CN1324137C - 盐芥的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了盐芥的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白，该基因的碱基序列如SEQID №：1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID №：2所示。本发明的基因将在培育耐盐、抗旱性增强的植物(特别是水稻、小麦等农作物)中发挥重要的作用。

Description

盐芥的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物中与抗胁迫相关的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及盐芥中的一个耐盐、抗旱基因及其编码蛋白与其在培育耐盐、抗旱性提高植物中的应用。

背景技术

研究表明，拟南芥的一些近亲具有极强的耐逆性，并且较适宜进行遗传操作。其中，盐生植物-盐芥与拟南芥极为相似，基因序列同源性可达70-90％，不仅具有遗传学模式植物令人满意的形态、生长特性及遗传特点，还对海水的高盐浓度具有较强的耐受能力。因此，盐芥不但是一种可供研究植物自然耐盐机制的优异遗传模式植物，更是一种分离优异耐盐、抗旱相关基因的资源植物。

发明内容

本发明的目的是提供一个盐芥的耐盐、抗旱基因及其编码蛋白。

本发明所提供的耐盐、抗旱基因，名称为eIF5A1，来源于十字花科植物盐芥(Thellungiella halophila)，它是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由671个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-414位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明耐盐、抗旱基因所编码的蛋白eIF5A1，是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID №：2由137个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增eIF5A1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

利用植物表达载体，将本发明的耐盐、抗旱基因导入植物细胞，可获得对高盐、干旱耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的可参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用eIF5A1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明eIF5A1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻，小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜等双子叶植物。

本发明所提供的盐芥的耐盐、抗旱基因eIF5A1经和拟南芥基因组基因的序列比对发现，该基因实际上为翻译其始因子5A(Translation initiation factor-5A，eIF5A)的编码基因。通过对转化本基因后所得到的转基因拟南芥植株的进行各项胁迫试验，证明本基因在转入植物后可显著提高植株的耐盐，抗旱性。本发明为人为控制植物中抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是水稻、小麦、油菜等农作物)中发挥重要的作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1A为载体pCB2004的物理图谱

图1为播种于含0mM NaCl的MS固体培养基上的eIF5A1转化体和野生型拟南芥的发芽及生长情况

图2为为播种于含100Mm NaCl+25mg/L glufosinate的MS固体培养基上的eIF5A1转化体和野生型拟南芥的发芽及生长情况

图3为为播种于含150Mm NaCl+25mg/L glufosinate的MS固体培养基上的eIF5A1转化体和野生型拟南芥的发芽及生长情况

图4为为播种于含200Mm NaCl+25mg/L glufosinate的MS固体培养基上的eIF5A1转化体和野生型拟南芥的发芽及生长情况

图5为播种于土壤中的eIF5A1转化体和野生型拟南芥经200Mm NaCl高盐胁迫处理2周后的生长情况

图6为播种于土壤中的eIF5A1转化体和野生型拟南芥经200Mm NaCl高盐胁迫处理18天后的生长情况

图7为播种于土壤中的eIF5A1转化体和野生型拟南芥经200Mm NaCl高盐胁迫处理18天后植株高度的测量结果

图8为eIF5A1转化体和野生型拟南芥发芽后经100mM NaCl高盐胁迫处理8天后的根系生长情况

图9为eIF5A1转化体和野生型拟南芥发芽后经100mM NaCl高盐胁迫处理12天后绘制的根系生长曲线

图10为eIF5A1转化体和野生型拟南芥发芽后经100mM NaCl高盐胁迫处理12天后侧根数量统计结果

图11为播种于土壤中的eIF5A1转化体和野生型拟南芥经2周干旱处理后的生长情况

图12为播种于土壤中的eIF5A1转化体和野生型拟南芥经2周干旱处理后恢复正长生长条件后收获的果荚

图13为播种于土壤中的eIF5A1转化体和野生型拟南芥经2周干旱处理后恢复正长生长条件后收获的果荚的长度测量结果

图14为eIF5A1转基因植株ST6-32和野生型拟南芥RT-PCR检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、盐芥耐盐、抗旱基因eIF5A1的获得

一、盐芥cDNA文库的构建

提取盐芥总RNA，反转录得到盐芥全基因组的cDNA，采用高通量构建载体的方法(Gateway Technology)  (汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆***：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将盐芥cDNA先重组克隆到pDONR207载体(Invitrogen公司)，得到Entry cDNA文库，然后再以重组克隆将整个cDNA文库穿梭至含有35S启动子的植物过量表达双元载体pCB2004(物理图谱如图1A所示)中，得到盐芥cDNA文库。上述重组反应完全按照Invitrogen提供的实验指南进行。

二、将盐芥cDNA文库转化野生型拟南芥

将步骤一构建的盐芥cDNA文库穿梭到双元载体pCB2004中，电转化至农杆菌C58C1，采用拟南芥花序浸花转化的方法(floral dip method)(Steven J.Cloughand Andrew F.Bent：Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal：Volume 16 Issue6 Page 735 -December 1998)大规模转化拟南芥。

三、拟南芥耐盐转化体的筛选

1、拟南芥转化体库的创建

在土壤中大规模播种步骤二获得的转化有盐芥cDNA文库的拟南芥转化体的种子，在种子发芽后约5天，表面喷洒浓度为0.2％的除草剂(glufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)进行筛选，以野生型拟南芥为对照。约1周后可以观察到转化体植株和野生型植株具有明显差别，野生型植株在0.2％除草剂glufosinate条件下不能存活，而转化体植物不受影响，可以正常生长。以200株转化体植株为一单位进行收种。

2、高通量方法初筛耐盐转化体植株

下述各实验中所用的种子均用如下方法进行表面灭菌处理：用50％消毒液(广州蓝月亮有限公司)在室温下灭菌15分钟，再用经灭菌的纯净水冲洗4-5遍。

将经消毒的步骤1收获的种子在4℃下放置3天，以使种子发芽一致。然后将种子播种于MS基本培养基(含2％蔗糖，1.5％琼脂粉，pH值5.8，高温蒸汽灭菌15分钟)上使其发芽，种子发芽生长条件为：22℃，光照培养。发芽后，再将其播种于含有220mM NaCl和25mg/L除草剂glufosinate的MS培养基上高通量筛选耐盐转化体，每个培养皿播3,000粒种子。待植株生长10天后，将存活下来的转化体植株移栽到土中，并单株收种。

3、耐盐转化体的复筛

对每一可能的耐盐转化体，选取其大约25至30粒种子用上述步骤2的方法进行表面灭菌后，播种于不同浓度的含盐的MS培养基上，盐浓度在0-200mM NaCl之间。种子生长一周左右后进行观察并记录相应数据，观察10天后，统计存活的植株数量，计算存活植株数量和死亡植株数量，两者之间比例高于3∶1的符合分离比例，可能为耐盐株系，将存活植株移入含有25mg/L除草剂glufosinate的MS培养基上，一周后观察小苗存活情况。如果小苗全部存活，表明上述可能的耐盐株系的耐盐性状和抗除草剂基因连锁，符合筛选要求。最后，移栽以上耐盐株系到土壤中，单株收种，将种子保存备用。

四、耐盐、抗旱基因eIF5A1的获得

根据盐芥cDNA在载体pCB2004中***位点的上、下游序列设计引物扩增cDNA序列，引物序列如下：

Omega：5’TTTTTACAACAATTACCAACAACAACAA3’；

attB2：5’-TACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTTT-3’

提取步骤三筛选得到的耐盐转化体的基因组DNA，并以此为模板，在引物Omega和attB2的引导下进行PCR扩增，50uLPCR扩增体系为，0.25uL ExTaq聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，2uL基因组DNA，10*PCR缓冲液5uL，dNTPs 100uM，上、下游引物各25uM，再用双蒸水将反应体系补充至50uL。用PCR技术扩增转入的盐芥cDNA。PCR反应条件为：先95℃1min，再66℃1min，最后72℃2min，共40个循环。反应结束后，对PCR产物进行测序，测序结果表明该基因具有序列表中的SEQ ID№：1的核苷酸序列，由671个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-414位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。在网站TAIR(www.arabidopsis.org)上和拟南芥基因组基因组序列进行序列比对，比对结果表明该基因与拟南芥中翻译其始因子5A(Translation initiation factor-5A，eIF5A)的编码基因同源，将该耐盐、抗旱基因命名为eIF5A1。

实施例2、转化有基因eIF5A1的拟南芥在培养基上的耐盐实验

将基因eIF5A1转化拟南芥，方法为：

用实施例1的方法构建eIF5A1的过量表达载体，将eIF5A1克隆入含有35S启动子的过量表达双元载体pCB2004中，得到eIF5A1的过量表达载体，命名为pCB2004/eIF5A1。经测序鉴定正确后，将pCB2004/eIF5A1电转化入农杆菌，再用花序转化方法(floral dip method)转化野生型拟南芥植株。用此种方法将基因eIF5A1转化拟南芥，然后对转基因植株进行耐盐实验，方法为：选择其中一株转基因植株(命名为ST6-32)，将其种子分别播种于含0Mm NaCl、100Mm NaCl+25mg/L glufosinate、150Mm NaCl+25mg/L glufosinate、200Mm NaCl+25mg/L glufosinate的MS固体培养基上，以野生型拟南芥为对照，在常规条件下培养，观察并记录发芽及生长情况，结果如图1-图4所示(图中，黑线上方播种的是转基因植株ST6-32，黑线下方播种的是野生型植株(wT))，eIF5A1转化体和野生型植株的种子在无盐培养基上皆可正常发芽；eIF5A1转化体在含NaCl 100mM和除草剂glufosinate 25mg/L的培养基上可以完全存活，而野生型种子的发芽和幼苗的生长受到抑制；在含NaCl 150mM和除草剂glufosinate 25mg/L的培养基上，eIF5A1转化体可以存活(有1/3未存活幼苗为WT)，也抗除草剂，而野生型种子的发芽及幼苗的生长受到强烈抑制；在含NaCl 200mM和除草剂glufosinate 25mg/L的培养基上，仅有eIF5A1转化体可以部分存活。上述实验证明耐盐性状和转入的基因eIF5A1连锁，eIF5A1可显著提高植物的耐盐性。

实施例3、转化有基因eIF5A1的拟南芥在土壤中的耐盐实验

将实施例2获得的eIF5A1转基因植株ST6-32和野生型拟南芥(WT)的种子播种于土壤中，在相同条件下培养，待生长至约10片叶子大小时，将两种拟南芥植株移至含200mM NaCl的土壤中继续进行培养，观察并记录其生长情况，经盐胁迫处理2周后的植株的生长情况如图5所示(每盆上方为ST6-32，下方为WT)，eIF5A1转基因植株ST6-32在200mM盐浓度胁迫下，仍然继续生长，开花结果，而在同样条件下，野生型植株的生长则受到抑制，生殖生长几乎完全受到抑制；盐胁迫18天后的植株生长情况如图6所示，统计此时两种植株的高度，结果如图7所示(上方为ST6-32，下方为WT)，eIF5A1转基因植株ST6-32显著高于野生型植株。上述耐盐实验进一步证明eIF5A1转基因植株的耐盐性显著强于野生型植株。

实施例4、转化有基因eIF5A1的拟南芥在盐胁迫下的根系发育

将实施例2获得的eIF5A1转基因植株ST6-32和野生型拟南芥(WT)的种子播种于MS固体培养基中，在相同条件下培养，待发芽后，将两种拟南芥植株移至含100mMNaCl的MS固体培养基中继续进行培养，观察并记录根系的生长情况。经盐胁迫处理8天后的根系的生长情况如图8所示(图中ST6-32为eIF5A1转化体，WT为野生型拟南芥)，eIF5A1转化体ST6-32的根系明显优于野生型植株的根系；根据所记录的经盐胁迫处理12天的数据绘出eIF5A1转化体ST6-32和野生型的根系生长曲线，如图9所示，表明eIF5A1转化体ST6-32根系的延伸速度显著高于野生型，说明其耐盐性显著高于野生型；经盐胁迫处理12天后eIF5A1转化体ST6-32和野生型的侧根数量的统计结果如图10所示，eIF5A1转化体ST6-32的侧根数量显著高于野生型。上述结果证明eIF5A1转基因植株的耐盐性显著强于野生型植株。

实施例5、转化有基因eIF5A1的拟南芥的干旱胁迫实验

将实施例2获得的eIF5A1转基因植株ST6-32和野生型拟南芥(WT)的种子播种于土壤中，在相同条件下培养，待生长至三星期大小时，对两种拟南芥植株实施干旱胁迫，连续两个星期不浇水，经盐胁迫处理2周后的植株的生长情况如图11所示，野生型植株出现萎焉，而eIF5A1转化体ST6-32在相同的胁迫处理条件下则生长良好，表明该来源于盐芥的基因eIF5A1可在拟南芥中表达，不但可增强转基因植株的耐盐性，还可增强其耐旱性。

经过上述干旱胁迫处理后，恢复浇水，两种拟南芥植株虽然可以恢复生长，但野生型的结实受到严重影响，其果荚(图12)和种子发育受到抑制，测量eIF5A1转基因植株ST6-32和野生型植株所结的果荚的长度，结果如图13所示，表明经干旱胁迫处理后，野生型植株的果荚大小显著小于eIF5A1转基因植株。

实施例6、RT-PCR检测eIF5A1在拟南芥的表达情况

提取eIF5A1转基因植株ST6-32和野生型拟南芥的RNA，并分别以两种RNA为模板，在引物attB1：5’-acaagtttgtacaaaaaagcaggct-3’和引物attB2：5’-tacaagaaagctgggtttttttttttt-3’的引导下，进行RT-PCR检测，以Tubulin为参照(扩增Tubulin的引物序列为：β-tubulinP1：5’-CGTGGATCACAGCAATACAGAGCC-3’和β-tubulinP2：5’-CCTCCTGCACTTCCACTTCGTCTTC-3’)，结果如图14所示(TH cDNA为扩增的目的产物eIF5A1，Tubulin为参照)，转基因植株ST6-32可扩增出eIF5A1，表明eIF5A1转入拟南芥后可在35S启动子作用下过量表达。

                     序列表

<160>2

<210>1

<211>671

<212>DNA

<213>十字花科植物盐芥(Thellungiella halophila)

<400>1

gctggtaaca tccgtaaggg tggtcacatc gtcatcaagg gccgtccctg caaggttgtt     60

gaggtttcga cttcgaagac tggcaagcac ggtcacgcga aatgtcactt tgttgccatt    120

gatatcttca ctgcgaagaa gctcgaggat atcgttccct cttcccacaa ttgtgatgtt    180

ccccatgtga atcgtgttga ttaccagttg attgatatct ccgaggatgg ctttgttagc    240

cttctgaccg acagtggtgg caccaaggac gatctcaagc ttcccaccga tgataatctg    300

gctgctctga tgaagagtgg attcgaggag ggtaaggatg ttgtggtgtc tgtcatgtcc    360

tccatgggag aggagcagat ctgtgccgtc aaggaagttg gtggtggcaa gtaaacaaag    420

tatcgttctc tttacacaga ggataatatt attaccagtt tgacgacagt tggtcaatgt    480

tataagaaca agaaaaaatg tttttttcct ttttctaatt tagaccattt gtgtgtgttt    540

cctgttgcaa gacaaacata tctattggtt ttggattgtt gaaaagtttg gtgttgaaac    600

agggaatatt tttcctttga tcctatgtta tctcttaatc ctttcacaaa aaaaaaaaaa    660

aaaaaaaaaa a                                                         671

<210>2

<211>137

<212>PRT

<213>十字花科植物盐芥(Thellungiella halophila)

<400>2

Ala Gly Asn Ile Arg Lys Gly Gly His Ile Val Ile Lys Gly Arg Pro

1               5                   10                  15

Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His

            20                  25                  30

Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe Thr Ala Lys Lys Leu

        35                  40                  45

Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp Val Pro His Val Asn

    50                  55                  60

Arg Val Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser

65                  70                  75                  80

Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp Asp Leu Lys Leu Pro Thr

                85                  90                  95

Asp Asp Asn Leu Ala Ala Leu Met Lys Ser Gly Phe Glu Glu Gly Lys

            100                 105                 110

Asp Val Val Val Ser Val Met Ser Ser Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys

        115                 120                 125

Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys

    130                 135

Claims (6)

1、盐芥的一个耐盐、抗旱基因，其碱基序列如SEQ ID №：1所示。

2、权利要求1所述耐盐、抗旱基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID №：2所示。

3、含有权利要求1所述耐盐、抗旱基因的表达载体。

4、含有权利要求1所述耐盐、抗旱基因的转基因细胞系。

5、含有权利要求1所述耐盐、抗旱基因的宿主菌。

6、一种培育耐盐、抗旱植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求1所述的耐盐、抗旱基因导入植物细胞，获得对高盐、干旱耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株，其中，所述被转化的植物宿主为拟南芥。

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