CN110305870B - p65基因在卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了p65基因在卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用。本发明通过预测FGFR1基因启动子区p65潜在结合位点，以及通过启动子活性分析初步判定了p65基因对FGFR1基因启动子活性的调控作用，并在超表达和干扰p65基因后检测了FGFR1基因mRNA表达变化和FGFR1启动子活性，发现p65基因能够促进FGFR1基因mRNA的表达，且能增强FGFR1基因启动子活性，这为p65基因和FGFR1基因在卵巢颗粒细胞中的表达调控机制研究积累材料；同时，本发明的结果显示p65靶向结合于FGFR1启动子区促进FGFR1的转录表达。

Description

p65基因在卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用
技术领域
本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，特别涉及p65基因在卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用。
背景技术
哺乳动物转录因子p65(REL-A)属于NFκB(nuclear factorκB)家族成员之一。NFκB家族由NFκB1(p50/p105)、NFκB2(p52/p100)、REL-A、REL-B和REL(cREL)五个成员组成。这些蛋白质之间经过二聚化后形成有功能的NFκB。NFκB主要位于细胞质中，其与抑制蛋白IκB结合形成稳定的IκB-NFκB复合物，并以无活性状态存在于细胞质中。当细胞受到刺激时，细胞外的信号因子与膜受体结合引起一系列下游反应，激活NFκB信号通路，使得IκB蛋白发生活化被降解，从而释放NFκB进入细胞核，自由的NFκB在细胞核中与下游靶基因结合调控靶基因的转录表达。
成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)是成纤维细胞生长因子受体家族成员之一，除FGFR1外该家族还包含FGFR2、FGFR3和FGFR4，该家族属于受体酪氨酸激酶，是一种跨膜蛋白质，基因结构主要由细胞外段、跨膜域和细胞内段三部分组成。FGFR1细胞外段为其配体成纤维细胞生长因子(Fibroblast growthfactor，FGFs)的结合区，细胞内段具有酪氨酸酶活性。当FGFs与FGFR1结合后会形成稳定的二聚体结构，FGFR1细胞内段酪氨酸激酶活性区被激活发生磷酸化，并通过蛋白质级联反应将FGFs信号传递至细胞核。FGFs/FGFR的结合可激活PLCγ，MAPK和PI3K-AKT等信号传导途径，并在细胞增殖、分化、存活和迁移过程中发挥重要作用。
卵泡的结构主要由***、颗粒细胞和膜细胞三部分组成。卵泡发育最为显著的形态变化特征为颗粒细胞的增殖和卵泡腔的形成。原始卵泡时期，***被单层扁平状的颗粒细胞所包裹，随着卵泡的发育，颗粒细胞逐渐增殖至数层，且形态也由扁平状变为柱状，并在卵泡成熟***前形成包裹***的卵丘颗粒细胞和紧贴卵泡内壁的壁层颗粒细胞。此外，已有大量研究认为卵泡的募集、选择和***过程本质上是颗粒细胞的增殖和分化，且各类生长因子、细胞因子和激素等也是通过颗粒细胞调控卵泡的发育和闭锁。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供p65基因在卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用。通过生物信息学技术预测p65基因在FGFR1基因启动子区可能存在的靶向结合位点，并结合基因工程和细胞工程技术，确定在卵巢颗粒细胞中p65基因在FGFR1基因启动子活性和mRNA表达变化中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：p65基因在卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用。
体外环境下，p65基因促进FGFR1基因mRNA的表达。
体外环境下，p65基因增强FGFR1基因启动子的活性，进而促进FGFR1基因的转录起始。
所述的FGFR1基因启动子序列信息可从NCBI数据库下载所得(Gene ID:100153248)。
所述的p65基因增强FGFR1基因启动子的活性为通过p65蛋白结合到FGFR1基因启动子的上游348bp至338bp(-348/-338)的位点上实现。
所述的卵巢颗粒细胞优选为猪卵巢颗粒细胞。
所述的促进FGFR1基因mRNA的表达，和/或增强FGFR1基因启动子的活性，可利用增加外源性p65基因的方式。
所述的增加外源性p65基因通过如下方法实现：将p65基因连接到载体上，构建含有p65基因的超表达载体；然后将含有p65基因的超表达载体转染到卵巢颗粒细胞中。
所述的载体为pcDNA3.1载体。
所述的含有p65基因的超表达载体优选为通过如下方法构建得到：
(1)提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，然后将其逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
(2)将目的片段连接到用限制性内切酶Kpn I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体，即所述的含有p65基因的超表达载体。
步骤(1)中进行PCR扩增所用引物如下所示：
F:5’-GGGGTACCATGGACGACCTCTTCCCCCT-3’；
R:5’-GCTCTAGATTAGGAGCTGATCTGACTCA-3’。
p65基因在制备促进FGFR1基因mRNA的表达，和/或增强FGFR1基因启动子的活性的药物中的应用，为利用增加外源性p65基因的方式。
所述的增加外源性p65基因通过如下方法实现：将p65基因连接到载体上，构建含有p65基因的超表达载体；然后将含有p65基因的超表达载体转染到卵巢颗粒细胞中。
所述的载体为pcDNA3.1载体。
抑制p65基因表达的小干扰RNA片段(siRNA)在猪卵巢颗粒细胞中抑制FGFR1mRNA的表达的应用，所述应用的环境为体外环境；
所述的小干扰RNA片段的靶向序列(si-p65)为：5′-GCACCGGATTGAGGAGAAA-3′。
本发明的验证结果如下：
1、本发明通过生物信息学网站预测发现FGFR1基因启动子区-1673/-1663、-1283/1273、-1056/-1046、-746/-736、-534/-524、-348/-338存在6个转录因子p65潜在结合位点(图1)。
2、本发明通过双荧光活性实验检测到，随着FGFR1启动子区长度由P1缺失至P5，启动子活性无显著变化；当启动子片段缺失至P6时，与P5相比P6启动子活性显著增加(P<0.05)；当启动子片段缺失至P7时，与P6相比P7启动子活性出现显著性降低(P<0.05)(图2)。
3、本发明通过qRT-PCR检测到，在颗粒细胞内超表达p65基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比FGFR1基因mRNA表达量显著增加(P<0.01)(图3a)；干扰p65基因表达后，与对照组(NC)相比FGFR1基因mRNA表达量显著减少(P<0.05)(图3b)。
4、本发明通过双荧光活性实验检测到，在颗粒细胞内超表达p65基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比FGFR1-P6启动子活性显著增高(P<0.01)(图4a)；干扰p65基因表达后，与对照组(NC)相比FGFR1-P6启动子活性无显著影响(图4b)；缺失FGFR1基因P6-P7(-377/-84)区域p65结合位点(-348/-338)后，FGFR1-P6启动子活性显著降低(P<0.05)(图4c)。
5、本发明通过ChIP实验检测到，p65结合于FGFR1(-348/-338)区域。ChIP结果表明，实验组(Anti-p65)PCR扩增得到预期目的片段长度的电泳条带，阳性对照(Input-p65和Anti-RNA polymerase II)有预期长度大小的电泳条带出现，阴性对照组(IgG)无电泳条带出现(图5)。
本发明以p65基因(Gene ID:100135665)和FGFR1基因(Gene ID：100153248)为研究对象，采用了分子细胞生物学方法研究p65基因在猪卵巢颗粒细胞中对FGFR1基因的靶向调控作用，证实了p65基因在猪卵巢颗粒细胞中正向调控FGFR1基因的转录表达。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明预测了FGFR1基因启动子区p65潜在结合位点，通过启动子活性分析初步判定了p65基因对FGFR1基因启动子活性的调控作用，并在超表达和干扰p65基因后检测了FGFR1基因mRNA表达变化和FGFR1-P6启动子活性，为p65基因和FGFR1基因在卵巢颗粒细胞中的表达调控机制研究积累材料。同时，本发明的结果显示p65靶向结合于FGFR1启动子区促进FGFR1的转录表达。
附图说明
图1是转录因子p65在FGFR1启动子区结合位点预测结果图。
图2是FGFR1基因启动子活性分析结果图。
图3是qRT-PCR法检测超表达和干扰p65对FGFR1基因mRNA表达变化结果图；其中，a为qRT-PCR法检测超表达p65对FGFR1基因mRNA表达的影响；b为qRT-PCR法检测干扰p65对FGFR1基因mRNA表达的影响。
图4是双荧光活性法检测超表达和干扰p65后，以及缺失p65结合位点后FGFR1-P6启动子活性变化结果图；其中，a为双荧光活性法检测超表达p65后FGFR1-P6启动子的活性变化；b为双荧光活性法检测干扰p65后FGFR1-P6启动子的活性变化；c为缺失p65结合位点后FGFR1-P6启动子的活性变化。
图5是ChIP法检测p65在FGFR1启动子区结合情况结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1构建p65基因超表达载体
BioEdit软件分析发现p65基因CDS区序列无Kpn I和Xba I两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司，货号V79020)存在Kpn I和Xba I酶切位点。primer premier 5.0软件设计p65基因CDS区引物，其上下游引物(F:5′-GGGGTACCATGGACGACCTCTTCCCCCT-3′；R:5′-GCTCTAGATTAGGAGCTGATCTGACTCA-3′)分别加上Kpn I和Xba I酶切位点序列。提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，然后逆转录成cDNA，再以猪卵巢颗粒细胞cDNA为模板，PCR扩增目的片段，经纯化回收、双酶切、连接pcDNA3.1载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Magen公司)，命名为pcDNA3.1-p65。
实施例2 FGFR1启动子缺失片段重组质粒的构建
使用BioEdit软件分析PCR扩增所得的FGFR1启动子区酶切位点分布情况，并参照pGL3-basic载体图谱，选择Kpn I和Bgl II作为构建FGFR1启动子缺失片段报告基因载体的酶切位点。
BioEdit软件分析发现FGFR1基因启动子区序列(Gene ID:100153248)无Kpn I和Bgl II两种限制性内切酶酶切位点，而pGL3-basic载体(购自Promega公司，货号E1751)存在Kpn I和Bgl II酶切位点。primer premier 5.0软件设计避开p65结合位点的FGFR1基因启动子缺失片段引物，其上下游引物分别加上Kpn I和Bgl II酶切位点序列。以猪耳组织DNA为模板，以P1(P2、P3、P4、P5、P6或P7)为上游引物，以R为下游引物，PCR扩增目的片段，经纯化回收、双酶切、连接pGL3-basic载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Magen公司)，按FGFR1基因启动子缺失片段的长度大小，由大到小依次命名为P1-P7(带有萤火虫荧光素酶标记)。同时，参照上述方法，以猪耳组织DNA为模板，以P6-DF/R和P6/P6-DR为引物扩增目的片段，并利用重叠PCR原理将缺失p65结合位点的目的片段拼接起来，再经酶切后连接到pGL3-basic载体上，得到缺失FGFR1基因P6(-377/-84)区域p65结合位点的重组质粒P6-p65-Del。
FGFR1启动子缺失片段P1-P7引物以及缺失启动子P6序列内p65结合位点的引物信息如下：
P1(-2044/+401)F:5′-GGGGTACCAAATTAGGGGACAAGGTTATCT-3′；
P2(-1652/+401)F:5′-GGGGTACCATAGCCTGATTCCTCAAGTCTG-3′；
P3(-1069/+401)F:5′-GGGGTACCGTTGCGCTGCCTGTGGTGTA-3′；
P4(-815/+401)F:5′-GGGGTACCACTTCAGGGCTACAGCGTCT-3′；
P5(-700/+401)F:5′-GGGGTACCAGCCAGAACGCAGGAAAGGA-3′；
P6(-377/+401)F:5′-GGGGTACCGACTCAGTTTAGCGCATTGC-3′；
P7(-84/+401)F:5′-GGGGTACCGCTTCGGCTCCATTGTTCCC-3′；
R:5′-GAAGATCTGAGTTGGCGGAAAAGTTGGG-3′；
P6-DF 5′-GGCGACCTCG****CCGCGGGCGCGCGCTGCATC-3′；
P6-DR 5′-GATGCAGCGCGCGCCCGCGG****CGAGGTCGCC-3′。
注：1、上述括号中“-2044/+401”表示FGFR1基因启动子区上游2044bp至下游401bp共2445个碱基(转录起始位点处的碱基定为“+1”)；其他以此类推，“-84/+401”表示FGFR1基因启动子区上游84bp至下游401bp共485个碱基。
2、P6-DF和P6-DR表示缺失启动子P6序列内p65结合位点所需用到的重叠PCR引物，“****”表示缺失序列“GGAAGGGACC”。
实施例3 FGFR1启动子区p65结合位点的预测
使用TFBIND、Biobase和Jaspar生物信息学网站在线预测FGFR1启动子区(-2044/+401)潜在转录因子结合位点情况，根据各生物信息学网站综合预测结果及文献查阅，确定p65作为候选转录因子结合在FGFR1启动子区影响猪FGFR1基因的表达。
TFBIND：http://tfbind.hgc.jp/；
Biobase：http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html；
Jaspar：http://jaspar.genereg.net/。
实施例4卵巢颗粒细胞的培养
(1)取屠宰场采集的猪卵巢组织放入含1％(w/w)双抗的PBS或生理盐水中，置于冰上迅速带回实验室；
(2)将采集的卵巢在无菌培养室用PBS或生理盐水(含1％(w/w)双抗)清洗3遍后，迅速转入超净工作台，并用1mL无菌一次性注射器浅***卵巢有腔卵泡中吸取***；
(3)吸取的***置于含有适量DMEM培养基的离心管中，800rpm室温离心5min；
(4)弃去上清，再用DMEM培养基重悬、离心，重复清洗细胞2次；配制DMEM完全培养基：89％(w/w)高糖DMEM培养基+10％(w/w)FBS+1％(w/w)双抗；
(5)用完全培养基重悬细胞，接种于75mL培养瓶；置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。
所述的双抗为青霉素和链霉素。
实施例5卵巢颗粒细胞的接种和转染
(1)猪卵巢颗粒细胞汇合度达到70～90％左右时，弃培养基，用预热的PBS清洗细胞3遍；
(2)加入0.25％胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液(DMEM完全培养基；)终止消化；
(3)PBS清洗2遍，期间800rpm离心5min；
(4)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；
(5)24h左右，观察猪卵巢颗粒细胞状态，待细胞汇合度达70～90％左右时准备转染；
(6)转染方法按Invitrogen公司的
Figure BDA0002097908450000071
3000试剂盒说明书进行；每组设置3个重复；
(7)转染后的细胞置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养；
(8)根据实验目的在转染24或48h后收集细胞。
实施例6 RNA抽提及反转录
细胞总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)猪卵巢组织用液氮研磨后，按每50～100mg的组织量加入1mL TRIzol，并反复吹打几次；从贴壁猪卵巢颗粒细胞中提取总RNA时，按每10cm2的细胞培养板底面积直接加入1mL TRIzol；
(2)冰上静置10min以充***解组织/细胞，12000rpm离心5min，弃沉淀吸上清于新1.5mL RNase-free管中；
(3)加入200μL氯仿(每1mL TRIzol)剧烈震荡15～30s，冰上静置15min，4℃12000rpm离心15min；
(4)吸取上层水相置于新的1.5mL RNase-free EP管中；
(5)加入500uL异丙醇(每1mL TRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在冰上静置10min，4℃12000rpm离心10min；
(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL 75％乙醇-DEPC水以洗涤RNA，4℃12000rpm离心5min后弃上清；
(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；
(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。
mRNA反转录参照TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect RealTime)cDNA反转录试剂盒进行。
实施例7 qRT-PCR
本发明中目的基因相对表达量的检测采用Maxima SYBR Green qPCRMaster Mix(2X)试剂盒(Thermo Scientific公司)进行。实验结果采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量(计算公式如下)。
目的基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}
其中GAPDH做为内参基因，本发明所用到的qRT-PCR引物为：
qRT-PCR-FGFR1 F：5′-GGCTACAAGGTCCGTTATG-3′；
R：5′-CAATCTTACTCCCATTCACC-3′；
qRT-PCR-GAPDH F：5′-TCGGAGTGAACGGATTTG-3′；
R：5′-TCACCCCATTTGATGTTGG-3′。
实施例8 FGFR1基因启动子区双荧光检测
以24孔细胞培养板为例，在猪卵巢颗粒细胞内转染FGFR1基因启动子缺失片段报告基因载体(即实施例2构建的载体P1-P7；450ng)和内参质粒pRL-TK(带有海肾荧光素酶标记；50ng)(内参质粒pRL-TK购自Promega公司，货号E2241)24h后进行启动子区双荧光素酶活性检测。双荧光检测参照Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System说明书进行，具体操作步骤如下：
(1)用预冷的PBS缓冲液清洗细胞两次后，每孔加入100μL的PLB(1X)细胞裂解液，室温震荡裂解15min；
(2)转移75μL细胞裂解液至白色酶标板中；
(3)加入75μL室温温度的Luciferase Assay Reagent，混匀后立即使用多功能酶标仪检测萤火虫荧光素酶发光值；
(4)加入75μL室温温度的Stop&Glo Reagent，混匀后立即使用多功能酶标仪检测海肾荧光素酶发光值；
萤火虫荧光素酶发光值与海肾荧光素酶发光值的比值即为FGFR1启动子区缺失片段的相对活性。应用统计学方法，分析3次独立实验的比值，分别计算“平均值±标准差”，使用单因素方差分析进行差异显著性分析。
实施例9 ChIP
ChIP检测参照Thermo公司Pierce Agarose ChIP Kit说明书进行，具体操作步骤如下：
(1)颗粒细胞的交联和收集
待原始猪卵巢颗粒细胞密度达到70～90％时，弃培养基，在细胞培养瓶内加入用DMEM完全培养基稀释至终浓度为1％(v/v)的甲醛，混匀后室温静置10min；加入GlycineSolution至其终浓度为1X，混匀后置通风橱静置5min，弃液体，用预冷的PBS清洗细胞；加含1％(v/v)Halt Cocktail的预冷PBS，用细胞刮刮下细胞并转移至1.5mL灭菌离心管中，3000xg离心5min，弃液体。
(2)颗粒细胞裂解和消化
以细胞量为2×106个/管为例，将装有卵巢颗粒细胞沉淀的离心管置于冰上，加100μL Lysis Buffer 1，涡旋混匀15s，冰浴10min，9000xg离心3min，弃液体；加100L MNaseDigestion Buffer Working Solution重悬沉淀；加0.25μL Micrococcal Nuclease(ChIPGrade)(10U/μL)涡旋混匀后于37℃水浴15min，期间每5min翻转混匀一次；加10μL MNaseStop Solution终止反应，短暂涡旋混匀后冰上静置5min，9000xg离心5min，弃液体；加50μLLysis Buffer 2重悬沉淀，冰浴15min，每5min涡旋混匀15s；9000xg离心5min，转移上清至新的1.5mL灭菌离心管中。
(3)免疫沉淀反应
转移5μL上清液作为“Input”对照组，于-20℃保存待用；剩余45μL上清液中加450μL 1×IP Dilution Buffer，混匀后转移至spin column柱子里，并加入抗体(阳性对照：10μL Anti-RNA Polymerase II抗体(来自试剂盒)；阴性对照：1～2μL Normal Rabbit IgG抗体(来自试剂盒)；实验组：10μL Anti-p65抗体(购自CST公司，货号：8242))，4℃摇床孵育过夜；加20μL ChIP Grade Protein A/G琼脂糖，4℃摇床1h，3000xg离心30s，弃液体；依次分别加入500μL IP Wash Buffer 1、IP Wash Buffer 2、IP Wash Buffer 3，期间4℃摇床5min，3000xg离心30s，弃液体；3000xg离心1min(再次离心是为了尽可能离去液体，留沉淀)。
(4)IP洗脱
向上述获得的沉淀中加150μL IP Elution Buffer，65℃孵育40min，每10min涡旋混匀一次；将柱子放在新的1.5mL灭菌离心管内，6000xg离心1min；加6μL 5M NaCl溶液和2μL 20mg/mL的蛋白酶K(Proteinase K)，涡旋混匀后，65℃热激1.5h；将5μL input对照组中加150μL IP Elution Buffer、6μL 5M NaCl溶液和2μL 20mg/mL的蛋白酶K，涡旋混匀后，65℃热激1.5h。
(5)DNA回收
每个IP和input管中加750μL DNA Binding Buffer，混匀后转移至DNA Clean-up柱子中，10000xg离心1min，弃液体；加750μL DNA Column Wash Buffer，10000xg离心1min，弃液体，10000xg空离1min；将柱子转至新的1.5mL灭菌离心管内，加50μL DNA ElutionBuffer，10000xg离心1min，回收的DNA于-20℃保存备用。
(6)PCR检测
根据转录因子p65在FGFR1基因启动子区结合位点预测结果，设计ChIP引物验证p65是否结合于FGFR1基因启动子区(GAPDH做为阳性对照引物)。
ChIP-PCR引物信息如下：
ChIP-FGFR1 F:5′-GACTCAGTTTAGCGCATTGC-3′；
R:5′-GAGAAAAGTCCTCAGGCTCC-3′；
ChIP-GAPDH F:5′-GATGTCCTGAGCCCCTACAG-3′；
R:5′-GGTAGGTGATGGGGACTGAG-3′。
结果分析
1、通过NCBI数据库获得FGFR1基因启动子区-2044/+401序列，使用TFBIND、Biobase及Jaspar生物信息学网站在线预测FGFR1启动子区潜在转录因子结合位点情况。根据各生物信息学网站综合预测结果及文献查阅，本研究确定p65作为候选转录因子。预测结果显示p65主要结合在FGFR1启动子区-1673/-1663、-1283/1273、-1056/-1046、-746/-736、-534/-524、-348/-338位点(图1)。
2、将FGFR1启动子缺失片段重组质粒P1-P7(带有萤火虫荧光素酶标记)与内参质粒pRL-TK(带有海肾荧光素酶标记)共同转染至卵巢颗粒细胞内，24h后收集细胞，并通过双荧光素酶法检测FGFR1启动子缺失片段的活性。结果显示(图2)，随着FGFR1启动子区长度由长变短时，即由P1至P5，启动子活性无显著变化；当启动子片段缺失至P6时，与P5相比P6启动子活性显著增加(P<0.05)；当启动子片段缺失至P7时，与P6相比P7启动子活性出现显著性降低(P<0.05)。结合p65潜在结合位点预测结果可以初步认为，p65可能在FGFR1启动子P5-P6区间(-700/-377)呈现负向调控作用，抑制FGFR1基因的转录起始；在P6-P7区间(-377/-84)呈现正向调控作用，促进FGFR1基因的转录起始。
所述的卵巢颗粒细胞来源于广州市嘉禾望岗屠宰场的健康商品母猪(杜长大三元杂交猪；下同)。
3、在卵巢颗粒细胞内分别转染pcDNA3.1-p65和si-p65 48h后，收集细胞抽提RNA并反转录成cDNA样品。通过qRT-PCR检测结果显示，在颗粒细胞内超表达p65后显著促进(P<0.01)FGFR1mRNA的表达(图3a)，干扰p65表达后显著抑制(P<0.05)FGFR1mRNA的表达(图3b)。结合FGFR1启动子活性分析结果(图2)：p65可能在FGFR1启动子P5-P6区间(-700/-377)呈现负向调控作用，在P6-P7区间(-377/-84)呈现正向调控作用。本研究在此可以确定p65主要是结合于FGFR1启动子P6-P7(-377/-84)区域，正向调控FGFR1的表达。而FGFR1启动子P5-P6(-700/-377)区域可能是由其他转录因子主要参与负向调控FGFR1的表达。
小干扰RNA片段靶向序列(si-p65)：5′-GCACCGGATTGAGGAGAAA-3′。
上述小干扰RNA片段由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照组NC来自广州市锐博生物科技有限公司(NC为该公司通用阴性对照产品)。
4、本发明将重组质粒pcDNA3.1-p65、FGFR1-P6和内参质粒pRL-TK共转染至卵巢颗粒细胞内，将si-p65、FGFR1-P6和内参质粒pRL-TK共转染至卵巢颗粒细胞内，将P6-p65-Del和内参质粒pRL-TK共转染至卵巢颗粒细胞内，然后分别进行启动子活性双荧光检测。检测结果显示，超表达p65后FGFR1-P6启动子活性显著增高(P<0.01)(图4a)；干扰p65表达对FGFR1-P6启动子活性无显著影响(图4b)；缺失FGFR1基因P6-P7(-377/-84)区域p65结合位点(-348/-338)后FGFR1-P6启动子活性显著降低(P<0.05)(图4c)。
5、上述结果表明转录因子p65可以正向调控FGFR1的表达。为进一步验证p65在FGFR1启动子区P6-P7(-377/-84)区域的结合情况，本研究经过ChIP实验确定p65结合于FGFR1(-348/-338)区域。ChIP结果表明，实验组(Anti-p65)PCR扩增得到预期目的片段长度的电泳条带，阳性对照(Input-p65，即为实施例9中不做后续实验处理的阳性对照)和Anti-RNA polymerase II有预期长度大小的电泳条带出现，阴性对照组(IgG)无电泳条带出现(图5)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> p65基因在卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物F
<400> 1
ggggtaccat ggacgacctc ttccccct 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物R
<400> 2
gctctagatt aggagctgat ctgactca 28
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P1(-2044/+401)F
<400> 3
ggggtaccaa attaggggac aaggttatct 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P2(-1652/+401)F
<400> 4
ggggtaccat agcctgattc ctcaagtctg 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P3 (-1069/+401)F
<400> 5
ggggtaccgt tgcgctgcct gtggtgta 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P4 (-815/+401)F
<400> 6
ggggtaccac ttcagggcta cagcgtct 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P5 (-700/+401)F
<400> 7
ggggtaccag ccagaacgca ggaaagga 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P6 (-377/+401)F
<400> 8
ggggtaccga ctcagtttag cgcattgc 28
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P7 (-84/+401)F
<400> 9
ggggtaccgc ttcggctcca ttgttccc 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P7 (-84/+401)R
<400> 10
gaagatctga gttggcggaa aagttggg 28
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P6-DF
<400> 11
ggcgacctcg ccgcgggcgc gcgctgcatc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P6-DR
<400> 12
gatgcagcgc gcgcccgcgg cgaggtcgcc 30
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-FGFR1 F
<400> 13
ggctacaagg tccgttatg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-FGFR1 R
<400> 14
caatcttact cccattcacc 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-GAPDH F
<400> 15
tcggagtgaa cggatttg 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-GAPDH R
<400> 16
tcaccccatt tgatgttgg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-FGFR1 F
<400> 17
gactcagttt agcgcattgc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-FGFR1 R
<400> 18
gagaaaagtc ctcaggctcc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-GAPDH F
<400> 19
gatgtcctga gcccctacag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-GAPDH R
<400> 20
ggtaggtgat ggggactgag 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si-p65
<400> 21
gcaccggatt gaggagaaa 19

Claims (5)

1.p65基因在猪卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用，其特征在于：
体外环境下，p65基因促进FGFR1基因mRNA的表达；
所述的促进FGFR1基因mRNA的表达，为通过增加外源性p65基因的方式实现。
2.p65基因在猪卵巢颗粒细胞中调控FGFR1基因的应用，其特征在于：
体外环境下，p65基因增强FGFR1基因启动子的活性，为通过p65蛋白结合到FGFR1基因启动子上游348bp至338bp的位点上，进而促进FGFR1基因的转录起始；
所述的增强FGFR1基因启动子的活性，为通过增加外源性p65基因的方式实现。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的增加外源性p65基因通过如下方法实现：将p65基因连接到载体上，构建含有p65基因的超表达载体；然后将含有p65基因的超表达载体转染到猪卵巢颗粒细胞中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述的含有p65基因的超表达载体通过如下方法构建得到：
（1）提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，然后将其逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR 扩增，得到目的片段；
（2）将目的片段连接到用限制性内切酶Kpn I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体，即所述的含有p65基因的超表达载体；
步骤（1）中进行PCR 扩增所用引物如下所示：
F:5’-GGGGTACCATGGACGACCTCTTCCCCCT-3’；
R: 5’-GCTCTAGATTAGGAGCTGATCTGACTCA-3’。
5.抑制p65基因表达的小干扰RNA片段在猪卵巢颗粒细胞中抑制FGFR1 mRNA的表达的应用，其特征在于：所述应用的环境为体外环境；
所述的小干扰RNA片段的靶向序列为：5′-GCACCGGATTGAGGAGAAA-3′。
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