CN110327317A - 紫草素在制备抗轮状病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及紫草素在制备抗轮状病毒感染的药物中的应用，紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物通过抑制轮状病毒的复制和扩增、通过抑制轮状病毒的抗原合成，最终获得抗轮状病毒的有益效果；且紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物对正常的细胞无毒副作用，安全性好，为研究轮状病毒感染的治疗策略提供了理论依据，为制备新的抗轮状病毒的药物提供了一个嵌入点。

Description

紫草素在制备抗轮状病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物应用领域，具体涉及紫草素在制备抗轮状病毒感染的药物中的应用。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠弧病毒家族(Reoviridae)的一个成员，是引起病毒性腹泻的主要病原体。全球每年约有1.1亿左右的新生儿因感染RV而出现严重的分泌性腹泻，约60万儿童因RV感染而脱水死亡。较其他病毒或细菌感染性腹泻而言，轮状病毒所引起的呕吐和腹泻的程度及其持续时间都要远远长于其他类型腹泻，对人类的健康与经济造成了巨大的影响。对于防止RV感染，接种疫苗仍然是最有效的手段。

CN106676076A公开了一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法，包含以下步骤，用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清轮状病毒毒株工作种子库；使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；接种轮状病毒毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，收获病毒液，经澄清、超滤浓缩、得到无血清人用轮状病毒疫苗原液。

CN108546288A公开了一种人轮状病毒VP8重组蛋白，所述VP8重组蛋白的氨基酸序列包括人轮状病毒VP8蛋白氨基酸序列和外源多肽氨基酸序列，所述外源多肽的等电点小于等于5。本发明还提供了基于该VP8重组蛋白制备的人轮状病毒疫苗。该VP8重组蛋白通过VP8蛋白与破伤风毒素和/或白喉毒素蛋白中含负电荷的氨基酸的多肽片段融合表达，提高大肠杆菌表达的轮状病毒VP8蛋白的水溶性和产量，并且所得到的融合蛋白具有很好的免疫能力，所制备得到的疫苗具有很好的效果。

CN104606674A公开了轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的缀合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球，载体蛋白之一为轮状病毒蛋白。该发明提供的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗制备工艺简单，采用纳米微球为连接物的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗能够增强小鼠Th1型免疫应答，以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和性，此外还可诱导小鼠产生轮状病毒抗体；具备两种疫苗的预防效果。

但是疫苗的减毒活性引起了一些与病毒脱落和传播风险，以及疫苗的成本、功效和安全性等相关的问题限制了其推广。因此，开发安全有效的抗轮状病毒的药物至关重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供紫草素的一种新应用，具体涉及紫草素在制备抗轮状病毒药物中的应用，本发明为轮状病毒感染的治疗提供了一种新的策略。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。

在本发明中，所述药物抑制轮状病毒的复制和扩增。

在本发明中，所述药物抑制轮状病毒的抗原合成。

紫草素为紫色片状结晶或结晶性粉末(结构式如下所示)，为紫草科多年生草本植物新疆紫草的干燥根所提取的***茶醌类化学成分。中医临床主要用于治疗湿性斑疹、紫廠、血尿、淋浊和血痢、热结便秘、烧伤、湿疹、丹毒等。现代医学研究发现，紫草素具有抗肿瘤、抗菌、抗生育、解热、止血、降血糖等广泛的药理作用。然而，对于紫草素抗轮状病毒药用方面的作用未见有相关研究报道。

本发明创造性地发现可以将紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物用于制备抗轮状病毒的药物中，通过体外实验研究发现其对轮状病毒具有抑制复制和扩增的作用，同时具有抑制轮状病毒抗原合成的作用，且这两种作用呈浓度依赖性，且在较低浓度范围内对正常细胞无毒副作用，安全性好。通过体内研究发现其能够显著减轻轮状病毒感染乳鼠的腹泻程度，并使其体重和精神状态恢复。

第二方面，本发明提供紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抑制轮状病毒的复制和扩增的药物中的应用。

第三方面，本发明提供紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抑制轮状病毒的抗原合成的药物中的应用。

在本发明中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料包括赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如赋形剂和稀释剂的组合、载体和调味剂的组合、粘合剂和填充剂的组合等。

优选地，所述载体包括脂质体、胶束、树状大分子、微球或微囊。

本发明所述紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物可以负载于常用药用载体上作为治疗急性髓系白血病的药物，实现更好的生物相容性、靶向性、生物安全性和给药效果。

优选地，所述紫草素为药物组合物中含有的紫草素。

优选地，所述药物组合物中包括乙酰紫草素、异戊酰紫草素或β-乙酰氧基-异戊酰紫草素中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如乙酰紫草素和异戊酰紫草素的组合、异戊酰紫草素和β-乙酰氧基-异戊酰紫草素的组合、乙酰紫草素和β-乙酰氧基-异戊酰紫草素的组合。

所述紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物还可以与其他药物联合使用实现对轮状病毒感染更好的治疗效果，例如乙酰紫草素、异戊酰紫草素、β-乙酰氧基-异戊酰紫草素等。

在本发明中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、注射剂、喷雾剂、膜剂、栓剂、滴鼻剂或滴丸剂。用紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物为活性成分的药物可以根据实际需要被制备成上述任一种药物剂型，各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

在本发明中，所述药物的给药途径可以根据实际需要选择口服给药、舌下给药、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔给药或经皮给药的任意一种方式。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明通过体外研究发现，紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物通过抑制轮状病毒的复制和扩增、通过抑制轮状病毒的抗原合成，最终获得抗轮状病毒的有益效果；且紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物对正常的细胞无毒副作用，安全性好；通过体内研究发现，紫草素能够显著减轻轮状病毒感染乳鼠的腹泻程度，并使其体重和精神状态恢复。本发明为研究轮状病毒感染的治疗策略提供了理论依据，为制备新的抗轮状病毒的药物提供了一个嵌入点。

附图说明

图1是紫草素对MA104细胞毒性评价结果统计图；

图2是紫草素对轮状病毒复制与扩增的抑制作用评价结果统计图；

图3是紫草素对轮状病毒抗原合成的抑制作用评价结果统计图；

图4是三组乳鼠的腹泻评分情况统计图；

图5是三组乳鼠的体重检测情况统计图；

图6是三组乳鼠在轮状病毒感染第三天的腹泻情况示意图(a为对照组，b为病毒模型组，c为紫草素治疗组)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

紫草素对MA104细胞毒性评价

本实施例研究紫草素对正常细胞MA104细胞株(猴胚胎肾细胞)的细胞毒性，具体操作方法为：取呈指数生长期的MA104细胞株，经胰酶消化脱壁后制成细胞悬液，细胞计数后，用含10％FBS的高糖DMEM稀释成1×10⁴/mL的细胞悬液，96孔培养板内每孔加入100μL细胞悬液，每孔含约细胞8000个；待细胞贴壁后吸出培养基，各实验组加入不同终浓度的紫草素药液(溶剂为DMEM培养液)，分别为0μM(对照组)、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM，对照组为相同体积DMEM培养液。实验组每个剂量设6个平行孔，对照孔同样设6孔；置于37℃，5％CO₂恒温培养箱培养72h；72h后，每孔细胞加入10％CCK-8溶液继续培养4h，在波长450nm的酶标免疫检测仪(Gene Company Linited公司)上测定各孔光吸收值；细胞的相对存活率通过公式计算＝[(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)×100％]。其中，OD实验组为实验组细胞在酶标免疫检测仪上测定的吸光度值，OD对照组为对照组细胞在酶标免疫检测仪上测定的吸光度值，OD空白为不加任何样品的空白孔在酶标免疫检测仪上测定的吸光度值。

结果如图1所示，用紫草素处理的MA104细胞的细胞存活率在浓度5μM、10μM、20μM、40μM、80μM下无明显的细胞毒性作用，细胞存活率介于92.5％-99.6％间。证明紫草素对正常的细胞无毒副作用，安全性好。

实施例2

紫草素对人轮状病毒复制与扩增的抑制作用

本实施例研究紫草素是否对人轮状病毒的复制与扩增有抑制作用，具体操作方法为：将MA104细胞以1×10⁴个细胞/孔的浓度接种在96孔板中并在37℃培养24h。待细胞贴壁后取出细胞培养板，PBS洗涤一遍。将MOI为0.01的轮状病毒液(100TCID50RV-Wa株病毒液，由第三军医大学免疫所赠予)与10μg/mL浓度的胰酶作用30min后加入到96孔培养板中，100μl/孔。正常细胞对照组加入等体积DMEM培养液。所有细胞在37℃，5％CO₂孵育2h，然后将病毒液吸出，加入不同浓度(0μM(病毒对照组)、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM)的紫草素药液，100μL/孔。病毒对照组加入等体积DMEM培养液。37℃，5％CO₂孵育24h。取出细胞培养板，吸出培养液，每孔细胞加入10％CCK-8溶液继续培养4h，在波长450nm的酶标免疫检测仪(GeneCompany Linited公司)上测定各孔光吸收值。抑制率＝(药物组平均OD值-病毒对照组平均OD值)/(正常细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值))×100％，实验重复5次。上述的OD值指各组细胞在酶标免疫检测仪上测定的吸光度值。

结果如图2所示，紫草素在10μM-80μM浓度范围内显示出显著的抑制轮状病毒的复制与扩增作用，并且这种抑制效应呈浓度依赖性。

实施例3

紫草素对人轮状病毒抗原合成的抑制作用

本实施例研究紫草素是否对人轮状病毒抗原的合成有抑制作用，具体操作方法为：将生长至单层的MA104细胞常规消化制成细胞悬液、细胞计数后以每孔1×10⁵细胞密度接种6孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养。待细胞完全贴壁后，去掉细胞中旧培养液，往6孔板中加入无血清的DMEM培养液培养6h。6h后吸去无FBS的DMEM培养液，细胞分别加入经过10μg/ml的胰酶孵育的100TCID50RV-Wa株病毒液37℃常规培养2h。2h后，吸去病毒液，无FBS的DMEM培养液洗一遍细胞后加入不同浓度(5μM、10μM、20μM、40μM、80μM)的紫草素药液，对照组加入等体积的不含FBS的DMEM培养基，37℃下继续培养24h。24h后，分别收集细胞培养液，然后再往细胞内加入等体积的无FBS的DMEM培养液，-20℃与4℃间反复冻融三次，4℃，6000r/min离心15min后，收集上清液于EP管中。

将两次收集的上清液使用人轮状病毒抗原检测试剂盒(购自DRG InternationalInc.；型号为EIA-4455)进行检测，具体操作如下：①取100μL的阴性对照液加入到1号孔中，100μL阳性对照液加入到2号板孔中。②取100μL的待测各组上清悬液样本各100μL加入到其余孔中，室温下孵育30min后，用洗液冲洗板子。③在每一孔内加入2滴试剂1(蓝色溶液)室温下孵育5min，然后用洗液冲洗板子。④在每一孔内加入2滴试剂2(红色溶液)室温下孵育5min后，用洗液冲洗板子。⑤在每一孔内加入2滴生色团，室温孵育5min后，每孔加入2滴终止液，混匀。⑥在450nm下，读取OD值。如果样本的OD值≥0.15，被确定为阳性标本。其中，试剂1为染成蓝色的抗轮状病毒多克隆抗体(含有噻汞撒)；试剂2为染成红色的结合辣根过氧化物酶的抗小鼠抗体(含有噻汞撒)；阳性对照液为稀释后的轮状病毒抗原(含有噻汞撒)；阴性对照液为缓冲液(含有噻汞撒)；生色团为TMB(四磷酸钠甲基苯啶)和过氧化氢；洗液为浓缩缓冲液和噻汞撒；终止液为1M磷酸。

结果如图3所示，ELISA实验结果表明紫草素对人轮状病毒抗原合成具有显著的抑制作用，且随着紫草素干预剂量的增加，轮状病毒感染的MA104细胞内外病毒抗原的表达水平越低，呈现一定的浓度依赖性。

实施例4

紫草素体内抗轮状病毒作用

本实施例研究紫草素的体内抗轮状病毒作用，具体操作方法为：将5日龄的昆明小鼠乳鼠30只随机分为空白组、病毒模型组、紫草素治疗组，每组10只，并分配母鼠自然哺乳喂养。实验前各组的乳鼠大便轮状病毒抗原检测均为阴性。动物分组后，空白组采用微量加样器借助动物自然吸允能力灌胃DMEM培养液，150μL/只。病毒模型组及紫草素治疗组乳鼠给予灌胃轮状病毒液(100TCID50)，150μL/只，病毒接种后，各组乳鼠与母鼠同笼，正常母乳喂养，进行病毒感染2天后，紫草素治疗组乳鼠给药0.58g/kg的药液，模型组及对照组给予DMEM培养液，每只200μL，每天1次，连续5天。各组动物隔离饲养观察，每天测量记录乳鼠的体重，收集感染前后乳鼠每天的大便样品。病毒攻击后，对动物进行连续的临床观察。每隔12h左右观察一次，每次用手指轻轻按摩乳鼠腹部，观察腹泻产生情况和对大便进行评分，腹泻的判断参照文献[Boshuizen JA,et al.(2003)Changes in small intestinalhomeostasis,morphology,and gene expression during rotavirus infection ofinfant mice.J Virol 77:13005–13016.]中的操作，分值介于1-4分。没有粪便(0分)；褐色的粪便(1分)；棕色软便(2分)；黄色软便(3分)；黄色水样便(4分)。评分≥2分的小鼠被认为发生了腹泻。腹泻的判断由同一人完成。无法获得粪便的乳鼠视为无腹泻。

各组乳鼠的腹泻评分情况如图4所示(以平均分值统计)，各组乳鼠的体重检测情况如图5所示(以平均分值统计)：病毒模型组和紫草素治疗组在感染病毒后12h至24h乳鼠出现腹部膨胀、呆滞、蜷缩、饮食减少、精神倦怠，并陆续有乳鼠出现腹泻，大便的量及次数比空白组多。病毒模型组在病毒攻击后连续3天，腹泻程度最严重，粪便呈水样便，出现腹泻的乳鼠数目比例最高，出现稀便的乳鼠***红肿，皮肤干燥多皱褶，精神懒倦，体质量増长缓慢甚至不增长等现象。紫草素治疗组在病毒攻击后第1天腹泻程度最严重，用药第3天后腹泻减轻。空白组未见腹泻，大便呈淡黄褐色，皮肤有弹性，***无红肿，体重增长较快。三组乳鼠在病毒感染第三天的腹泻情况如图6所示(a为对照组，b为病毒模型组，c为紫草素治疗组)，由图可知：空白组乳鼠为未出现腹泻情况，粪便呈褐色；病毒模型组在病毒攻击第3天，腹泻程度最严重，粪便呈水样便；紫草素治疗组乳鼠在第3天腹泻程度得到明显的缓解，粪便为黄色软便。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的紫草素在制备抗轮状病毒感染的药物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物抑制轮状病毒的复制和扩增。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物抑制轮状病毒的抗原合成。

4.紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抑制轮状病毒的复制和扩增的药物中的应用。

5.紫草素或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抑制轮状病毒的抗原合成的药物中的应用。

6.如权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料包括赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述载体包括脂质体、胶束、树状大分子、微球或微囊。

9.如权利要求1-8中任一项所述的应用，其特征在于，所述紫草素为药物组合物中含有的紫草素；

优选地，所述药物组合物中包括乙酰紫草素、异戊酰紫草素或β-乙酰氧基-异戊酰紫草素中的任意一种或至少两种的组合。

10.如权利要求1-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、注射剂、喷雾剂、膜剂、栓剂、滴鼻剂或滴丸剂。