CN110305201B - 植物抗逆相关基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明鉴定了一种与抗逆相关基因及其编码蛋白与应用。本发明提供了一种由SEQ ID NOs.1‑8所示的氨基酸序列组成的蛋白质和SEQ ID NOs.9‑16所示的DNA核苷酸序列；经实验证明，本发明提供的基因AGL16在抗逆性中起着重要的作用，负调控抗逆性，其缺失造成植物更耐盐、耐旱及耐渗透胁迫的表型。在不同植物如水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜等中敲除所述基因或其同源基因，可以培育出更耐盐、耐旱及耐渗透胁迫的新品种。

Description

植物抗逆相关基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种植物抗逆相关基因及其编码蛋白与应用。具体地，所述“抗逆”是指耐盐、耐旱及耐渗透胁迫。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为典型的科学研究的一种模式草本植物，它属于双子叶植物纲，十字花科，广泛分布于欧亚大陆和非洲西北部。拟南芥基因功能的研究可以为其他农作物的研究提供一个理论基础。

土壤的干旱和盐碱化问题日益威胁着人类生存有限的宝贵的土地资源。干旱是环境胁迫中影响植物生长最为严重的一个因素。据研究统计，世界干旱、半干旱地区占地球陆地总面积的33％，对其世界粮食产量的危害相当于其它自然灾害的总和。干旱胁迫由于缺少水分的供应，造成植物体内渗透势发生改变，引起细胞膜上的蛋白结构变化，体内代谢紊乱，同时会产生大量的活性氧毒害植物，严重影响植物的生长发育及产量。盐胁迫已成为全球范围内影响农业生产的重要环境影响因子。据调查资料结果显示，全球盐碱地的面积以每年1.0x106-1.5x106公顷的速度增长。当面临盐胁迫，细胞的质膜透性被改变，细胞膜的蛋白结构及活性失去稳定，同时植物体内积累大量的无机离子，造成对其它营养元素的吸收不平衡，严重破坏了细胞内正常的代谢，积累有毒的代谢产物，抑制其根系或组织生长，使植物不能正常的完成生命周期，严重影响产量和品质。因此，了解及解析其抗逆机制，对于提高植物的抗逆性，培育抗逆新品种是一项至关重要的科学任务。

发明内容

本发明的一个目的是鉴定参与拟南芥抗逆的相关基因及其编码蛋白，其缺失造成植物更抗逆的表型。

在本发明中，“抗逆的表型”是指植物在盐和渗透胁迫处理条件下，在种子萌发期间和对照相比具有更高的种子萌发率，幼苗根系生长表现为具有更长或者发达的根系，以及成苗生长阶段更耐盐和耐旱的功能。“抗逆基因”是指植物生长发育阶段具有更耐盐、耐旱及耐渗透胁迫功能的基因。在本领域中，“耐盐”通常是指植物生长过程中对盐害具有耐受的能力；“耐旱”通常是指植物生长过程中对干旱造成的水分缺失的适应和抵抗能力；“耐渗透胁迫”通常是指植物生长过程中对渗透胁迫引起的渗透式改变的耐受能力。在实验室中，通常用在培养基中添加NaCl来检验植物的耐盐性，例如，在培养基中添加终浓度为100-300mM的NaCl，并且，检验植物的耐渗透胁迫性通常通过在培养基中添加一定量的甘露醇来进行，例如，在培养基中添加终浓度为100-400mM的甘露醇。在培养基中同时添加一定量的NaCl和甘露醇可以同时检验植物的耐盐和耐渗透胁迫能力。同时可以通过土壤干旱实验检测植物的耐旱能力。例如，植株在22-24℃温度和16h光照及8h黑暗条件下正常生长四周左右，充分浇灌一次后进行干旱处理(不浇水)处理两周后，再复水(充分浇灌)，统计不同株系的存活率。本领域技术人员应该理解，不同的植物可能具有不同的耐盐、耐旱和耐渗透胁迫的能力，因此，在实验室模拟条件下，通常认为与在相同条件下生长的对照植株相比，如果测试植株比对照生长得好，存活率高，则认为测试植株具有相应的耐受能力。

在第一方面，本发明鉴定的一种抗逆基因为ATAGL16，其来自拟南芥，其核苷酸序列选自如下：

(1)编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.9所示的DNA序列；

(3)在高严谨条件下可与序列表中1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述严格条件为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

SEQ ID NO.9所示的DNA序列由723个核苷酸组成。

在第二方面，本发明涉及抗逆基因ATAGL16编码的蛋白，所述ATAGL16蛋白是如下(a)或(b)或(c)的蛋白：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和缺失和/或添加且具有与SEQ ID NO.1所示的蛋白相同活性的衍生的蛋白质；

(c)其它基因编码的与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有SEQ ID NO.1所示的蛋白的活性的蛋白；

SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由240个氨基酸残基组成。

利用NCBI网站BLAST工具，通过与拟南芥AGL16氨基酸序列(SEQ ID NO.1)比对发现水稻、玉米、烟草、小麦、棉花、大豆、油菜中与拟南芥AGL16氨基酸序列(SEQ ID NO.1)同源的蛋白(如SEQ ID NOs.2-8所示)，推测它们也具有与拟南芥AGL16氨基酸序列(SEQ IDNO.1)相似的功能。并且，本发明人在实施例中验证了水稻中的同源序列(SEQ ID NO.2)具有与拟南芥AGL16氨基酸序列(SEQ ID NO.1)相似的功能。因此，与拟南芥AGL16氨基酸序列(SEQ ID NO.1)同源的蛋白序列及其编码核苷酸序列也在本发明的范围内。可以将与拟南芥AGL16氨基酸序列(SEQ ID NO.1)同源且具有相似功能活性的蛋白统称为AGL16蛋白，将编码其的核苷酸序列统称为AGL16基因。

在一个实施方案中，编码SEQ ID NOs.2-8所示的AGL16蛋白的AGL16基因分别如SEQ ID NOs.9-16所示。

表1.来自拟南芥的抗逆基因AGL16基因及其同源基因

在第三方面，本发明涉及用于AGL16任一片段扩增的引物，包含AGL16基因的表达盒或重组植物表达载体、AGL16转基因细胞系、包含AGL16基因的宿主菌。其中所述宿主菌可为真核菌类或原核菌类，例如，但不限于，农杆菌、酵母菌、大肠杆菌等。

在第四方面，本发明涉及抗逆基因AGL16在培育具有抗逆性的植株中的应用。本发明人发现，在植株中缺失AGL16基因能够提高植物的耐盐、耐旱及耐渗透胁迫的能力。

本领域技术人员应该理解，缺失ATAGL16基因的植株可以通过基因敲除(knock-out)技术获得。

在第五方面，本发明涉及一种培育具有抗逆性的植物品种的方法，敲除植物中的AGL16基因或其同源性较高的基因，获得具有抗逆性的转基因株系，其中所述“抗逆性”是指耐盐、耐旱及耐渗透胁迫的能力。具体地，所述方法包括下述步骤：

(1)选择编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列或目标植物中与SEQID NO.1所示的氨基酸序列比对相似度最高的基因作为同源基因，将所述核苷酸序列或同源基因的片段构建到基因敲除载体中；

(2)用步骤(1)中构建好的基因敲除载体转化目标植物的细胞或组织，获得转基因植株；

(3)将获得的转基因植株进行抗性筛选及转录水平上表达量的鉴定，确定目的基因已被敲除，从而获得转基因敲除株系；

所得到的转基因敲除株系在用150mM NaCl和250mM甘露醇处理的培养基上具有更高的种子萌发率和更发达的根系，具有良好的耐盐和耐渗透胁迫能力。同时，在土壤实验中，用含有250mM NaCl的盐水浇灌和干旱处理(不浇水)两周后，存活率高，具有耐盐和耐旱的功能。

例如，如果要培育具有耐盐、耐旱和耐渗透胁迫能力的水稻品种，则可以用编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列构建基因敲除载体，转化水稻的细胞或组织，获得转基因水稻植株，将获得的转基因水稻植株进行抗性筛选及转录水平上表达量的鉴定，确定目的基因已被敲除，从而获得转基因敲除株系，所得到的转基因敲除株系在用150mM NaCl和250mM甘露醇处理的培养基上具有更高的种子萌发率和更发达的根系，具有良好的耐盐和耐渗透胁迫能力，同时，用盐水浇灌和干旱处理，存活率高，具有抗盐和抗旱的能力。由此得到具有耐盐、耐旱和耐渗透胁迫性的水稻品种。对于其他物种的培育，方法与此类似，选择目标物种中与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列比对相似度最高的基因作为同源基因，将所述核苷酸序列或同源基因的片段构建到基因敲除载体中，转化目标物种的细胞或组织获得转基因敲除的植株，进一步验证所得的转基因敲除植株具有抗渗透胁迫性。

在一个优选的实施方案中，所述培育耐盐、耐旱和耐渗透胁迫的植物的方法包括下述步骤：(1)选择目标植物中和SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列比对相似度最高的基因作为同源基因，将同源基因的片段构建到基因敲除载体中，如CRISPR/Cas9载体；

(2)将步骤(1)中构建好的基因敲除载体通过农杆菌介导的遗传转化、植物病毒载体***转化、直接外源DNA转化(电导、基因枪)等常规方法进行不同植物细胞或组织的转化，获得转基因植株；

(3)将获得的转基因植株进行抗性筛选及转录水平上表达量的鉴定，已确定该基因被敲除，不具备功能，从而获得转基因敲除株系；

(4)将获得的转基因敲除株系的种子和对照材料的种子进行无菌清洗后，铺于含有150mM NaCl和250mM甘露醇的培养基上，比较和对照的种子萌发率；

(5)将获得的转基因敲除株系的种子和对照材料的种子进行无菌清洗后，铺于正常的培养基中，待生长4天后转移至含有150mM NaCl和250mM甘露醇的培养基上，或者直接铺于含有150mM NaCl和250mM甘露醇的培养基中，统计地下部分根系的长度和地上部分叶子的大小；

(6)将获得的转基因敲除株系和对照材料的成苗在土壤中进行盐水浇灌或干旱处理，统计植株的存活率，存活率更高的株系作为耐盐和耐旱的植株；

(7)将在含有150mM NaCl和250mM甘露醇处理的培养基上种子萌发率更高、根系更发达，地上部分更壮的株系作为耐盐和耐渗透胁迫的植株。

适用于所述方法的植物包括，但不限于拟南芥、烟草、水稻、小麦、玉米、棉花、油菜或大豆等，优选拟南芥和水稻。

含有本发明AGL16的植物表达载体可通过使用农杆菌介导的遗传转化、植物病毒载体***转化、直接外源DNA转化(电导、基因枪)等常规方法进行不同植物细胞或组织的转化。其中双子叶植物(拟南芥、棉花、油菜、大豆等)和单子叶植物(小麦、水稻、玉米等)都可以作为被转化的宿主。

在本发明实施的一个方案中，所述抗逆拟南芥突变体为Salk_104701，在本发明中命名为agl16缺失突变体；所述目标植物为野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

所述的植物抗逆的功能是指在甘露醇(mannitol)模拟渗透胁迫和盐(NaCl)处理的条件下具有更高的种子萌发率和更发达的根系。同时，在土壤实验中，用含有250mM NaCl的盐水浇灌和干旱处理(不浇水)两周后，植株具有更高的存活率。

我们从拟南芥种子库ABRC获得了一个T-DNA捅入AT3G57230基因外显子上的缺失突变体Salk_104701。从TAIR网站查询到，该拟南芥基因命名为ATAGL16，后期实验中将Salk_104701实验材料命名为agl16缺失突变体。同时，构建了35S启动子驱动AGL16基因表达的过表达株系OX。以拟南芥野生型Col-0作为对照，实施种子萌发实验和根系表型实验，统计种子的萌发率、子叶转绿的比例和主根长。结果发现，AGL16是一个负调控抗逆的转录因子。为了进一步验证ATAGL16的功能，我们进行了地上部分的土壤盐处理和干旱实验、统计其不同株系的存活率、气孔密度和气孔导度，结果中agl16缺失突变体相对于野生型表现为更抗逆，OX过表达株系出现更不耐的表型，这些结果都证明了ATAGL16基因在抗逆中起着极为重要的作用，是抗逆的负调控因子，其缺失造成植物更抗逆的表型。

为了培育其他抗逆品种，我们获得了水稻敲除了与拟南芥ATAGL16同源的基因的纯合株系，对其进行了功能分析。结果表明，在盐胁迫和渗透胁迫处理条件下，水稻的AGL16功能缺失株系具有更发达的根系和更壮的地上部分，明显具有抗逆的功能。这一结果更加证明了敲除植物中与拟南芥ATAGL16同源的基因可以培育新的抗逆品种。

综上所述，本发明提供下述：

1.一种植物抗逆性相关的蛋白，其选自下述：

(a)由SEQ ID NOs.1-8所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(b)将SEQ ID NOs.1-8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和缺失和/或添加且具有与SEQ ID NOs.1-8相同活性的衍生的蛋白质；或

(c)其它基因编码的与SEQ ID NOs.1-8所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上的蛋白；

其中所述抗逆性是指耐盐、耐旱和耐渗透胁迫的特性。

2.编码第1项所述的蛋白的基因。

3.如第2项所述基因，其中所述基因是以下任意一种：

(1)SEQ ID NO.9-16所示的DNA序列；或

(2)在高严谨条件下可与SEQ ID NO.9-16所示的DNA序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

4.含有第2或3项所述的基因的植物重组载体或表达盒。

5.包含第2或3项所述的基因或第4项所述的植物重组载体或表达盒的宿主细胞，其中所述宿主细胞为微生物细胞，优选为农杆菌细胞或大肠杆菌细胞。

6.第1项所述的蛋白、第2或3项所述的基因、第4项所述的重组载体或表达盒或第5项所述的宿主细胞在培育耐盐、耐旱和耐渗透胁迫的植物中的应用。

7.一种培育耐盐、耐旱和耐渗透胁迫的植物的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)选择编码SEQ ID NOs.1-8所示的氨基酸序列的核苷酸序列或目标植物中与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列比对相似度最高的基因作为同源基因，将所述核苷酸序列或同源基因的片段构建到基因敲除载体中；

(2)用步骤(1)中构建好的基因敲除载体转化目标植物的细胞或组织，获得转基因植株；

(3)将获得的转基因植株进行抗性筛选及转录水平上表达量的鉴定，确定目的基因已被敲除，从而获得转基因敲除株系；

所得到的转基因敲除株系在用150mM NaCl和250mM甘露醇处理的培养基上具有更高的种子萌发率和更发达的根系，具有良好的耐盐和耐渗透胁迫能力，在土壤实验中，用含有250mM NaCl的盐水浇灌和干旱处理(不浇水)两周后，植株存活率高，具有耐盐和耐旱的功能。

8.第7项所述的方法，其中步骤(1)中所用的基因敲除载体为CRISPR/Cas9载体。

9.第7项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.第8项所述的方法，其中所述植物选自拟南芥、烟草、水稻、小麦、玉米、棉花、油菜或大豆。

11.第10项所述的方法，其中所述植物为拟南芥或水稻。

附图说明

图1.(A)Salk_104701的***位点示意图；

(B)Salk_104701的基因组和RNA水平上鉴定；

(C)确定Salk_104701为缺失纯合突变体。

图2.(A)过表达株系AGL16-CDS目的片段扩增；

(B)通过Gateway***，将AGL16-CDS目的片段构建到最终载体pCB2004的酶切鉴定图，箭头指示酶切阳性片段；

(C)构建正确的命名为pCB2004-AGL16的最终载体的图谱示意图；

(D)过表达株系AT3G57230基因在RNA水平的表达鉴定。

图3.(A)agl16，OX和Co1-0种子在正常的MS培养基(配制方法见实施例3)、含有120mM NaCl、150mM NaCl、250mM甘露醇的MS培养基上的萌发情况；

(B)不同处理条件下不同株系种子萌发率的统计结果；

(C)不同处理条件下不同株系子叶转绿率的统计结果。

图4.(A)拟南芥agl16缺失突变体、AGL16过表达株系(OX)和野生型拟南芥Col-0幼苗在正常的MS培养基、含有120mM NaCl、150mMNaCl、250mM甘露醇的MS培养基上的根系生长情况；

(B)不同处理条件下不同株系幼苗主根长短的统计结果。

图5.(A)拟南芥agl16缺失突变体、AGL16过表达株系(OX)和野生型拟南芥Col-0材料在正常土壤中和用250mM NaCl盐水浇灌的实验；

(B)不同株系盐水浇灌实验的存活率统计；

(C)不同株系土壤干旱处理；

(D)不同株系土壤干旱实验中苗的存活率统计；

(E)不同株系叶片离体失水率的统计；

(F)不同株系叶片气孔密度的统计；

(G)不同浓度的脱落酸(ABA)处理后气孔孔径的统计结果。

图6.(A)AGL16-pro目的片段扩增；

(B)AGL16pro：：GUS载体构建(pCB308R)酶切图，箭头指示酶切阳性片段；

(C)构建正确的命名为pCB308R-AGL16的最终载体的图谱示意图；

(D)-(O)拟南芥AGL16基因的不同时期组织表达。

图7.(A)AGL16-GFP目的片段扩增；

(B)pGWB5-AGL16载体构建(pGWB5)酶切图，箭头指示酶切阳性片段；

(C)构建正确的命名为pGWB5-AGL16的最终载体的图谱示意图；

(D)获得的pGWB5-AGL16的转基因材料，通过激光共聚焦观察，拟南芥AGL16蛋白定位于细胞核。

图8.(A)野生型(WT)水稻和功能缺失突变体Osagll6材料的在盐和甘露醇处理条件下的表型分析；

(B)-(D)野生型(WT)水稻和功能缺失突变体Osagl16材料的在正常条件(MS培养基)、盐(含100mM NaCl的MS培养基)和甘露醇(含200mM甘露醇的MS培养基)处理条件下的根长统计图。

具体实施方式

以下通过实施例具体说明本发明的技术方案。然而，这些实施例仅用于举例说明的目的，并不意味着本发明的范围限于此。

下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1拟南芥agl16缺失突变体在DNA和RNA水平上的鉴定

首先，从拟南芥种子库ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center，TheOhio State University Rightmire Hall 1060Carmack Road，Columbus，OH 43210 USA)获得了一个T-DNA***AT3G57230基因靠近终止密码子的外显子上的缺失突变体Salk_104701(图1A)。取幼苗或成体苗进行植物DNA的抽提，获得基因组模板，使用引物LP和RP经过PCR扩增，完成基因组水平鉴定，获得纯合体株系(图1B)。后又经过RNA的抽提，获得纯化后RNA，然后进行反转录获得cDNA模板，使用引物P1和P2，以Ubiqutin5基因作为内参，经过qRT-PCR检测，结果发现agl16的所有株系中AT3G57230基因均几乎不表达，即agl16 5个株系均为功能缺失纯合体株系(图1C)。

基因组(DNA)的提取方法：(1)称取大约50-100mg的新鲜拟南芥组织材料放入研钵中，向其中加入420uL的DNA抽提缓冲液将材料磨碎。研磨完成后，向研钵中再加入5ul10mg/mL的RNA酶，迅速将研钵中的液体转移至1.5mL的EP管中，来回颠倒混匀，放置65℃水浴锅，温浴10-15分钟，每隔3分钟取出颠倒混匀使其充分反应。(2)65℃水浴锅取出样品，向EP管中加入等体积的酚和氯仿去除多余的蛋白。(3)12000rpm转速高速离心10分钟，然后取300uL上清转移至新的1.5mLEP管，再向管里分别加入0.7倍体积的异丙醇和0.1倍体积3M的醋酸钠，促进DNA沉淀。(4)以12000rpm转速高速离心10分钟，弃上清，然后加入1mL70％酒精清洗DNA沉淀两遍。(5)室温下晾干沉淀，向管里加入20uL ddH₂O溶解DNA沉淀，作为基因组模板。

PCR引物如下：

上游引物(LR)：5’-CCATGCATTTTCGGTTTTATG-3’

下游引物(RP)：5’-CTCTTCTTTTGCCTTTTGCAG-3’

20uL PCR扩增体系如下：(其中2x Taq Master mix酶购自南京诺唯赞生物技术有限公司)

2x Taq Master mix酶	10uL
		20uM LP	0.5uL
20uM RP	0.5uL
		DNA模板	0.5uL
ddH<sub>2</sub>O	8.5uL

PCR程序为：首先95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，退火温度56℃，72℃条件下延伸时间30秒，循环数设置为40，最后保持72℃充分延伸10分钟，完成后保存于25℃。

RNA的提取方法：(1)称取大约50-100mg的新鲜拟南芥组织材料放入研钵中，然后加入适量液氮将材料研磨至粉末，迅速加入1mL的TRIZOL试剂(北京全式金生物技术有限公司)，待融化后，继续低温下研磨多次，然后将磨碎的组织液转移到1.5mL的无菌EP管里。(2)向管中加入10uL的β-巯基乙醇帮助去除组织液中的蛋白，室温静置5分钟，充分反应。(3)充分反应后，向管中加入200uL的氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温静置3-5分钟后，以12000rpm的转速4℃条件下离心10-15分钟。(4)吸取大约250uL的上清转移至新的1.5mL的EP管，加入等体积的异丙醇混匀后，室温放置10分钟，12000rpm转速4℃条件下离心10分钟。(5)去除上清，向管中加入1mL 75％的冰酒精清洗RNA一至两遍。(6)12000rpm转速在4℃条件下离心5分钟，弃上清，晾干RNA，加入20uL的DEPC处理过的去离子水。

RNA的反转录：取适量的RNA模板进行反转录形成cDNA，用于荧光定量PCR检测。使用的是TaKaRa(Prime Script RT reagent Kit)反转录试剂盒。反转录体系如下(20uL)：

将配制好的反转录体系，放至37℃水浴锅温浴2小时，完成反转录后，反应后的cDNA作为荧光定量PCR(qRT-PCR)的模板。

qRT-PCR引物如下：

上游引物(P1)：5’-GACCTCCACAAGAAAGTAAACC-3’

下游引物(P2)：5’-GCAATGAAGGAAAAATAGTTGAGT-3’

Ubiqutin5基因引物序列为：

上游引物LP：5’-AGAAGATCAAGCACAAGCAT-3’，

下游引物RP：5’-CAGATCAAGCTTCAACTCCT-3’。

荧光实时定量PCR使用的SYBR green试剂来自TaKaRa公司，通过荧光实时定量PCR仪器(StepOne real-time PCR system)检测ATAGL16基因在转录水平的表达量。如下(20uL体系)：

SYBR green	10uL
		20uM P1	0.5uL
20uM P2	0.5uL
		模板	0.5uL
ddH2O	9.5uL

荧光实时定量PCR的扩增条件：95℃预变性20秒，95℃变性10秒，60℃退火和延伸30秒，40个循环数。

实施例2拟南芥AGL16过表达株系OX的获得

首先设计带有全接头(attB)连接的AGL16编码区(CDS)引物LP和RP，通过PCR获得目的片段(图2A)，并将其进行胶回收。采用高通量构建载体的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆***：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将回收的AGL16-CDS目的片段，利用Gateway^R BP Clonase^TM IIEnzyme Mix试剂盒(Invitrogen)将AGL16-CDS重组克隆到pDONR207的穿梭载体(购自Invitrogen)中，再次通过Gateway^TM克隆技术将中间穿梭载体重组克隆到pCB2004终载体(Xiang et al.，1999；Lei et al.，2007)的attR1和attR2之间，通过酶切鉴定获得正确的pCB2004-AGL16终载体(图2B和C)。再经测序确定终载体无突变后，将构建成功正确的pCB2004-AGL16载体电转入农杆菌C58C1感受态中，通过浸花转化，获得转基因种子。将收到的T0代种子铺到含50mg/L除草剂(glufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)的MS培养基(配制方法见下述实施例3)上筛选转入AtAGL16基因的阳性株系。将抗除草剂的T1阳性苗种在土壤中生长至成熟，然后单株收种。再将T1代种子铺到含除草剂的MS培养基上，选取分离出的阳性苗继续种下去单株收种，获得T2代种子。取在含有除草剂MS培养基上全萌的纯合株系进行RNA的抽提。RNA的抽提、反转录以及qRT-PCR的具体操作如实施例1，qRT-PCR中AtAGL16基因的上游引物(P1)、下游引物(P2)和内参基因的引物皆与实施例1中一致。结果表明，通过qRT-PCR鉴定各株系中AtAGL16基因的表达量，我们获得了多个过表达纯合体株系OX(图2D)。

实验植物载体构建过程中，目的片段扩增使用的KOD FX酶(购自TOYOBO)的扩增体系，如下(50uL体系)：

2x KOD缓冲液	25uL
		2.5mM dNTP	5uL
20uM P1	1uL
		20uM P2	1uL
KOD FX	1uL
		模板	1uL
ddH2O	16uL

PCR引物如下：

上游引物(LP)(小写字母表示attB1接头)：

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctATGGGAAGGGGCAAGATCGC-3’

下游引物(RP)(小写字母表示attB2接头)：

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtTTATGCAATGAAGGAAAAATAG-3’

使用KOD FX酶的PCR扩增条件：首先98℃预变性3分钟，98℃变性10秒，退火温度60℃，68℃条件下延伸30秒，循环数设置为40，最后保持68℃充分延伸10分钟，完成后保存于25℃。

实施例3拟南芥种子萌发实验

首先，将agl16(即购自拟南芥种子库ABRC的Salk_104701突变体，为缺失agl16的纯合突变体)、OX(实施例2构建的过表达AGL16的纯合体株系)、Col-0(即野生型拟南芥，作为实验对照材料)种子分装到2mL的EP管中，保证少量多管，向管内加入1mL的10％Bleach(即100mL Bleach由10mL蓝月亮84消毒液和90mL纯水组成)，置于摇床230rpm的转速清洗15分钟，然后在超净工作台用灭菌后的纯水再次清洗4遍，完成后，放于4℃黑暗条件下春化两天。选取春化后饱满的种子点在分别添加有0mM、120mM NaCl、150mM NaCl、250mM甘露醇的MS培养基中，该操作过程在超净工作台完成。点种子完成后，将皿置于22-24℃温度和16h光照及8h黑暗条件的培养间观察培养。从点种子后的第二天开始计算，以种子的胚根伸出定义为萌发，统计一周内每一天的种子萌发率和子叶转绿的数目。

结果发现4个株系在MS培养皿上的萌发率及子叶变绿的数目大致没有差异。然而当在含有不同浓度的盐和甘露醇培养基中，agl16缺失突变体的种子萌发率和子叶变绿的比例显著高于野生型，同时两个OX过表达株系相对于野生型的萌发率和子叶变绿的数目明显较低(图3A，B，C)。这一结果说明了AyAGL16基因在渗透胁迫中发挥着非常重要的功能，一旦该基因缺失，植物对外界的渗透胁迫表现为具有更耐的功能；如果该基因过表达，植物则对渗透胁迫表现为更敏感，不利于植物的萌发和生长。

MS培养基配方如下(1L)：

10x大量元素(MS_max)配方如下(1L)：

NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>	16.5g
		KNO<sub>3</sub>	19g
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	4.40g
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	3.7g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.7g
		水	补足至1L

100x微量元素(MS_min)配方如下(1L)：

KI	0.083g
		H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	0.62g
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O	2.23g
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.86g
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.025g
		CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.0025g
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.0025g
		水	补足至1L

100x铁盐配方如下(1L)：

FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.78g
		Na<sub>2</sub>-EDTA·2H<sub>2</sub>O	3.73g
水	补足至1L

实施例4拟南芥根系表型分析

首先，如同实施例3的步骤清洗agl16、OX、Col-0种子15分钟后，放于4℃黑暗条件下春化两天。完成春化后，我们先将种子铺在MS培养基皿上，经过4天的生长，然后选择子叶和根长一致的不同株系幼苗将其转移到分别含有不同浓度0mM、120mM NaCl、150mM NaCl和250mM甘露醇的MS培养基皿上，保证每个处理的皿上4个株系的幼苗数量相同。从移苗的当天开始，每天观察并统计不同材料的主根长，持续统计一周。

结果发现，4个株系在正常的MS培养皿上的主根长和地上部分子叶长势一致，没有明显差异。然而在含有不同浓度的盐(NaCl)和甘露醇的处理培养皿中，agl16缺失突变体的主根明显长于野生型，而两个OX过表达株系的主根相对短于野生型，地上部分也有相同的趋势(图4A，B)。这一结果说明了AtAGL16基因在盐胁迫和渗透胁迫中对于根系的生长发挥着重要的作用。一旦该基因缺失，幼苗的主根具有更耐盐和耐渗透胁迫的功能；如果该基因过表达，幼苗的主根则对盐胁迫和渗透胁迫表现为更敏感，抑制主根的伸长。这一结果更加验证了实施例3中的结果，说明AtAGL16基因在盐胁迫和渗透胁迫中起着负调控的作用。

实施例5土壤盐处理以及干旱处理拟南芥地上部分的表型分析

实施例2和3的结果充分证明了拟南芥AtAGL16基因在种子萌发及幼苗生长阶段对渗透胁迫有着负调控的功能，在此基础上，我们继续探索了在成苗时期，AtAGL16基因是否也同样发挥着重要的功能。首先，我们将agl16、OX和Col-0种子清洗春化后，铺到MS培养基中，待生长到7天后，选择幼苗状态一致且较好的移至土壤中，尽量保证每一小盆土松弛度一致、每小盆幼苗数量相同，保持22-24℃温度和16h光照及8h黑暗条件下生长。当生长到4周左右并且苗尚还未抽苔，拍照记录正常生长条件下苗的生长状态，然后用250mM NaCl盐水浇灌，保证每一小盆自然充分吸收盐水，然后观察不同株系地上部分叶片的变化(图5A)，把叶子大部分发白的成体苗定义为死亡。当盐水处理两周后，统计4个株系材料的存活率并对其进行拍照记录(图5B)，结果表明agl16缺失突变体叶片发黄变白直至死亡的数目远低于野生型株系，而同时两个过表达株系死亡数目远高于对照。这一结果验证了agl16缺失突变体有耐盐的功能。

土壤干旱实验中，前期的材料准备和盐水浇灌实验相同，待幼苗生长到第四周左右，用水浇灌一次，使每小盆充分吸水，拍照记录正常生长条件下苗的生长状态。排除其他干扰因素，后进行干旱处理，观察不同株系地上部分叶片的变化。待干旱处理15天后，不同株系地上部分之间出现明显的表型并拍照记录。再充分浇灌水，使其成体苗复水，统计4个株系材料的存活率并拍照记录(图5C，D)。复水后发现agll6缺失突变体株系的存活率远高于野生型，而同时两个过表达株系的存活率低于对照。同时开展了叶片离体失水实验，尽量保证取不同株系相同位置的大小接近的叶片，放置于温湿度稳定的环境，前期每隔15分钟分别称取叶片的重量，后期可以减缓频率。其统计结果表明，在失水3小时以后，agl16缺失突变体的叶片失水率显著低于野生型，过表达OX 17-5株系失水率显著高于野生型，而过表达OX 24-15株系略低于OX 17-5株系，但高于对照，均差异显著(图5E)。这一结果进一步验证了agl16缺失突变体有抗旱的功能。

植物抗旱的机理与气孔的密度和气孔的导度直接相关。取土壤中种植的四周大、未抽苔的agl16，OX和Col-0成体苗叶片若干，撕下下表皮，制片，置于显微镜下，选取相同的部位观察统计气孔数目。图5F的结果表明agl16缺失突变体的气孔密度显著低于对照，过表达OX 17-5株系的气孔密度显著高于对照。同时开展了气孔对脱落酸(ABA，购自Sigma)的反应灵敏程度实验，首先用气孔开放缓冲液处理叶片4-8小时，使气孔充分打开，然后添加0、5、20uMABA继续处理叶片，反应2小时后统计气孔开放的孔径。当0uM ABA处理时，四个株系的气孔孔径无差异，然而当用5、20uM ABA处理时，agl16缺失突变体的气孔孔径大小显著小于野生型，而过表达OX 24-15株系的气孔孔径显著大于野生型(图5G)。agl16缺失突变体的气孔密度较少，气孔孔径较小更能保存更多的水分，防止更多的水分蒸发，所以更抗旱。

图5中的所有结果更有力的验证了AtAGL16基因在抗逆中起着负调控的作用。

气孔开放缓冲液配方如下：(1L)PH调至6.15

KCl	3.726g
		K<sup>+</sup>-MES	1.952g
CaCl<sub>2</sub>	0.0012g
		水	补足至1L

即，所述气孔开放缓冲液包含50mM KCl、10mM K⁺-MES和10uM CaCl₂，pH 6.15。

ABA处理缓冲液配方：(1L)PH调至5.6

KCl	0.746g
		K<sup>+</sup>-MES	0.976g
CaCl<sub>2</sub>	0.006g
		水	补足至1L

即，所述ABA处理缓冲液包含10mM KCl、5mM K⁺-MES和50uM CaCl₂，pH 5.6。

实施例6拟南芥AGL16基因的不同时期组织表达

首先选取AGL16启动子区域1500-2000bp处设计引物，上游引物LP前端带attB1接头，下游引物RP前端带attB2接头，采用实施例2中的KOD酶PCR扩增***，获得大小为1700bp的目的片段(AGL16-pro)(图6A)，并将其进行胶回收。利用Gateway^R BP Clonase^TM IIEnzyme Mix试剂盒(Invitrogen)将AGL16-pro通过42℃热激转化重组克隆到pDONR207的穿梭载体(购自Invitrogen)中，再次通过Gateway^TM克隆技术将中间穿梭载体重组克隆到pCB308R终载体(Xiang et al.，1999；Lei et al.，2007)的attR1和attR2之间，通过酶切鉴定获得正确的pCB308R-AGL16终载体(图6B，C)。再经测序确定终载体无突变。将构建成功的pCB308R-AGL16载体电转入农杆菌C58C1感受态中，通过浸花转化，获得转基因种子。将收到的T0代种子铺到含50mg/L除草剂的MS培养基上筛选出含有抗性的融合GUS基因的报告株系。将抗除草剂的T1阳性苗种在土壤中生长至成熟，然后单株收种。再将T1代种子铺到含除草剂的MS培养基上，选取分离出的阳性苗继续种下去单株收种获得T2代种子。取在含有除草剂MS培养基上全萌的纯合体株系进行后续的GUS染色，观察拟南芥在种子萌发，幼苗以及成苗不同时期的时空表达情况。通过GUS染色的结果显示，在种子萌发阶段的胚根伸出能着色(图6D，E)；在幼苗两片、四片、六片、八片叶子时期，主要在根的主根尖和中柱和及叶片都有表达(图6F-I，M，N)；在成苗时期，在莲台叶、茎生叶，花、果夹和气孔都有一定的表达(图6J-L，O)。

PCR引物如下：

上游引物(LR)(小写字母表示attB1接头)：

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctAACTATGAACTTGGTAGCTCTTG-3’

下游引物(RP)(小写字母表示attB2接头)：

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt TTCTGCTTCTATCACTTTTACAC-3’

GUS染液的配制成分(100mL)：

X-Gluc	0.05g
		N-N-二甲基甲酰胺	1mL
0.1M磷酸缓冲液(PH＝7.0)	78mL
		5mM铁***	10mL
5mM亚铁***	10mL
		1％Triton-X 100	100uL
水	补足为100mL

GUS染色步骤：首先将融合GUS基因的纯合体报告株系种子，经过表面消毒清洗，铺到MS皿上。取种子萌发时期，幼苗两片、四片、六片、八片叶子和成苗浸泡于GUS染液中，置于37℃培养箱黑暗处理，时刻观察材料的染色结果，防止染液变蓝时间染过，及时终止染色。当终止染色后，需要逐级脱色，倒掉染液(若染液未变蓝可回收下次使用)，用清水洗一遍，然后向管中加入30％酒精，脱色30分钟后，再换成70％酒精，脱色30分钟，最后换成100％酒精继续脱色直到将叶片颜色洗脱干净。脱色完成后需逐级复水，和脱水步骤相反，先用70％酒精，浸泡30分钟，再使用30％酒精，浸泡30分钟，最后置于水中观察以及拍照，长期保存需置于30％酒精中。

实施例7拟南芥AGL16蛋白的亚细胞定位

首先设计带有全接头(attB)连接的AGL16编码区且不含终止密码子的引物LP和RP，采用实施例2中的KOD酶PCR扩增***，获得大小为750bp左右的AGL16-GFP目的片段(图7A)，并将其进行胶回收。利用Gateway^R BP Clonase^TM II Enzyme Mix试剂盒(购自Invitrogen)将AGL16-GFP通过42℃热激转化重组克隆到pDONR207的穿梭载体中，再次通过Gateway^TM克隆技术将中间穿梭载体重组克隆到35S启动子驱动的pGWB5终载体的attR1和attR2之间，通过酶切鉴定获得正确的pGWB5-AGL16载体(图7B，C)。再经测序确定终载体无突变。再将构建成功的pGWB5-AGL16载体电转入农杆菌C58C1感受态中，通过浸花转化，获得转基因种子。将收到的T0代种子铺到含50mg/L卡那霉素(购于北京索莱宝科技有限公司)的MS培养基上筛选出含有抗性的融合GFP基因的报告株系。将抗卡那霉素的T1阳性苗种在土壤中生长至成熟，然后单株收种。再将T1代种子铺到含卡那霉素的MS培养基上，选取分离出的阳性苗继续种下去单株收种获得T2代种子。取在含有卡那霉素的MS培养基上全萌的纯合体株系在OLYMPUSIX-710激光共聚焦显微镜下进行根部荧光观察，设置激发波长为488nm，发射波长为510nm，结果如图7D所示，可以看出AGL16绿色荧光蛋白定位在细胞核中，说明AGL16蛋白是一个核定位的转录因子。

PCR引物如下：

上游引物(LR)(小写字母表示attB1接头)：

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctATGGGAAGGGGCAAGATCG-3’

下游引物(RP)(小写字母表示attB2接头)：

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtGCTGCAATGAAGGAAAAATAG-3’

实施例8水稻Osagl16功能缺失突变体在盐和甘露醇处理下的表型分析

首先，委托杭州百格生物技术有限公司(地址：浙江省杭州市滨江区天和高科技产业园C幢2楼)用CRISPR/Cas9的敲除技术敲除水稻中的拟南芥AGL16的同源基因，获得多个水稻Osagl16功能缺失突变体株系。将Osagl16功能缺失突变体株系Osagl16-1、Osagl16-2、Osagl16-4和WT(野生型中花11)水稻种子(需去掉外皮)分装到2mL的EP管中，保证少量多管，先向管内加入1.5mL的75％酒精(即100mL 75％的酒精由75mL无水酒精和25mL纯水组成)清洗1分钟后用无菌水清洗3遍，再用10％Bleach(即100mL 10％Bleach由10mL蓝月亮84消毒液和90mL纯水组成)，置于摇床230rpm的转速清洗30分钟，然后在超净工作台用灭菌后的纯水再次清洗5遍，即完成。选取饱满的水稻种子点在分别添加有0mM、100mM NaCl、200mM甘露醇的MS培养瓶中(MS配方如同实施例3)，该操作过程在超净工作台完成。完成后，将培养瓶置于16-26℃温度和16h光照及8h黑暗条件的培养间观察培养。从点种子后的当天开始计算，两周后，拍照记录并统计不同株系的主根长和地上部分高度。从图8A结果来看，在正常条件下，WT和Osagl16的3个功能缺失突变体株系地上地下部分无明显的差异；当在100mMNaCl处理的条件下，Osagl16的3个株系的根系和地上部分比WT更发达；当在200mM甘露醇处理的条件下，Osagl16的3个株系具有更发达的根系，但是它们的地上部分均受到抑制，只有Osagl16-4的地上部分比WT更壮。同时统计了各个处理条件下的主根长度，结果表明，在正常条件下各个株系之间无显著差异；当在100mM NaCl处理的条件下，Osagl16-1和Osagl16-2的主根长度显著长于WT；同时甘露醇处理时，3个Osagl16株系都长于对照WT(图8B)。这些结果都进一步验证了Osagl16材料有耐盐和耐甘露醇模拟的渗透胁迫的功能。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (8)

1.一种包含编码如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的蛋白的基因的基因敲除载体或基因敲除表达盒在培育耐盐、耐旱及耐渗透胁迫的拟南芥中的应用。

2.一种包含编码如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白的基因的基因敲除载体或基因敲除表达盒在培育耐盐、耐旱及耐渗透胁迫的水稻中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其中编码权利要求1所述的蛋白的基因是SEQ ID NO. 9所示的DNA序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其中编码权利要求2所述的蛋白的基因是SEQ ID NO.10所示的DNA序列。

5.包含权利要求1-4中任一项所述的基因敲除载体或基因敲除表达盒的宿主细胞在培育耐盐、耐旱及耐渗透胁迫的植物中的应用，其中所述宿主细胞为微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述宿主细胞为农杆菌细胞或大肠杆菌细胞。

7.一种培育耐盐、耐旱及耐渗透胁迫的植物的方法，所述方法包括下述步骤：

（1）选择编码SEQ ID NO. 1或2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，将所述核苷酸序列的片段构建到基因敲除载体中；

（2）用步骤（1）中构建好的基因敲除载体转化目标植物的细胞或组织，获得转基因植株，所述转基因植株是拟南芥或者水稻；

（3）将获得的转基因植株进行抗性筛选及转录水平上表达量的鉴定，确定目的基因已被敲除，从而获得转基因敲除株系；

所得到的转基因敲除株系在用150mM NaCl和250mM甘露醇处理的培养基上具有更高的种子萌发率和更发达的根系，在干旱处理时有更高的存活率，具有良好的耐盐、耐旱和耐渗透胁迫能力。

8.权利要求7所述的方法，其中步骤（1）中所用的基因敲除载体为CRISPR/Cas9载体。

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