CN104706836B

CN104706836B - 一种祛除黄褐斑的中药组合物及其应用与制备方法

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Publication number: CN104706836B
Application number: CN201510079063.5A
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 刘崇万; 徐振秋; 柏伟荣; 毕宇安; 王跃生; 邓辰辰; 刘世娟; 董兴叶
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: CN104706836A

Abstract

本发明涉及中药领域，尤其涉及一种中药组合物及其应用与制备方法。该中药组合物，由以下原料制得：当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花和葡萄籽提取物。本发明通过比较不同拆方组的结果发现缺当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花、葡萄籽提取物对于抑制小鼠B‑16黑素瘤细胞活性、酪氨酸酶活性以及黑色素生成的作用依次减弱，且当归、墨旱莲、女贞子的添加与否对于结果具有显著影响。说明本发明提供的中药组合物具有合理的配方，其中各组分缺一不可。

Description

一种祛除黄褐斑的中药组合物及其应用与制备方法

技术领域

本发明涉及中药领域，尤其涉及一种中药组合物及其应用与制备方法。

背景技术

黄褐斑俗称“蝴蝶斑”，“肝斑”或者“妊娠斑”，一种获得性色素沉着皮肤病，表现为色素对称性沉着，主要发生在面部，以颧部、颊部、鼻、前额、颏部为主，轻者为淡黄色或浅褐色；重者呈深褐色或浅黑色。多发于中青年女性，是临床上常见而又难以治愈的皮肤病之一。流行病学显示黄褐斑多发生于女性，而且随年龄增长，病情加重。并且大多数患者伴有不同程度的***、失眠、心烦易怒等内分泌及植物神经功能紊乱，给患者带来生活及精神方面诸多烦恼和痛苦。

中医学认为，黄褐斑的发生多由于肾阴不足，肾水不能上承，或肝郁气结、肝失条达，郁久化热，灼伤阴血，致使颜面气血失和而发病。临床上黄褐斑患者常出现***、腰膝酸软等肾阴不足之证，或表现出性格抑郁、情志不畅、急躁易怒等肝气不舒症状。而现代医学认为，黄褐斑主要是由于黑色素在皮肤内增多而引起，黑素细胞增多和黑色素生成增多是引起黑色素增多的两个主要因素。紫外线、内分泌、遗传、氧自由基、微生物等因素是引起黑色素增多的因素。另外，还有研究发现，黄褐斑的形成与下列因素有关：内分泌失调、妊娠***和孕激素水平、口服避孕药、子宫卵巢疾病、遗传因素、氧自由基、紫外线照射、血清铜含量、甲乙型肝炎、胆囊炎、酪氨酸功能障碍、化妆品、光毒性药物、抗癫痫药及情绪波动等。

因此，从中医辨证论治的角度，大多是理气活血，疏肝解郁，调和心脾等整体辨证论治治疗本病，从现代医学治疗的角度，主要从抑制黑色素的生成酶即酪氨酸酶，调节体内雌孕激素水平，清除自由基和脂质过氧化物等方面治疗。

目前市场上流通的声称具有祛斑作用的产品种类繁多，既包括定位于美容修饰作用的膏霜、乳液、水剂型态的化妆品，也包括胶囊、口服液等用于内服的保健食品，此外，还有一些针对皮肤病变而产生的斑点为治疗为目的的外用药品。这些产品中，大多数包括中药组合物或中药提取物的组合物。中药或中药提取物配伍是否合理决定着这些产品能够起到很好的治疗黄褐斑是作用。不合理的配方不但不能达到治疗黄褐斑的作用，反而可能会导致黄褐斑的加重。

因此，进一步开发配伍合理，能够有效治疗黄褐斑的中药组合物十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种能够有效治疗黄褐斑的中药组合物及其应用制备方法。

本发明提供了一种中药组合物，由以下原料制得：当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花和葡萄籽提取物。

在本发明的实施例中，本发明提供的中药组合物由以下质量份的原料制得：当归1份～10份、墨旱莲1份～6份、女贞子1份～6份、玫瑰花1份～8份、葡萄籽提取物0.1份～1.0份。

在一些实施例中，本发明提供的中药组合物由以下质量份的原料制得：

当归4份～8份、墨旱莲2份～4份、女贞子2份～4份、玫瑰花3份～5份、葡萄籽提取物0.1份～0.4份。

在一些实施例中，本发明提供的中药组合物由以下质量份的原料制得：当归6份、墨旱莲3份、女贞子3份、玫瑰花4份、葡萄籽提取物0.2份。

在一些实施例中，本发明提供的中药组合物由以下质量份的原料制得：当归5份、墨旱莲4份、女贞子2份、玫瑰花5份、葡萄籽提取物0.3份。

在一些实施例中，本发明提供的中药组合物由以下质量份的原料制得：当归4份、墨旱莲4份、女贞子4份、玫瑰花4份、葡萄籽提取物0.2份。

墨旱莲本发明采用的葡萄籽提取物可为自行制备，也可由市场购得，其实施皆在本发明的保护范围之内。

在本发明的实施例中，葡萄籽提取物的制备方法为：将葡萄籽粉碎，以乙醇回流提取后，经浓缩、干燥，得到葡萄籽提取物。

作为优选，葡萄籽的含水量不大于5％。

作为优选，乙醇的质量为葡萄籽的10倍。

作为优选，回流提取的温度为90℃～100℃，提取2次，每次2h。

作为优选，浓缩采用真空浓缩，浓缩至密度为1.2g/cm³～1.5g/cm³。

作为优选，干燥采用喷雾干燥，温度为170℃～180℃。

本发明实施例中采用的葡萄籽提取物中原花青素含量≥95％，水分含量≤ 5％，pH值为2.5～4.5，灰分≤0.5％，砷≤10mg/kg，铁≤3mg/kg。

黑色素是一种生物多聚体，广泛存在于人和动物的皮肤、毛发和眼睛中。黑色素的生成与酪氨酸酶密切相关，其主要发生在黑色素细胞中。黑色素的的形成过程大致如下：体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下形成3,4-二羟基苯丙氨酸 (即多巴)、多巴进一步氧化形成多巴醌、多巴醌经多聚合反应与氧化反应生成多巴色素、多巴色素又经一系列羟化反应、脱羧反应、氧化反应形成5，6- 吲哚醌，再与其他中间产物结合形成黑色素。因此，黄褐斑的形成与黑色素细胞活性以及体内存在的酪氨酸酶活性密切相关，鉴于此，本发明在相关的药效实验过程中选择了检测小鼠B-16黑素瘤细胞活性、酪氨酸酶活性以及黑色素生成量来探讨本专利发明组合物对于黄褐斑的祛除效果。

本发明通过比较不同拆方组的结果发现缺当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花、葡萄籽提取物对于抑制小鼠B-16黑素瘤细胞活性、酪氨酸酶活性以及黑色素生成的作用依次减弱，且当归、墨旱莲、女贞子的添加与否对于结果具有显著影响。说明，本发明提供的中药组合物具有合理的配方，其中各组分缺一不可。

本发明提供的中药组合物在制备祛除黄褐斑的产品中的应用。

实验结果表明：(1)本发明组合物在极低浓度时，可刺激B16细胞的增殖；但当其浓度介于50μg/ml-400μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于400μg/ml时，对B-16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用趋于平衡，不再增强；(2)本发明组合物在极低浓度时，对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但当其浓度介于100μg/ml-300μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于400μg/ml时，对酪氨酸酶活性抑制作用趋于平衡，不再增强；(3)本发明组合物在极低浓度时，对黑色素生成有一定促进作用，但当其浓度介于50μg/ml-150μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于150μg/ml时，对黑色素生成抑制作用趋于平衡，不再增强。

在本发明的实施例中，祛黄褐斑的产品为口服产品。

作为优选，口服产品的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、饮液或颗粒剂。

作为优选，祛黄褐斑的产品为保健品、食品或药物。

本发明还提供了一种祛除黄褐斑的产品，包括本发明提供的中药组合物。

作为优选，祛除黄褐斑的药物包括本发明提供的中药组合物及药学上可接受的辅料。

优选的，药学上可接受的辅料为：稀释剂、吸收剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、包衣材料或胶囊材料中任一种或两者以上的组合。

作为优选，祛除黄褐斑的保健品包括本发明提供的中药组合物及保健品中可接受的辅料。

优选的，保健品中可接受的辅料为：微晶纤维素、二氧化硅、预胶化淀粉、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠、甲基硅油、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、甜菊糖苷、玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮或磷酸钙中任一种或两者以上的组合。

作为优选，祛除黄褐斑的食品包括本发明提供的中药组合物及食品中可接受的原料和辅料。

优选的，辅料为柠檬酸、苹果酸、山梨酸钾、马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇、甜菊糖甙、羟丙纤维素、羧甲基纤维素钠、明胶、大豆油、黄芪胶、氯化钠、氯化钾或磷酸钙。

优选的，原料为蜂蜜、蜂王浆或蜂胶。

本发明提供的中药组合物的制备方法，包括：将当归、墨旱莲、女贞子和玫瑰花水煎后，过滤得滤液，将滤液浓缩、干燥后与葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

在本发明的实施例中，水煎的温度为80℃～100℃，次数为1次～3次，每次水煎60min～120min。

作为优选，水煎的温度为100℃，次数为3次，每次水煎90min。

在本发明的实施例中，所述水煎的水的质量为当归、墨旱莲、女贞子和玫瑰花质量之和的8倍～10倍。

作为优选，所述水煎的水的质量为当归、墨旱莲、女贞子和玫瑰花质量之和的9倍。

作为优选，浓缩采用真空浓缩，浓缩温度为60℃。

作为优选，浓缩至密度为1.1g/mL。

作为优选，干燥为喷雾干燥，干燥温度为150℃～200℃。

本发明提供了一种中药组合物，由以下原料制得：当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花和葡萄籽提取物。本发明通过比较不同拆方组的结果发现缺当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花、葡萄籽提取物对于抑制小鼠B-16黑素瘤细胞活性、酪氨酸酶活性以及黑色素生成的作用依次减弱，且当归、墨旱莲、女贞子的添加与否对于结果具有显著影响。说明本发明提供的中药组合物具有合理的配方，其中各组分缺一不可。

具体实施方式

本发明提供了一种中药组合物及其应用与制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的原料皆为普通市售品，皆可由市场购得。

其中，小鼠B-16黑素瘤细胞株，由华神集团提供；

酶标仪：Bio-Rad，Model 550；

离心机：LDZ5-2，北京医用离心机厂；

倒置显微镜：Nikon DEAPHOT Fx-35DX；

二氧化碳细胞培养箱：BNA-311，ESPEC；

精密电子天平(精密度0.01g)：EB-3200D，日本岛津；

电子天平(精密度0.001g)：JA1003A，上海精天电子仪器有限公司；

离心沉淀器：80-2，上海手术器械厂；

连续定量可调移动移液枪：10ul-100ul、20ul-200ul、100-1000ul、1-5ml，芬兰雷勃Finnpipette；

石英紫外线杀菌灯：扬州通达卫生器械有限公司；

智能立式不锈钢灭菌器：LDZM-40KCS，上海申安医疗器械有限公司；

SOD试剂：南京建成生物工程研究所提供，批号20031225；

MDA试剂：南京建成生物工程研究所提供，批号20031226；

硫化钠：500g/瓶，化学纯，成者化学试剂厂，批号980923；

生理盐水：0.9％氯化钠注射液，500ml：4.5g。国药准字H51021158，四川科伦大药厂有限责任公司，批号20030921-18；

RPMI-1640：GIBCO公司；

胎牛血清、胎牛血清：HyClone公司；

L多巴：美国Slpa公司产品，批号D9628；

胰蛋白酶：上海华美生物公司产品，批号2186；

MTT，SDS，ConA，琼脂：Sigma公司；

另有谷氨酰胺，青霉素，庆大霉素，Tris Base及其它国产分析纯试剂。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 中药组合物的制备

将当归60g、墨旱莲30g、女贞子30g、玫瑰花40g洗净后，1280g饮用水，加热至80℃，水煎三次，每次煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为 150～200℃，得细粉A。将细粉A与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

实施例2 中药组合物的制备

将当归80g、墨旱莲40g、女贞子40g、玫瑰花50g洗净后，2100g饮用水，加热至90℃，水煎3次，每次煎煮90分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为 150～200℃，得细粉A。将细粉A与4g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

实施例3 中药组合物的制备

将当归40g、墨旱莲20g、女贞子20g、玫瑰花30g洗净后，1100g饮用水，加热至120℃，水煎3次，每次煎煮60分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为 150～200℃，得细粉A。将细粉A与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

实施例4 中药组合物的制备

将当归10g、墨旱莲10g、女贞子10g、玫瑰花10g洗净后，400g饮用水，加热至120℃，水煎2次，每次煎煮60分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A与1g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

实施例5 中药组合物的制备

将当归100g、墨旱莲60g、女贞子60g、玫瑰花80g洗净后，3000g饮用水，加热至90℃，水煎1次，煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A与10g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

对比例1 拆方中药组合物的制备

将墨旱莲30g、女贞子30g、玫瑰花40g洗净后，1000g饮用水，加热至 80℃，水煎三次，每次煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为 60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

对比例2 拆方中药组合物的制备

将当归60g、女贞子30g、玫瑰花40g洗净后，1300g饮用水，加热至80℃，水煎三次，每次煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

对比例3 拆方中药组合物的制备

将当归60g、墨旱莲30g、玫瑰花40g洗净后，1300g饮用水，加热至80℃，水煎三次，每次煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

对比例4 拆方中药组合物的制备

将当归60g、墨旱莲30g、女贞子30g洗净后，1200g饮用水，加热至80℃，水煎三次，每次煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

对比例5 拆方中药组合物的制备

将当归60g、墨旱莲30g、女贞子30g、玫瑰花40g洗净后，1600g饮用水，加热至80℃，水煎三次，每次煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为 150～200℃，得到中药组合物。

对比例6 拆方中药组合物的制备

将女贞子30g、玫瑰花40g洗净后，700g饮用水，加热至80℃，水煎三次，每次煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

对比例7 拆方中药组合物的制备

将玫瑰花40g洗净后，400g饮用水，加热至80℃，水煎三次，每次煎煮 120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

对比例1 拆方中药组合物的制备

将当归60g、玫瑰花40g洗净后，1000g饮用水，加热至80℃，水煎三次，每次煎煮120分钟，得过滤液；将滤液浓缩，浓缩温度为60℃，浓缩至比重 1.1g/ml；将浓缩液喷雾干燥，喷干温度为150～200℃，得细粉A。将细粉A 与2g葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

实施例6 祛黄褐斑保健品的制备

取实施例1～5任一项制备的中药组合物，与辅料混合，制粒，获得祛黄褐斑的保健品。

实施例7 祛黄褐斑药物的制备

取实施例1～5任一项制备的中药组合物，与微晶纤维素混合，制粒，获得去黄褐斑的药物。

实施例8 祛黄褐斑食品的制备

取实施例1～5任一项制备的中药组合物，与蜂蜜混合，获得祛黄褐斑的食品。

实施例9 中药组合物对B16细胞增殖抑制作用

取本发明实施例1～3和对比例1～8制得的中药组合物检测对B16细胞增殖的抑制作用，实验设不添加中药组合物的空白对照。实验方法为：

1.1培养液配制

(1)RPMI-1640培养液(1000ml)：将RPMI-1640干粉溶于300ml三蒸水中，用水洗包装袋2次，倒入合并、搅拌，加三蒸水至近1000ml处：加NaHCO₃2g，补充谷氨酰胺至终浓度为3mmol/L，加入酚红(终浓度为5.3mg/L)；加入抗生素a青霉素(100U/ml)、b庆大霉素(50U/ml)；定容至1000ml；以NaOH或HCl 调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的RPMI-1640培养液2ml 入25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察有否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

(2)10％小牛血清的RMPI-1640培养液(100ml)：取配好的RPMI-1640培养液90ml，加入10ml小牛血清，以NaOH或HCl调节PH至7.2。过滤除菌， 4℃保存。吸取配制好的含10％小牛血清的RPMI-1640培养液2ml入25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察有否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

(3)10％胎牛血清的RMPI-1640培养液(100ml)：取配好的RPMI-1640培养液80ml，加入10ml胎牛血清和10mlHeper’s(终浓度为5mmol/L)；加入2- 巯基乙醇(2-Me)至终浓度为50μmol/L以NaOH或HCI调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液2ml入 25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察是否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

1.2消化液配制

(1)母液配制：用无钙镁Hanks液配制0.25％的胰蛋白酶溶液。过滤除菌， 4℃保存。用PBS配制0.04％的EDTA，高压灭菌，4℃保存。

(2)应用液配制：取0.4ml 0.04％的EDTA，0.4ml 0.25％胰蛋白酶，加入无菌PBS到2ml，4℃保存。

1.3无机盐缓冲液配制

(1)PBS溶液(1000ml)：8g NaCl(137mmol/L)，0.2g KCl(2.7mmol/L)，1.15gNa₂HPO₄·7H₂O(4.3mmol/L)，0.2g KH₂PO₄(1.4mmol/L)溶于1L双蒸水中，调节 PH到7.2。高压灭菌，4℃保存。

(2)0.83％Tris-NH₄Cl溶液(500ml)：3.0275g Tris(0.05mol/L)溶于250ml双蒸水中；4.15g NH₄Cl(0.83％)溶于250ml双蒸水中。两种溶液混合，加双蒸水中定容至500ml。高压灭菌，4℃保存。

1.4观察中药组合物对B16细胞增殖抑制作用

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的 RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为5×10⁴个/ml。取0.1ml细胞悬液加入96孔细胞培养板，放在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养。

将实施例1～3和对比例1～8提供的中药组合物用生理盐水配置成2000μ g/ml的母液，121℃灭菌20min。将母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、 800、1200、1600μg/ml(共14个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔，取平均值。实验设空白对照，空白对照组不添加药液。

在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养72小时。于细胞培养结束前5 小时每孔弃去培养上清100μl，加入浓度为5mg/ml的MTT10μl(用生理盐水配制，过滤除菌)。培养结束后，每孔加10％SDS(用0.01M的HCl配置)100μl 振荡混匀，37℃下4小时，用酶标仪在570nm处读取0D值。统计软件采用 DPS 7.05版，处理间比较采用单因素分析，多重比较采用LSD法。

其中，实施例1提供的中药组合物对B16细胞增殖的抑制作用如表1所示：

表1 实施例1提供中药组合物体外抑制B-16增殖的影响(n-4，x±S)

浓度(μg/ml)	OD值	浓度(μg/ml)	OD值
				0	0.397±0.011a	300	0.375±0.013b
25	0.405±0.008a	400	0.360±0.008b
				50	0.410±0.013a	500	0.359±0.013b
75	0.407±0.014a	800	0.358±0.016b
				100	0.401±0.012a	1000	0.359±0.011b
150	0.400±0.010a	1200	0.358±0.009b
				200	0.386±0.011a	1400	0.357±0.015b
250	0.390±0.013a	1600	0.358±0.023b

注：a、b表示同一列中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)。

由表1可见，用MTT法测定本发明组合物对B-16黑色素瘤细胞增殖的影响，与空白对照相比有明显的抑制作用。在极低浓度时，本发明组合物可刺激B16细胞的增殖；但当其浓度大于50μg/ml时，随浓度增高，则呈现出抑制作用，最佳抑制浓度为400μg/ml；当本发明组合物浓度大于400μg/ml时，对B-16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用不会再随着浓度增大而增加。本发明实施例2～5制得中药组合物的检测结果与此相似。

其中，固定浓度为400μg/ml，比较实施例1提供的中药组合物和对比例 1～8提供的中药组合物对B16细胞增殖的抑制作用如表2所示：

表2 本发明组合物(不同拆方组)抑制B-16增殖的影响(n-4，x±S)

注：表2试验各药物浓度的选择均是在表1优选后的基础上进行，即浓度为400μg/ml；

a、b、c表示同一行中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)

由表2可见，用MTT法测定本发明组合物(不同拆方组)对B-16黑色素瘤细胞增殖的影响，与空白组相比，其他组别均有一定的抑制作用，而与对照组相比，所有的拆方组抑制作用均明显降低，另外，比较不同拆方组的结果发现缺当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花、葡萄籽提取物对于结果的影响依次减弱，且当归、墨旱莲、女贞子的添加与否对于结果具有显著影响。本发明实施例2～5制得中药组合物的检测结果与此相似。

可见，本发明组合物在极低浓度时，可刺激B16细胞的增殖；但当其浓度介于50μg/ml-400μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于400μg/ml时，对B-16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用趋于平衡，不再增强。

实施例10 中药组合物对酪氨酸酶活性的影响

取本发明实施例1～3和对比例1～8制得的中药组合物检测对酪氨酸酶活性的抑制作用，实验设不添加中药组合物的空白对照。培养液、消化液、无机盐缓冲液、母液的配制方法与实施例9相同，实验方法为：

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的 RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为8×10⁴个/ml。取0.1ml细胞悬液加入96孔细胞培养板。放在37℃、5％CO₂饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。

将母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0、25、50、 75、100、150、200、250、300、350、400、800、1200、1600μg/ml(共14个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设 4个复孔。在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养48小时。弃去上层清液，用PH7.4的PBS洗涤细胞2次，每孔加入50μl、1％TritonX-100。将96孔细胞培养板迅速放入-30℃冰箱，30min后取出，室温下自然解冻从而破坏细胞。 37℃预温后加入1％L-多巴溶液(10μl/孔)，37℃反应2h，用酶标仪在490nm 处读取0D值。统计软件采用DPS 7.05版，处理间比较采用单因素分析，多重比较采用LSD法。

其中，实施例1提供的中药组合物对酪氨酸酶活性的抑制作用如表3所示：

表3 本发明组合物对酪氨酸酶活性的影响(n-4，x±S)

浓度(ug/ml)	OD值	浓度(ug/ml)	OD值
				0	0.208±0.015a	300	0.142±0.022b
25	0.215±0.010a	400	0.100±0.017c
				50	0.212±0.018a	600	0.099±0.015c
75	0.213±0.015a	800	0.098±0.014c
				100	0.209±0.014a	1000	0.097±0.012c
150	0.197±0.017a	1200	0.098±0.014c
				200	0.160±0.014b	1400	0.099±0.008c
250	0.160±0.012b	1600	0.099±0.009c

注：a、b、c表示同一列中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)

由表3可见，小鼠B-16黑色素瘤细胞在经本发明组合物作用48小时后，低浓度本发明组合物(＜50μg/ml)对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但随浓度增高，则对酪氨酸酶活性有明显的抑制作用。本发明组合物浓度在 100-400μg/ml的范围内，能有效抑制B-16黑色素瘤细胞株的酪氨酸酶活性，且最佳抑制浓度为400μg/ml，当本发明组合物浓度大于400μg/ml时，对酪氨酸酶活性的抑制作用不会再随着浓度增大而增加。本发明实施例2～5制得中药组合物的检测结果与此相似。

其中，固定浓度为400μg/ml，比较实施例1提供的中药组合物和对比例 1～8提供的中药组合物对酪氨酸酶活性的抑制作用如表4所示：

表4 本发明组合物(不同拆方组)抑制酪氨酸酶活性的影响(n-4，x±S)

备注：表4试验各药物浓度的选择均是在表3优选后的基础上进行，即400μg/ml；

a、b、c表示同一行中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)。

由表4可见，与空白组相比，对照组及不同的拆方组别对于酪氨酸酶活性均有一定的抑制作用，而与对照组相比，所有的拆方组抑制作用均明显降低，另外，比较不同拆方组的结果发现缺当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花、葡萄籽提取物对于结果的影响依次减弱，且当归、墨旱莲、女贞子的添加与否对于结果具有显著影响。

可见，本发明组合物在极低浓度时，对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但当其浓度介于100μg/ml-300μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于400μg/ml时，对酪氨酸酶活性抑制作用趋于平衡，不再增强。

实施例11 中药组合物对黑色素生成的影响

取本发明实施例1～3和对比例1～8制得的中药组合物检测对黑色素生成的抑制作用，实验设不添加中药组合物的空白对照。培养液、消化液、无机盐缓冲液、母液的配制方法与实施例9相同，实验方法为：

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的 RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为1×10⁵个/ml。取1ml细胞悬液加入 24孔细胞培养板。在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养。

将母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0、25、50、 75、100、150、200、250、300、350、400、800、1200、1600μg/ml(共14个梯度)加入贴壁生长4小时的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔，在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养96小时。0.25％胰蛋白酶消化细胞，每孔取1×10⁵个细胞离心弃去上层清液，加入1ml1mol/L的 NaOH，震荡5分钟，用酶标仪在490nm处读取0D值。统计软件采用DPS 7.05 版，处理间比较采用单因素分析，多重比较采用LSD法。

其中，实施例1提供的中药组合物对黑色素生成的抑制作用如表5所示：

表5 本发明组合物对黑色素生成的影响(n-4，x±S)

浓度(ug/ml)	OD值	浓度(ug/ml)	OD值
				0	0.099±0.010a	300	0.049±0.019c
25	0.095±0.009a	400	0.048±0.008c
				50	0.090±0.012a	600	0.050±0.018c
75	0.088±0.009a	800	0.049±0.020c
				100	0.076±0.020b	1000	0.051±0.013c
150	0.069±0.015b	1200	0.047±0.010c
				200	0.049±0.010c	1400	0.049±0.009c
250	0.049±0.010c	1600	0.049±0.009c

注：a、b、c表示同一列中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)。

由表5可见，本发明组合物对小鼠B-16黑色素瘤细胞作用4d后，测定黑色素含量，在50μg/ml以下，随药物浓度增加，黑色素含量不断增加，说明在极低浓度下，本发明组合药物具有一定促进黑色素生成的作用；而大于 50μg/ml浓度时，随浓度增高，本发明组合物可明显抑制黑色素的生成，当本发明组合物浓度为150μg/ml时，其对黑色素生成的抑制达到最大；在 150-1600μg/ml之间，对黑色素的抑制趋于平稳。

其中，固定浓度为150μg/ml，比较实施例1提供的中药组合物和对比例 1～8提供的中药组合物对酪氨酸酶活性的抑制作用如表6所示：

表6 本发明组合物(不同拆方组)抑制黑色素生成的影响(n-4，x±S)

注：表6试验各药物浓度的选择均是在表5优选后的基础上进行，即浓度为100μg/ml；

a、b表示同一行中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)。

由表6可见，与空白组相比，对照组及不同的拆方组别对于黑色素生成均有一定的抑制作用，而与对照组相比，所有的拆方组抑制作用均明显降低，另外,比较不同拆方组的结果发现缺当归、墨旱莲、女贞子、玫瑰花、葡萄籽提取物对于结果的影响依次减弱，且当归、墨旱莲、女贞子的添加与否对于结果具有显著影响。

本发明组合物在极低浓度时，对黑色素生成有一定促进作用，但当其浓度介于50μg/ml～150μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于150μg/ml时，对黑色素生成抑制作用趋于平衡，不再增强。

可见，本发明组合物具有一定的祛黄褐斑的作用，且当归、墨旱莲、女贞子对结果具有显著影响，本发明提供中药组合物中的组分缺一不可。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种祛除黄褐斑的中药组合物，其特征在于，

由以下重量份的原料制得：当归1份~10份、墨旱莲1份~6份、女贞子1份~6份、玫瑰花1份~8份、葡萄籽提取物0.1份~1.0份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料制得：当归4份~8份、墨旱莲2份~4份、女贞子2份~4份、玫瑰花3份~5份、葡萄籽提取物0.1份~0.4份。

3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述葡萄籽提取物中原花青素的含量不低于95%。

4.如权利要求1~3任一项所述的中药组合物在制备祛除黄褐斑的产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为口服产品。

6.一种祛除黄褐斑的产品，其特征在于，包括如权利要求1~3任一项所述的中药组合物。

7.如权利要求1~3任一项所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括：将当归、墨旱莲、女贞子和玫瑰花水煎后，过滤得滤液，将所述滤液浓缩、干燥后与葡萄籽提取物混合，得到中药组合物。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述水煎的温度为80℃~100℃，次数为1次~3次，每次水煎60min~120min。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述水煎的水的重量为所述当归、墨旱莲、女贞子和玫瑰花重量之和的8倍~10倍。