CN114245803A

CN114245803A - 用于重构小神经胶质细胞的方法和组合物

Info

Publication number: CN114245803A
Application number: CN202080055641.0A
Authority: CN
Inventors: A·比菲; A·蒙特佩洛索
Original assignee: Childrens Medical Center Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Childrens Medical Center Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2022-03-25
Also published as: EP4010361A1; WO2021026294A1; EP4010361A4; US20220323503A1

Abstract

本公开的特征在于CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞和使用此类细胞用于治疗代谢病症或神经***病症的方法。所公开的方法包括用于制备和修饰CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞诸如造血干祖细胞的方法。其他公开的方法包括治疗患有或易患代谢疾病或神经***疾病的受试者的方法，包括向所述受试者给药包含半合子及/或纯合子缺陷CX3CR1细胞的组合物。所述CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞可以经修饰以具有编码治疗性多肽或多核苷酸的核酸分子。

Description

用于重构小神经胶质细胞的方法和组合物

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请主张2019年8月6日提交的美国申请号62/883,428的优先权，其整体内容通过引用而以其整体并入本文。

背景技术

最近的研究结果表明，造血干细胞和祖细胞(HSPC)可在给予预处理方案后促进常驻脑髓系细胞群的更新。在代谢疾病和神经***疾病的情境下，植入的细胞可能充当媒介物以将神经保护剂(neuroprotective agents)递送至被影响的患者的脑部。但是，由于移植的HSPC及其后裔的植入和扩张与神经***疾病的快速进展相比缓慢，这种方法尚未被广泛用于神经***疾病和代谢疾病的治疗。因此，需要改进的HSPC移植方法。本公开涉及这种需求和其他重要的需求。

发明内容

如下所述，本公开的特征在于涉及增强移植的造血干祖细胞及其后裔在有其需要的受试者中的植入的方法和组合物。

在一态样中，本发明提供一种CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞，其包括编码治疗性多核苷酸或多肽的外源核酸分子。在实施方案中，外源核酸分子在CX3XR1基因座处被***细胞的基因组内。在实施方案中，治疗性多核苷酸或多肽为具有神经保护活性的(neuroprotective)。

在另一态样中，本发明提供一种药物组合物，其包括任何上述CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞。

在另一态样中，本发明提供一种试剂盒，其包括任何上述CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞和用于将该细胞给药至有其需要的受试者的指南。

在另一态样中，本发明提供一种试剂盒，其包括上述药物组合物。

在另一态样中，本发明提供一种在受试者中重构小神经胶质细胞的方法，包括向该受试者给药任何上述CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞。

在另一态样中，本发明提供一种在受试者中重构小神经胶质细胞的方法，其中，该方法包括向该受试者给药上述药物组合物。

在另一态样中，本发明提供一种在受试者中治疗代谢疾病或神经***疾病的方法，该方法包括向该受试者给药上述CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞。在上述方法的多种实施方案中，给药为脑室内给药。在上述方法的多种实施方案中，给药为静脉内给药。在上述方法的多种实施方案中，该方法进一步包括在给药该药物组合物之前的去髓预处理。在实施方案中，去髓预处理包括给药能够将内源小神经胶质细胞去髓的烷基化剂。在实施方案中，烷基化剂为白消安(busulfan)。

本公开定义的组合物和方法是联系下文所提供的实施例而分离或另外制造的。从具体实施方式和权利要求书可明了本发明的其他特征和优点。

定义

除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有本发明所属领域技术人员所一般理解的意义。下述参考文献对技术人员提供本发明中使用的多个术语的一般性定义：Singleton等人所著《微生物学和分子生物学词典(第二版)》(Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994))；《剑桥科技词典》(The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988))；Rieger等人编撰的《遗传性术语表(第五版)》(The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger etal.(eds.),Springer Verlag(1991))；以及Hale和Marham所著《哈珀·柯林斯生物学词典》(Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)).如本文中所用，除非明确排除，否则下述术语具有归于其下方的意义。

如本文种所用，“去髓预处理(ablative conditioning)”是指向受试者给药一种组合物，该组合物摧毁骨髓我环境中的内源造血干细胞和祖细胞并且功能性地定义中枢神经***中的小神经胶质祖细胞。

“剂(agent)”意为任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子、或肽、或其片段。

“改变(alteration)”意为基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)，如通过该领域已知的方法如本文所述的那些方法所检测。如本文中所用，改变包括表达水平中10％的变化、表达水平中25％的变化、40％的变化、以及50％的变化或更高的变化。

“缓解(ameliorate)”意为减少、阻抑、衰减、缩减、迟滞或稳定化疾病的发展或进展。

“生物样品(biologic sample)”意为源自有机体的任何组织、细胞、体液或其他材料。

本公开中，“包含(comprises、comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可具有美国专利法中规定的属于它们的意义，且可意为“包括(includes,including)”等；“主要由...组成(consists essentially)”等具有美国专利法中规定的属于它们的意义，且该术语是开放性的，允许超过其所引述者的存在，只要其所引述的基本或新颖特征没有被超过其所引述者的存在改变即可，但不包括先前技术实施方案.

“CX3CR1蛋白”或“人类β趋化因子受体样1蛋白”意为一种蛋白质或其片段，其与GenBank登录号ABS29268.1具有至少约85％的氨基酸序列同一性并且是趋化因子弗拉托肯(fractalkine)的受体。示例性CX3CR1多肽序列提供于下。

>AAA87032.1β趋化因子样1[智人(Homo sapiens)]

MDQFPESVTENFEYDDLAEACYIGDIVVFGTVFLSIFYSVIFAIGLVGNLLVVFALTNSKKPKSVTDIYLLNLALSDLLFVATLPFWTHYLINEKGLHNAMCKFTTAFFFIGFFGSIFFITVISIDRYLAIVLAANSMNNRTVQHGVTISLGVWAAAILVAAPQFMFTKQKENECLGDYPEVLQEIWPVLRNVETNFLGFLLPLLIMSYCYFRIIQTLFSCKNHKKAKAIKLILLVVIVFFLFWTPYNVMIFLETLKLYDFFPSCDMRKDLRLALSVTETVAFSHCCLNPLIYAFAGEKFRRYLYHLYGKCLAVLCGRSVHVDFSSSESQRSRHGSVLSSNFTYHTSDGDALLLL

“CX3CR1多核苷酸”或“人类β趋化因子受体样多核苷酸”意为编码CX3CR1多肽的核酸分子。CX3CR1基因编码弗拉托肯的受体。示例性CX3CR1多核苷酸序列提供于下：

>U28934.1人类β趋化因子受体样1mRNA，完整的编码序列

GGGGCAGATCCAGATTCCCTTTGCAGTCCACGCCAGGCCTTCACCATGGATCAGTTCCCTGAATCAGTGACAGAAAACTTTGAGTACGATGATTTGGCTGAGGCCTGTTATATTGGGGACATCGTGGTCTTTGGGACTGTGTTCCTGTCCATATTCTACTCCGTCATCTTTGCCATTGGCCTGGTGGGAAATTTGTTGGTAGTGTTTGCCCTCACCAACAGCAAGAAGCCCAAGAGTGTCACCGACATTTACCTCCTGAACCTGGCCTTGTCTGATCTGCTGTTTGTAGCCACTTTGCCCTTCTGGACTCACTATTTGATAAATGAAAAGGGCCTCCACAATGCCATGTGCAAATTCACTACCGCCTTCTTCTTCATCGGCTTTTTTGGAAGCATATTCTTCATCACCGTCATCAGCATTGATAGGTACCTGGCCATCGTCCTGGCCGCCAACTCCATGAACAACCGGACCGTGCAGCATGGCGTCACCATCAGCCTAGGCGTCTGGGCAGCAGCCATTTTGGTGGCAGCACCCCAGTTCATGTTCACAAAGCAGAAAGAAAATGAATGCCTTGGTGACTACCCCGAGGTCCTTCAGGAAATCTGGCCCGTGCTCCGCAATGTGGAAACAAATTTTCTTGGCTTCCTACTCCCCCTGCTCATTATGAGTTATTGCTACTTCAGAATCATCCAGACGCTGTTTTCCTGCAAGAACCACAAGAAAGCCAAAGCCATTAAACTGATCCTTCTGGTGGTCATCGTGTTTTTCCTCTTCTGGACACCCTACAACGTTATGATTTTCCTGGAGACGCTTAAGCTCTATGACTTCTTTCCCAGTTGTGACATGAGGAAGGATCTGAGGCTGGCCCTCAGTGTGACTGAGACGGTTGCATTTAGCCATTGTTGCCTGAATCCTCTCATCTATGCATTTGCTGGGGAGAAGTTCAGAAGATACCTTTACCACCTGTATGGGAAATGCCTGGCTGTCCTGTGTGGGCGCTCAGTCCACGTTGATTTCTCCTCATCTGAATCACAAAGGAGCAGGCATGGAAGTGTTCTGAGCAGCAATTTTACTTACCACACGAGTGATGGAGATGCATTGCTCCTTCTCTGAAGGGAATCCCAAAGCCTTGTGTCTACAGAGAACCTGGAGTTCCTGAACCTGATGCTGACTAGTGAGGAAGATTTTTGTTGTTATTTCTTACAGGCACAAAATGATGGACCCAATGCACACAAAACAACCCTAGAGTGTTGTTGAGAATTGTGCTCAAAATTTGAAGAATGAACAAATTGAACTCTTTGAATGACAAAGAGTAGACATTTCTCTTACTGCAAATGTCATCAGAACTTTTTGGTTTGCAGATGACAAAAATTCAACTCAGACTAGTTTAGTTAAATGAGGGTGGTGAATATTGTTCATATTGTGGCACAAGCAAAAAGGGTGTCTGAGCCCTCAAAGTGAGGGGAACCAGGGCCTGAGCCAAGCTA

当应用于CX3CR1，术语“半合子”是指仅具有一个CX3CR1基因拷贝的其他形式的二倍体细胞。

如本文中所用，术语“测定(determining)”、“评估(assessing)”、“分析(assaying)”、“测量(measuring)”和“检测(detecting)”指的是定量测定和定性测定两者，且就其本身而言，术语“测定”在本文中与“分析”、“测量”等可互换使用。若试图进行定量测定，则使用短语“测定被分析物等的量”。若试图进行定性及/或定量测定，则使用短语“测定被分析物的水平”或“检测”被分析物。

“检测(detect)”指的是证实待检测的被分析物的存在、不存在或量。

“可检测的标记(detectable label)”意为一种组合物，当连接至感兴趣的分子时，该组合物使得后者可经由光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁性微珠、金属微珠、胶体离子、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，一般用于ELISA)、生物素、地高辛或半抗原。

“疾病”意为损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或病变。在一种实施方案中，该疾病是代谢疾病或病症或者神经***疾病或病症。

“有效量(effective amount)”意为相对于未治疗患者缓解疾病症状所需的化合物的量。用来实践本发明的用于治疗性处理疾病的活性化合物的有效量可变，取决于给药方式以及受试者的年龄、体重和一般健康情况。基本上，主治医生或兽医将决定适宜的量和用药方案。这一量被称为“有效”量。在一种实施方案中，有效量是增强移植的细胞在脑中的植入的量。

如本文中所用，“外源核酸分子(Exogenous nucleic acid molecule)”是指核酸分子，该核酸分子不是内源核酸分子，即，它不是天然地存在于细胞内的核酸分子。

“片段(fragment)”意为蛋白质或核酸的一个部分，其大致上与参考蛋白质或核酸一致。在一些实施方案中，该部分保留本文所述的参考蛋白质或核酸的生物学活性的至少50％、75％或80％，或更优选90％、95％或甚至99％。

“造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell；HSPC)”意为一种干细胞(stem)或其祖细胞(progenitor)，该细胞在被称为造血的过程中产生循环造血细胞和组织驻留造血细胞。

“杂交(Hybridization)”意为互补核碱基之间的氢键键合，其可以是沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)和反向胡斯坦氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。

术语“分离的(isolated)”、“纯化的(purified)”或“生物学纯的(biologicallypure)”指的是物质没有不同程度的在其天然状态下发现的正常伴生组分。“分离(Isolate)”表示与原始来源或周围物质分隔的程度。“纯化(Purify)”表示高于“分离”的分隔程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质最够不含其他材料，使得任何杂质均不在材料上影响该蛋白质的生物学性质或不造成其他负面后果。换言之，如果本发明的核酸或肽基本上在通过重组DNA技术生产时不含细胞物质、病毒物质或培养基，或者当化学合成时不含化学前体或其他化学品，则该核酸或肽是纯化的。典型使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来测定纯度和均质性。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中给出实质上的一条谱带。对于可进行修饰如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的修饰可给出不同的分离的蛋白，它们可独立纯化。

“分离的多核苷酸(isolated polynucleotide)”意为一种核酸(例如，DNA)，其不含在本发明的核酸分子所源自的有机体的天然出现的基因组中位于该基因侧翼的基因。该术语因此包括，举例而言，重组DNA，其被并入载体内、并入自主复制质粒或病毒内、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA内，或作为独立于其他序列的单独分子而存在(举例而言，通过PCR或限制性内切酶消化制备的cDNA或基因组或cDNA片段)。此外，该术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码附加多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。

“分离的多肽(isolated polypeptide)”意为已经与其天然伴随组分分离的本发明的多肽。典型地，以重量计，当多肽的至少60％不含其天然关联的蛋白质和天然出现的有机分子时，则该多肽是分离的。以重量计，优选该制剂含有至少75％、更优选至少90％、最优选99％的本发明的多肽。可通过例如从天然来源提取、编码多肽的重组核酸的表达、或化学合成蛋白质来获得本发明的分离的多肽。可通过任何适宜的方法例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量纯度。

“标记物(marker)”意为任意蛋白质或多核苷酸，其在表达水平或活性上有与疾病或病变相关的改变(alteration)。

“小神经胶质细胞(microglia)”意为中枢神经***的免疫细胞。

如本文中所用，如“获得一剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方法取得该剂。

如本文中所用，术语“预防(prevent,preventing)”、“防止(prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等指的是降低受试者体内发展出病变或病症的概率，其中，该受试者不具有病变或病症但处于发展出病变或病症的风险下或易于发展出病变或病症。

“降低(reduces)”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的负向改变(alteration)。

“参考(reference)”意为标准或对照条件。

“参考序列(reference sequence)”是用作序列比对基础的定义序列。参考序列可以是特定序列的一部分或整体；例如，全长度cDNA或基因序列的链段、或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度将通常为，在一些实施方案中，至少约16个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸，或与之接近或之间的整数。对于核酸，参考核酸序列的长度将通常为至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸或约至少300个核苷酸或与之接近或之间的任何整数。

可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子无须与内源核酸序列100％相同，但典型将会展现基本同一性。具有与内源序列“实质同一性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子无须与内源核酸序列100％相同，但典型将会展现基本同一性。具有与内源序列“实质同一性(substantial identity)”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意为在互补多核苷酸序列(如，本文中揭示的基因)或其部分在多种严格条件下配对以形成双链分子。(见，例如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。

举例而言，严格的盐浓度一般为少于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠、少于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠、或少于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格度杂交可在不存在有机溶剂如甲酰胺的情况下获得，而高严格度杂交可在存在至少约35％甲酰胺，且在一些实施方案中至少约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件一般将包括至少约℃、至少约37℃、或至少约42℃的温度。可变的附加因素，如杂交时间、洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及包含或不饱和载体DNA，是该领域技术人员所周知的。通过按需要组合这些多种条件来实施各种水平的严格度。在一种实施方案中，杂交将出现在30℃的750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中。在另一种实施方案中，杂交将出现在37℃的500mMNaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中。在又一种实施方案中，杂交将出现在42℃的250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中。对这些条件的有用变化(variations)对于该领域技术人员是显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格度也将变化。可通过盐浓度和温度来界定洗涤严格度条件。如上，可通过降低盐浓度或增加温度来增加洗涤严格度。举例而言，洗涤步骤的严格的盐浓度包括少于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，或少于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件一般将包括至少约25℃、至少约42℃、或至少约68℃的温度。在一些种实施方案中，洗涤步骤将出现在25℃的30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。在其他实施方案中，洗涤步骤将出现在42℃的15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。在其他实施方案中，洗涤步骤将出现在68℃的15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。对这些条件的额外变化对于该领域技术人员是显而易见的。杂交技术是该领域技术人员所周知的，且揭示在例如Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；《分子生物学现代技术》(Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,WileyInterscience,New York,2001))；《分子克隆技术指南》(Berger and Kimmel(Guide toMolecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York))；以及《分子克隆：实验室手册》(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York)中。

“受试者(subject)”意为哺乳动物，包括但不限于人类和非人类哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物。

“基本相同(substantially identical)”意为多肽或核酸分子展现与参考氨基酸序列(例如，任何一种本文所述的氨基酸序列)或核酸序列(例如，任何一种本文所述的核酸序列)的至少50％同一性。在一些实施方案中，此序列在氨基酸水平或核酸水平上与用于比较的序列的同一性为至少60％、80％或85％、90％、95％或甚至99％。

通常使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心的遗传学计算机公司(Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的序列分析软件包BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列一致性。该软件通过设定多种替换、缺失、及/或其他修饰的同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守替换典型包括下述各组的组内替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在例示性的测定一致性程度的途径中，可使用BLAST程序，其中，介于e^-3与e^-100之间的可能性得分指示密切相关的序列。

“转基因(transgene)”意为将外源核酸分子引入宿主细胞内，该外源核酸分子编码待在该宿主细胞内表达的多肽或多核苷酸。

如本文中所用，“治疗(treat,treating,treatment)”(动词、动名词、名称)等指的是减轻或缓解与其相关的病变及/或症状。应知晓，尽管未排除，但治疗病症或症状并不需要完全消除与该病症或症状相关的病症、症候或症状。

本文中提供的范围理解为该范围内所有值的略写。例如，1至50的范围理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的组的任意数字、数字组合或子范围。

除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“或”理解为包含的。除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“一”和“该”理解为单数或复数。

除非明确指出或从语境中明显可见，否则本文中使用的术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如，处于均值的2标准偏差内。“约”可理解为处于所指出值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从语境中明确排除，否则本文中提供的所有数值均以术语“约”修饰。

本文中，对任何变量定义中一系列化学基团的描述包括该变量作为任何单一基团或作为所列基团的组合的定义。对本文中变量或态样的实施方案的描述包括该实施方案作为任何单一输送方案或作为与任何其他实施方案或其部分的组合。

本文中提供的任何组合物或方法可与本文中提供的一种或多种任何其他组合物和方法组合。

附图说明

图1A至图1G示出了CX3CR1^+/GFP和野生型(WT)细胞在总骨髓接受者中的植入。图1A为示意图，其示出将CX3CR1^+/GFP或野生型(WT)总骨髓(tBM)细胞(含有造血干祖细胞(HSPC))移植到使用去髓方案预处理的接受者小鼠体内的移植方案(Tpx)，该去髓方案为连续4天以25mg/kg的日剂量给药白消安。图1B为图表，其显示在移植后45、90和180天，移植的CD45.2细胞在骨髓(BM)单核细胞(MNC)内的植入，表达为CD45.2⁺细胞与骨髓单核细胞(BM MNC)的比率。图1C为图表，其显示在移植后45、90和180天，谱系阴性(Lin^-)HSPC在总CD45.2⁺BM细胞中的频率。图1D为图表，其显示在移植后45、90和180天，Kit⁺/Sca-1⁺/Lin^-(KLS)细胞在CD45.2⁺总BM细胞中的频率。图1E为图表，其显示在移植后45、90和180天，移植的CD45.2细胞在脑髓系CD11b⁺细胞内的植入，表达为CD45.2⁺细胞与总脑CD11b⁺细胞的比率。图1F为图表，其显示在移植后45、90和180天，成熟小神经胶质细胞样(μ)细胞(鉴定为CD11b^highCD45^low细胞)在CD45.2⁺脑细胞中的频率。图1G为图表，其显示在移植后45、90和180天，短暂扩增μ(TAμ)细胞(鉴定为CD11b^low CD45^high细胞)在CD45.2⁺脑细胞中的频率。如在附图中所用，HCT表示造血细胞移植。

图2A至2G比较CX3CR1^+/GFP与野生型Lin^-HSPC在接受者中的植入。图2A为示意图，其示出将CX3CR1^+/GFP和WT Lin^-HSPC移植到使用去髓方案预处理的小鼠体内的移植方案(Tpx)，该去髓方案为连续4天以25mg/kg的日剂量给药白消安。图2B为图表，其显示在移植后45、90和180天，移植的CD45.2细胞在骨髓(BM)单核细胞(MNC)内的植入，表达为CD45.2⁺细胞与骨髓单核细胞(BM MNC)的比率。图2C为图表，其显示在移植后45、90和180天，谱系阴性(Lin^-)HSPC在总CD45.2⁺BM细胞中的频率。图2D为图表，其显示在移植后45、90和180天，Kit⁺/Sca-1⁺/Lin^-(KLS)细胞在CD45.2⁺总BM细胞中的频率。图2E为图表，其显示在移植后45、90和180天，移植的CD45.2细胞在脑髓系CD11b⁺细胞内的植入，表达为CD45.2⁺细胞与总脑CD11b⁺细胞的比率。图2F为图表，其显示在移植后45、90和180天，成熟小神经胶质细胞样(μ)细胞(鉴定为CD11b^high CD45^low细胞)在CD45.2⁺脑细胞中的频率。图2G为图表，其显示在移植后45、90和180天，短暂扩增μ(TAμ)细胞(鉴定为CD11b^low CD45^high细胞)在CD45.2⁺脑细胞中的频率。如在附图中所用，HCT表示造血细胞移植。

图3A至3G演示CX3CR1^+/GFP和野生型Lin^-HSPC在竞争性移植接受者中的植入。图3A为示意图，其显示静脉内(IV)和脑室内(ICV)地将使用慢病毒载体转导以表达不同标记物(分别为Cherry和蓝色荧光蛋白(BFP))的野生型和CX3CR1^+/GFP HSPC竞争性移植到使用去髓方案预处理的接受者小鼠体内的移植方案和时间线，该去髓方案为连续4天以25mg/kg的日剂量给药白消安。将野生型和CX3CR1^+/GFP HSPC以1:1比率移植到竞争性移植接受者内(C+B表示小鼠在IV环境下移植0.5x10⁶WT HSPC+0.5x10⁶ CX3CR1^+/GFP HSPC，在ICV环境下移植0.15x10⁶ WT HSPC+0.15x10⁶ CX3CR1^+/GFP HSPC)。对照动物：Cherry＝仅移植1x10⁶ WT HSPCIv、0.3x106⁶ WT HSPC ICV的小鼠，BFP＝仅移植1x10⁶ CX3CR1^+/GFP HSPC Iv、0.3x106⁶CX3CR1^+/GFP HSPC ICV的小鼠。图3B为图表，其显示IV移植的CD45.2细胞在接受者的造血器官(骨髓(BM)、脾、胸腺)中的植入，表达为CD45.2+供体细胞的百分比。图3C为图表，将供体细胞组成表征为在IV竞争性移植的小鼠造血器官中，标记物阳性的细胞(Cherry⁺和BFP⁺)在CD45.2⁺供体细胞中的百分比。图3D为图表，将IV竞争性移植的小鼠的BM供体细胞组成表征为在髓系(Gr-1+、cd11b+)和淋巴系(B220+和CD3+)供体植入细胞中评估的标记物阳性的细胞(Cherry⁺和BFP⁺)的百分比。图3E为图表，将IV竞争性移植的小鼠的脾供体细胞组成表征为在髓系(Gr-1+、cd11b+)和淋巴系(B220+和CD3+)供体植入细胞中评估的标记物阳性的细胞(Cherry⁺和BFP⁺)的百分比。图3F为图表，其显示IV和ICV移植的CD45.2细胞在接受者的脑内的髓系植入，表达为CD45.2⁺供体细胞与总CD11b⁺细胞的比率。图3G为图表，将IV和ICV竞争性移植的小鼠的脑供体细胞组成表征为标记物阳性的细胞(Cherry⁺和BFP⁺)在CD45.2⁺cd11b+细胞中的百分比。

图4A至图4H显示对于CX3CR1^+/GFP和WT HSPC的脑髓系后裔的表征，这些HSPC被IV或ICV地移植到图3A至图3G中所示并且在移植后45天牺牲的竞争性移植接受者中。图4A为免疫荧光图像，其显示植入到竞争性移植小鼠的脑内的CX3CR1^+/GFP和WT小神经胶质细胞样细胞。图4B显示分支细胞分析的宏观工作流程。使用标准化的Macro通过ImageJ软件分析经过最大密度投影后的共聚焦图像。为了表征供体来源的小神经胶质细胞，对每个细胞分析了包括阈(treshold)、骨骼(sketelon)和去除细胞体在内的形态指标。图4C为图表，其显示在竞争性移植接受者的脑内，IV和ICV递送的CX3CR1^+/GFP(BFP)和WT(Cherry)细胞的标记物阳性髓系后裔的分支的累计长度。图4D为图表，其示出在HSPC竞争性移植接受者内，针对IV和ICV递送的CX3CR1^+/GFP(BFP)和WT(Cherry)细胞的标记物阳性髓系后裔计算的复杂性指数。图4E为图表，其描绘在竞争性移植接受者的脑内，IV和ICV递送的CX3CR1^+/GFP(BFP)和WT(Cherry)细胞的标记物阳性髓系后裔覆盖的环境面积。图4F为对通过ImageJ软件分析的小神经胶质细胞样细胞进行的Sholl分析的示例。图4G为图表，其显示应用于竞争性移植接受者的脑内经IV递送的CX3CR1^+/GFP(BFP)和WT(Cherry)细胞的标记物阳性髓系后裔的Sholl分析的结果。图4H为图表，其显示应用于竞争性移植接受者的脑内经ICV递送的CX3CR1^+/GFP(BFP)和WT(Cherry)细胞的标记物阳性髓系后裔的Sholl分析的结果。

图5为一系列图表，其显示在竞争性移植接受者中，通过IV移植的CX3CR1^+/GFP或WT细胞的标记物阳性分选的后裔进行的小神经胶质细胞相关基因的mRNA表达。显示了每种基因在FACS分选的CD11b⁺CD45⁺标记物阳性(BFP对比Cherry)脑细胞中和从出生后3天的新生动物(幼崽)分离的CD11b⁺CD45⁺脑细胞中的表达，与相同基因在成年WT未移植参考小鼠中的表达进行比较。

图6A至6F演示CX3CR1^GFP/GFP和野生型Lin^-HSPC在竞争性移植接受者中的植入。图6A为示意图，其显示将使用慢病毒载体转导以表达不同标记物(分别为Cherry和蓝色荧光蛋白(BFP))的野生型和CX3CR1^GFP/GFP HSPC竞争性移植到使用去髓方案预处理的接受者小鼠体内的移植方案和时间线，该去髓方案为连续4天以25mg/kg的日剂量给药白消安。将野生型和CX3CR1^GFP/GFP HSPC以1:1比率移植到竞争性移植接受者内(C+B表示小鼠移植0.5x10⁶WT HSPC+0.5x10⁶ CX3CR1^GFP/GFP HSPC)。对照动物：Cherry＝仅移植1x10⁶ WT HSPC的小鼠，BFP＝仅移植1x10⁶ CX3CR1^GFP/GFP HSPC的小鼠。图6B为图表，其显示IV移植的CD45.2细胞在造血器官(外周血、BM和脾)中的植入，表达为CD45.2⁺细胞的百分比。图6C为图表，其显示IV移植的CD45.2细胞在接受者的脑内的髓系植入，表达为CD45.2⁺供体细胞与总CD11b⁺细胞的比率。图6D为图表，将供体细胞组成表征为在竞争性移植的接受者造血器官和脑中，标记物阳性的细胞(Cherry⁺和BFP⁺)在CD45.2⁺供体细胞中的百分比。图6E为图表，其将竞争性移植的小鼠的BM供体细胞组成表征为在髓系(Gr-1+、cd11b+)和淋巴系(B220+和CD3+)供体植入细胞中评估的标记物阳性的细胞(Cherry⁺和BFP⁺)的百分比。图6F为图表，其将IV竞争性移植的小鼠的脾供体细胞组成表征为在髓系(Gr-1+、cd11b+)和淋巴系(B220+和CD3+)供体植入细胞中评估的标记物阳性的细胞(Cherry⁺和BFP⁺)的百分比。

主要组件符号说明

无。

具体实施方式

本公开的特征在于可用于增强造血干祖细胞(HSPC)植入和HSPC后裔扩张的组合物和方法。

本公开至少部分地基于以下发现：对于C-X3-C基序趋化因子受体1(CX3CR1)为半合子的细胞在移植到受试者脑内后表野生型细胞更快地生成髓系后裔并成熟。

CX3CR1

CX3CR1也称为弗拉托肯受体，是一种七跨膜结构域受体，属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族。它在几种细胞类型(例如，小神经胶质细胞、单核细胞、天然杀手细胞、T细胞和平滑肌细胞)内表达。小神经胶质细胞是中枢神经***中唯一的表达CX3CR1的细胞类型。CX3CR1在发育期间并且响应脑损伤/病变而被高度表达。

作为GPCR，CX3CR1的作用是抑制性的，因为它发挥作用以减少环状腺苷单磷酸酯(cAMP)的产生并且阻止由第二信使介导的后续信号传导级联的触发。由CX3CR1信号传导控制的细胞内途径主要包括磷脂酶C(PLC)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和细胞外信号调节激酶(ERK)调节，它们调控细胞迁移、粘附、增殖和存活。此外，CX3CR1是牵涉到小神经胶质细胞个体发生中的关键分子之一。

弗拉托肯(CX3CL1)是趋化因子受体CX3CR1的唯一配体并且被表达为膜结合分子或可溶形式。弗拉托肯裂解由至少两种酶ADAM10和ADAM17介导，这两种酶分别在内稳条件下和炎性条件下具有活性。弗拉托肯主要以其膜结合形式充当粘附分子，而其可溶形式对CX3CR1具有驱化性质。CX3CL1以及CX3CR1的局部产生和膜表达也受控于其他细胞因子如TNFα、IL-1、IFNγ、NO及缺氧。

CX3CR1–CX3CL1轴的活化导致小神经胶质细胞维持在静止状态并且神经网络维持在稳态。在生理条件下，CX3CR1似乎抑制小神经胶质细胞活化，而在特定条件下，可能发生自相矛盾的对炎性应答的促进。神经元是脑中CX3CL1的主要生产者，并且该轴对于与小神经胶质细胞的通讯非常重要。

令人惊奇的是，如下文所报导，移植来自对于CX3CR1基因为单倍体不足的供体小鼠的总骨髓或HSPC导致在接受者的脑中生成小神经胶质细胞样供体细胞后裔，这些细胞后裔比标准野生型供体细胞的脑细胞后裔更加成熟(富含CD11b^high CD45^low小神经胶质细胞样的μ细胞对比CD11b^low CD45^high短暂扩增的TAμ细胞)。这一现象导致在移植的细胞后裔中，CD11b^high CD45^low小神经胶质细胞样μ细胞中的CX3CR1半合子细胞数量出乎意料地增加。与此同时，与WT细胞移植接受者的供体BM细胞中的KLS细胞数量相比，CX3CR1单倍体不足细胞移植接受者的供体BM细胞中的KLS细胞数量增加。

出乎意料的是，在竞争性移植的情境中，与野生型供体细胞相比，CX3CR1单倍体不足的供体源性细胞对于接受者的造血器官和脑髓系室的再群体化的贡献更大。在每种所测试的组织和细胞室中，CX3CR1单倍体不足的细胞的频率均大于WT细胞的频率。对于植入细胞执行的分支研究显示，CX3CR1^+/GFP细胞的脑髓系后裔也获取了更多成熟的小神经胶质细胞样形貌并且以高于WT细胞后裔的水平表达小神经胶质细胞相关基因。

值得注意的是，CX3CR1半合子小鼠没有明显表型。因此，没有理由期望CX3CR1半合子细胞的移植将会与野生型细胞的移植有所不同。

因此，本公开提供CX3CR1半合子或纯合子缺陷HSPC细胞用于移植。在一些实施方案中，CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞是造血干祖细胞(HSPC)。在一些实施方案中，CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞分离自生物样品或通过基因组编辑、靶向基因添加或使用本领域已知的任何敲除基因的方法生成。用于收集生物样品和自其分离细胞(例如，HSPC)的方法是本领域中众所周知的。在一些实施方案中，评估细胞以确定与受试者的免疫相容性。

治疗剂的表达

本发明的一些态样提供一种CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞，其包含编码治疗剂(例如，治疗性多肽或多核苷酸)的外源核酸分子。在一些实施方案中，治疗剂是多核苷酸或多肽。在一些实施方案中，多肽或多核苷酸可以改善疾病(例如，神经***疾病或病症或代谢疾病或病症)或其症状。在一些实施方案中，编码治疗剂的核酸分子被整合到CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞的基因组内。在一些实施方案中，编码治疗剂的核酸分子被***到CX3CR1等位基因缺失或失能的基因座处。在一些实施方案中，外源核酸分子的表达收到CX3CR1启动子/增强剂区域的调节，与CX3CR1表达一致。

在一些实施方案中，外源核酸分子包含调节元件以用于表达转基因。例如，外源核酸分子可以包含编码用于治疗代谢疾病或神经***疾病的治疗剂的转基因和，在一些情况下，用于表达该转基因的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成性活性启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)或猿猴病毒40(SV40)启动子。在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子，其中，该转基因在HSPC植入和分化后被表达。在一些实施方案中，神经元特异性启动子是突触蛋白(Syn)启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，其中，该转基因仅在特定化合物存在或不存在下被表达。例如，四环素是可用来活化四环素敏感性启动子的药物。在一些实施方案中，源自被移植到受试者脑内的包含由脑特异性启动子驱动的转基因的HSPC的小神经胶质细胞或小神经胶质细胞样细胞将表达该转基因。

在一些实施方案中，外源核酸分子除了包含转基因外，还可以包含允许鉴定细胞的可检测标记或其他标记物，这些细胞已经被成功修饰或源自已经被成功修饰以表达该转基因的细胞。

半合子或纯合子缺陷CX3CR1细胞的生成

在本公开的一些实施方案中，HSPC或经编辑以去除CX3CR1的一个或两个功能性拷贝或使之失能，以生成对于该基因为半合子或纯合子缺陷性的HSPC。

基因编辑(gene editing)是生物医学研究的一个主要焦点，其属于基础科学和临床科学的交叉学科。“基因编辑”工具可以操纵位于特定染色体基因座处的细胞DNA序列而不在该基因组其他位点引入突变(mutations)。这一技术有效地令研究者能够在体外或体内操纵细胞的基因组。

在一种实施方案中，基因编辑涉及将核酸内切酶靶向至基因组中的具***点以在该具***置生成双链断裂。如果引入了供体DNA分子(例如，质粒或寡核苷酸)，则包含双链断裂的核酸与所引入的DNA之间可能发生相互作用，尤其是如果两个核酸共享同源序列。在这一实例中，可发生被称为“基因靶向”的过程，在该过程中，染色体的DNA末端通过同源性重组侵入供体DNA的同源序列中。使用供体质粒序列作为同源重组的模板，可实施所关注基因的无缝敲除。重要的是，如果供体DNA分子包括位于靶标基因(例如，CX3CR1)内的缺失，则同源重组介导的双链断裂修复将会把供体序列引入染色体中，导致该缺失被引入染色体基因座内。通过将核酸酶靶向至含有靶标基因的基因组位点，该概念为使用双链断裂形成来刺激同源重组并因而将功能性靶标基因替换为该基因的缺失形式。同源重组路径的优点是，它具有在原先的野生型等位基因位置处无缝生成基因敲除的潜力。

基因组编辑工具可使用双链断裂来增强细胞基因操纵。此类方法可采用锌指核酸酶(例如在美国专利6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185和6,479,626中以及美国专利公布20030232410和US2009020314中有所描述，其通过引用并入本文)；转录激活子样效应子核酸酶(TALEN；例如在美国专利8,440,431、8,440,432、8,450,471、8,586,363和8,697,853中以及美国专利公布20110145940、20120178131、20120178169、20120214228、20130122581、20140335592和20140335618中有所描述，其通过引用并入本文)；和CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas9***(例如在美国专利8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,871,445、8,889,356、8,906,616、8,932,814、8,945,839、8,993,233和8,999,641中以及美国专利公布20140170753、20140227787、20140179006、20140189896、20140273231、20140242664、20140273232、20150184139、20150203872、20150031134、20150079681、20150232882和20150247150中有所描述，其通过引用并入本文)。例如，锌指核酸酶DNA序列(zinc fingernuclease DNA sequence)识别能力和特异性可为无法预测的。类似地，TALEN和CRISPR/Cas9不仅在所希望的位点处裂解，而且经常也在其他“脱靶”位点处裂解。这些方法具有与脱靶双链断裂诱导和潜在的有害突变(包括与这些脱靶效应有关的indel、基因组重排和染色体重排)相关的显著问题。锌指核酸酶和TALEN一定要使用模块化序列特异性DNA结合蛋白来生成对于基因组中的约18个碱基的序列的特异性。

RNA引导的核酸酶介导的基因组编辑，基于2型CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR缔合的)***，为改变基因组提供了一个有价值的途径。简而言之，Cas9(由单向导RNA(sgRNA)引导的核酸酶)结合至紧随前间区序列邻近基序(PAM)之后的靶向基因组基因座并生成双链断裂。然后，通过导致***/缺失(indel)突变的非同源性末端接合，或通过需要外源性模板并且可在靶标基因座生成精确修饰的同源导向修复来修复双链断裂(Mali et al.,Science,Feb15,2013；339(6121):823-6，其内容通过引用以其整体并入本文)。不同于将功能性或部分功能性的基因拷贝添加到受试细胞但保留该基因的最初功能失调拷贝的基因疗法，这一***可去除失能拷贝中的缺陷。使用修饰的核酸酶进行的基因矫正已经在组织培养细胞和罕见病啮齿动物模型中得以证明。

CRISPR已经被广泛用于有机体中，包括面包酵母(S.cerevisiae)、斑马鱼、线虫(例如，C.elegans)、植物、小鼠和数种其他有机体。此外，已经对CRISPR做出修饰以制备可编程的转录因子，该转录因子允许科学家靶向并激活或沉默特定基因。现在可获得数万种向导RNA的文库。通过***包含cas基因和特异性设计的CRISPR的质粒，可在任何所希望的位置切割有机体的基因组。

CRISPR重复序列的尺寸在24至48个碱基对范围内。它们往往显示某种二元对称性，暗指二级结构诸如发夹的形成，但不是真正的回文。重复序列通过类似长度的间隔序列分隔开来，其中，一些CRISPR间隔序列准确地匹配来自质粒和噬菌体的序列，但一些间隔序列匹配原核生物基因组(自我靶向间隔序列)。可快速地添加新间隔序列以应对噬菌体感染。

CRISPR相关(cas)基因往往与CRISPR重复序列-间隔序列阵列相关。截至2013年，已有超过四十个不同的Cas蛋白质家族被描述。这些蛋白质家族中，Cas1在不同的CRISPR/Cas***中似乎无处不在。已经使用cas基因与重复序列结果的具体组合来定义八个CRISPR亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中，的一些与编码重复序列相关神秘蛋白(RAMP)的额外基因模块有关。单个基因组中可能出现超过一种CRISPR亚型。CRISPR/Cas亚型的零星分布暗示，该***在微生物进化期间受到水平基因转移的影响。

外源性DNA显然被由Cas基因编码的蛋白质加工为小元件(长度为约三十个碱基对)，然后，这些小元件被***到邻近前导序列的CRISPR基因座中。来自CRISPR基因座的RNA被构成性的表达并且被Cas蛋白加工为小RNA，这些小RNA包含单个的具有侧翼重复序列的外源性衍生序列元件。这些RNA引导其他Cas蛋白以RNA或DNA水平沉默外源性基因元件。证据表明了CRISPR亚型间的功能多样性。Cse(Cas亚型E.coli)蛋白(称为大肠杆菌(E.coli)中的CasA-E)形成功能性复合物Cascade，其将CRISPR RNA转录物加工成Cascade保留的间隔序列-重复序列单元。在其他原核生物中，Cas6加工CRISPR转录物。有趣的是，在大肠杆菌中进行基于CRISPR的噬菌体失活需要Cascade和Cas3，但既不需要Cas1也不需要Cas2。在强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和其他原核生物中发现的Cmr(Cas RAMP模块)与识小CRISPR RNA形成功能性复合物，该复合物识别并裂解互补性靶标RNA。RNA引导的CRISPR酶被分类为V型限制性内切酶。也见美国专利公布2014/0068797，其通过引用而以其整体并入本文。

作为RNA引导的蛋白质，Cas9需要RNA分子来引导对DNA靶标的识别。尽管Cas9优先询问含有前间隔邻近基序(PAM)序列(即，NGG)的DNA序列。但是，Cas9-gRNA复合体需要在向导RNA(gRNA)与靶标核酸序列之间实质性互补以创建双链断裂。合成gRNA可以被设计为将用于Cas9靶向的必需RNA序列组合成单一RNA，该单一RNA由RNA聚合酶2I型启动子U6驱动表达。合成gRNA的最小长度略微超过100个碱基，并且含有一个以在PAM序列NGG前与之紧邻的20个原间隔序列核苷酸为靶标的部分。

在一种方法中，使用CRISPR-Cas***改变受试者的一个或多个细胞以令CX3CR1缺失或灭活。Cas9可用来靶向CX3CR1基因。一旦识别靶标，Cas9就将双链断裂引入CX3CR1靶标基因中。在双链断裂位点处的同源导向修复(HDR)可允许***灭活或删除形式的CX3CR1序列。

以下美国专利和专利公布通过引用并入本文：8,697,35、20140170753、20140179006、20140179770、20140186843、20140186958、20140189896、20140227787、20140242664、20140248702、20140256046、20140273230、20140273233、20140273234、20140295556、20140295557、20140310830、20140356956、20140356959、20140357530、20150020223、20150031132、20150031133、20150031134、20150044191、20150044192、20150045546、20150050699、20150056705、20150071898、20150071899、20150071903、20150079681、20150159172、20150165054、20150166980、和20150184139。在一些实施方案中，编辑HSPC以生成半合子CX3C3R1细胞包括将编码治疗剂的外源核酸分子***到CX3CR1基因座处。

治疗剂在CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞中的表达

本文提供方法以修饰CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞，从而表达治疗剂(例如，神经保护多肽或改善代谢病症所需的多肽)。在一些实施方案中，CX3CR1细胞经修饰以并入编码治疗剂的外源核酸分子。外源核酸分子可以被并入CX3CR1细胞的基因组内。本公开还设想修饰CX3CR1半合子或纯合子缺陷HSPC以将编码治疗剂的核酸序列并入缺失的CX3CR1等位基因基因座中。通过这种方式，半合子或纯合子缺陷HSPC在CX3CR1基因组控制下***纵以表达治疗性转基因。

为了表达外源多核苷酸或多肽，可以通过本领域中已知的技术将编码该多核苷酸和多肽的核酸分子***到表达载体中。例如，可通过涉及使用合成DNA链接基的限制酶链接或通过钝端连接将双链DNA克隆到适当的载体中。一般使用DNA连接酶来连接该DNA分子，且可通过使用碱性磷酸酯酶处理而避免不希望的接合。

本公开还包括载体(例如，重组质粒)，该载体包括如本文所述的核酸分子(例如，转基因)。术语“重组载体”包括已经被变更、修饰或工程化的载体(如，质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、或其它纯化的核酸载体)，从而使得该重组载体含有比该重组载体所来自的原生或天然核酸分子中所包括的核酸序列更大、更小或不同的核酸序列。例如，重组载体可包括编码多肽的核苷酸序列或其片段，其可操作地连接至调控序列，诸如启动子序列、终止子序列、长末端重复序列、未转译区等，如本文所定义。重组表达载体允许表达其内部包括的基因或核酸。

在本公开的一些实施方案中，一个或多个具有编码本文所述的一种或多种多肽或多核苷酸的核苷酸序列的DNA分子被可操作地连接至一个或多个调控序列，其可将所希望的DNA分子整合到真核细胞内。例如，可通过引入一种或多种允许选择含有该表达载体的宿主细胞的标记物，选择已经被所引入的DNA稳定转染或转导的细胞(例如，CX3CR1半合子细胞)。可选择的标记物基因可直接连接至待表达的核酸序列，或可通过共转染或共转导被引入相同的细胞内。本文所述多核苷酸或多肽的最有合成所需的任何额外元件对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。

将外源核酸分子引入细胞(例如，CX3CR1半合子细胞)内的方法是本领域中已知的。例如，真核细胞可以通过转染(例如，磷酸钙介导的转染)从环境中摄取核酸分子。转染不采用病毒或病毒载体来将外源核酸引入接受者细胞内。真核细胞的稳定转染包括将所转染的核酸整合到接受者细胞基因组内，所转染的核酸随后可以被接受者细胞的后裔遗传。

真核细胞(例如，CX3CR1半合子或纯合子缺陷HSPC)可以通过转导进行修饰，在转导中，病毒或病毒载体将外源核酸分子稳定地引入接受者细胞内。真核转导递送***是本领域中已知的。大多数细胞类型的转导可以使用逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和禽病毒***实施，并且此类***是本领域中众所周知的。尽管逆转录病毒***通常与神经元细胞转导不相容，但慢病毒是非常适合转导干细胞以及神经元细胞的逆转录病毒的一个属。因此，在本公开的一些实施方案中，病毒载体***是慢病毒***。在一些实施方案中，病毒载体***是禽病毒***，例如，US8642570、DE102009021592、PCT/EP2010/056757和EP2430167中所述的禽病毒载体***，其内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，在与预期的接受者细胞接触之前，病毒载体被组装或封装在封装细胞内。在一些实施方案中，载体***是自灭活***，其中，病毒载体被组装在封装细胞内，但在与接受者细胞接触之后，病毒载体不能在接受者细胞内产生。

病毒载体的组分被编码在质粒上。因为质粒尺寸越大，转导效率越低，从而病毒载体的安全性增加(参见例如，Addgene.org/guides/lentivirus/)多种具有不同病毒序列的质粒是进行封装所必需的。例如，在慢病毒载体***中，第一质粒可以包含编码一组抗原(例如，gag)及/或逆转录酶(pol)基因的核苷酸序列，而第二质粒编码病毒粒子蛋白(rev)及/或包膜(env)基因的表达的调节子。包含转基因的外源核酸分子可以被封装到载体内并且递送之接受者细胞内，在该处，该转基因被整合到接受者细胞的基因组内。此外，转基因可以使用分立封装***封装，如US8642570、DE102009021592、PCT/EP2010/056757和EP2430167中所述。

引入一个或多个载体之后，培养宿主细胞，然后给药至受试者。可通过包括西方墨点法分析、免疫印迹、和免疫荧光在内的免疫分析来检测载体中编码的重组蛋白的表达。可通过该领域中已知的或本文所述的任意方法完成重组蛋白的纯化，例如，涉及提取、沉淀、色谱和电泳的任何传统过程。可用于纯化蛋白的其他纯化过程包括使用结合靶点蛋白的单克隆抗体进行的亲和色谱。通常，令含有重组蛋白的粗制剂穿行通过其上固定有适合的单克隆抗体的柱。蛋白一般经由特异性抗体结合至该柱，而杂质则穿行通过。洗涤该柱后，例如通过改变pH或离子强度将蛋白质从凝胶中洗脱。

造血细胞移植

通过促成脑内髓细胞群的更新，CX3CR1半合子或纯合子缺陷性的HSPC及/或其后裔可充当媒介物以用于将治疗分子进行跨血脑屏障递送。用于造血细胞移植(HCT)的方法和基于造血干细胞(HSC)的基因疗法是本领域中已知的，并且已经用于治疗患有影响神经***的非造血性和非肿瘤性疾病诸如过氧化物酶体病症和溶酶体贮积疾病(LSD)(LSD)(Cartier et al.Science 326,818-823(2009)；Biffi et al.Science 341,1233158(2013)；Sessa et al.Lancet 388,476-487(2016))和神经***疾病(Simard etal.Neuron 49,489-502(2006)).的患者。事实上，HSPC及/或其后裔可促进脑中的髓系细胞群的更新(Ajami et al.Nat Neurosci 10,1538-1543(2007)；Ajami et al.Nat Neurosci14,1142-1149(2011)；Biffi et al.J.Clin.Invest.116,3070-3082(2006)；Mildner etal.Nat Neurosci 10,1544-1553(2007)；Capotondo et al.Proc Natl Acad Sci U SA.109,15018-15023(2012))。小神经细胞在这些病症中的作用和结果已经有所描述(Jeyakumar et al.Brain 126,974-987(2003)；Wada et al.Proc Natl Acad Sci U S A97,10954-10959(2000)；Ohmi et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100,1902-1907(2003)；Eichler et al.Ann Neurol 63,729-742(2008)，各自的内容以其整体并入本文)。

尽管小神经胶质细胞的发育起源不同于骨髓源性骨髓单核细胞(Ginhoux etal.Science 330,841-845(2010)，其内容通过引用以其整体并入本文)，但最近已证明，在具体的实验条件下，在移植了供体HSPC的小鼠脑中，可以成功地生成显示小神经胶质细胞样表型并表达一些小神经胶质细胞表面标记物的供体来源细胞。使用去髓预处理方案以摧毁内源小神经胶质祖细胞，可以提高抑制效率，诸如国际申请号PCT/US2017/056774中所述，其内容通过引用以其整体并入本文。在本公开的一些实施方案中，去髓预处理方案包括在移植之前将烷基化剂给药至受试者。在各种实施方案中，烷基化剂是白消安。白消安能够将功能性上定义的脑驻留小神经胶质细胞前体去髓(Capotondo et al.Proc Natl AcadSci U S A.109,15018-15023(2012)；Wilkinson et al.Mol Ther 21,868-876(2013))。

HSPC具有生成新的髓系和小神经胶质细胞群的能力，可以在中枢神经***(CNS)中发挥治疗性效果。本公开提供包含CX3CR1半合子或纯合子缺陷HSPC的组合物和用于植入此类细胞的改良方法。

通过一个类似于出生后小神经胶质细胞生理成熟的逐步过程，HSPC移植生成了转录上可依赖的小神经胶质细胞。CX3CR1半合子或纯合子缺陷造血细胞在移植到去骨髓的接受者内后能够生成新的小神经胶质细胞，这些细胞被保留在人类和鼠长期造血干细胞(HSC)内。在一些实施方案中，在进行CX3CR1半合子或纯合子缺陷HSPC的脑室内递送后，可以生成小神经胶质细胞，这出乎意料地导致了比递送野生型HSPC更快且更广泛的小神经胶质细胞替换。

药物组合物

本公开设想的组合物包括包含对于CX3CR1而言为半合子或纯合子缺陷性的细胞的药物组合物。在一些实施方案中，对于CX3CR1为半合子的细胞经修饰以表达治疗剂。在一些实施方案中，对于CX3CR1为纯合子的细胞(例如，CX3CR1^GFP/GFP)经修饰以表达治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂为具有神经保护性的(neuroprotective)或需要用其替换缺失的代谢酶。本文设想的药物组合物可包含自体细胞或异体细胞。在一些实施方案中，该细胞是CX3CR1半合子或纯合子缺陷HSPC。

如本文所述的CX3CR1半合子或纯合子缺陷HSPC可以作为治疗组合物(例如，作为药物组合物)给药。如本文所述的细胞组合物可以提供为无菌液体制剂，例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘稠组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂可能比凝胶(另一种粘稠组合物)或固体组合物更容易制备。此外，液体组合物可能更便于给药(即，通过注射)。另一方面，粘稠组合物可以配制在适当的粘度范围内以提供与具体组织的更长接触时间。液体或粘稠组合物可以包含载体，该载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、以及其合适的混合物。

无菌可注射溶液可以通过将本文所述的细胞并入足量的适当稀释剂中来制备。此类组合物可以是与合适的载体或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋葡萄糖或其他适用于将活细胞递送至受试者的载体或赋形剂的掺和物。组合物也可以冻干。组合物可以含有佐剂物质诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、芳香剂、着色剂等，取决于所希望的给药途径和制剂。可查询标准教材诸如《雷明顿药物科学(第十七版)》(“Remington's Pharmaceutical Science,”17th edition,1985，通过引用并入本文)来制备合适的制剂而无需过度实验。

可以添加增强细胞组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过抗细菌剂或抗真菌剂，包括但不限于，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可以确保对于微生物作用的预防。但是，根据本公开，所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂必需与细胞相容。

组合物可以是等渗的(isotonic)，即，它们具有与血液和脑脊液相同的渗透压(osmotic pressure)。本发明组合物的所希望的等渗性可以使用氯化钠或其他药学可接受的剂诸如右旋葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质实施。氯化钠可能适用于含有钠离子的缓冲液。

若必要，可以使用药学可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在选定水平。在一些实施方案中，增稠剂是甲基纤维素，其容易获得且便宜并且易于操作。其他合适的增稠剂包括但不限于，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和卡波姆。增稠剂的浓度将取决于所选择的剂和所使用的剂的量。合适的载体和其他添加剂可根据给药途径和剂型属性(例如，液体剂型可以配制为溶液、悬浮液、凝胶或另一液体形式，诸如时间释放调配物或液体填充形式)来选择。

待给药的细胞的有效量可根据被治疗的受试者而变。在一种实施方案中，将约10⁴至约10⁸之间的细胞给药至受试者，在另一种实施方案中，将约10⁵至约10⁷之间的细胞给药至受试者。

技术人员可以容易地确定待给药的组合物中CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞和任选的添加剂、媒介物及/或载体的量。在一种实施方案中，任何添加剂(除了细胞之外)以约0.001％至约50％(重量)溶液的量存在于磷酸盐缓冲盐水中，并且活性成分(activeingredient)以微克至毫克的数量级存在，诸如约0.0001％至约5wt％。在另一种实施方案中，活性成分以约0.0001％至约1wt％存在。在又一种实施方案中，活性成分以约0.0001％至约0.05wt％存在。在再一种实施方案中，活性成分以约0.001％至约20wt％存在。在一些实施方案中，活性成分以约0.01％至约10wt％存在。在另一种实施方案中，活性成分以约0.05％至约5wt％存在。对于待给药至动物或人类的任何组合物，并且对于任何特定给药方法，可以通过在合适的动物模型例如啮齿动物诸如小鼠中测量致死剂量(LD)和LD₅₀来确定毒性。也可以确定组合物的剂量、组合物中组分的浓度和引起合适应答的给药组合物的时机。鉴于本领域技术人员的知识、本公开和本文所引的文献，此类确定不需要过度实验。依次给药的时间也可以无需过度实验而确定。

治疗方法

本公开提供治疗有其需要的受试者的方法，通过将对于CX3CR1为半合子或纯合子缺陷性的细胞或包含该细胞的药物组合物给药至该受试者而进行。在一些实施方案中，需要进行治疗的受试者患有或易患代谢疾病或神经***疾病。

通过评估受试者体内的代谢疾病或神经***疾病的一种或多种症状，专业医护人员可将受试者诊断为患有该疾病。本公开提供治疗代谢疾病或神经***疾病或其症状的方法，包括向受试者(例如，哺乳动物，诸如人类)给药治疗有效量的对于CX3CR1为半合子的细胞，该细胞可以表达或不表达治疗性多肽。在一些实施方案中，细胞是HSPC。在一些实施方案中，细胞是小神经胶质祖细胞。因此，在一些实施方案中，该方法包括向受试者给药治疗有效量的本文所述细胞，该量在代谢疾病或神经***疾病被治疗的条件下足以治疗该疾病。

本文的方法包括对该受试者(包括被证实需要此治疗的受试者)给药有效量的本文所述的细胞或本文所述的包含此类细胞的组合物以产生此效果。此治疗将被适当地给予苦于、患有、易患代谢疾病或神经***疾病或其症状或处于该疾病或其症状风险下的受试者，尤其是人类。在一些实施方案中，本文的方法包括对受试者(包括被证实需要此治疗的受试者)给药有效量的本文所述的化合物或本文所述的组合物以产生此效果。

在一些实施方案中，以靶向方式将该细胞或包含该细胞的组合物给药至受试者。例如，在一些实施方案中，直接将包含对于CX3CR1为半合子或纯合子缺陷性的细胞的组合物给药至受试者脑部。在一些实施方案中，通过脑室内给药将该组合物直接递送至脑部。在一些实施方案中，以这一方式将该组合物递送至受试者脑部的侧脑室。

作为另一种选择，诸如通过静脉内给药将该组合物进行全身递送。以该方式给药的细胞在植入受试者脑内之前必须跨越血脑屏障。其他给药模式(肠胃外、黏膜、植入、腹膜内、皮内、透皮、肌肉内、脑室内注射，静脉内给药包括输液及/或快速推注，以及皮下给药)是本领域中通常所知的。在一些实施方案中，细胞在适用于注射的介质诸如磷酸盐缓冲盐水中给药至受试者。因为被正在给药至受试者的细胞旨在再群体化小神经胶质细胞，脑室内给药可能优于其他需要跨越血脑屏障的给药途径。

在一些实施方案中，对于CX3CR1为半合子或纯合子缺陷性的细胞经修饰以表达治疗剂。在一些实施方案中，修饰对于CX3CR1为半合子或纯合子缺陷性的细胞的基因组以使其在CX3CR1基因座处具有编码治疗剂的核酸，使得该细胞包含CX3CR1基因的一个功能性拷贝和编码该治疗剂的核酸分子的一个功能性拷贝。在一些实施方案中，治疗剂是神经保护剂(neuroprotective agent)。在此类实施方案中，移植的CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞(其表达治疗剂)在受试者脑内的植入提供了表达治疗剂的细胞群。但因为移植的细胞意在替换内源细胞(即，小神经胶质细胞)，在某些实施方案中，治疗患有、易患代谢疾病或神经***疾病或处于发展出该疾病风险下单受试者进一步包括在给药表达治疗剂的CX3CR1半合子或纯合子缺陷HSPC之前，给药用于将内源细胞诸如小神经胶质细胞去髓的剂。在一些实施方案中，该剂是烷基化剂。在各种实施方案中，烷基化剂是白消安。在一些实施方案中，烷基化剂的纳米颗粒递送可能在创建对于移植的HSPC的植入有效的合适环境，如国际申请号PCT/US2017/056774中所述，其内容通过引用以其整体并入本文。

试剂盒

本公开设想了用于治疗或预防代谢疾病或神经***疾病的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含一种组合物，该组合物包含对于CX3CR1为半合子或纯合子缺陷性的细胞。在一些实施方案中，对于CX3CR1为半合子或纯合子缺陷性的细胞经修饰以表达治疗剂。在一些实施方案中，修饰对于CX3CR1为半合子缺陷性的细胞的基因组以使其在CX3CR1基因座处具有编码治疗剂的核酸，使得该细胞包含CX3CR1基因的一个功能性拷贝和编码该治疗剂的核酸分子的一个功能性拷贝。在一些实施方案中，修饰对于CX3CR1为纯合子缺陷性的细胞的基因组以使其在CX3CR1基因座处具有编码治疗剂的核酸，使得该细胞不包含CX3CR1基因的功能性拷贝但包含编码该治疗剂的核酸分子的至少一个功能性拷贝。试剂盒可以包含关于治疗方案、试剂、设备(试管、反应容器、针头、注射器等)的使用说明，以及用于校准或实施治疗方案的标准。根据本公开的试剂盒中提供的使用说明可以涉及合适的操作参数，其形式为可检测的标签或独立的插页。任选地，试剂盒可以进一步包含标准或对照信息，因此可将测试样品与对照信息标准进行比较以确定是否实现了一致的结果。在一些实施方案中，该试剂盒包括用于内源小神经胶质细胞的去髓预处理的纳米颗粒。

在一些实施方案中，该试剂盒包含含有治疗性或预防性细胞组合物的无菌容器；此类容器可为盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、包、或其他该领域中已知的适合的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适用于容纳药物的材料制作。

若需要，本发明的剂可与将该剂给药至患有代谢疾病或神经疾病或中枢神经***病症或处于发展出该疾病或病症风险下的受试者的使用说明书一起提供。使用说明书通常将包括关于使用该组合物治疗或预防疾病或病变的信息。在其他实施方案中，使用说明书包括下列的至少一种：对治疗剂的说明；治疗或预防神经疾病或其症状的给药方案和方式；预防措施；警告信息；指示；禁忌说明；过量信息；副作用；动物药理；临床研究；及/或参考文献。使用说明书可直接印在容器(当存在时)上，或作为用于该容器的标签，或作为独立的页、册、卡或折叠式印刷品提供在给容器内或与该容器一起提供。

除非明确指定，否则本发明的实践采用传统的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，这些技术处于该领域技术人员的知识范围内。此类技术在文献中完整地诠释，如，《分子克隆：实验室手册(第二版)》(MolecularCloning:ALaboratory Manual,second edition,(Sambrook,1989))；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(Gait,1984))；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture(Freshney,1987))；《实验免疫学手册》的《酶学方法》(Methods in Enzymology Handbookof Experimental Immunology(Weir,1996))；《用于哺乳动物细胞的转基因载体》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(Miller and Calos,1987))；和《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987))；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学现代方法》(Current Protocols in Immunology(Coligan,1991))。这些技术可用来生产本发明的多核苷酸和多肽，且因此可在作成并实践本发明中考虑这些技术。尤其可用于特定实施方式的技术将在下文中讨论。

提出下述实施例以向该领域技术人员提供对于如何制作并使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完全公开和说明，但并不试图限制发明人所认定的发明范畴。

实施例

实施例1：CX3CR1^+/GFP造血细胞的移植导致迅速的小神经胶质细胞重构

从8周龄CD45.2野生型或CD45.2 CX3CR1^+/GFP小鼠分离骨髓细胞。红细胞溶解后，将2.0x10⁶个细胞经静脉内(IV)移植到经过白消安预处理(25mg/kg，持续四天)的八周龄CD45.1野生型接受者内。对移植的小鼠进行临床监测，并且在移植后45、90和180天牺牲(图1A)。没有出现中途死亡。在灌注后牺牲时，收集骨髓和脑以通过流式细胞术监测移植的细胞的植入。在木瓜蛋白酶消化和Percoll密度梯度Fenix后，分离脑细胞。

在接受者的骨髓中观察到了移植的CX3CR1^+/GFP细胞和野生型细胞的类似的持续植入(图1B)。与接受野生型细胞的小鼠相比，在接受CX3CR1^+/GFP细胞的小鼠中观察到了更高频率的供体Kit⁺谱系^-Sca-1⁺(KLS)细胞(一种类型的造血干细胞)(图1B至图1D)。在脑内，在CX3CR1^+/GFP和野生型细胞接受者中观察到了类似的总体CD45.2供体细胞植入(图1E至图1G)。但是，在接受从不同供体分离的细胞的小鼠中，观察到了不同比例的CD45⁺CD11⁺髓系细胞亚群。特别地，与移植野生型细胞的小鼠相比，观察到在移植CX3CR1^+/GFP细胞的小鼠中更快地出现更多成熟的小神经胶质细胞样(μ)CD45^low CD11b^high细胞与更少不成熟的短暂扩增μ(TAμ)CD45^high CD11b^low细胞。

当移植CX3CR1^+/GFP造血干祖细胞(Lin^-)(1x10⁶ Lin-细胞/小鼠，在白消安预处理后)时，获得了相似的结果(图2A至2G)。

实施例2：CX3CR1^+/GFP造血干祖细胞(HSPC)在移植后具有竞争优势

更好地表征CX3CR1^+/GFP细胞的表型并评估他们是否具有优于野生型的定性(和定量)优势，执行了竞争性移植实验。从八周龄CD45.2野生型或CD45.2 CX3CR1^+/GFP小鼠分离HSPC，用编码不同荧光标记物(分别为PGK.mCherry和PGK蓝色荧光蛋白(BFP))的慢病毒载体标记，并且以1:1的比率共移植到CD45.1白消安去骨髓的接受者中(图3A)。

采用静脉内(IV)和脑室内(ICV)给药在独立的实验中执行移植。在IV环境下，每只小鼠移植总计1.0x10⁶HSPC。在ICV环境下，每只小鼠移植总计0.3x10⁶HSPC。还向接受通过ICV给药的HSPC的小鼠静脉内地提供2.0x10⁶个总骨髓未转导的CD45.1细胞，以用于在移植后五天时从发育不全中恢复。还执行单一群体的mCherry⁺野生型HSPC或BFP+CX3CR1^+/GFPHSPC的移植作为对照。

在移植后一个月执行流血时，在全部小组中均观察到了良好的供体细胞(CD45.2)植入。全部小鼠均在移植后45天牺牲，在全部分析的组织和小组中均显示良好的供体细胞(CD45.2)植入(图3B至图3G)。在全部所分析组织(骨髓、脾和脑)的竞争性环境中，CX3CR1^+/GFP HSPC在植入方面显示了一贯且稳健的优于野生型的定量优势(图3C至图3G)。在全部所分析的造血组织中，在淋巴系和髓系两个谱系中均观察到了单倍体不足与野生型细胞相比的优势。值得注意的是，移植CX3CR1^+/GFP或野生型HSPC或两种HSPC组合的动物在全部所分析的组织中显示了髓系和淋巴系群体的类似表现。在ICV移植的动物的造血器官中检测到非常少甚至没有共体细胞植入。

在IV和ICV移植的动物的脑内均观察到了良好的共体细胞植入(图3F)。而且，在竞争性移植的动物的脑内，在CD11b⁺造血供体细胞部分中，CX3CR1^+/GFP细胞比野生型细胞更具代表性(图3G)。

总体上，这些数据表明，当被共移植到去骨髓的宿主中时，在CX3CR1基因座处为单倍体不足的HSPC的植入及/或生成成熟的后裔的能力比正常细胞大。对于植入单倍体不足的细胞的中枢神经***而言，这也是事实。

实施例3：CX3CR1^+/GFP HSPC在移植后生成比野生型HSPC更多的成熟小神经胶质细胞样细胞

为了证实CX3CR1单倍体不足性可能也与被抑制的细胞及/或他们的后裔特别是在脑内更快成熟有关，分析了植入到竞争性移植的小鼠脑内的细胞的形貌和小神经胶质细胞相关基因的表达。

评估了文献中报导的不同参数，这些参数是描述小神经胶质细胞形貌的有价值的标准(Verdonk et al.2016)。这些参数包括分支的总长度(Sum长度)；复杂性指数(CI)，定义为每个细胞的链段数量与其初级分支数量的比率，其中，链段是两个基点之间的进程长度；覆盖的环境面积(COA)，其定义细胞分支所覆盖的2D总表面并且描述为通过连接其进程的末端所形成的多边形的面积，以μm²表示。分析了来自在移植后45天牺牲的竞争性移植接受者小鼠皮层的脑组织切片上的CX3CR1^+/GFP细胞和野生型细胞。该分析手动进行，使用在Fiji程序上运行的宏，旨在使过程无偏(图4A、图4B)。在IV和ICV两种环境中，与Cherry野生型细胞相比，CX3CR1^+/GFP BFP细胞均具有更长的分支且它们的分支的复杂性更高，并且覆盖更大的面积(图4C至图4E)。为了排除由于两个报告基因的不同信号/表达所致的任何可能的偏倚，基于在野生型和CX3CR1^+/GFP细胞两者中的异体移植炎性因子1(Iba-1)表达来执行相同的分析。在全部所分析的参数中均未观察到差异，表明荧光标记物可用于对这些参数进行快速评估。总体上，这些数据表明CX3CR1^+/GFP具有比野生型更多的成熟形貌。

为了验证结果，通过计数以细胞体的质心为中心、半径逐渐增大的同心圆的交点数，执行Sholl分析(图4F)。通过对交点的总和与相交半径作图，可根据其复杂性将细胞的分布可视化。在IV和ICV两种环境中，CX3CR1^+/GFP细胞在图的(右上)象限铺陈和分布更广，表明与野生型细胞相比，其成熟表型更多(图4G、图4H)。

为了确定移植动物的脑中的野生型和CX3CR1单倍体不足的小神经胶质细胞样细胞是否在成熟期间差异性地表达基因，在小神经胶质细胞样细胞中评估了小神经胶质细胞签名基因以及与小神经胶质细胞成熟相关的转录因子(Butovsky et al.,2014)。根据来自牺牲时的竞争性移植小鼠的脑的BFP(单倍体不足的细胞)和Cherry(野生型细胞)表达，对这些细胞进行分选。从分选的细胞中提取RNA，并使用SuperScript VILO预混液和定制TaqMan PreAmp Pools(Thermo Fisher Scientific)生成并扩增cDNA。使用定制设计的基于TaqMan的微流控卡基因表达测定法(Applied Biosystems)执行基因表达分析。使用幼崽(出生后3天的新生动物)和年龄匹配的未治疗野生型小神经胶质细胞作为参考进行分析。出乎意料的是，对于所分析的表达水平更高的基因中的一些，与野生型细胞相比，在CX3CR1单倍体不足的细胞中观察到了类似于在分离自未治疗的野生型小鼠的成年小神经胶质细胞中观察到的结果。这些结果可以指出上述报导的关于CX3CR1单倍体不足的细胞更快成熟的结论。

实施例4：与单倍体不足的CX3CR1^+/GFP HSPC一样，CX3CR1^GFP/GFP HSPC具有优于WTHSPC的定量再群体化优势

为了更好地理解CX3CR1轴在移植后再群体化中的功能性作用，类似于采用单倍体不足的HSPC执行的那些誓言，使用CX3CR1纯合子缺陷细胞执行竞争性移植誓言。采用IV途径的细胞递送进行移植，这导致了单倍体不足的HSPC在脑中具有优势的更为引人注目的结果并且促进造血器官重构。

在独立的实验中，从八周龄CD45.2野生型或CD45.2 CX3CR1^GFP/GFP小鼠分离HSPC，用编码不同荧光标记物(分别为PGK.mCherry和PGK蓝色荧光蛋白(BFP))的慢病毒载体标记，并且以1:1的比率共移植到CD45.1白消安去骨髓的接受者中(图6A)。每只小鼠移植总计1.0x10⁶HSPC(0.5*10^6mCherry⁺HSPC+0.5*10^6BFP⁺CX3CR1^GFP/GFPHSPC，在竞争性移植的动物中)。还执行单一群体的mCherry⁺野生型HSPC或BFP+CX3CR1^GFP/GFP HSPC的移植作为对照。

在移植后，监测小鼠并且在单倍体不足环境中评估的相同短期时间点(45天)牺牲小鼠。在移植后30天，通过令小鼠流血收集外周血(PB)，并且在牺牲时在灌注后收集造血器官(BM、脾)和脑。总体上，造血器官中的供体细胞植入(％CD45.2)在野生型细胞与CX3CR1^GFP/GFP细胞之间是类似的，但在PB、BM和脾中观察到了CX3CR1^GFP/GFP细胞植入的轻微下降(图6B)。供体细胞群中的相对比例显示，在全部造血组织中，CX3CR1^GFP/GFP均具有优于野生型细胞的定量优势(图6D)。与将单倍体不足的CX3CR1+/GFP细胞在同一实验环境中与野生型细胞竞争移植相比，观察到的优势不那么引人注目。注意，仅移植野生型HSPC或仅移植CX3CR1^GFP/GFP HSPC的对照小鼠显示高频率的转导的细胞(mCherry₊：99,43+/-0,2；BFP₊：99,2+/-0,44)，证实了基于LV报告基因表达的分析的可靠性。在全部所分析的造血组织中，在淋巴系和髓系两个谱系中均观察到了CX3CR1^GFP/GFP与野生型细胞相比的优势。值得注意的是，移植CX3CR1^GFP/GFP或野生型HSPC或两种HSPC组合的动物在全部所分析的组织中显示了髓系和淋巴系群体的类似表现。

在脑内均观察到了良好的共体细胞植入，且在全部实验小组中观察到了一定程度的差异(图6C)。在竞争性移植的动物的脑内，在CD11b⁺造血供体细胞部分中，CX3CR1^GFP/GFP细胞比野生型细胞更具代表性(图6D)。这种竞争优势在脑内比在造血器官中观察到的更加显著。

这些数据证实，HSPC中CX3CR1表达的减少导致造血器官中的植入优势，并且在脑相关髓系群体中更加明显。这些数据也支持CX3CR1轴在髓系细胞在HSPC移植后重构的机制中的作用。

实施例5：在人类HSPC中的CX3CR1基因座处进行编辑

目前正在设计一种靶向的基因添加方法，将至少一种基因***到人类HSPC和它们的后裔中的CX3CR1基因座处，该至少一种基因将会在植入时在其小神经胶质细胞样后裔中被表达。该基因座处在靶向治疗基因添加后的单倍体不足也可能使编辑后的HSPC与野生型细胞相比具有再群体化和成熟优势。

测试了不同向导靶向并减少CD34⁺人类HSPC中的CX3CR1表达的特异性。通过分解(TIDE)分析跟踪INDEL，以评估单倍体不足、敲除和野生型细胞的分布，从而表征待注入的CD34⁺细胞群。编辑后的细胞通过流式细胞术检测CX3CR1的表达来表征，并检测其植入免疫缺陷小鼠接受者的中枢神经***内的能力。

其他实施方案

从前述说明书可知，可对本文所述的发明作出变化和修改以令其适应各种用途和条件。此类实施方案也处于所附权利要求书的范畴内。

本文中，对任何变量定义中一系列元件的描述包括该变量作为任何单一元件或作为所列元件的组合(或亚组合)的定义。对本文中实施方案的描述包括该实施方案作为任何单一实施方案或作为与任何其他实施方案或其部分的组合。

本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用并入本文，其并入程度与各独立的专利和出版物具体且独立地指明以待通过引用并入相同。

Claims

1.一种CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞，其包含编码治疗性多核苷酸或多肽的外源核酸分子。

2.根据权利要求1所述的CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞，其中，所述外源核酸分子在所述CX3CR1基因座处被***所述细胞的基因组内。

3.根据权利要求1或2所述的CX3CR1半合子或纯合子缺陷细胞，其中，所述治疗性多核苷酸或多肽为具有神经保护活性的。

4.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞。

5.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞以及用于将所述细胞给药至有其需要的受试者的指南。

6.一种试剂盒，其包含根据权利要求4所述的药物组合物。

7.一种在受试者中重构小神经胶质细胞的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求1至3中任一项所述的CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞。

8.一种在受试者中重构小神经胶质细胞的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求4所述的药物组合物。

9.一种在受试者中治疗代谢疾病或神经***疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求1至3中任一项所述的CX3CR1半合子及/或纯合子缺陷细胞。

10.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中，所述给药为脑室内给药。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中，所述给药为静脉内给药。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，进一步包括在给药所述药物组合物之前的去髓预处理。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，去髓预处理包括给药能够将内源小神经胶质细胞去髓的烷基化剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述烷基化剂为白消安。