CN110343677B - 提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，包括以下步骤：S1、提供毕赤酵母菌种子液、基础盐培养基以及发酵罐；S2、将所述基础盐培养基配入至所述发酵罐中，再对所述发酵罐进行预处理和参数设置；S3、将所述种子液接入至位于所述发酵罐内的基础盐培养基中进行流加发酵，在所述流加发酵过程中，待所述基础盐培养基中的甘油消耗完后，继续加入甘油进行发酵培养；S4、待步骤S3中添加的甘油消耗完后，添加甲醇和培养基继续进行流加发酵。该方法通过优化毕赤酵母的发酵工艺，能明显提高过氧化氢酶的表达量和酶活性。

Description

提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，属于微生物领域。

背景技术

堆肥好氧发酵的生物化学过程都是在酶参与下进行的酶促反应。在堆肥腐熟期，过氧化氢酶、脱氢酶、多酚氧化酶等氧化还原酶发挥了作用，把有机物降解并进一步转化成腐殖质,实现了堆肥的无害化处理。过氧化氢酶是一种稳定的除氧酶，其作用是高效分解过氧化氢，避免细胞高度氧化，在纺织、食品、环保等工程领域应用广泛。在上世纪50年代初开始了微生物过氧化氢酶发酵的研究，近30年来，随着微生物筛选技术的不断发展和完善，科学家们通过不同的筛选方式得到了大量过氧化氢酶生产菌株，并对这些菌株进行了发酵优化策略等方面的研究。实验表明，过氧化氢酶在毕赤酵母中表达水平与培养条件关系密切，表达条件对表达量高低的影响也极其显著。

然而，现有技术领域中对提高微生物过氧化氢酶表达量的研究仅局限在优化温度、pH、无机盐离子浓度、摇床转速等培养条件层面，未见发酵工艺方面的创新。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，通过优化毕赤酵母的发酵工艺，能明显提高过氧化氢酶的表达量和酶活性。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，包括以下步骤：

S1、提供毕赤酵母菌种子液、基础盐培养基以及发酵罐；

S2、将所述基础盐培养基配入至所述发酵罐中，再对所述发酵罐进行预处理和参数设置；

S3、将所述种子液接入至位于所述发酵罐内的基础盐培养基中进行流加发酵，在所述流加发酵过程中，待所述基础盐培养基中的甘油消耗完后，继续加入甘油进行发酵培养；

S4、待步骤S3中添加的甘油消耗完后，添加甲醇和培养基继续进行流加发酵。

进一步地，步骤S2具体包括：

S21、校正pH电极和溶氧电极，将所述基础盐培养基配入所述发酵罐中，密封后将所述发酵罐至于大灭菌锅进行灭菌；

S22、待步骤S21的发酵罐冷却后，将其置于发酵台上进行安装，打开冷却水和气泵电源，并连接通气管道进行通气，维持罐压在0.05Mpa；再设置相关参数，并在确定的转速和通气量下对所述溶氧电极进行斜率标定，数值为100％；

S23、待温度稳定各项参数都正确后，将所述毕赤酵母菌种子液接入至发酵罐中的基础盐培养基中，开始发酵计时，并记录各种参数。

进一步地，在接种所述毕赤酵母菌种子液前还包括：在无菌条件下将所述毕赤酵母菌种子液移入灭菌的离心杯中，在4℃，8000rpm的条件下离心10min，弃上清。

进一步地，步骤S3具体包括：在所述流加发酵过程中，菌种会消耗所述基础盐培养基中的甘油，并从适应期进入指数生长期，这一过程中，所述发酵罐内的溶氧下降，当所述基础盐培养基中的甘油消耗完后，溶氧上升；再继续流加50％(v/v)甘油，流速为1.65mL/min，流加时间为3～9h。

进一步地，步骤S3还包括：在流加甘油的后续发酵过程中，溶氧改用纯氧和空气混合控制，并通过调节通气量、氧气的流量或转速控制溶氧浓度在30％-60％。

进一步地，步骤S3还包括：在流加甘油的后续发酵过程中通过流加25％(v/v)氨水和30％(v/v)磷酸控制pH在4～6。

进一步地，步骤S4的具体步骤为：流加50％(v/v)甘油结束后，待溶氧再一次上升时，流加0.1％～1％(v/v)纯甲醇和流加培养基的混合液，流速为0.55mL/min。

进一步地，还包括采用Ni₂₊柱层析法对过氧化氢酶进行分离纯化：提取步骤S4中的培养基的重组粗酶液，对Ni₂₊柱进行活化处理后进行层析，再对过氧化氢酶进行纯化。

进一步地，提取所述重组粗酶液包括以下步骤：

(1)步骤S4完成后，在4℃，5000g的条件下离心5min收集菌体；

(2)菌体用灭菌ddH₂O重悬洗涤，在4℃，5000g的条件下离心5min收集菌体；

(3)用结合缓冲液重悬菌体，采用超声破碎法破碎菌体，得到超声破碎液；

(4)将所述超声破碎液在4℃，30000g的条件下离心20min，收集上清液。

进一步地，对所述Ni₂₊柱的活化处理包括以下步骤：

(1)充分悬浮柱填料保存液后，装入至层析柱中静置；

(2)设置柱流速为10CV/h，待柱中保存的20％乙醇流至柱顶部时，加入ddH₂O进行洗柱；

(3)待柱中ddH₂O流至柱顶部时，加入电荷缓冲液进行洗柱；

(4)待所述电荷缓冲液流至柱顶部时，加入结合缓冲液洗柱，并将柱填料保存于结合缓冲液中。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法在发酵罐培养条件下，运用补料分批发酵工艺在对数期添加甘油提高毕赤酵母菌数量，添加甲醇提高过氧化氢酶表达量和酶活性。故，该方法通过在发酵工艺方面进行创新，提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量及酶活水平，对于实现堆肥无害化处理具有十分重要的意义。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，包括以下步骤：

S1、提供毕赤酵母菌种子液、基础盐培养基以及发酵罐；

S2、将所述基础盐培养基配入至所述发酵罐中，再对所述发酵罐进行预处理和参数设置；

S3、将所述种子液接入至位于所述发酵罐内的基础盐培养基中进行流加发酵，在所述流加发酵过程中，待所述基础盐培养基中的甘油消耗完后，继续加入甘油进行发酵培养；

S4、待步骤S3中添加的甘油消耗完后，添加甲醇和培养基继续进行流加发酵。

本发明中，步骤S2具体包括：

S21、校正pH电极和溶氧电极，将所述基础盐培养基配入所述发酵罐中，密封后将所述发酵罐至于大灭菌锅进行灭菌；

S22、待步骤S21的发酵罐冷却后，将其置于发酵台上进行安装，打开冷却水和气泵电源，并连接通气管道进行通气，维持罐压在0.05Mpa；再设置相关参数，并在确定的转速和通气量下对所述溶氧电极进行斜率标定，数值为100％；

S23、待温度稳定各项参数都正确后，将所述毕赤酵母菌种子液接入至发酵罐中的基础盐培养基中，开始发酵计时，并记录各种参数。

步骤S2在接种所述毕赤酵母菌种子液前还包括：在无菌条件下将所述毕赤酵母菌种子液移入灭菌的离心杯中，在4℃，8000rpm的条件下离心10min，弃上清。

本发明中，步骤S3具体包括：在所述流加发酵过程中，菌种会消耗所述基础盐培养基中的甘油，并从适应期进入指数生长期，这一过程中，所述发酵罐内的溶氧下降，当所述基础盐培养基中的甘油消耗完后，溶氧上升；再继续流加50％(v/v)甘油，流速为1.65mL/min，流加时间为3～9h，优选为6h。步骤S3还包括：在流加甘油的后续发酵过程中，溶氧改用纯氧和空气混合控制，并通过调节通气量、氧气的流量或转速控制溶氧浓度在30％-60％。步骤S3还包括：在流加甘油的后续发酵过程中通过流加25％(v/v)氨水和30％(v/v)磷酸控制pH在4～6，优选为5。

本发明中，步骤S4的具体步骤为：流加50％(v/v)甘油结束后，待溶氧再一次上升时，流加0.1％～1％(v/v)纯甲醇和流加培养基的混合液，优选为0.5％(v/v)纯甲醇和流加培养基的混合液，流速为0.55mL/min。

本发明中，还包括采用Ni₂₊柱层析法对过氧化氢酶进行分离纯化：提取步骤S4中的培养基的重组粗酶液，对Ni₂₊柱进行活化处理后进行层析，再对过氧化氢酶进行纯化。

提取所述重组粗酶液包括以下步骤：

(1)步骤S4完成后，在4℃，5000g的条件下离心5min收集菌体；

(2)菌体用灭菌ddH₂O重悬洗涤，在4℃，5000g的条件下离心5min收集菌体；

(3)用结合缓冲液(1×binding buffer)重悬菌体，采用超声破碎法破碎菌体，得到超声破碎液；

(4)将所述超声破碎液在4℃，30000g的条件下离心20min，收集上清液。

对所述Ni₂₊柱的活化处理包括以下步骤：

(1)充分悬浮柱填料保存液后，取2mL装入至层析柱中静置(柱体积CV：1.5mL)；

(2)设置柱流速为10CV/h，待柱中保存的20％乙醇流至柱顶部时，加入3CV ddH₂O进行洗柱；

(3)待柱中ddH₂O流至柱顶部时，加入电荷缓冲液(5CV 1×charge buffer)进行洗柱；

(4)待所述电荷缓冲液流至柱顶部时，加入结合缓冲液(5CV 1×binding buffer)洗柱，并将柱填料保存于结合缓冲液中。

对所述过氧化氢酶进行纯化包括以下步骤：

以超声上清上样，分别用结合缓冲液(10CV 1×binding buffer)、洗涤缓冲液(10CV 1×wash buffer)、洗脱液(3CV 1×elute buffer)以及膜再生液(3CV1×stripbuffer)洗涤层析柱，每1mL收集一管，4℃保存备用。

本发明的毕赤酵母菌种子液还可以通过以下方法得到：

冻存菌株的活化

将菌株从-80℃冰箱中取出，50℃水浴解菌，将菌株接种到YPD培养基上，培养三天。

种子液的制备

制作种子液：挑取毕赤酵母单菌落接种至种子培养基BMGY(500ml)中，28℃，200rpm摇床培养24h。在无菌条件下将种子液移入灭菌的离心杯中，在4℃，8000rpm的条件下离心10min，弃上清，用基础盐培养基重悬菌体，按10％(200ml)接种量接种于含5L发酵罐中。

实施例一 通过补充甘油提高毕赤酵母菌量的培养方法

将种子培养液按10％(200ml)接种量接种于含5L发酵罐中，接种后经过一段适应期后进入指数生长期，此时通过补料管流动添加50％甘油，流速约为1.65mL/min，补料时间设为3h，6h，9h三个处理，同时设置对照。发酵罐中溶氧改用纯氧和空气混合控制，空气和氧气分别有流量计，在后续发酵过程中，通过调节通气量、氧气的流量或转速使溶氧浓度控制在30％-60％，在此期间pH通过流加25％氨水和30％磷酸控制在5左右。在发酵结束后取发酵液测定酵母菌数量，结果如表1。

表1 不同甘油添加量对菌数量的影响

由上表可以看出，发酵罐中酵母菌在对数培养期阶段添加50％甘油补充培养基的营养后，酵母菌活菌数量较对照组均有增加，说明采用甘油补料发酵工艺有助于菌量的提升，且补料时间为6h时，酵母菌数量为4.7X10⁹cfu/ml。

实施例二 不同浓度甲醇诱导提高毕赤酵母过氧化氢酶酶活的表达方法

甘油补料结束后，待发酵罐内溶氧量再一次上升时，用补料管添加纯甲醇与基础培养基的混合液，补料过程中，培养基内甲醇浓度设为0.1％，0.5％，1％三个处理，流速约为0.55mL/min，同时设置对照。发酵结束后收集发酵上清液，测定其过氧化氢酶酶活，结果如表2。

表2 添加不同甲醇浓度条件下过氧化氢酶酶活

甲醇浓度(％)	酶活(u/ml)
		0.1	15321
0.5	20267
		1	16967
ck	2790

由上表可以看出，在补加甘油后，继续补加甲醇，过氧化氢酶酶活较对照组相比均有提高，且浓度为0.5％的甲醇为最佳补料浓度，说明采用0.5％甲醇补料发酵工艺有助于过氧化氢酶活的提升，最高酶活为20267u/ml。

实施例三 0.5％甲醇不同诱导时间下提高过氧化氢酶表达量的方法

甘油补料结束后，待发酵罐内溶氧量再一次上升时，用补料管添加0.5％纯甲醇与基础培养基的混合液，流速约为0.55mL/min，补料时间设为48h，72h，96h三个处理。待发酵结束后收集发酵上清液，测定其过氧化氢酶酶活，结果如表3。

表3 0.5％甲醇不同诱导时间下过氧化氢酶酶活

由上表可以看出，在补加50％甘油6h后，继续补加0.5％甲醇且诱导时间为72h，最高酶活为20348u/ml。

综上所述：本发明的提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法在发酵罐培养条件下，运用补料分批发酵工艺在对数期添加甘油提高毕赤酵母菌数量，添加甲醇提高过氧化氢酶表达量和酶活性。故，该方法通过在发酵工艺方面进行创新，提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量及酶活水平，对于实现堆肥无害化处理具有十分重要的意义。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提供毕赤酵母菌种子液、基础盐培养基以及发酵罐；

S2、将所述基础盐培养基配入至所述发酵罐中，再对所述发酵罐进行预处理和参数设置；

步骤S2具体包括：

S21、校正pH电极和溶氧电极，将所述基础盐培养基配入所述发酵罐中，密封后将所述发酵罐置 于大灭菌锅进行灭菌；

S22、待步骤S21的发酵罐冷却后，将其置于发酵台上进行安装，打开冷却水和气泵电源，并连接通气管道进行通气，维持罐压在0.05Mpa；再设置相关参数，并在确定的转速和通气量下对所述溶氧电极进行斜率标定，数值为100%；

S23、待温度稳定各项参数都正确后，将所述毕赤酵母菌种子液接入至发酵罐中的基础盐培养基中，开始发酵计时，并记录各种参数；在接种所述毕赤酵母菌种子液前还包括：在无菌条件下将所述毕赤酵母菌种子液移入灭菌的离心杯中，在4℃，8000rpm的条件下离心10min，弃上清；

S3、将所述种子液接入至位于所述发酵罐内的基础盐培养基中进行流加发酵，在所述流加发酵过程中，待所述基础盐培养基中的甘油消耗完后，继续流加甘油进行发酵培养；在流加甘油的后续发酵过程中，溶氧改用纯氧和空气混合控制，并通过调节通气量、氧气的流量或转速控制溶氧浓度在30%-60%；并通过流加25%（v/v）氨水和30%（v/v）磷酸控制pH在4~6；

步骤S3具体包括：当所述基础盐培养基中的甘油消耗完后，溶氧上升；再继续流加50%（v/v）甘油，流速为1.65mL/min，流加时间为6~9h；

S4、待步骤S3中添加的甘油消耗完后，流加50%（v/v）甘油结束后，待溶氧再一次上升时，流加0.1%~1%（v/v）纯甲醇和流加培养基的混合液，流速为0.55mL/min，时间为48~96h。

2.如权利要求1所述的提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，其特征在于，还包括采用Ni₂₊柱层析法对过氧化氢酶进行分离纯化：提取步骤S4中的培养基的重组粗酶液，对Ni²⁺柱进行活化处理后进行层析，再对过氧化氢酶进行纯化。

3.如权利要求2所述的提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，其特征在于，提取所述重组粗酶液包括以下步骤：

(1)步骤S4完成后，在4℃，5000g的条件下离心5min收集菌体；

(2)菌体用灭菌ddH₂O重悬洗涤，在4℃，5000g的条件下离心5min收集菌体；

(3)用结合缓冲液重悬菌体，采用超声破碎法破碎菌体，得到超声破碎液；

(4)将所述超声破碎液在4℃，30000g的条件下离心20min，收集上清液。

4.如权利要求2所述的提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法，其特征在于，对所述Ni^{2 +}柱的活化处理包括以下步骤：

(1)充分悬浮柱填料保存液后，装入至层析柱中静置；

(2)设置柱流速为10CV/h，待柱中保存的20%乙醇流至柱顶部时，加入 ddH₂O进行洗柱；

(3)待柱中ddH₂O流至柱顶部时，加入电荷缓冲液进行洗柱；

(4)待所述电荷缓冲液流至柱顶部时，加入结合缓冲液洗柱，并将柱填料保存于结合缓冲液中。