CN110346471B

CN110346471B - 一种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法

Info

Publication number: CN110346471B
Application number: CN201910599463.7A
Authority: CN
Inventors: 姜维; 李炜男; 严小军; 刘宇; 胡世伟; 李世杰; 李加亮
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2039-07-04
Also published as: CN110346471A

Abstract

本发明涉及检测方法技术领域，公开了一种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，包括如下步骤：取鱼头部软组织，捣碎后作为试样加入提取液加热提取得粗提液；待粗提液冷却至室温，冷冻离心后取上清液用微孔滤膜过滤；用高效液相色谱测定上述滤液中的肌肽和鹅肌肽的含量，所述高效液相色谱的色谱柱中使用负载铜离子的介孔改性Al‑SBA‑15作为填料。本发明采用负载铜离子的介孔改性Al‑SBA‑15作为高效液相色谱分析时色谱柱中的填料，对肌肽和鹅肌肽的吸附和分离效果好，检测的精确度和灵敏度高，操作简便，无需繁琐的预处理步骤，仅通过简单的预处理即可上机测定同时峰面积和保留时间偏差很小，具有很高的准确性。

Description

一种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法

技术领域

本发明涉及检测方法技术领域，尤其是涉及一种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法。

背景技术

肌肽和鹅肌肽是由L-组氨酸和β-丙氨酸合成的功能性二肽，存在于动物的骨骼肌及大脑中，通常从家禽骨骼肌中提取，具有维持机体pH值稳定、抗氧化、抗衰老和神经调节等重要生理作用。因此，建立快速、可靠的肌肽和鹅肌肽的检测方法十分必要。

目前肌肽和鹅肌肽的检测尚无相关国家标准，主要的测定方法有高效液相色谱法、离子交换色谱法和毛细管电泳法。但三种方法对样品的分离纯化要求都较高，需要复杂的前处理方法，测定生物体中肌肽和鹅肌肽含量时步骤繁琐、测量效率低。

为提高测量精度，简化前处理方法，目前一般使用高效液相色谱和质谱联用的方法对生物体内的肌肽和鹅肌肽进行测定，例如，文献：UHPLC-ESI-MS/MS法测定动物源食物提取物中肌肽与鹅肌肽的含量[J].分析测试学报,2018.中公开了一种超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱法，以分子离子和碎片离子质荷比定性，建立了一种简单、快速、可同时测定肌肽和鹅肌肽含量的方法，以满足特医食品、保健食品等领域动物源提取物中肌肽和鹅肌肽含量的分析要求。

但使用昂贵复杂的质谱检测器检测成本较高，大部分实验室不具备检测条件，不利于检测方法的广泛使用。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中使用高效液相色谱和质谱联用的方法测定生物体内的肌肽和鹅肌肽时，质谱检测器检测成本较高，大部分实验室不具备检测条件，不利于检测方法的广泛使用；如果仅采取高效液相色谱法测定，则精度较差，且对样品的分离纯化要求较高，需要复杂的前处理方法，测定步骤繁琐、测量效率低的问题，提供一种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，测定时使用适合的填料及测定参数，使得只需对鱼头样品进行简单的预处理后，就可快速精确测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，包括如下步骤：

(1)取鱼头部软组织，捣碎后作为试样加入提取液加热提取得粗提液；

(2)待粗提液冷却至室温，冷冻离心后取上清液用微孔滤膜过滤；

(3)用高效液相色谱测定上述滤液中的肌肽和鹅肌肽的含量，所述高效液相色谱的色谱柱中使用负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15作为填料。

介孔SBA-15材料具有可调节的孔道结构、较大的孔径，较好的水热稳定性，并且易于官能团化，形成疏水或亲水环境，因此是色谱柱填料的理想原料。但SBA-15中仅存在的Si-OH键几乎不能与肌肽和鹅肌肽发生物理和化学吸附，因此单纯使用SBA-15作为填料无法很好的分离和测定肌肽和鹅肌肽的含量。

本发明对SBA-15进行改性，在SBA-15中加入铝元素，形成Al-SBA-15，并在氧化硅骨架中引入羧基及负载铜离子，羧基能与肌肽和鹅肌肽中氨基端产生非特异性结合，形成离子键，进而吸附肌肽和鹅肌肽；负载的铜离子能够与肌肽和鹅肌肽中的咪唑基螯合，进一步提高肌肽和鹅肌肽在介孔材料中的吸附量；而Al-SBA-15中的铝元素增加了二氧化硅材料中的酸性位，增大了材料表面的电荷，使铜离子与Al-SBA-15载体的相互作用加强，使铜离子在材料表面的分散更为均匀。

因此，采用本发明中的负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15作为高效液相色谱分析时色谱柱中的填料，对肌肽和鹅肌肽的吸附和分离效果好，检测的精确度和灵敏度高，操作简便，无需繁琐的预处理步骤，仅通过步骤(1)和(2)中简单的预处理即可上机测定。

作为优选，步骤(3)中所述负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15的制备方法如下：

A)将P123和NaF溶解在1-2mol/L的盐酸溶液中，35-45℃下搅拌至完全溶解；

B)向上述溶液中逐滴加入氰基乙基三乙氧基硅烷，搅拌20-30min后再逐滴加入正硅酸乙酯，35-45℃下搅拌6-8h；

C)向上述溶液中加入1-2mol/L的NaAlO₂的盐酸溶液，35-45℃下搅拌20-30h；

D)用氨水将溶液pH调节到1.6-1.7后，移入特氟龙内衬反应釜，并将反应釜置于100-200℃烘箱中活化36-48h；

E)将反应釜从烘箱中取出，将至室温后用氨水将溶液的pH调节至5.5-6.5，再置于100-200℃烘箱中活化36-48h；

F)过滤后将产物用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，60-100℃下干燥8-12h，得到氰基化Al-SBA-15；

G)将氰基化Al-SBA-15加入到质量分数为44％-47％的硫酸溶液中，90-100℃下搅拌反应24-36h，过滤、洗涤后，70-90℃下干燥8-12h，得到羧基化Al-SBA-15；

H)将羧基化Al-SBA-15分散在0.1-0.2mol/L的CuSO4溶液中，搅拌反应20-30h后抽滤，所得产物洗涤后在50-70℃下干燥8-10h；

I)将所得产物在马弗炉中500-600℃下焙烧4-5h，得到所述负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15。

本发明步骤A)至步骤F)中，以聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物P123为模板，NaF为辅助剂，NaAlO₂为铝源，并加入氰基乙基三乙氧基硅烷及正硅酸乙酯进行共水解-缩聚，通过调节pH法制得了稳定性良好的氰基化Al-SBA-15介孔材料，步骤G)中对氰基化Al-SBA-15用硫酸进行酸解，得到羧基化Al-SBA-15；步骤H)中将二价铜离子负载在羧基化Al-SBA-15表面，再通过步骤I)中的焙烧去除模板物质后，得到负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15。

作为优选，步骤A)-步骤C)中，溶液中NaF、P123、氰基乙基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯、NaAlO₂、HCl的质量比为1:(170-180):(40-45):(500-550):(20-50):(2600-2800)。采用此比例制得的负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15，具有较大的孔隙，硅铝比适中，较易负载二价铜离子，对肌肽和鹅肌肽的吸附性强。

作为优选，步骤(1)中所述提取液为蒸馏水、0.1mol/L NaOH溶液、0.6mol/L盐酸中的一种。

作为优选，步骤(1)中加入提取液中的试样质量为(0.8-1.2g)/10mL。

作为优选，步骤(1)中加热提取的温度为75-85℃，提取时间10-20min。

采用上述的提取液及提取液用量，在适当的反应条件下对肌肽和鹅肌肽的提取率高，有利于后续的分析测定

作为优选，步骤(2)中冷冻离心时的温度为0-4℃，时间10-20min，微孔滤膜孔径为0.45μm。使用该方法可以将试样中的肌肽和鹅肌肽有效保留，并去除其他杂质，便于后续高效液相色谱的进样分析。

作为优选，步骤(3)中采用匀浆法将3.8-4g负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15填料装入250mm×4.6mm的不锈钢柱管中得到所述色谱柱，匀浆法中的溶液为正己烷-异丙醇(V:V＝90:10)，装柱压力为40-50MPa。采用此方法装填的色谱柱固定相的用量适中，对肌肽和鹅肌肽的吸附性能好。

作为优选，步骤(3)中高效液相色谱法测定时，以pH为8-9的20mmol/L磷酸盐缓冲液和甲醇为流动相，等梯度洗脱，其中甲醇的质量分数为1-5％。采用该洗脱液能有效将肌肽和鹅肌肽洗脱，有利于肌肽和鹅肌肽的测定。

作为优选，步骤(3)中高效液相色谱法测定时，使用紫外检测器检测，波长230nm，流速1.0mL/min，柱温35℃。采用该参数对肌肽和鹅肌肽进行测定时，峰面积和保留时间偏差小，具有很高的准确性。

因此，本发明具有如下有益效果：本发明采用负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15作为高效液相色谱分析时色谱柱中的填料，对肌肽和鹅肌肽的吸附和分离效果好，检测的精确度和灵敏度高，操作简便，无需繁琐的预处理步骤，仅通过简单的预处理即可上机测定同时峰面积和保留时间偏差很小，具有很高的准确性。

附图说明

图1是标准样品(250mg/L)的色谱图；

图2是实施例1中鱼头样品的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。

实施例1：

填料的制备：将P123和NaF溶解在1.5mol/L的盐酸溶液中，40℃下搅拌至完全溶解；向上述溶液中逐滴加入氰基乙基三乙氧基硅烷，搅拌25min后再逐滴加入正硅酸乙酯，40℃下搅拌7h；再加入1.5mol/L的NaAlO₂的盐酸溶液，40℃下搅拌24h，溶液中NaF、P123、氰基乙基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯、NaAlO₂、HCl的质量比为1:175:42:520:30:2700；用氨水将溶液pH调节到1.65后，移入特氟龙内衬反应釜，并将反应釜置于150℃烘箱中活化40h；将反应釜从烘箱中取出，将至室温后用氨水将溶液的pH调节至6，再置于150℃烘箱中活化40h；过滤后将产物用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，80℃下干燥10h，得到氰基化Al-SBA-15；将氰基化Al-SBA-15加入到质量分数为45％的硫酸溶液中，95℃下搅拌反应30h，过滤、洗涤后，80℃下干燥10h，得到羧基化Al-SBA-15；将羧基化Al-SBA-15分散在0.15mol/L的CuSO₄溶液中，搅拌反应24h后抽滤，所得产物洗涤后在60℃下干燥9h后在马弗炉中550℃下焙烧4.5h，得到负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15填料。

色谱柱装填：采用匀浆法将3.9g上述制得的负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15填料装入250mm×4.6mm的不锈钢柱管中得到色谱柱，匀浆法中的溶液为正己烷-异丙醇(V:V＝90:10)，装柱压力为45MPa。

样品预处理：取鱼头部软组织，用高速组织捣碎机捣碎后，置于-20℃冰箱保存；称取1.0g上述样品于50mL离心管中，加入10mL蒸馏水提取液，旋窝震荡1min，80℃水浴提取15min，冷却至室温后，旋窝震荡1min，4℃、10000G条件下冷冻离心15min，取上清液用0.45的水相微孔滤膜过滤。

肌肽和鹅肌肽的测定：进样量20μL，以pH为9的20mmol/L磷酸缓冲盐(磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配置)：甲醇＝99:1为流动相，等梯度洗脱；用紫外检测器检测，波长230nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。肌肽和鹅肌肽能与其他组分分开达到基线分离的目的。

实施例2：

填料的制备：将P123和NaF溶解在2mol/L的盐酸溶液中，45℃下搅拌至完全溶解；向上述溶液中逐滴加入氰基乙基三乙氧基硅烷，搅拌30min后再逐滴加入正硅酸乙酯，45℃下搅拌6h；再加入2mol/L的NaAlO₂的盐酸溶液，45℃下搅拌20h，溶液中NaF、P123、氰基乙基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯、NaAlO₂、HCl的质量比为1:180:45:550:50:2800；用氨水将溶液pH调节到1.7后，移入特氟龙内衬反应釜，并将反应釜置于200℃烘箱中活化36h；将反应釜从烘箱中取出，将至室温后用氨水将溶液的pH调节至6.5，再置于200℃烘箱中活化36h；过滤后将产物用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，100℃下干燥8h，得到氰基化Al-SBA-15；将氰基化Al-SBA-15加入到质量分数为47％的硫酸溶液中，100℃下搅拌反应24h，过滤、洗涤后，90℃下干燥8h，得到羧基化Al-SBA-15；将羧基化Al-SBA-15分散在0.2mol/L的CuSO₄溶液中，搅拌反应20h后抽滤，所得产物洗涤后在70℃下干燥8h后在马弗炉中600℃下焙烧4h，得到负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15填料。

色谱柱装填：采用匀浆法将4g上述制得的负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15填料装入250mm×4.6mm的不锈钢柱管中得到色谱柱，匀浆法中的溶液为正己烷-异丙醇(V:V＝90:10)，装柱压力为50MPa。

样品预处理：取鱼头部软组织，用高速组织捣碎机捣碎后，置于-20℃冰箱保存；称取1.2g上述样品于50mL离心管中，加入10mL蒸馏水提取液，旋窝震荡1min，85℃水浴提取20min，冷却至室温后，旋窝震荡1min，2℃、10000G条件下冷冻离心20min，取上清液用0.45的水相微孔滤膜过滤。

肌肽和鹅肌肽的测定：进样量20μL，以pH为9的20mmol/L磷酸缓冲盐(磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配置)：甲醇＝95:5为流动相，等梯度洗脱；用紫外检测器检测，波长230nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。肌肽、鹅肌肽能与其他组分分开达到基线分离的目的。

实施例3：

填料的制备：将P123和NaF溶解在1mol/L的盐酸溶液中，35℃下搅拌至完全溶解；向上述溶液中逐滴加入氰基乙基三乙氧基硅烷，搅拌20min后再逐滴加入正硅酸乙酯，35℃下搅拌8h；再加入1mol/L的NaAlO₂的盐酸溶液，35℃下搅拌30h，溶液中NaF、P123、氰基乙基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯、NaAlO₂、HCl的质量比为1:170:40:500:20:2600；用氨水将溶液pH调节到1.6后，移入特氟龙内衬反应釜，并将反应釜置于100℃烘箱中活化48h；将反应釜从烘箱中取出，将至室温后用氨水将溶液的pH调节至5.5，再置于100℃烘箱中活化48h；过滤后将产物用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，60℃下干燥12h，得到氰基化Al-SBA-15；将氰基化Al-SBA-15加入到质量分数为44％的硫酸溶液中，90℃下搅拌反应36h，过滤、洗涤后，70℃下干燥12h，得到羧基化Al-SBA-15；将羧基化Al-SBA-15分散在0.1mol/L的CuSO₄溶液中，搅拌反应30h后抽滤，所得产物洗涤后在50℃下干燥10h后在马弗炉中500℃下焙烧5h，得到负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15填料。

色谱柱装填：采用匀浆法将3.8g上述制得的负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15填料装入250mm×4.6mm的不锈钢柱管中得到色谱柱，匀浆法中的溶液为正己烷-异丙醇(V:V＝90:10)，装柱压力为40MPa。

样品预处理：取鱼头部软组织，用高速组织捣碎机捣碎后，置于-20℃冰箱保存；称取0.8g上述样品于50mL离心管中，加入10mL蒸馏水提取液，旋窝震荡1min，75℃水浴提取10min，冷却至室温后，旋窝震荡1min，0℃、10000G条件下冷冻离心10min，取上清液用0.45的水相微孔滤膜过滤。

肌肽和鹅肌肽的测定：进样量20μL，以pH为8的20mmol/L磷酸缓冲盐(磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配置)：甲醇＝95:5为流动相，等梯度洗脱；用紫外检测器检测，波长230nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。肌肽、鹅肌肽能与其他组分分开达到基线分离的目的。

对比例1：

对比例1与实施例1的区别在于，对比例1中色谱柱的填料使用未改性的SBA-15，制备方法为：将P123和NaF溶解在1.5mol/L的盐酸溶液中，40℃下搅拌至完全溶解；向上述溶液中逐滴加入正硅酸乙酯，40℃下搅拌7h，溶液中NaF、P123、正硅酸乙酯、HCl的质量比为1:175:520:2700；移入特氟龙内衬反应釜，并将反应釜置于150℃烘箱中活化40h；过滤后将产物用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，80℃下干燥10h后在马弗炉中550℃下焙烧4.5h，得到SBA-15填料。其余均与实施例1中相同。

测定时肌肽、鹅肌肽不能与其他组分分开达到基线分离的目的。

对比例2：

对比例2与实施例1的区别在于，对比例2中色谱柱的填料使用未负载铜离子的羧基化Al-SBA-15，制备方法为：将P123和NaF溶解在1.5mol/L的盐酸溶液中，40℃下搅拌至完全溶解；向上述溶液中逐滴加入氰基乙基三乙氧基硅烷，搅拌25min后再逐滴加入正硅酸乙酯，40℃下搅拌7h；再加入1.5mol/L的NaAlO₂的盐酸溶液，40℃下搅拌24h，溶液中NaF、P123、氰基乙基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯、NaAlO₂、HCl的质量比为1:175:42:520:30:2700；用氨水将溶液pH调节到1.65后，移入特氟龙内衬反应釜，并将反应釜置于150℃烘箱中活化40h；将反应釜从烘箱中取出，将至室温后用氨水将溶液的pH调节至6，再置于150℃烘箱中活化40h；过滤后将产物用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，80℃下干燥10h，得到氰基化Al-SBA-15；将氰基化Al-SBA-15加入到质量分数为45％的硫酸溶液中，95℃下搅拌反应30h，过滤、洗涤后，80℃下干燥10h，得到羧基化Al-SBA-15；将羧基化Al-SBA-15洗涤后在60℃下干燥9h后在马弗炉中550℃下焙烧4.5h，得到羧基化Al-SBA-15填料。其他均与实施例1中相同。

测定时肌肽、鹅肌肽不能完全与其他组分分开达到基线分离的目的。

方法的线性范围测量：

分别准确称取50mg肌肽、鹅肌肽标准品，用超纯水溶解定容至50mL容量瓶中，配制成1000mg/L的肌肽、鹅肌肽标准储备液。将标准储备液稀释成质量浓度为1.0，5.0，10.0，20.0，100.0，200.0，500.0mg/L的肌肽、鹅肌肽混合标准溶液，过0.45的水相微孔滤膜后，在实施例1中所述色谱条件下进行测定，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作线性回归，其线性回归方程、相关系数、和线性范围如表1所示。测定结果表明，在该色谱条件下，肌肽、鹅肌肽的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

表1：方法线性范围。

成分	线性方程	相关系数(R<sup>2</sup>)	线性范围(mg/L)
				肌肽	y＝1303.9x+1838.2	0.9999	5.0-500.0
鹅肌肽	y＝3002.9x-1190.7	1	1.0-500.0

高效液相色谱流动相的选择：

以250mg/L的标准样品进样，改变不同的流动相pH及流动相中甲醇的比例，在其余与实施例1中相同的色谱条件下进行测定不同流动相条件下标准品的分离度，结果如表2所示。结果表明，随着pH的升高和甲醇比例的降低，分离效果逐渐变好，使用纯水相时，样品分离效果最佳。但是为了降低色谱柱的损耗，增强色谱柱使用寿命，最终本发明选择pH为8-9的20mmol/L磷酸盐缓冲液和甲醇为流动相，甲醇的质量分数为1-5％。

表2：不同流动相条件下标准品的分离度。

流动相	pH＝7 5％甲醇	pH＝8 5％甲醇	pH＝9 5％甲醇	pH＝9纯水相	pH＝9 1％甲醇
						分离度(R)	1.88	3.01	3.33	5.57	4.67

方法的精密度测量：

取同一浓度的肌肽、鹅肌肽标准溶液在同一天内连续进样5次进行精密度的测定。计算其保留时间和峰面积的相对标准偏差。肌肽标准品的保留时间与峰面积的标准偏差为0.114％和0.618％；鹅肌肽标准品的保留时间与峰面积的标准偏差为0.0426％和0.514％。肌肽和鹅肌肽的保留时间与峰面积的RSD均小于1％，说明该方法具有很好的精密度。

检测限和定量限的计算：

根据INTRODUCTION TO MODERN LIQUID CHROMATOGRAPHY,Third Edition一书中所给出的检测限、定量限计算公式：

检测限：

定量限：

其中σ代表标准曲线线性回归后的标准误差，S’代表标准曲线的斜率。

根据公式计算出本发明肌肽检出限为3.12mg/L，定量限为9.46mg/L；鹅肌肽的检出限为1.07mg/L，定量限为3.24mg/L。

回收率的测定：

采用实施例1中的色谱条件测定肌肽和鹅肌肽的回收率，结果如表3所示，表明本发明中肌肽和鹅肌肽的回收率高。

表3：回收率测定结果。

加标量(mg)	肌肽回收率(％)	鹅肌肽回收率(％)
			0	/	/
1.0	101	101
			1.5	102	103
2.0	114	115

Claims

1.一种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，包括如下步骤：

（1）取鱼头部软组织，捣碎后作为试样加入提取液加热提取得粗提液；

（2）待粗提液冷却至室温，冷冻离心后取上清液用微孔滤膜过滤；

（3）用高效液相色谱测定滤液中的肌肽和鹅肌肽的含量，所述高效液相色谱的色谱柱中使用负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15作为填料；高效液相色谱测定时，使用紫外检测器检测。

2.根据权利要求1所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤（3）中所述负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15的制备方法如下：

A）将P123和NaF溶解在1-2mol/L的盐酸溶液中，35-45℃下搅拌至完全溶解；

B）向上述溶液中逐滴加入氰基乙基三乙氧基硅烷，搅拌20-30min后再逐滴加入正硅酸乙酯，35-45℃下搅拌6-8h；

C）向上述溶液中加入1-2mol/L的NaAlO₂的盐酸溶液，35-45℃下搅拌20-30h；

D）用氨水将溶液pH调节到1.6-1.7后，移入特氟龙内衬反应釜，并将反应釜置于100-200℃烘箱中活化36-48h；

E）将反应釜从烘箱中取出，降至室温后用氨水将溶液的pH调节至5.5-6.5，再置于100-200℃烘箱中活化36-48h；

F）过滤后将产物用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，60-100℃下干燥8-12h，得到氰基化Al-SBA-15；

G）将氰基化Al-SBA-15加入到质量分数为44%-47%的硫酸溶液中，90-100℃下搅拌反应24-36h，过滤、洗涤后，70-90℃下干燥8-12h，得到羧基化Al-SBA-15；

H）将羧基化Al-SBA-15分散在0.1-0.2mol/L的CuSO₄溶液中，搅拌反应20-30h后抽滤，所得产物洗涤后在50-70℃下干燥8-10h；

I）将所得产物在马弗炉中500-600℃下焙烧4-5h，得到所述负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15。

3.根据权利要求2所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤A）-步骤C）中，溶液中NaF、P123、氰基乙基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯、NaAlO₂、HCl的质量比为1:（170-180）:（40-45）:（500-550）:（20-50）:（2600-2800）。

4.根据权利要求1所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤（1）中所述提取液为蒸馏水、0.1mol/L NaOH溶液、0.6mol/L 盐酸中的一种。

5.根据权利要求1或4所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤（1）中加入提取液中的试样质量为（0.8g-1.2g）/10mL。

6.根据权利要求1所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤（1）中加热提取的温度为75-85℃，提取时间10-20min。

7.根据权利要求1所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤（2）中冷冻离心时的温度为0-4℃，时间10-20min，微孔滤膜孔径为0.45μm。

8.根据权利要求1或2所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤（3）中采用匀浆法将3.8-4g负载铜离子的介孔改性Al-SBA-15填料装入250mm×4.6mm的不锈钢柱管中得到所述色谱柱，匀浆法中的溶液为体积比为90:10的正己烷-异丙醇，装柱压力为40-50MPa。

9.根据权利要求1或2所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤（3）中高效液相色谱法测定时，以pH为8-9的20mmol/L磷酸盐缓冲液和甲醇为流动相，等梯度洗脱，其中甲醇的质量分数为1-5%。

10.根据权利要求1或2所述的测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法，其特征是，步骤（3）中使用紫外检测器检测时，波长230nm，流速1.0mL/min，柱温35℃。