CN110361547A - 一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途；本发明利用免疫学得到两个特定的抗体，再将抗体结合血红蛋白‑触珠蛋白复合物得到“标记后的第一特定抗体—血红蛋白‑触珠蛋白复合物—标记后的第二特定抗体”的免疫复合体，再运用磁珠化学发光检测体系完成检测；这样的设计能够特异性检测人粪便样本中血红蛋白‑触珠蛋白复合物，具有灵敏度高、稳定性好的优点，能很好反映下消化道出血状况，辅助早期筛查直肠癌或结肠癌等下消化道肿瘤，具有较高的临床应用价值。

Description

一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在 检测下消化道健康的用途

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途。

背景技术

粪便中的血红蛋白(Hb，Hemoglobin)又称便潜血或便隐血(FOB，Fecal OccultBlood)，目前在临床上被看作是筛查直肠癌、结肠癌的肿瘤标志物之一。消化道少量出血可以不引起大便颜色改变，只有靠便隐血试验才能确定。凡是消化道疾病引起少量出血的，均可有隐血便，因此隐血检查对于发现和诊断多种消化道出血性疾病都有重要价值，是普查筛选消化道疾病的有效手段，便隐血试验已经成为人们不断深入研究的热点。

触珠蛋白(Hp，Haptoglobin，也称为结合珠蛋白或珠球蛋白)广泛存在于人类和许多哺乳动物的血液及其他体液中，个体内的含量比较稳定。触珠蛋白具有结合游离血红蛋白的能力，作用类似于血红蛋白的转运蛋白，血红蛋白容易与触珠蛋白结合形成稳定不可逆的复合物，叫做血红蛋白-触珠蛋白复合物(Hb-Hp Complex)。血清触珠蛋白除可作为溶血诊断指标外，近年来随着研究的深入，触珠蛋白还与恶心肿瘤、肾病、组织损伤等高度相关。

粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物，其检测的敏感度和特异性与血红蛋白检测相当，因其在肠道内的抗菌能力强，性质较为稳定，不易受胃肠道粘液等成分影响，且其活性持续时间较长，其稳定性明显高于未形成复合物的血红蛋白，可以克服被检测标本中的血红蛋白在胃肠道内滞留时间过长而被分解或破坏后出现的假阴性结果。

便隐血在目前临床上主要检测方法有化学法和免疫学方法：化学法常用的有邻甲苯胺法、还原酚酞法、联苯胺法、匹拉米洞法、俞创木脂法等。其设计原理基本相同，都是基于血红蛋白中的含铁血黄素部分有催化过氧化物分解的作用，能催化试剂中的过氧化氢，分解释放新生态氧，氧化上述色原物质而呈色，显色的深浅反应了血红蛋白的多少。然而在实际应用中由于粪便成份差别很大，各实验室具体操作细节不同，用化学法检测结果存在很大差异，并且缺乏特异性和准确性。外源性食物中如果含有血红蛋白、肌红蛋白，其血红素的作用均可以使实验呈阳性，大量生食蔬菜中含有活性的植物过氧化物也可催化过氧化物分解，出现假阳性反应。血液在肠道中停留过久，血红蛋白变性，则会出现与病情不符的阴性结果。此外，如果患者服用大量的维生素C或其他具有还原性的药物，在实验中可将过氧化物还原，从而不能氧化色原物质，也可使实验出现假阴性。因此，化学法易受干扰因素多、假阳性率高、冰醋酸配成的试剂易形成晶体等条件限制，亟需一种特异性好、灵敏度高、检测快速、简单的隐血检测方法。

免疫学方法是目前检测隐血常用的方法，主要包括免疫单抗法、酶联免疫吸附法、免疫斑点法、胶乳免疫透射比浊法、放射免疫扩散法、反向间接血凝法、胶体金标记夹心免疫检验法等。免疫法检测的指标一般是人血红蛋白或人红细胞基质，所用抗体是抗人血红蛋白抗体或抗人红细胞基质抗体。用化学法检测便潜血可检出消化道任何部位的出血，即不能区分上消化道、还是下消化道出血；免疫法检测人红细胞基质主要检出下消化道出血，这样对筛查下消化道出血相关疾病(结肠，直肠息肉或肿瘤)具有特异性高等优点，不受上消化道疾病的影响。但是血红蛋白由于受到肠道内细菌的作用及大肠粘膜产生的粘液成分影响而变性，易出现假阴性反应。

免疫学方法检测血红蛋白的局限性：免疫层析一步法目前是用抗人血红蛋白抗体来特异性结合人血红蛋白抗原，此法简便、快捷，只特异性地针对人血红蛋白抗原表位，基本排除了饮食及药物等因素的干扰。免疫胶体金法隐血试验有一定的灵敏度，高于或低于此范围均可出现假阴性。单克隆抗体胶体金法在检测消化道出血有时候会漏诊，其原因主要有：A.血红蛋白经过消化酶降解而变性，已不具有原来的免疫原性；B.过量的大出血而致使反应体系中抗原过剩，出现后带现象；C.病人的血红蛋白抗原结构改变也会影响血红蛋白或红细胞基质与单克隆抗体亲和度。日本Eiken Chemical Co.Ltd.公司已推出免疫比浊法OC-SENSOR(乳胶增强免疫比浊法)检测粪便样本中的人血红蛋白，该法也应用了全自动免疫诊断***，操作简便，然而该方法不是特异地检测人触珠蛋白-血红蛋白复合物，受血红蛋白在粪便中易降解这个因素的影响。另外，上述免疫层析法和免疫比浊法的检测程序中都不包含任何洗涤步骤，容易受粪便样本中包含的纤维、颗粒等细小固体的影响，在免疫层析法中可能出现粪便细小颗粒在检测条带区的沉淀堆积，在免疫比浊法中粪便颗粒可能直接干扰比浊结果的准确性，从而增加出现假性检测结果的风险。

血红蛋白-触珠蛋白复合物检测隐血反应，其测的是有无隐血，而不是有无肿瘤标志，隐血反应呈阳性必须用其他方法确认，例如肠镜等，这是因为可能由其他因素引起的偶尔出血阳性，同样潜血反应阴性也有可能是假阴性，这是由于早期肿瘤少量出血和大便中触珠蛋白形成复合物，而对于这种复合物抗血红蛋白抗体不能对之识别，因而检测结果呈阴性。检测粪便样本中触珠蛋白-血红蛋白复合物是检出大便潜血除血红蛋白和血红素以外的一种新型标志物，其最大优点是触珠蛋白-血红蛋白复合物在粪便样本中不易被降解,相比血红蛋白更稳定，从而降低假阴性结果的风险。日本的目黑高志对48例结肠癌或直肠癌患者的粪便，用放射免疫法分别检测这组患者粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物Olb-Hp)及血红蛋白(Hb)，结果阳性分别为44例及35例，这里至少有9例便隐血者为假阴性，也就是说测定大便隐血诊断直肠癌或结肠癌的阳性符合率仅在70％左右，而测定血红蛋白-触珠蛋白复合物对直肠癌或结肠癌的大便潜血阳性符合率在90％以上，造成测定便隐血对直肠癌或结肠癌20％-30％假阴性主要原因：由于消化道少量出血，释放出的血红蛋白(Hb)在经过较长的肠道时与粪便内的Hp结合成复合物引起隐血假阴性，显然检测粪便中的血红蛋白来诊断是否患直肠癌或结肠癌的肿瘤标志物有严重漏检。

目前市场上已有检测血红蛋白-触珠蛋白复合物的试剂盒。如中国发明专利申请公布号为CN 104515859 A(公布日为2015年4月15日)提供了一种血红蛋白、血红蛋白-结合珠蛋白复合物、转铁蛋白联检试剂盒及其制备方法、检测方法，其应用免疫学原理、侧向层析技术以及化学邻甲苯胺显色法，通过检测人粪便中的血红蛋白、血红蛋白—结合珠蛋白复合物、转铁蛋白，发现下消化道出血症状，早期诊断直肠癌或结肠癌等下消化道肿瘤。

上述发明旨在提供一种血红蛋白、血红蛋白-结合珠蛋白复合物、转铁蛋白联检试剂盒，由一根同时检测血红蛋白、血红蛋白-结合珠蛋白复合物、转铁蛋白的试纸条，化学邻甲苯胺试纸，上卡壳和下卡壳组成的试纸盒，所述免疫试纸条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫和PVC底板，样品垫边缘处黏贴在硝酸纤维素膜上，吸水纸边缘处黏贴在硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜固定在PVC底板上。硝酸纤维素膜上平行设置有3条检测线、质控线以及靠近硝酸纤维素膜底端的金标复合物划膜线，质控线处包被有羊抗鼠IgG，3条检测线处同时包被有血红蛋白单抗、血红蛋白-结合珠蛋白复合物单抗和转铁蛋白单抗，金标复合物划膜线处含有血红蛋白单抗、血红蛋白-结合珠蛋白复合物单抗和转铁蛋白单抗的金标复合物。金标复合物为60mm胶体金用于抗人血红蛋白单抗、抗人结合蛋白单抗和人转铁蛋白单抗的标记物。胶体金与被标记的蛋白质是依靠静电作用结合，结合力不稳定，交易受酸碱因素等外界环境干扰，因此其检测灵敏度较低。

上述发明的检测结果为：在试纸盒的长条形观察窗口中，有一条质控线和三条对应检测物质的检测线，同时在化学试纸观察窗口有用化学邻甲苯胺显色法检测的结果。对于免疫学方法，在长条形观察窗口中，均在检测线和质控线位置出现紫色红色带，表示样品中存在血红蛋白、血红蛋白-结合珠蛋白复合物、转铁蛋白；对于化学方法，在化学试纸观察窗口出现蓝色反应表明结果呈阳性。检测结果解读为：检测结果血红蛋白、血红蛋白-触珠蛋白复合物、转铁蛋白都是阳性或者血红蛋白、血红蛋白-触珠蛋白复合物都是阳性或者血红蛋白、转铁蛋白都是阳性，则高度怀疑是消化道出血，很可能患直肠癌或结肠癌等下消化道肿瘤，建议进一步诊断加以确认；如果血红蛋白-结合珠蛋白复合物、转铁蛋白都是阴性而血红蛋白阳性可能由于突发性炎症引起的；血红蛋白、血红蛋白-触珠蛋白复合物、转铁蛋白都是阴性者，说明消化道没有出血。该发明由化学方法和免疫学方法相结合，且检测物质较多，检测结果及其判定方法复杂，不同方法学及不同物质检测结果的判定可能不一致，临床应用局限较大。同时，该发明的检测结果为显色方式，仅靠肉眼判定，缺少精确的定量检测方法，无法检测受试者的消化道出血程度。

为解决现有技术的不足，市场需要一种能够特异性检测人粪便样本中血红蛋白-触珠蛋白复合物的检测试剂和检测方法，能定量反映下消化道出血状况，辅助早期筛查直肠癌或结肠癌等下消化道肿瘤，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途，利用免疫学得到两个特定的抗体，再将抗体结合血红蛋白-触珠蛋白复合物得到“标记后的第一特定抗体-血红蛋白-触珠蛋白复合物-标记后的第二特定抗体”的免疫复合体，再运用磁珠化学发光检测体系完成检测；这样的设计能够特异性检测人粪便样本中血红蛋白-触珠蛋白复合物，具有灵敏度高、稳定性好的优点，能定量反映下消化道出血状况，辅助早期筛查直肠癌或结肠癌等下消化道肿瘤，具有较高的临床应用价值。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，包括：由抗体检测体系与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物形成的免疫结合体，免疫结合体的磁珠化学发光检测体系；所述磁珠化学发光检测体系的固定分离相为磁微粒，定标品和质控品为人体血红蛋白-触珠蛋白复合物；所述免疫结合体是“磁珠-第一特定抗体-人体血红蛋白-触珠蛋白复合物-发光标记物标记的第二特定抗体”。

前述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白单体结合的特定抗体和与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体；所述特定抗体与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体触珠蛋白单体结合，与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体血红蛋白单体结合。

前述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体和与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体；所述特定抗体与血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体不与任何人体触珠蛋白单体或人体血红蛋白单体结合；与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体血红蛋白单体结合。

前述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体和与人体血红蛋白单体结合的特定抗体，特定抗体抗体可与血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体不与任何触珠蛋白单体或血红蛋白单体结合；与人体血红蛋白结合的特定抗体不与任何触珠蛋白单体结合。

前述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，固定分离相是链霉亲和素包被的磁珠，所述磁珠与生物素标记的第一特定抗体结合。

前述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，固定分离相是第一特定抗体包被的磁珠。

前述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，第二特定抗体为发光标记物标记的抗体，所述发光标记物为吖啶酯。

前述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，第一特定抗体、第二特定抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂的检测方法，包括如下步骤：按校准定标程序用定标品对血红蛋白-触珠蛋白复合物定量检测进行定标；添加质控品和待检样本到指定的反应杯中；在各反应杯中添加第一特定抗体、第二特定抗体和磁珠；经过二次孵育使得反应杯中形成“磁珠-第一特定抗体-人体血红蛋白-触珠蛋白复合物-吖啶酯标记的第二特定抗体”的免疫复合体；用清洗液清洗各反应杯多次去除未结合的抗体；在各反应杯中添加全自动免疫检验***用发光底物液A液；在各反应杯中添加全自动免疫检验***用发光底物液B液；在全自动化学发光仪上依序测量，依据血红蛋白-触珠蛋白复合物试剂校准定标的校准曲线信息进行数据处理，得出待检样本人体血红蛋白-触珠蛋白复合物的浓度。

一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂的用途，

检测下消化道健康的步骤包括：

步骤一，体检样本采集和前处理：用样本萃取液采集并萃取新鲜待测人粪便样本，获得澄清待测样本；

步骤二，检测试剂前处理：使用前，将血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂置于室温复温，准备第一被标记的粪便潜血抗体，第二被标记的粪便潜血抗体，血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，待测样本，被包被的磁微粒溶液，清洗液，全自动免疫检验***用底物液A液，全自动免疫检验***用底物液B液；

制备抗体的过程为：步骤一，免疫注射血红蛋白-触珠蛋白复合物到实验用动物；步骤二，终止免疫并放血；步骤三，制备免疫层析亲和柱；步骤四，提取和纯化抗体得到高浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体；

步骤三，定标品、质控品前处理；

步骤四，定标；

步骤五，在全自动化学发光测定仪上检测，

各添加50μL的质控品和样本到指定的反应杯中；

在各反应杯中添加50μL第一被标记的粪便潜血抗体；

在各反应杯中添加25μL被包被的磁微粒溶液；

孵育；

用清洗液清洗各反应杯多次；

在各反应杯中添加100μL第二被标记的粪便潜血抗体；

孵育；

用清洗液清洗各反应杯多次；

在各反应杯中添加200μL全自动免疫检验***用底物液A液；

在各反应杯中添加200μL全自动免疫检验***用底物液B液；

在全自动化学发光仪上依序测量各反应杯相对光强度RLU；

步骤六，计算：化学发光分析仪通过粪便潜血测定试剂卡内烧录的校准曲线和测定的相对光强度RLU，计算样品和质控品的浓度值；

步骤七，质控：依据质控品的测定浓度，与标示值范围进行比较，若超出标示的质控范围，说明本次检测不合格，需重新进行检测；

步骤八，根据参考范围和检测结果判定下消化道健康情况：

正常健康人群的界定值低于200μg/g；

阳性人群的界定值大于50μg/g；

强阳性人群的界定值为大于1000μg/g。

本发明的有益之处在于：

本发明利用免疫学得到两个特定的抗体，再采用两个特定的抗体结合血红蛋白-触珠蛋白复合物不同抗原决定簇的“双抗体夹心”技术，得到“标记后的第一特定抗体-血红蛋白-触珠蛋白复合物-标记后的第二特定抗体”的免疫复合体，能够特异性检测人粪便样本中的血红蛋白-触珠蛋白复合物，灵敏度高，稳定性好；

本发明采用全自动磁珠化学发光平台开发出的检测方法，检测步骤简单，时间短；

本发明检测得到的结果能很好反映下消化道出血症状，辅助早期诊断直肠癌或结肠癌等下消化道肿瘤，对下消化道健康的检测具有临床应用价值；

本发明运用本试剂进行一项人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物浓度研究，再对样本结果采用百分位数法求得参考范围，这个参考范围能够很好的辅助个人下消化道出血的评估和下消化道出血相关症状的诊断。

附图说明

图1是本发明的血红蛋白-触珠蛋白复合物的结构示意图；

图2是本发明的血红蛋白-触珠蛋白复合物多克隆抗体的制备流程图；

图3是本发明的血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆抗体的制备流程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

Δ一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；

免疫复合体包括：定标品、质控品和待测样本中的血红蛋白-触珠蛋白复合物与标记后的第一特定抗体、标记后的第二特定抗体三者复合形成“标记后的第一特定抗体—血红蛋白-触珠蛋白复合物—标记后的第二特定抗体”的“双抗体夹心”免疫复合体；

第一特定抗体、第二特定抗体的产生是将血红蛋白-触珠蛋白复合物注入动物后，通过免疫反应获得的血红蛋白-触珠蛋白复合物多克隆抗体或通过杂交瘤技术制备出针对特定抗原决定簇的血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆抗体。

人血红蛋白氨基酸序列:

人触珠蛋白氨基酸序列:

作为一种实施例，一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，包括：由抗体检测体系与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物形成的免疫结合体，免疫结合体的磁珠化学发光检测体系；磁珠化学发光检测体系的固定分离相为磁微粒，定标品和质控品的主要成分为人体血红蛋白-触珠蛋白复合物；免疫结合体是“磁珠--第一特定抗体--人体血红蛋白-触珠蛋白复合物—发光标记物标记的第二特定抗体”。发光标记物可以是吖啶酯，也可以是鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，优选吖啶酯，吖啶酯激发发光是非酶促反应，无需催化剂，发光速度快、发光强度大,灵敏度更高。作为一种实施例，固相分离体是链霉亲和素包被的磁珠，其与生物素标记的第一特定抗体结合；作为另一种实施例，固相分离体是第一特定抗体包被的磁珠。

第一特定抗体和第二特定抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。

如图1所示的血红蛋白-触珠蛋白复合物结构，血红蛋白-触珠蛋白复合物由血红蛋白分子与触珠蛋白分子结合形成，其中两个血红蛋白分子形成二聚体，与一个触珠蛋白分子结合，具有血红蛋白分子与触珠蛋白分子的结合处和血红蛋白分子与触珠蛋白分子的非结合处；其中c段和d段为血红蛋白和触珠蛋白结合部位，a段和b段为血红蛋白和触珠蛋白非结合部位，a段为血红蛋白的独有部位，b段为触珠蛋白的独有部位。

抗体与血红蛋白-触珠蛋白复合物的结合方式有如下三种实施例：

实施例1：第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白单体结合的特定抗体和与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体；所述特定抗体与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体触珠蛋白单体结合，与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体血红蛋白单体结合。此种实施例结合处在于如图1所示的a段和b段。

实施例2，第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体和与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体；所述特定抗体与血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体不与任何人体触珠蛋白单体或人体血红蛋白单体结合；与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体血红蛋白单体结合。此种实施例结合处在于如图1所示的c段和d段的结合处以及b段处。

实施例3，第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体和与人体血红蛋白单体结合的特定抗体，特定抗体抗体可与血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体不与任何触珠蛋白单体或血红蛋白单体结合；与人体血红蛋白结合的特定抗体不与任何触珠蛋白单体结合。此种实施例结合处在于如图1所示的c段和d段的结合处以及a段处。

血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体的制备过程为：步骤一，免疫注射血红蛋白-触珠蛋白复合物到实验用动物；步骤二，终止免疫并放血；步骤三，制备免疫层析亲和柱；步骤四，提取和纯化抗体得到高浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体。

进一步的，血红蛋白-触珠蛋白复合物多克隆抗体的制备过程为：步骤一，免疫注射血红蛋白-触珠蛋白复合物到实验用动物；步骤二，进行抗血清滴度测定，若检测合格，终止免疫并放血；步骤三，制备免疫层析亲和柱；步骤四，提取和纯化抗体得到高浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体。

再进一步的，血红蛋白-触珠蛋白复合物多克隆抗体的具体制备过程为：

步骤一，免疫注射血红蛋白-触珠蛋白复合物到实验用动物；

从实验用动物采血，灭活、凝结并离心收集上层血清，作为阴性参照品；将佛氏完全佐剂与高浓度血红蛋白-触珠蛋白复合物混合均匀，注入实验用动物内；经过首次免疫周期后7-10天取血，免疫4-5次；

步骤二，采集免疫后动物血液，进行抗血清滴度测定，若检测合格，终止免疫并放血；

步骤三，制备免疫层析亲和柱；

(1)将琼脂糖凝胶与盐酸溶液按一定比例混合均匀，2-4℃过夜，获得溶涨胶；

(2)将溶涨胶填充亲和柱，分别用盐酸溶液和偶联缓冲液冲洗介质；

(3)取三个亲和柱，将高浓度血红蛋白与偶联缓冲液混合，加入第一个亲和柱的溶涨胶中；将高浓度触珠蛋白与偶联缓冲液混合，加入第二个亲和柱的溶涨胶中；将高浓度血红蛋白-触珠蛋白复合物与偶联缓冲液混合，加入第三个亲和柱的溶涨胶中，在室温下将亲和柱混合摇匀，并用偶联缓冲液冲洗亲和柱；

(4)固相抗原：在亲和柱中加入BSA溶液，室温孵育，并用磷酸盐缓冲液洗涤介质，最后用乙醇溶液密封保存。

步骤四，提取和纯化抗体得到高浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体；

(1)用PBS溶液清洗免疫层析亲和柱；

(2)将已提取的免疫兔血清与PBS溶液等比例混合，分别加入三个免疫层析亲和柱中，在室温下将亲和柱混合摇匀；

(3)用PBS溶液清洗亲和柱，去除杂质；

(4)用抗体洗脱液清洗亲和柱，将特异性结合在亲和柱上的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体洗脱，收集洗脱液，得到特异性抗体；

(5)用蔗糖或聚乙二醇将含特异性抗体的洗脱液浓缩，并在PBS溶液中透析提纯得到高浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物多克隆抗体。抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系，固定相为磁微粒；

检测试剂包括：生物素标记粪便潜血抗体，吖啶酯标记粪便潜血抗体，血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，待测样本，链霉亲和素包被的磁微粒溶液，粪便潜血测定定标卡、粪便潜血测定试剂卡，清洗液，样本萃取液，全自动免疫检验***用底物液A液和B液。

作为一种实施例，检测试剂为链霉亲和素-生物素体系；包括如下试剂：

生物素标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆或多克隆抗体；

标记物标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆或多克隆抗体；

血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，成分包括：人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原；

血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，成分包括：人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原；

待测样本；

链霉亲和素包被的磁微粒；

粪便潜血测定定标卡；

粪便潜血测定试剂卡；

清洗液，清洗液的成分包括：磷酸盐，氯化钠，吐温20；

样本萃取液，样本萃取液的成分包括：氯化钙、吐温20、叠氮钠；

全自动免疫检验***用底物液A液，成分包括：过氧化氢；

全自动免疫检验***用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。

作为一种实施例，检测试剂为抗体直接包被的磁微粒体系；包括如下试剂：

血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆或多克隆抗体包被的磁微粒，

标记物标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆或多克隆抗体；

血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，成分包括：人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原；

血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，成分包括：人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原；

待测样本；

粪便潜血测定定标卡；

粪便潜血测定试剂卡；

清洗液，清洗液的成分包括：磷酸盐，氯化钠，吐温20；

样本萃取液，样本萃取液的成分包括：氯化钙、吐温20、叠氮钠；

全自动免疫检验***用底物液A液，成分包括：过氧化氢；

全自动免疫检验***用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。

一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂的检测方法，包括如下步骤：按校准定标程序用定标品对血红蛋白-触珠蛋白复合物定量检测进行定标；添加定标品、质控品和待检样本到指定的反应杯中；在各反应杯中添加第一特定抗体、第二特定抗体和磁珠；经过二次孵育使得反应杯中形成“磁珠--第一特定抗体--人体血红蛋白-触珠蛋白复合物--吖啶酯标记的第二特定抗体”的免疫复合体；用清洗液清洗各反应杯多次去除未结合的抗体；在各反应杯中添加全自动免疫检验***用发光底物液A液；在各反应杯中添加全自动免疫检验***用发光底物液B液；在全自动化学发光仪上依序测量，依据血红蛋白-触珠蛋白复合物试剂校准定标的校准曲线信息进行数据处理，得出待检样本人体血红蛋白-触珠蛋白复合物的浓度。全自动化学发光仪具有由计算机程序控制的自动加样和试剂、混匀、孵育、洗涤和发光值检测等功能。

进一步的检测方法，包括如下步骤：

用样本萃取液将新鲜人粪便样本收集并萃取，得到澄清待测样本；

按定标程序用定标品对血红蛋白-触珠蛋白复合物定量检测进行定标；

各添加质控品和样本到指定的反应杯中；

制备抗体的过程为：步骤一，免疫注射血红蛋白-触珠蛋白复合物到实验用动物；步骤二，终止免疫并放血；步骤三，制备免疫层析亲和柱；步骤四，提取和纯化抗体得到高浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体；

在各反应杯中添加第一被标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体；

在各反应杯中添加被包被的磁微粒溶液；

孵育；

用清洗液清洗各反应杯多次；

在各反应杯中添加第二被标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体；

孵育；

清洗各反应杯多次；

在各反应杯中添加全自动免疫检验***用底物液A液；

在各反应杯中添加全自动免疫检验***用底物液B液；

在化学发光仪上依序测量，依据血红蛋白-触珠蛋白复合物试剂卡内烧录的校准曲线信息进行数据结果处理。

Δ如图2所示，血红蛋白-触珠蛋白复合物多克隆抗体制备的具体过程如下：

1.免疫实验用动物

(1)挑选2-3只健康的实验室用兔子(饲养时间6-7周，重量约2.0kg)；

(2)从兔耳静脉采血，灭活、凝结并离心收集上层血清，作为阴性参照品；

(3)将250μL佛氏完全佐剂与250μL高浓度血红蛋白-触珠蛋白复合物混合均匀，注入兔子双肩皮下肌肉或双后腿肌肉；

(4)免疫周期为20天，首次免疫后7-10天取血(包括测试取血和最终放血)，免疫4-5次；

2.终止免疫并放血

(1)取测试样本：首次免疫后7-10天内取测试血液，随后每次免疫后2-3天内取测试血液；

(2)检测免疫效果：将免疫后兔血液样本离心，取上层血清为抗血清，用稀释缓冲液稀释抗血清，分别设置1:50、1:100、1:200、1:400、1:1000五个稀释梯度，加入100μL稀释后的抗血清与阴性参照品到血红蛋白-触珠蛋白复合物包被的微孔板的小孔中，室温孵育1小时，并用清洗液洗涤微孔板，随后加入100μL HRP标记鼠抗兔抗体，室温孵育40分钟，并用清洗液洗涤微孔板，每孔加入50μL四甲基联苯胺(TMB)，室温下孵育10-20分钟，每孔加入50μL终止液，在酶标仪上读取450nm时的吸光度；

(3)终止免疫：当免疫样本所测得的吸光度值与阴性参考品的吸光度值的差值满足抗体制备的要求时，终止免疫，处死免疫兔子并放血，离心收集上层血清，并将血清样本放置2-8℃冷藏。

3.制备免疫层析亲和柱

(1)将琼脂糖凝胶与盐酸溶液按一定比例混合均匀，2-4℃过夜，获得溶涨胶；

(2)将溶涨胶填充亲和柱，分别用盐酸溶液和偶联缓冲液冲洗介质；

(3)取三个亲和柱，将一定比例的高浓度血红蛋白与偶联缓冲液混合，加入第一个亲和柱的溶涨胶中；将一定比例的高浓度触珠蛋白与偶联缓冲液混合，加入第二个亲和柱的溶涨胶中；将一定比例的高浓度血红蛋白-触珠蛋白复合物与偶联缓冲液混合，加入第三个亲和柱的溶涨胶中。在室温下将亲和柱混合摇匀，并用偶联缓冲液冲洗亲和柱；

(4)固相抗原：在亲和柱中加入BSA溶液，室温孵育约3小时，并用磷酸盐缓冲液洗涤介质，最后用20％乙醇溶液密封保存。

4.提取和纯化抗体

(1)用高浓度PBS溶液清洗免疫层析亲和柱，以平衡亲和柱；

(2)将已提取的免疫兔血清与PBS溶液等比例混合，分别加入三个免疫层析亲和柱中，在室温下将亲和柱混合摇匀；

(3)用高浓度PBS溶液清洗亲和柱，去除杂质蛋白等其它杂质；

(4)用抗体洗脱液清洗亲和柱，将特异性结合在亲和柱上的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体洗脱，收集洗脱液，得到特异性抗体；

(5)用蔗糖或聚乙二醇将含特异性抗体的洗脱液浓缩，并在PBS溶液中透析提纯得到高浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物多克隆抗体。

Δ如图3所示，血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆抗体制备流程：

1，免疫实验用动物；

(1)挑选5只健康的实验室用BALB/c雌性小鼠(饲养时间6-8周)；

(2)对小鼠采血0.2-0.3mL，将血液灭活、凝结并离心收集上层血清，作为阴性参照品；

(3)用抗原稀释液将高浓度血红蛋白-触珠蛋白复合物稀释，取200μL稀释后的血红蛋白-触珠蛋白复合物，加入等量的佛氏完全佐剂混合均匀，腹腔注射小鼠；

(4)免疫周期为20天，首次免疫后7-10天开始取血(包括测试取血和最终放血)，免疫4-5次；

2，终止免疫并制作杂交瘤细胞；

(1)取测试样本：首次免疫后7-10天内取测试血液，随后每次免疫后2-3天内取测试血液；

(2)检测免疫效果：将免疫后兔血液样本离心，取上层血清为抗血清，用稀释缓冲液稀释抗血清，分别设置1:50、1:100、1:200、1:400、1:1000五个稀释梯度，加入100μL稀释后的抗血清与阴性参照品到血红蛋白-触珠蛋白复合物包被的微孔板的小孔中，室温孵育1小时，并用清洗液洗涤微孔板，随后加入100μL HRP标记鼠抗兔抗体，室温孵育40分钟，并用清洗液洗涤微孔板，每孔加入50μL四甲基联苯胺(TMB)，室温下孵育10-20分钟，每孔加入50μL终止液，在酶标仪上读取450nm时的吸光度；

(3)终止免疫并制作杂交瘤细胞：当免疫样本所测得的吸光度值与阴性参考品的吸光度值的差值满足抗体制备的要求时，采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3，筛选及制备；

(1)杂交瘤阳性克隆的筛选：将杂交瘤细胞在HAT培养基中培养。用血红蛋白单体、触珠蛋白单体和血红蛋白-触珠蛋白复合物对杂交瘤细胞进行克隆筛选，筛选出分泌与血红蛋白单体特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，并且其分泌的单克隆抗体能与血红蛋白-触珠蛋白复合物特异性结合；筛选出分泌与触珠蛋白单体特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，并且其分泌的单克隆抗体能与血红蛋白-触珠蛋白复合物特异性结合；筛选出能与血红蛋白-触珠蛋白复合物特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其分泌的单克隆抗体不能与血红蛋白单体或触珠蛋白单体结合；

(2)单克隆抗体的大量制备：将上述筛选的杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，获得所需要的大量单克隆抗体。

4，纯化单克隆抗体；

用重组蛋白A亲和层析柱纯化细胞培养获得的单克隆抗体，获得血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆抗体。

Δ抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系，固定相为磁微粒。有以下两种固相分离实施方案：

(1)“链霉亲和素-生物素”体系；

一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，包括：

生物素标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆或多克隆抗体；

标记物标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆或多克隆抗体，作为一种实施例，发光信号标记物可以是吖啶脂，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠；

血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，成分包括：人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原；

血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，成分包括：人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原；

待测样本；

链霉亲和素包被的磁微粒；

粪便潜血测定定标卡：卡内烧录血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品相关信息；

粪便潜血测定试剂卡：卡内烧录粪便潜血测定校准曲线相关信息；

清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；

样本萃取液，样本萃取液的成分包括：氯化钙、吐温20、叠氮钠；

全自动免疫检验***用底物液A液，成分包括：过氧化氢；

全自动免疫检验***用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。

(2)抗体直接包被的磁微粒体系；

一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，包括：

血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆或多克隆抗体包被的磁微粒，

标记物标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物单克隆或多克隆抗体，作为一种实施例，标记物可以是吖啶脂，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠；

血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，成分包括：人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原；

血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，成分包括：人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原；

待测样本；

粪便潜血测定定标卡：卡内烧录血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品相关信息；

粪便潜血测定试剂卡：卡内烧录粪便潜血测定校准曲线相关信息；

清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；

样本萃取液，样本萃取液的成分包括：氯化钙、吐温20、叠氮钠；

全自动免疫检验***用底物液A液，成分包括：过氧化氢；

全自动免疫检验***用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。

血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的使用方法的一种实施例—磁微粒化学发光法；

血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂包括：生物素标记粪便潜血抗体，吖啶酯标记粪便潜血抗体，血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，待测样本，链霉亲和素包被的磁微粒溶液，粪便潜血测定定标卡、粪便潜血测定试剂卡，清洗液，样本萃取液，全自动免疫检验***用底物液A液和B液。粪便潜血测定定标卡内烧录血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品相关信息，粪便潜血测定试剂卡内烧录粪便潜血测定校准曲线相关信息，清洗液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、吐温20，样本萃取液的主要成分为氯化钙、吐温20、叠氮钠，全自动免疫检验***用底物液A液的主要成分为过氧化氢。全自动免疫检验***用底物液B液的主要成分为氢氧化钠。粪便潜血测定定标品和粪便潜血测定质控品的主要成分为人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物抗原。

血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的检测方法包括以下步骤：

用样本萃取液将新鲜人粪便样本收集并萃取，得到澄清待测样本；

按定标程序用血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品对血红蛋白-触珠蛋白复合物定量检测进行定标；

各添加50μL的血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品和样本到指定的反应杯中；

在各反应杯中添加50μL生物素标记粪便潜血抗体；

在各反应杯中添加25μL的链霉亲和素包被的磁微粒溶液；

37℃孵育15min；

用清洗液清洗各反应杯3次；

在各反应杯中添加100μL吖啶酯标记粪便潜血抗体；

37℃孵育10min；

用清洗液清洗各反应杯3次；

在各反应杯中添加200μL全自动免疫检验***用底物液A液；

在各反应杯中添加200μL全自动免疫检验***用底物液B液；

在全自动化学发光仪上依序测量，依据粪便潜血测定试剂卡烧录的校准曲线信息进行数据结果处理。q-FOB试剂卡烧录的校准曲线如下表所示：

血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂在检测下消化道健康的用途，应用步骤包括：

步骤一，体检样本采集和前处理；检验机构使用样本萃取液对体检人员进行正规粪便样本的采集和萃取，萃取步骤严格按照样本萃取液使用说明书进行。经萃取的待测样本在15-25℃可保存3天，2-8℃可保存5天，-20℃可保存3个月，仅限冻融3次。样本在运输时应避免剧烈震动。

步骤二，检测试剂前处理：使用前，将血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂置于室温复温，准备第一被标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体，第二被标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体，血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，待测样本，被包被的磁微粒，清洗液，全自动免疫检验***用底物液A液，全自动免疫检验***用底物液B液；作为一种实施例，第一被标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体为生物素标记粪便潜血抗体，第二被标记的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体为吖啶酯标记粪便潜血抗体，被包被的磁微粒为链霉亲和素包被的磁微粒溶液。

步骤三，定标品、质控品及清洗液前处理：定标品、质控品每管添加1.0mL的蒸馏水或去离子水溶解，静置5分钟，上下颠倒混匀，确保所有的固体物溶解完全且无气泡产生。使用完毕后应立即置于-20℃保存，仅限冻融3次；按清洗液说明书要求将清洗液进行稀释，并置于全自动化学发光测定仪指定位置。

步骤四，定标：将抗体及磁微粒溶液放入试剂瓶套装，仪器扫入粪便潜血测定试剂卡，将试剂瓶套装放入仪器指定位置；随后将粪便潜血测定定标卡扫入仪器中，并将定标品放入指定的反应架中，对粪便潜血定量检测进行定标；

步骤五，将质控品和萃取好的待测样本放入全自动化学发光测定仪上指定的试剂反应架中，在全自动化学发光测定仪上进行粪便潜血定量检测，按下表程序进行加样和操作(单位：μL)：

步骤六，计算：化学发光分析仪通过粪便潜血测定试剂卡内烧录的校准曲线和测定的相对光强度(RLU)计算样品和质控品的浓度值。

步骤七，质控：依据质控品的测定浓度，与标示值范围进行比较，若超出标示的质控范围，说明本次检测不合格，需重新进行检测。

步骤八，根据参考范围和检测结果判定健康情况。

参考范围如下：

正常健康人群的界定值低于200μg/g；

阳性人群的界定值大于50μg/g；

强阳性人群的界定值为大于1000μg/g。

参考范围的应用和检测结果的解释：

血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂对于检验结果的解释如下：

健康人群的检测界定值低于200μg/g，是因为在不同的抗体及反应体系中，界定值会有所差异，并且在对不同地区的人群进行检测时，其正常人群的检测界定值会具有一定的波动性，例如，可以通过对当地一定数量健康人群进行检测，将健康人群检测界定值定位为180μg/g，也可以为150μg/g或100μg/g，但是其界定值上限必须低于200μg/g。因此当检测样本结果高于200μg/g时，可以判断此样本为阳性，临床解释为出现下消化道出血症状，需进行内镜检查作为进一步确诊，需要在专业医生指导下进行治疗；阳性人群的界定值大于50μg/g，是通过对一定数量的下消化道出血患者粪便样本进行检测，将检测结果通过统计学方法得出的下限值，不同地区的不同人群可以依据当地阳性样本结果确定阳性值，例如可以通过对当地一定数量的下消化道出血患者粪便样本进行检测，将阳性样本检测界定值定位为60μg/g，也可以为70μg/g或80μg/g，但是其界定值下限必须大于50μg/g。因此当检测样本结果低于50μg/g时，可以判断此样本为阴性，临床解释为未出现下消化道出血症状；

强阳性人群的界定值为大于1000μg/g，是依据下消化道大出血患者的粪便中血红蛋白-触珠蛋白复合物含量确定的。当样本检测结果在1000μg/g以上，判断为强阳性，临床解释为严重下消化道出血症状，需要在专业医生指导下进行及时的干预和治疗。

运用本试剂进行一项人粪便血红蛋白-触珠蛋白复合物浓度研究，再对样本结果采用百分位数法求得参考范围，这个参考范围能够很好的辅助个人下消化道出血的评估和下消化道出血相关症状的诊断，在实验四中得到验证。

需要说明的是：本发明是一种检测产品，并非疾病的诊断和治疗的方法，只是辅助临床判断的工具而已。

以下对50μg/g、200μg/g和1000μg/g的界定值进行说明。

本发明将200μg/g作为正常界定值上限，即cut-off值，具有重要意义。为了确立健康人群的正常值范围，在实验室，使用3盒本发明专利所述的血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂，测定此项目的正常值范围并作出正常受试者的cut-off值。此次试验共检测了246个来自正常受试者的新鲜粪便样本，年龄范围在17-81周岁。通过spss软件进行受试样本数据的统计和分析，其检测样本数据表明受试者的正常范围为0-590.4ng/mL，95％置信区间为33.34-57.38ng/mL。依据正常人样本的95％置信区间，正常受试者的cut-off值确定为400.04ng/mL，依据粪便的稀释倍数，换算成每克粪便中血红蛋白-触珠蛋白复合物含量，正常受试者的cut-off值为200μg/g。

本发明将50μg/g作为阳性界定值下限。通过检测120例下消化道出血患者的新鲜粪便样本，在受试样本筛选中，依据患者临床诊断结果，将下消化道出血患者分为轻度、中度、重度患者，每个程度40例样本，年龄范围为18-70周岁。在实验室，使用2盒本发明专利所述的血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂，双孔测定受试样本，将每个样本测定结果的均值作为最终测试结果。通过spss软件进行受试样本检测结果的数据统计和分析，将阳性样本测定结果的5％置信区间定为阳性界定值下限，即为50μg/g。

本发明将1000μg/g定为便隐血的强阳性界定值。试剂线性上限能达到2000μg/g，因此1000μg/g的强阳性判断值在其检测的线性范围内，能检测出强阳性结果。将1000μg/g定为便隐血的强阳性判断值，是依据消化道大出血患者的粪便中血红蛋白-触珠蛋白复合物含量而定。临床上以消化道出血1000mL以上为消化道大出血，而其中有10％左右的消化道出血以粪便形式排出，即消化道大出血患者的粪便中有100mL左右的出血量。在正常人血液中，女性的血红蛋白含量在110-150g/L，男性的血红蛋白含量在120-165g/L，通过血红蛋白结合法可测得正常人血液中触珠蛋白含量为0.3-2.0g/L，可将触珠蛋白含量的上限定为血液中血红蛋白-触珠蛋白复合物含量，即为2.0g/L，则消化道大出血患者的粪便中有0.2g血红蛋白-触珠蛋白复合物。正常人每天的排便量在100-300g左右，以200g为正常人排便的平均水平，据此计算可得消化道大出血患者的粪便中血红蛋白-触珠蛋白复合物含量为1000μg/g，因此以1000μg/g定为便隐血强阳性判断值。

以下通过实验验证本发明的效果；

Δ实验一，灵敏度实验：

取零浓度校准品作为样本测定其相对光强度值(xi)，重复测定20次，得出20次测量结果的相对光强度值(xi)，求出平均值按公式(1)计算标准差(SD)，得出所对应的相对光强度值。根据试剂盒内试剂卡烧录的校准曲线方程，将所对应的相对光强度值代入上述方程，求对应的浓度值，即为灵敏度,根据行业标准及设计要求，灵敏度应不大于0.5μg/g。

根据上述方法，本实验用零浓度校准品L1进行血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的灵敏度实验。实验结果如下：

上述结果表明，血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的灵敏度为0.12ng/mL，低于0.5ng/mL的标准，说明试剂盒的检测灵敏度较高。

实验二，准确度实验：

取一个浓度水平的工作校准品，重复检测3次，按公式(4)计算相对偏差(B％)，根据行业标准及设计要求，如果3次结果的相对偏差(B％)都不大于15.0％的要求，即判为合格。如果大于等于2次的结果不符合，即判为不合格。如果有1次结果不符合，则应重新连续测试20次，并分别按照公式(4)计算相对偏差，如果大于等于19次测试的结果的相对偏差(B％)都不大于15.0％的要求，则准确度符合要求。

B％＝(M-T)/T×100％…………………………(3)

B％：相对偏差；

M：工作校准品测试值；

T：工作校准品靶值。

根据上述方法，本实验用工作校准品L3进行血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的检测灵敏度实验。实验结果如下：

上述结果表明，血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的结果相对偏差(B％)均低于15.0％的标准，说明试剂盒的准确度较好。

实验三，批内精密度实验：

取2个不同浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物参考品或样本，各重复检测10次，分别求出平均值按公式(1)计算标准差(SD)，根据公式(2)分别计算变异系数(CV),根据行业标准及设计要求，变异系数(CV)应不大于10％。

根据上述方法，本实验用质控品1和质控品2进行血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的批内精密度实验。实验结果如下：

上述结果表明，血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的批内精密度的平均CV为3.9％，低于10％的标准，说明试剂盒的精密度较好。

实验四，血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的对比试验的临床使用数据如下：

在嘉兴某临床机构进行血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂的对比试验。考核试剂为嘉兴行健生物科技有限公司生产的粪便隐血测定试剂盒(磁微粒化学发光法)，即本发明专利所述的血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂，配套检测仪器为南京迪格诺斯ACL2800全自动化学发光测定仪；参比试剂选择美国纽约Polymedco公司的OC-Auto Micro 80粪便隐血检测仪及其试剂，参比试剂cut-off值为100ng/mL。试验地点为该临床机构的检验科。受试者预先接受临床的内镜检查，明确其是否出现消化道出血症状。随机选取未出现消化道出血症状受试者的新鲜粪便样本26例，出现消化道出血症状受试者的新鲜粪便样本77例。受试样本共103例，其中男性56例，女性47例，年龄范围在18-83岁。临床对比试验为同步双盲的平行对照试验，将考核试剂和参比试剂同时和“金标准”—临床内镜检查结果做比较，得出结果。

试验过程中粪便样本的收集、处理以及检验过程严格按照粪便隐血测定试剂盒(磁微粒化学发光法)说明书要求、南京迪格诺斯ACL2800全自动化学发光测定仪使用说明书要求、OC-Auto Micro 80粪便隐血检测仪及其试剂说明书要求分别进行。

以下为一种粪便钙卫蛋白检测试剂临床对比试验结果：

结果处理：

通过检测数据结果，绘制临床比对的四格表，其中考核试剂与内镜检查(金标准)结果的四格表如表1所示，参比试剂与内镜检查(金标准)结果的四格表数据如表2所示。

表1考核试剂—内镜检查(金标准)四格表

表2参比试剂—内镜检查(金标准)四格表

由上述四格表可得：考核试剂的检测灵敏度为92.3％，检测特异度为98.7％，阳性预测值为96.0％，阴性预测值为97.4％；参比试剂的检测灵敏度为84.6％，检测特异度为93.5％，阳性预测值为81.5％，阴性预测值为94.7％。考核试剂的各项临床指标均优于参比试剂，检测灵敏度和特异度更好，与实际临床检验结果更加接近。

本发明提供一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途，利用免疫学得到两个特定的抗体，再将抗体结合血红蛋白-触珠蛋白复合物得到“标记后的第一特定抗体—血红蛋白-触珠蛋白复合物—标记后的第二特定抗体”的免疫复合体，再运用磁珠化学发光检测体系完成检测；这样的设计能够特异性检测人粪便样本中血红蛋白-触珠蛋白复合物，具有灵敏度高、稳定性好的优点，能很好反映下消化道出血状况，辅助早期筛查直肠癌或结肠癌等下消化道肿瘤，具有较高的临床应用价值。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 嘉兴行健生物科技有限公司

<120> 一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途

<141> 2019-08-22

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> PRT

<213> human hemoglobin

<400> 1

Met Glu His Thr Phe Gln Leu Arg Ala Glu Trp Ser Ser Arg Asp Thr

1 5 10 15

Pro His Pro Lys Arg Gly Phe Thr Arg Asp Ile Leu Ile Gln Ala Asp

20 25 30

Gly Pro Gly Glu Leu Gln Gly Ser Ala Ala Arg Ala Phe His Gly Asp

35 40 45

Thr Ser Arg Trp Asn Pro Glu Gln Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Glu

50 55 60

Cys His Ile Leu Ser Tyr Leu Phe Val Ala Gly Gln Glu Lys Leu Ala

65 70 75 80

Val Ser His Ile Glu Val Gly Gly Glu Leu Leu Leu Ser His Asp Leu

85 90 95

Lys Glu Gly Gly Gln Val Ala Ser Ala Val Leu Arg Pro Gln Val Trp

100 105 110

Leu Asp Glu Ala Thr His Asp Gln Asp Pro Gln Ala Tyr Gln Arg Ala

115 120 125

Gly Glu Leu His Glu Thr Ala His Gln Gln Cys Phe Val Ala Arg Ser

130 135 140

Val Asn Phe Pro Val Ala Ile Lys Pro Val Thr Thr Gly Glu Pro Lys

145 150 155 160

Arg Lys Ser Pro Gln Phe Thr Thr Arg Leu Gly Ala Pro Ile Ala Leu

165 170 175

Arg Pro Pro Arg Pro Ala Lys Lys Pro Val Ser Val Thr Gly Ala Thr

180 185 190

Gly Ser Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Phe Tyr Asp Gln Val Gly Gly

195 200 205

His Glu Thr Phe Ala Lys Leu Ala Arg Val Phe Tyr Glu Gln Val Ala

210 215 220

Thr Asp Pro Glu Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Glu Glu Asp Leu Gly Pro

225 230 235 240

Ala Glu Ala Arg Leu Arg Met Phe Leu Glu Gln Tyr Trp Gly Gly Pro

245 250 255

Thr Thr Tyr Ser Gln Gln Arg Gly His Pro Arg Leu Arg Lys Arg His

260 265 270

Met Pro Phe Glu Ile Gly Pro Gln Glu Arg Asp Thr Trp Leu Lys Tyr

275 280 285

Met Lys Val Ala Val Lys Ser Leu Asp Leu Ala Pro Leu Gln Glu Glu

290 295 300

Thr Leu Trp Asp Tyr Leu Glu Arg Ala Ala His Ala Met Gln Asn Arg

305 310 315 320

Ser

<210> 2

<211> 406

<212> PRT

<213> human haptoglobin

<400> 2

Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu

1 5 10 15

Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly

20 25 30

Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val

35 40 45

Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly

50 55 60

Val Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly

65 70 75 80

Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro

85 90 95

Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys

100 105 110

Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn

115 120 125

Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu

130 135 140

Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln

145 150 155 160

Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln

165 170 175

Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile

180 185 190

Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His

195 200 205

Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu Tyr

210 215 220

Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val

245 250 255

Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr

260 265 270

Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala

275 280 285

Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala

290 295 300

Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu

305 310 315 320

Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu

325 330 335

His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr

340 345 350

Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr

355 360 365

Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala

370 375 380

Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln

385 390 395 400

Lys Thr Ile Ala Glu Asn

405

Claims (10)

1.一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，其特征在于，包括：由抗体检测体系与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物形成的免疫结合体，免疫结合体的磁珠化学发光检测体系；所述磁珠化学发光检测体系的固定分离相为磁微粒，定标品和质控品为人体血红蛋白-触珠蛋白复合物；所述免疫结合体是“磁珠-第一特定抗体-人体血红蛋白-触珠蛋白复合物-发光标记物标记的第二特定抗体”。

2.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，其特征在于，所述第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白单体结合的特定抗体和与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体；所述特定抗体与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体触珠蛋白单体结合，与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体血红蛋白单体结合。

3.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，其特征在于，所述第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体和与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体；所述特定抗体与血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体不与任何人体触珠蛋白单体或人体血红蛋白单体结合；与人体触珠蛋白单体结合的特定抗体不与任何人体血红蛋白单体结合。

4.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，其特征在于，所述第一特定抗体、第二特定抗体为与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体和与人体血红蛋白单体结合的特定抗体，所述特定抗体抗体可与血红蛋白-触珠蛋白复合物形成免疫结合体，与人体血红蛋白-触珠蛋白复合物结合的特定抗体不与任何触珠蛋白单体或血红蛋白单体结合；与人体血红蛋白结合的特定抗体不与任何触珠蛋白单体结合。

5.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，其特征在于，所述固定分离相是链霉亲和素包被的磁珠，所述磁珠与生物素标记的第一特定抗体结合。

6.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，其特征在于，所述固定分离相是第一特定抗体包被的磁珠。

7.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，其特征在于，所述第二特定抗体为发光标记物标记的抗体，所述发光标记物为吖啶酯。

8.根据权利要求1所述的一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂，其特征在于，所述第一特定抗体、第二特定抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

9.一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：按校准定标程序用定标品对血红蛋白-触珠蛋白复合物定量检测进行定标；添加定标品、质控品和待检样本到指定的反应杯中；在各反应杯中添加第一特定抗体、第二特定抗体和磁珠；经过二次孵育使得反应杯中形成“磁珠-第一特定抗体-人体血红蛋白-触珠蛋白复合物-吖啶酯标记的第二特定抗体”的免疫复合体；用清洗液清洗各反应杯多次去除未结合的抗体；在各反应杯中添加全自动免疫检验***用发光底物液A液；在各反应杯中添加全自动免疫检验***用发光底物液B液；在全自动化学发光仪上依序测量，依据血红蛋白-触珠蛋白复合物试剂校准定标的校准曲线信息进行数据处理，得出待检样本人体血红蛋白-触珠蛋白复合物的浓度。

10.一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂在检测下消化道健康的用途，其特征在于，检测下消化道健康的步骤包括：

步骤一，体检样本采集和前处理：用样本萃取液采集并萃取新鲜待测人粪便样本，获得澄清待测样本；

步骤二，检测试剂前处理：使用前，将血红蛋白-触珠蛋白复合物检测试剂置于室温复温，准备第一被标记的粪便潜血抗体，第二被标记的粪便潜血抗体，血红蛋白-触珠蛋白复合物定标品，血红蛋白-触珠蛋白复合物质控品，待测样本，被包被的磁微粒溶液，清洗液，全自动免疫检验***用底物液A液，全自动免疫检验***用底物液B液；

制备血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体的过程为：步骤一，免疫注射血红蛋白-触珠蛋白复合物到实验用动物；步骤二，终止免疫并放血；步骤三，制备免疫层析亲和柱；步骤四，提取和纯化抗体得到高浓度的血红蛋白-触珠蛋白复合物抗体；

步骤三，定标品、质控品前处理；

步骤四，定标；

步骤五，在全自动化学发光测定仪上检测，

各添加质控品和样本到指定的反应杯中；

在各反应杯中添加第一被标记的粪便潜血抗体；

在各反应杯中添加被包被的磁微粒溶液；

孵育；

用清洗液清洗各反应杯多次；

在各反应杯中添加第二被标记粪便潜血抗体；

孵育；

用清洗液清洗各反应杯多次；

在各反应杯中添加全自动免疫检验***用底物液A液；

在各反应杯中添加全自动免疫检验***用底物液B液；

在全自动化学发光仪上依序测量各反应杯相对光强度RLU；

步骤六，计算：化学发光分析仪通过粪便潜血测定试剂卡内烧录的校准曲线和测定的相对光强度RLU，计算样品和质控品的浓度值；

步骤七，质控：依据质控品的测定浓度，与标示值范围进行比较，若超出标示的质控范围，说明本次检测不合格，需重新进行检测；

步骤八，根据参考范围和检测结果判定下消化道健康情况：

正常健康人群的界定值低于200μg/g；

阳性人群的界定值大于50μg/g；

强阳性人群的界定值为大于1000μg/g。