQ IDNO：3；
步骤S03.将多肽片段SEQ ID NO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应，随后酸解脱除保护基，得到多肽片段SEQ ID NO：4；
步骤S04.将多肽片段SEQ ID NO：2与多肽片段SEQ ID NO：4溶于吡啶和醋酸的混合溶剂中进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽；
其中，所述第1个至第25以及第26个至第36个氨基酸是指恩夫韦肽从CONH2端顺次至Ac端的各个氨基酸；
SEQ ID NO：2为：
H2N-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2；
SEQ ID NO：3为：
AcHN-YTSLIHSLIEE—COOH；
SEQ ID NO：4为：
AcHN-YTSLIHSLIEE—COO—Ph—CHO。
下面对上述合成方法做进一步的解释说明：
步骤S01中，涉及的氨基树脂可以是Rink Amide树脂、Rink Amide AM树脂、RinkMBHA树脂、Sieber树脂中的任一种。参与反应的氨基树脂的取代值为0.2～1.2mmol/g。优选氨基树脂的取代值为0.6～0.9mmol/g。本发明中氨基树脂依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，指的是氨基树脂先与恩夫韦肽第1个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到的产物再与恩夫韦肽的第2个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，直至与恩夫韦肽的第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应。在进行偶联反应之前，有必要去除对应Fmoc-氨基酸上的Fmoc保护，去Fmoc保护的试剂为体积含量为哌啶(PIP)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，其中哌啶的体积百分含量为15～25％，去Fmoc保护的试剂用量为每克氨基酸树脂中加入5～15mL PIP的DMF溶液。优选哌啶的体积百分含量为20％。在去Fmoc保护过程中，脱保护时间为10～60min。
优选地，偶联反应中，氨基酸的用量为氨基树脂固载量总摩尔数的1.2～2倍，偶联反应过程中，需要加入缩合剂和活化剂，缩合剂的用量与活化剂的用量相同。优选地，缩合剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N－二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并***-1-基－氧基三吡咯烷基磷(PyBop)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的任一种；活化剂选自1-羟基苯并***(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)中的任一种。
优选地，缩合剂的摩尔用量为氨基树脂树脂固载总摩尔数的1.2～6倍。
优选地，酸解处理中需要使用酸解剂，酸解剂为三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂。该酸解剂中，按照体积百分比，TFA：EDT：水＝95％:2.5％:2.5％。每克氨基树脂所使用的酸解剂为5～10mL。裂解条件为室温下裂解1～5h。
步骤S02中，优选羧基树脂为二氯三苯甲基氯树脂、Wang树脂中的任一种；所述羧基树脂的取代值为0.3～1.5mmol/g。
优选羧基树脂的取代值为0.6～0.9mmol/g，该取代值下有利于提高多肽片段的合成纯度。本发明中羧基树脂依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，指的是羧基树脂先与恩夫韦肽第26个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到的产物再与恩夫韦肽的第27个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，直至与恩夫韦肽的第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应。在进行偶联反应之前，有必要去除对应Fmoc-氨基酸上的Fmoc保护，去Fmoc保护的试剂为体积含量为哌啶(PIP)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，其中哌啶的体积百分含量为15～25％，去Fmoc保护的试剂用量为每克羧基酸树脂中加入5～15mL PIP的DMF溶液。优选哌啶的体积百分含量为20％。在去Fmoc保护过程中，脱保护时间为10～60min。
优选地，偶联反应中，氨基酸的用量为羧基树脂固载量总摩尔数的1.2～2倍，氨基酸原料加料过少，无法让偶连反应反应完全，加料过多会导致原料浪费。偶联反应过程中，需要加入缩合剂和活化剂，缩合剂的用量与活化剂的用量相同。优选地，缩合剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N－二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并***-1-基－氧基三吡咯烷基磷(PyBop)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的任一种；活化剂选自1-羟基苯并***(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)中的任一种。
优选地，缩合剂的摩尔用量为羧基树脂树脂固载总摩尔数的1.2～6倍。
优选地，酸解处理中需要使用酸解剂，酸解剂为三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液。该酸解剂中，TFA的体积含量为1％。每克羧基树脂所使用的酸解剂为5～10mL。具体的裂解条件为室温下裂解10～60min，反复裂解3～6次。
上述接入乙酰基的方法为对偶联产物进行脱除Fmoc保护基接乙酰基之后，采用体积百分含量为为5％乙酸酐/10％N-甲基***啉/85％N,N-二甲基甲酰胺溶液，其用量为每克的羧基树脂加入7～9mL，反应时间为20～120min。
本发明步骤S01、S02中，涉及的第1个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸具体如表1所示。表1中，括号的内容表示氨基酸的侧链保护基，并且第1个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸的用量为起始原料树脂固载量总摩尔数的1.2～6倍，以确保偶联反应完全。
表1氨基酸对应的Fmoc-氨基酸
氨基酸序号 Fmoc-氨基酸 分子量
1 Fmoc-Phe-OH 387
2 Fmoc-Trp(Boc)-OH 526
3 Fmoc-Asn(Trt)-OH 597
4 Fmoc-Trp(Boc)-OH 526
5 Fmoc-Leu-OH 353
6 Fmoc-Ser(tBu)-OH 383
7 Fmoc-Ala-OH 311
8 Fmoc-Trp(Boc)-OH 526
9 Fmoc-Lys(Boc)-OH 468
10 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 412
11 Fmoc-Leu-OH 353
12 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 426
13 Fmoc-Leu-OH 353
14 Fmoc-Leu-OH 353
15 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 426
16 Fmoc-Gln(Trt)-OH 610
17 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 426
18 Fmoc-Asn(Trt)-OH 597
19 Fmoc-Lys(Boc)-OH 468
20 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 426
21 Fmoc-Gln(Trt)-OH 610
22 Fmoc-Gln(Trt)-OH 610
23 Fmoc-Asn(Trt)-OH 597
24 Fmoc-Gln(Trt)-OH 610
25 Fmoc-Ser(tBu)-OH 383
26 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 426
27 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 426
28 Fmoc-Ile-OH 353
29 Fmoc-Leu-OH 353
30 Fmoc-Ser(tBu)-OH 383
31 Fmoc-His(Trt)-OH 620
32 Fmoc-Ile-OH 353
33 Fmoc-Leu-OH 353
34 Fmoc-Ser(tBu)-OH 383
35 Fmoc-Thr(tBu)-OH 397
36 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 459
步骤S03中，多肽片段SEQ ID NO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应需要使用缩合试剂和活化试剂，且缩合试剂和活化试剂的用量相等；缩合试剂选自N,N－二异丙基碳二亚胺(DIC)，N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)；优选的为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)。缩合试剂的摩尔用量为肽片段SEQ IDNO：3摩尔数的3～6倍，优选为3～3.5倍。活化试剂选自1-羟基苯并***(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)中的任一种。
缩合反应结束，采用酸解剂进行酸解处理，以脱除保护基，裂解条件为室温下裂解1～5h，得到多肽片段SEQ ID NO：4。其中，酸解剂为三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂。该酸解剂中，按照体积百分比为，TFA：EDT：水＝95％:2.5％:2.5％。每克氨基树脂所使用的酸解剂为5～10mL。
步骤S04中，吡啶和醋酸的混合溶剂中，吡啶和醋酸的摩尔比为6:1～1:6。丝氨酸多肽连接过程中，原料反应浓度为多肽片段SEQ ID NO：2为5mM～50mM，优选为10mM，反应时间为室温条件下3～15h，优选5～8h。
经过丝氨酸多肽连接后，进行酸解处理，酸解处理使用的酸解剂为体积百分含量为95％三氟乙酸(TFA)的水溶液酸解处理的条件为室温酸解5～30min。
经过步骤S04处理得到的恩夫韦肽为恩夫韦肽的粗品。该恩夫韦肽粗品纯度高，但是，为了能够得到纯品的恩夫韦肽，还可以进行后处理。
具体的后处理可以采用高效液相色谱法纯化得到的恩夫韦肽粗品，先将恩夫韦肽粗品溶解后，将pH调节至7.5左右，如可以使用pH＝7.5的NH4HCO3水溶液溶解以调节至pH＝7.5，随后用0.45μm滤膜滤过，滤液经反相C18柱纯化，纯化流动相***为0.05mol/L醋酸钠的水和乙腈***，将所需要的组分收集浓缩；再以流动相***为1％醋酸-乙腈***换盐，将需要的组分收集浓缩，冻干得产品。
上述恩夫韦肽的合成方法，具有合成效率高、成本低、收率高以及适于工业化应用的特点。具体来说，上述合成方法的优点主要表现在：
以两个片段进行丝氨酸多肽连接法制得产品，该方法两个片段的多肽连接溶解度好，反应条件温和，不需添加任何缩合试剂和活化试剂，只需要简单沉降过滤，即可得到高纯度的两条多肽片段，中间体无需经过高效液相色谱纯化，制得的恩夫韦肽粗品纯度高达85％以上，最后经过分离，可得大于98％纯度的恩夫韦肽；本发明提供的方法生产工艺简单，更适合规模化工业化生产。
由于恩夫韦肽具有抗艾滋病药物效果，其具体是通过阻止病毒与T细胞等免疫细胞的接触融合，干扰HIV-1进入T细胞，防止艾滋病患者的免疫***遭受病毒破坏来发生作用，因此，本发明还提供一种含有本发明合成方法获得的恩夫韦肽的融合抑制剂。
为更好的说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种恩夫韦肽的合成方法，其合成路径请参阅图1，包括以下步骤：
S11.多肽片段SEQ ID NO：2的制备
取1000g Rink Amide MBHA树脂，其取代值为0.7mmol/g，先用5L DMF溶涨5min，过滤后树脂用5L 20％哌啶/DMF去保护20min，用kaiser test鉴定脱保护成功，过滤后树脂分别用DMF、二氯甲烷DCM各洗三次。
取1.5mol Fmoc-Phe-OH和1.5mol HOBt，用2L DMF溶解；另取1.5mol DIC，搅拌下慢慢加入前述DMF溶液中，与室温环境中搅拌反应30min后，缓缓加入上述脱完Fmoc的RinkAmide MBHA树脂，偶联反应2h。用kaiser test鉴定偶联完全。过滤后，树脂分别用DMF、DCM各洗2次。之后用5L 20％哌啶/DMF去保护20min，过滤后树脂再次分别用DMF，二氯甲烷DCM各洗三次，得到NH2-Phe-氨基树脂
先将第2-25个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸备好待用，结构如表1所示，第2个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸的活化方法为：
取1.5mol Fmoc-氨基酸和1.5mol HOBt，用适量DMF溶解；另取1.5mol DIC，搅拌下慢慢加入至Fmoc-氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30min后，加入NH2-Phe-氨基树脂偶联120min，过滤，DMF、DCM各洗2次后即得Fmoc-Trp(Boc)-Phe-氨基树脂。
采用上述同样方法，依次接入第3至第25个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸，即前一步得到的Fmoc-[1～(n-1)]个氨基酸-氨基树脂脱Fmoc保护后与活化的Fmoc-保护氨基酸(第n个)偶联反应60-300min，n＝1～2，接完所有保护氨基酸后，用DMF洗三次，甲醇洗三次，抽干的3.9kg树脂。
取上述树脂，加入裂解试剂(5ml/g肽树脂)[TFA/水/1,2-乙二硫醇＝95％/2.5％/2.5％(V/V)]，搅拌均匀，室温搅拌反应2h，反应混合物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后，加入至少5倍体积的冰镇的无水***沉淀，再用无水***沉淀3次，抽干得白色粉末即多肽片段SEQ ID NO：2，高效液相色谱测定其纯度为87％。
S12.多肽片段SEQ ID NO：3的制备：
取1000g二氯三苯甲基氯树脂，其取代值为0.7mmol/g，先用5L DCM溶涨15min，过滤后加入0.7mol的第26个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH和5L二氯甲烷，搅拌下缓慢加入1.4mol的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，反应120min，加入100mL甲醇继续反应30min后过滤。DMF洗涤2次，DCM洗涤2次。
采用与上述相同方法脱除Fmoc保护基后，采用与相同的偶联方法装载第26-36个氨基酸对应第Fmoc保护的氨基酸(如表1所述)，装载方法与前述方法一致，当脱除完第36个氨基酸的Fmoc保护基后，加入5L溶液5％乙酸酐/10％N－甲基***啉/85％DMF溶液，反应60min接入乙酰基(Ac)，完成反应后，用DMF洗涤三次，甲醇洗涤3次并抽干得2.4kg树脂。
将上述树脂加入1％TFA/DCM溶液(10mL/g树脂)，切割30min，切割三次，过滤收集滤液，旋干得白色固体即为多肽片段SEQ ID NO：3。
S13.多肽片段SEQ ID NO：4的制备：
取0.7mol多肽片段SEQ ID NO：3与2.1mol丙酮叉保护的水杨醛溶解于3L DCM中。在搅拌下，缓慢加入2.1mol DIC与2.1mol HOBt，反应180min后，旋干得油状物质。
取上述多肽粗品，加入裂解试剂(5mL/g肽)[TFA/水/1,2-乙二硫醇＝95％/2.5％/2.5％(V/V)]，搅拌均匀，室温搅拌反应2h，反应混合物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后，加入至少5倍体积的冰镇的无水***沉淀，再用无水***沉淀3次，抽干得白色粉末即多肽片段SEQ ID NO：4，高效液相色谱测定其纯度为83％。
S14.恩夫韦肽SEQ ID NO：1的制备：
取上述制得得0.1mol多肽片段SEQ ID NO：2与0.1mol多肽片段SEQ ID NO：4溶解与预先混合的吡啶/冰醋酸＝1/1(摩尔比)的混合溶液中，使得多肽的浓度为10mM。在室温搅拌下反应6h，HPLC监测反应完全后，缓慢倒入至少5倍体积的冰***中，沉淀，过滤后，固体溶解于95％TFA/H2O中。室温下搅拌反应10～20min后，缓慢倒入至少5倍体积的冰***中，沉淀，过滤，抽干得白色粉末即为恩夫韦肽粗品。
S15恩夫韦肽粗品得纯化
取步骤S14制得得恩夫韦肽粗品，加pH＝7.5的NH4HCO3水溶液溶解，用0.45μm滤膜滤过，滤液采用高效液相色谱进行纯化，流动相***为0.05mol/L醋酸钠的水和乙腈***，色谱填料为10μm的反相C18，77mm×250mm的色谱柱，流速为80mL/min，采用梯度***洗脱，收集主峰，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到恩夫韦肽醋酸化中间体浓缩液。
取恩夫韦肽醋酸化中间体浓缩液，采用高效液相色谱法进行换盐，流动相***为1％醋酸-乙腈，色谱填料为10μm的反相C18，紫外检测波长为280nm，先用流动相平衡色谱柱，色谱柱为77mm×250mm，流速为80mL/min，采用梯度洗脱，收集换盐主峰，蒸去大部分乙腈，得到恩夫韦肽纯品水溶液，冷冻冻干得产品，得815g白色粉末，纯度为99.1％，工艺总收率为36.2％。
对上述实施例1得到的恩夫韦肽进行纯度测定，具体测定方法如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％TFA的水为A相，以乙腈为B相，检测波长为220nm，按表2中的梯度进行洗脱。
表2洗脱梯度表
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
20 50 50
30 40 60
35 5 95
36 80 20
40 80 20
实施例2
一种恩夫韦肽的合成方法，其合成路径请参阅图1，具体过程参阅实施例1的。
实施例2与实施例1的区别在于：相对于步骤S11中Rink Amide MBHA树脂的取代值为0.60mmol/g；相对于步骤S12中二氯三苯甲基氯树脂的取代值为0.60mmol/g；相对于步骤S13中二氯三苯甲基氯树脂的取代值为0.60mmol/g；实施例2中的缩合剂与活化剂的组合为DIEA/HATU。
步骤S215纯化后，最终得到恩夫韦肽纯品745g，纯度为99.4％，总收率为38.6％。
实施例3
一种克胰素的合成方法，其合成路径请参阅图1，具体过程参阅实施例1的步骤。
实施例3与实施例1的区别在于：相对于步骤S11中Rink Amide MBHA树脂的取代值为0.85mmol/g；相对于步骤S12中二氯三苯甲基氯树脂的取代值为0.85mmol/g；相对于步骤S13中二氯三苯甲基氯树脂的取代值为0.85mmol/g；实施例3中的缩合剂与活化剂的组合为DIEA/HBTU。
步骤S315纯化后，最终得到恩夫韦肽纯品1014g，纯度为99.2％，总收率为37.1％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S01.以氨基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到全保护的多肽片段，酸解得到脱保护基的多肽片段SEQ ID NO：2；
步骤S02.以羧基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，偶联反应结束接入乙酰基，酸解切割，得到多肽片段SEQ IDNO：3；
步骤S03.将多肽片段SEQ ID NO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应，随后酸解脱除保护基，得到多肽片段SEQ ID NO：4；
步骤S04.将多肽片段SEQ ID NO：2与多肽片段SEQ ID NO：4溶于吡啶和醋酸的混合溶剂中进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽；
其中，所述第1个至第25以及第26个至第36个氨基酸是指恩夫韦肽从CONH2端顺次至Ac端的各个氨基酸；
SEQ ID NO：2为：
H2N-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2；
SEQ ID NO：3为：
AcHN-YTSLIHSLIEE—COOH；
SEQ ID NO：4为：
AcHN-YTSLIHSLIEE—COO—Ph—CHO。
2.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，所述氨基树脂选自RinkAmide树脂、Rink Amide AM树脂、Rink MBHA树脂、Sieber树脂中的任一种；所述氨基树脂的取代值为0.2～1.2mmol/g；
所述羧基树脂为二氯三苯甲基氯树脂、Wang树脂中的任一种；所述羧基树脂的取代值为0.3～1.5mmol/g。
3.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01、步骤S02中的偶联反应中需加入缩合剂和活化剂，缩合剂和活化剂的加入量相等，其中，缩合剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N－二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并***-1-基－氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯中的任一种；活化剂选自1-羟基苯并***、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑中的任一种。
4.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S03的缩合反应中，缩合试剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的任一种；活化试剂选自1-羟基苯并***、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑中的任一种，且缩合试剂和活化试剂的用量相等；所述缩合试剂的摩尔用量为多肽片段SEQ IDNO：3摩尔数的3～6倍。
5.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01中，氨基酸为载体树脂的树脂固载量的总摩尔数的1.2～6倍；步骤S02中，氨基酸为载体树脂的树脂固载量的总摩尔数的1.2～6倍。
6.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01、步骤S03中酸解处理使用的酸解剂均为三氟乙酸、1,2-乙二硫醇和水的混合溶剂。
7.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S02中酸解处理使用的酸解剂为1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液；
步骤S04中酸解处理使用的酸解剂为95％三氟乙酸的水溶液。
8.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S02中，接入乙酰基的方法为采用体积百分含量为5％乙酸酐、10％N-甲基***啉、85％N,N-二甲基甲酰胺的溶液溶解偶联反应得到的产物。
9.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01、S02中偶联反应前需要对Fmoc-氨基酸进行去Fmoc保护处理，去Fmoc保护处理使用的溶液为体积分数为15～25％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
10.如权利要求1～9所述的恩夫韦肽的合成方法合成的恩夫韦肽在制备融合抑制剂中的应用。
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