CN108559750B

CN108559750B - Stat3在猪卵巢颗粒细胞中的应用

Info

Publication number: CN108559750B
Application number: CN201810039848.3A
Authority: CN
Inventors: 张哲�; 袁晓龙; 李加琪; 周小枫
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2038-01-16
Also published as: CN108559750A

Abstract

本发明公开了一种STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。本发明以STAT3为研究对象，通过构建猪STAT3基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，并通过其在猪卵巢颗粒细胞的表达活性找到STAT3的核心启动子区；再验证转录因子C/EBPβ与STAT3核心启动子区之间的相互作用；随后构建C/EBPβ超表达载体和合成小干扰RNA(C/EBPβ‑siRNA)，检测C/EBPβ对STAT3的影响；最后分别转染C/EBPβ超表达载体和C/EBPβ‑siRNA到颗粒细胞检测细胞的凋亡和增殖。本发明通过找到STAT3启动子区结合的转录因子C/EBPβ在卵巢颗粒细胞中的应用，对于研究卵巢卵泡闭锁机制具有很好的应用价值。

Description

STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，特别涉及一种STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

背景技术

卵巢是决定雌性动物繁殖力的重要器官，它的主要功能之一就是卵泡发育和***。卵巢功能异常会导致生殖降低，这些功能异常情况包括卵巢早衰(Premature ovarianfailure，POF)、多囊卵巢综合症(polycystic ovarian syndrome，PCOS)以及卵巢癌症等。其中卵巢早衰的主要原因：一是在胚胎时期没有形成足够多的原始卵泡(先天不足)；二是原始卵泡的激活和抑制受到影响，也有研究显示卵泡闭锁的加速也能引发卵巢早衰。

在卵泡的发育过程中，颗粒细胞会由扁平状变成立方形进而分化，这一系列的变化都会对***的成长发育、原始卵泡生长的启动、生长期卵泡发育的调控以及卵泡闭锁有着重要的作用。此外颗粒细胞凋亡也是启动卵泡闭锁的重要机制。

STAT3(The signal transducer and activator of transcription 3)蛋白作为STAT家族的一员，在不同种类的细胞中有着多种生物学功能包括细胞增殖、分化以及凋亡等。研究显示，STAT3基因在心、肺、肾、卵巢、输卵管和子宫组织中都有表达，特别是在生殖***组织中有相对高的表达。此外，在***、颗粒细胞、膜细胞以及***中都检测到了高水平的STAT3和蛋白。STAT3通路是由几种配体激活比如瘦素和白介素6，在小鼠中，激活的STAT3(磷酸化的STAT3，pSTAT3)参与了由凋亡引起的乳腺退化生理过程。另有研究显示，在牛卵泡闭锁过程中STAT3被激活。瘦素调节猪卵巢颗粒细胞的类固醇生成，同时在细胞培养基中添加瘦素会增加磷酸化STAT3的水平。表皮生长因子是颗粒细胞功能的调控者，STAT3由EGF激活后，从颗粒细胞的胞质转移到核内。

目前研究中只在细胞和组织水平上进行了验证，没有在活体猪上进行验证，主要原因是动物某种表型的变化是由多种因素引起的，另外，在没有较高把握成功的实验情况下，猪活体实验成本也高。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

本发明的另一目的在于提供C/EBPβ在调控STAT3基因转录中的应用。

本发明的再一目的在于提供抑制C/EBPβ的RNA小干扰片段(siRNA)。

本发明的目的通过下述技术方案实现：STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

C/EBPβ在调控STAT3基因转录中的应用，转录因子C/EBPβ促进STAT3核心启动子的转录活性。

本发明提供抑制C/EBPβ的siRNA，序列如下：

siRNA-C/EBPβ-1：5′-CCATGGAAGTGGCCAACTT-3′；

siRNA-C/EBPβ-2：5′-CCTCGCAGGTCAAGAGTAA-3′；

siRNA-C/EBPβ-3：5′-GGAACTTGTTCAAGCAGCT-3′；

转录因子C/EBPβ促进STAT3基因的转录和蛋白合成，siRNA-C/EBPβ抑制STAT3基因的转录和蛋白合成。

C/EBPβ在抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡、和/或促进猪卵巢颗粒细胞增殖中的应用。

本发明的验证结果如下：

1、将Stat3基因启动子缺失片段重组质粒和pGL-TK内参质粒依次共转染到卵巢颗粒细胞。多功能酶标仪测量萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的具体数值，计算其对应比值，即为各重组质粒活性。Stat3基因5’调控区各缺失片段活性值如图所示。由图结果可知，P3(-1034/+375)的活性显著低于P2(-1532/+375)和P4(-587/+375)，且差异极显著(P＝0.000178和P＝0.000964)。当缺失-1532/-1034片段后，活性显著下降，由此我们可知-1532/-1034片段存在正向调控元件的结合位点。当缺失-1034/-587片段后，活性显著上升，由此我们可知-1034/-587片段存在反向调控元件的结合位点。综上，-1532/-587片段为Stat3基因启动子核心调控区。

2、首先我们用TFBIND、JASPAR、Bimas等一些生物信息学网站预测-1532/-1034区域的转录因子，再通过ChIP验证。我们主要关注了C/EBPβ这个转录因子。ChIP结果显示，实验组Ip和Input组都有条带且亮度基本一致，阳性对照组H3有条带但阴性对照组IgG组无条带。综上，C/EBPβ通过识别结合在STAT3启动子区的-1397/-1387区域。

3、合成3对干扰C/EBPβ小片段/对照(C/EBPβ-siRNA/siRNA-NC)，筛选并检测其干扰效率。由附图结果可知，转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的C/EBPβ-siRNA-2小片段进行后续实验。

siRNA-C/EBPβ-1：5′-CCATGGAAGTGGCCAACTT-3′；

siRNA-C/EBPβ-2：5′-CCTCGCAGGTCAAGAGTAA-3′；

siRNA-C/EBPβ-3：5′-GGAACTTGTTCAAGCAGCT-3′。

4、为了研究C/EBPβ对STAT3基因表达的影响，首先我们将STAT3正向调控区的重组质粒P2(-1532/+375)分别与C/EBPβ超表达载体(pcDNA3.1-C/EBPβ)或小干扰RNA(C/EBPβ-siRNA)共转染到颗粒细胞，来探索C/EBPβ对STAT3核心启动子区转录活性的影响。接着我们分别转染pcDNA3.1-C/EBPβ或C/EBPβ-siRNA到颗粒细胞，利用Q-PCR和WB来分析C/EBPβ在转录和翻译水平上对STAT3基因表达的影响。结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的荧光活性显著高于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的荧光活性显著低于对照组siRNA-NC。这表明C/EBPβ促进STAT3核心启动子的转录活性，C/EBPβ-siRNA抑制转录活性。另一部分结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的STAT3mRNA和蛋白水平显著高于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的STAT3mRNA和蛋白水平显著低于对照组siRNA-NC。这表明C/EBPβ促进STAT3基因的转录和蛋白合成，C/EBPβ-siRNA抑制STAT3基因的转录和蛋白合成。

5、我们分别转染pcDNA3.1-C/EBPβ或C/EBPβ-siRNA到颗粒细胞，利用Annexin V-FITC法和Edu法分别检测C/EBPβ对颗粒细胞凋亡和增殖的影响。结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)显著低于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的凋亡率显著高于对照组siRNA-NC。另一部分结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的增值率显著高于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的增殖率显著低于对照组siRNA-NC。综上，C/EBPβ可能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡和促进增殖。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明是首次证实转录因子C/EBPβ对STAT3基因转录调控的影响：通过双荧光素酶报告***找到STAT3基因的核心启动子区，进而利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)、实时定量PCR(Q-PCR)以及Western Blot(WB)等找到并验证转录因子C/EBPβ对STAT3转录的影响；最后探究C/EBPβ对卵巢颗粒细胞凋亡和增殖的影响。

2、STAT3可能直接或间接参与了性腺发育、***成熟、卵子形成过程以及卵泡闭锁，本发明是以STAT3为研究对象，采用了分子和细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中的应用：C/EBPβ可抑制卵巢颗粒细胞的凋亡和促进增殖。对研究卵巢卵泡闭锁机制等具有很好的应用价值。

3、本发明技术方案设计周详，结果可靠。为证实转录因子C/EBPβ对STAT3基因转录调控作用以及细胞功能上的影响，本发明从多层次、多角度验证，在转录活性、mRNA水平以及蛋白水平验证，最后在颗粒细胞中的功能验证。

附图说明

图1是STAT3启动子缺失片段重组载体的双荧光活性分析图。

图2是ChIP验证转录因子C/EBPβ在STAT3核心启动子区的结合情况图；其中，M为1500bpmarker，泳道1为Input组，泳道2为实验组Ip，泳道3为H3，泳道4为IgG。

图3是qRT-PCR检测3对C/EBPβ干扰小片段干扰效率图。

图4是分别从转录活性、mRNA以及蛋白水平三个方面验证C/EBPβ对STAT3的转录调控图；其中，图A为超表达C/EBPβ促进STAT3核心调控区的转录活性；图B为超表达C/EBPβ促进STAT3的mRNA生成；图C为干扰C/EBPβ抑制STAT3核心调控区的转录活性；图D为干扰C/EBPβ抑制STAT3的mRNA生成；图E为超表达C/EBPβ促进STAT3基因的蛋白合成；图F为干扰C/EBPβ抑制STAT3基因的蛋白合成。

图5是Annexin V-FITC法检测转录因子C/EBPβ对颗粒细胞凋亡的结果图；其中，图A～C为超表达C/EBPβ抑制颗粒细胞凋亡；图D～F为干扰C/EBPβ促进颗粒细胞凋亡。

图6是Edu染色法检测转录因子C/EBPβ对颗粒细胞增殖的影响图；其中，图A和B为超表达C/EBPβ促进颗粒细胞增殖；图C和D为干扰C/EBPβ抑制颗粒细胞增殖。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1构建STAT3启动子报告基因重组载体

(1)利用Primer5设计引物，以抽提的猪耳DNA为模板扩增STAT3的5’调控区；扩增的片段经纯化回收、连接pMD18T载体(购自Takara公司)、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提普通质粒，命名为T-STAT3。

(2)BioEdit软件分析发现STAT3基因5’调控区序列无MIu I和Xho I两种限制性内切酶酶切位点，而pGL3-basic Vector存在MIu I和Xho I酶切位点。Primer5设计5对STAT3基因5’调控区缺失片段引物，其上下游引物分别加上MIu I和Xho I酶切位点序列。以T-STAT3普通质粒为模版，PCR扩增；同样各缺失片段经纯化回收、双酶切、连接pGL3载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自美国Magen公司)，分别命名为P1(-2199/+375)、P2(-1532/+375)、P3(-1034/+375)、P4(-587/+375)和P5(-167/+375)。

本发明所用到的STAT3基因5’调控区引物：

STAT3(-2199/+375)Forward：5′-TCCTCAACCCACCAAGAAAG-3′；

Reverse：5′-CTCCCGGTCTCTTCGTATCC-3′。

本发明所用到的缺失片段引物为：

Reverse：同上；

Reverse：同上；

Reverse：同上；

Reverse：同上。

注：黑色加粗字体部分为保护碱基，下划线为酶切位点。

实施例2卵巢颗粒细胞的培养和转染

(1)在广州嘉禾屠宰场采集健康母猪卵巢，置于含1％(v/v)双抗的PBS缓冲液中(冰上)，快速运回实验室处理；

(2)先在细胞房外用含双抗的PBS清洗卵巢，置于烧杯中，放入传递窗；

(3)酒精擦拭细胞房超净台，镊子夹取卵巢，用注射器吸取***，打入含有5mLDMEM培养液的离心管中，每管抽取***至9mL；

(4)1000rpm离心5min，弃上清，加入5mL PBS，吹打混匀，清洗两次；

(5)配制完全培养基：89％DMEM、10％血清和1％双抗，上下颠倒混匀；

(6)加5mL完全培养基重悬细胞沉淀；

(7)75mL培养瓶中先加入10mL完全培养基，再加入上述重悬液；

(8)显微镜观察后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，24h后观察颗粒细胞生长情况，等颗粒细胞长至90％左右，倒掉培养基，用预热的含1％(v/v)双抗的PBS洗3遍；

(9)加入胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液终止消化；

(10)DMEM清洗2遍，期间1000rpm/min离心5min；

(11)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；

(12)24h左右，观察细胞状态，待细胞汇合度达80％左右时准备转染；

(13)转染方法按Invitrogen公司的

3000试剂盒说明书进行，每组设置3个重复；

(14)转染后的孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，转染后24h～72h，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。

所述的双抗为青霉素和链霉素。

实施例3qRT-PCR

本发明中基因的qRT-PCR检测采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)试剂盒(Thermo Scientific公司)。实验采用比较Ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：

基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}

检测基因用GAPDH做内参，本发明所用到的qRT-PCR引物为：

qRT-PCR-STAT3Forward：5′-GGGCTTTATCAGTAAGGAGA-3′；

Reverse：5′-GGAATGTCAGGGTAGAGGTA-3′；

qRT-PCR-C/EBPβForward：5′-CGGACTGCAAGCGGAAGGAGGA-3′；

Reverse：5′-GGCTGGACGACGAGGATGTGGA-3′；

qRT-PCR-GAPDH Forward：5′-TCCCGCCAACATCAAAT-3′；

Reverse：5′-CACGCCCATCACAAACAT-3′；

细胞的总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体步骤如下：

(1)颗粒细胞直接加入TRIzol；

(2)室温下放置10min以充***解细胞，12000g离心5min，弃沉淀吸上清于新RNase-free管中；

(3)加入0.2mL氯仿(每1mL TRIzol)剧烈震荡15～30s，室温下放置5min后4℃12000g离心15min；

(4)吸取上层水相置于新RNase-free EP管中；

(5)加入0.5mL异丙醇(每1mL TRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在室温放置10min，4℃12000g离心10min；

(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL 75％乙醇-DEPC(每1mL TRIzol)以洗涤RNA，4℃12000g离心5min后尽量弃上清；

(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；

(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。

使用TaKaRa公司的PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)cDNA反转录试剂盒反转录总RNA。

实施例4染色质免疫共沉淀(ChIP)

(1)屠宰场采集健康母猪卵巢，抽取***进行培养，细胞生长密度到达70％时进行细胞交联处理；

(2)交联：去除培养瓶内原有培养基，细胞依次经过甲醛，甘氨酸，PBS-HaltCocktail(含蛋白酶抑制剂Halt Cocktail的PBS缓冲液)混合液处理后，离心收集细胞沉淀；

(3)裂解消化：加入Lysis Buffer 1(ABclonal-ChIP Assay Kit购自ABclonal)重悬沉淀，10000g离心10min收集沉淀；分别加入MNase Digestion Buffer WorkingSolution，Micrococcal Nuclease，MNase Stop Solution，Lysis Buffer 2，10000g离心10min收集上清；

(4)免疫沉淀：取45μl上清，450μl 1×IP Dilution Buffer稀释，转移至结合柱，加入抗体对应孵育；结合柱分别加入ChIP Grade Protein A/G树脂，IP Wash Buffer 1，IPWash Buffer 2，IP Wash Buffer 3清洗，空离去除残液；

(5)IP和DNA回收：结合柱分别加入IP Elution Buffer，NaCl和蛋白酶K热激处理；DNA Binding Buffer，Column Wash Buffer清洗后，ddH₂O回收DNA；

(6)定性PCR：以STAT3基因转录起始位点前1.5kb以内区域为模板序列设计PCR引物，产物范围为100～160bp。引物序列和PCR反应体系如下；

本发明所用到的定性PCR引物为：

STAT3Forward：5′-ATAGCTATCCTTGGGGAGG-3′；

Reverse：5′-AAGGGCCTGTTATCTCAC-3′；

GAPDH Forward：5′-GATGTCCTGAGCCCCTACAG-3′；

Reverse：5′-GGTAGGTGATGGGGACTGAG-3′；

反应体系为：ddH₂O 7μl、上下游引物各0.5μl、DNA2μl、2xPCR Premix10μl。

实施例5Western Blot

(1)单层贴壁细胞(实施例2中的卵巢颗粒细胞)总蛋白的提取：倒掉细胞培养液，加入适量预冷的PBS洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。6孔板细胞每孔加入100-200μL蛋白裂解液和10μL 100mM的PMSF，裂解细胞30min。收集细胞裂解液移至1.5mL离心管中，4℃14000rpm离心5min。取部分上清加入上样buffer，煮沸10min。缓慢恢复室温后，稍离心，放于-20℃保存；

(2)SDS-PAGE电泳：BCA法蛋白样品初步定量后，每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5:1混合，煮沸5min。SDS-PAGE电泳至溴酚蓝刚出胶底部止；

(3)蛋白质转移：PVDF膜甲醇预处理3～5s，放至转印液浸润30min。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层“三明治”结构。此操作必须将气泡完全去除。100V恒压60～120min；

(4)免疫印记：取出杂交膜，TBST漂洗5min，重复三次。5％(w/w)脱脂奶粉溶液室温封闭90min，TBST漂洗5min，重复三次。加入STAT3一抗(STAT3一抗，购自爱必信生物)(1:500)4℃孵育过夜，TBST洗膜5min，三次。加入二抗稀释液(二抗：Goat anti-rabbit IgG-HRP)，购自SANTA CRUZ)(1:5000)室温孵育1h，TBST洗膜5min，三次。蒸馏水漂洗膜2min，三次。擦干PVDF膜上的液体，加入化学发光剂放于一胶片上，放入X射线暗盒置于暗房。在暗房内打开暗盒，放入胶片，5min后打开暗盒，拿出胶片。采用Image Plus软件分析胶片中的蛋白条带。

实施例6颗粒细胞凋亡检测

本发明中Annexin V-FITC技术检测细胞凋亡，参照BioVision公司Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit操作说明书，具体操作步骤如下：

(1)将细胞培养板放置在室温，用2mL PBS溶液轻轻润洗培养板内细胞，去除PBS溶液；

(2)加入不含EDTA的胰酶消化细胞，将细胞轻轻重悬于步骤(1)中的培养基使其密度大约为1×10⁶细胞/mL；

(3)将0.5mL细胞悬液从细胞培养板中(约5×10⁵个细胞)转移到一个干净的离心管内，加入500μL 1×Binding Buffer；

(4)加5μL Annexin V-FITC和室温5μL propidium iodide；

(5)室温避光反应5min；

(6)立即用FACSCalibur流式细胞仪检测分析(每组三个重复)。

实施例7颗粒细胞增殖检测

本发明用EdU法检测细胞增殖，参照锐博公司Cell-Light^TM EdU Apollo 567Invitro Kit检测试剂盒，具体操作步骤如下：

(1)制备50μM EdU培养基：用细胞培养基以1：1000的比例稀释EdU溶液；

(2)细胞融合度为50～80％时弃培养液，加入100μL 50μM EdU培养基孵育2h；

(3)固定细胞：弃培养液，每孔加入100μL细胞固定液(4％多聚甲醛的PBS)室温孵育15～30min；

(4)2mg/mL甘氨酸孵育10min，PBS冲洗2次；

(5)弃上清，加入100μL渗透剂(0.5％(v/v)TritonX-100的PBS)透化细胞，PBS冲洗1次；

(6)EdU检测：加入100μL的

染色反应液，避光室温孵育30min，PBS冲洗1次，沉淀细胞，弃上清；

(7)DNA染色：每孔加入100μL DAPI反应液，避光室温孵育30min；

(8)加入100μL渗透剂(0.5％(v/v)TritonX-100的PBS)冲洗3次，洗脱DAPI反应液；

(9)荧光显微镜镜检(每组三个重复)。

实施例8荧光素酶报告基因活性检测

荧光素酶报告基因活性检测，参照Promega公司的Dual-Luciferase ReporterAssay System试剂盒，具体操作步骤如下：

(1)转染48h后，吸去旧的培养基，用PBS清洗两次，每孔细胞加入100μL的GloLysis Buffer，室温轻微振摇5min，收集细胞裂解液；

(2)将30μL细胞裂解液加入96孔发光板后，在其中加入75μL

Luciferase Assay Reagent，混匀后在20～25℃静置15～30min。在BioTek公司Synergy 2多功能酶标仪上检测发光值，对应于萤火虫荧光素酶的表达水平；

(3)再加入75μL Stop&

试剂，混匀后在20～25℃静置15～30min。检测发光值，对应于海肾荧光素酶的表达水平；

(4)萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶表达量的比值为萤火虫荧光素酶相对活性，即为对应靶基因活性(三个重复)。

结果分析：

1、将Stat3基因启动子缺失片段重组质粒和pGL-TK内参质粒依次共转染到卵巢颗粒细胞。多功能酶标仪测量萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶具体数值，计算其对应比值，即为各重组质粒活性。Stat3基因5’调控区各缺失片段活性值如图1所示。由图结果可知，P3(-1034/+375)的活性显著低于P2(-1532/+375)和P4(-587/+375)，且差异极显著(P＝0.000178和P＝0.000964)。当缺失-1532/-1034片段后，活性显著下降，由此我们可知-1532/-1034片段存在正向调控元件的结合位点。当缺失-1034/-587片段后，活性显著上升，由此我们可知-1034/-587片段存在反向调控元件的结合位点。综上，-1532/-587片段为Stat3基因启动子核心调控区，我们选取了其中的正向调控区-1532/-1034进行下一步研究。

2、首先我们用TFBIND、JASPAR、Bimas等一些生物信息学网站预测-1532/-1034区域的转录因子，再通过ChIP验证。我们主要关注了C/EBPβ这个转录因子。ChIP结果显示(图2)，实验组Ip和Input组都有条带且亮度基本一致，阳性对照组H3有条带但阴性对照组IgG组无条带。综上，C/EBPβ通过识别结合在STAT3启动子区的-1397/-1387区域。

3、合成3对干扰C/EBPβ小片段/对照(C/EBPβ-siRNA/siRNA-NC)，筛选并检测其干扰效率。结果如图3所示，转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的C/EBPβ-siRNA-2片段进行后续实验。

siRNA-C/EBPβ-1：5′-CCATGGAAGTGGCCAACTT-3′；

siRNA-C/EBPβ-2：5′-CCTCGCAGGTCAAGAGTAA-3′；

siRNA-C/EBPβ-3：5′-GGAACTTGTTCAAGCAGCT-3′。

上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照siRNA-NC来自广州市锐博生物科技有限公司。

4、为了研究C/EBPβ对STAT3基因表达的影响，首先我们将STAT3正向调控区的重组质粒P2(-1532/+375)分别与C/EBPβ超表达载体(pcDNA3.1-C/EBPβ)或小干扰RNA(C/EBPβ-siRNA)共转染到颗粒细胞，来探索C/EBPβ对STAT3核心启动子区转录活性的影响；其中，C/EBPβ超表达载体的构建方法为：首先PCR扩增C/EBPβ的CDS区(蛋白质编码区)，测序验证正确后提取普通质粒，再通过普通质粒与pcDNA3.1载体的双酶切、连接、转化、挑单克隆测序验证正确后提取无内毒素质粒。最后对提取的无内毒素质粒进行双酶切鉴定，验证C/EBPβ超表达载体是否构建成功。接着我们分别转染pcDNA3.1-C/EBPβ或C/EBPβ-siRNA到颗粒细胞，利用Q-PCR和WB来分析C/EBPβ在转录和翻译水平上对STAT3基因表达的影响。结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的荧光活性显著高于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的荧光活性显著低于对照组siRNA-NC(图4)。这表明C/EBPβ促进STAT3核心启动子的转录活性，C/EBPβ-siRNA抑制转录活性。另一部分结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的STAT3mRNA和蛋白水平显著高于对照组pcDNA3.1，C/EBPβ-siRNA组的STAT3mRNA和蛋白水平显著低于对照组siRNA-NC(图)。这表明C/EBPβ促进STAT3基因的转录和蛋白合成，C/EBPβ-siRNA抑制STAT3基因的转录和蛋白合成。

5、我们分别转染pcDNA3.1-C/EBPβ或C/EBPβ-siRNA到颗粒细胞，利用Annexin V-FITC法和Edu法分别检测C/EBPβ对颗粒细胞凋亡和增殖的影响。结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)显著低于对照组pcDNA3.1(图5)，C/EBPβ-siRNA组的凋亡率显著高于对照组siRNA-NC(图5)。另一部分结果显示pcDNA3.1-C/EBPβ组的增值率显著高于对照组pcDNA3.1(图6)，C/EBPβ-siRNA组的增殖率显著低于对照组siRNA-NC(图6)。综上，C/EBPβ可能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡和促进增殖。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> siRNA- C/EBPβ-1

<400> 1

ccatggaagt ggccaactt 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> siRNA- C/EBPβ-2

<400> 2

cctcgcaggt caagagtaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> siRNA- C/EBPβ-3

<400> 3

ggaacttgtt caagcagct 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> STAT3（-2199/+375）Forward

<400> 4

tcctcaaccc accaagaaag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> STAT3（-2199/+375）Reverse

<400> 5

ctcccggtct cttcgtatcc 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P1（-2199/+375）Forward

<400> 6

cgacgcgttc ctcaacccac caagaaag 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P1（-2199/+375）Reverse

<400> 7

ccctcgagct cccggtctct tcgtatcc 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P2（-1532/+375）Forward

<400> 8

cgacgcgtct ccaagtcatt gattttct 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P2（-1532/+375）Reverse

<400> 9

ccctcgagct cccggtctct tcgtatcc 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P3（-1034/+375）Forward

<400> 10

cgacgcgtta ctaaacaaac acaataaa 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P3（-1034/+375）Reverse

<400> 11

ccctcgagct cccggtctct tcgtatcc 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P4（-587/+375）Forward

<400> 12

cgacgcgtct gaggttcaaa gcaggcgg 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P4（-587/+375）Reverse

<400> 13

ccctcgagct cccggtctct tcgtatcc 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P5（-167/+375）Forward

<400> 14

cgacgcgtct ctcctcattg gcaagtgg 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P5（-167/+375）Reverse

<400> 15

ccctcgagct cccggtctct tcgtatcc 28

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-STAT3 Forward

<400> 16

gggctttatc agtaaggaga 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-STAT3 Reverse

<400> 17

ggaatgtcag ggtagaggta 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-C/EBPβ Forward

<400> 18

cggactgcaa gcggaaggag ga 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-C/EBPβ Reverse

<400> 19

ggctggacga cgaggatgtg ga 22

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH Forward

<400> 20

tcccgccaac atcaaat 17

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH Reverse

<400> 21

cacgcccatc acaaacat 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> STAT3 Forward

<400> 22

atagctatcc ttggggagg 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> STAT3 Reverse

<400> 23

aagggcctgt tatctcac 18

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH Forward

<400> 24

gatgtcctga gcccctacag 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH Reverse

<400> 25

ggtaggtgat ggggactgag 20

Claims

1.C/EBPβ在体外抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡和/或促进猪卵巢颗粒细胞增殖中的应用。

2.根据权利要求 1所述的应用，其特征在于，通过siRNA抑制C/EBPβ，其抑制C/EBPβ的siRNA的序列如下：

siRNA- C/EBPβ-1：5′- CCATGGAAGTGGCCAACTT -3′。

3.根据权利要求 1所述的应用，其特征在于，通过siRNA抑制C/EBPβ，其抑制C/EBPβ的siRNA的序列如下：

siRNA- C/EBPβ-2：5′- CCTCGCAGGTCAAGAGTAA -3′。

4.根据权利要求 1所述的应用，其特征在于，通过siRNA抑制C/EBPβ，其抑制C/EBPβ的siRNA的序列如下：

siRNA- C/EBPβ-3：5′- GGAACTTGTTCAAGCAGCT -3′。