CN110272898A - 一种通用型微生物病原体裂解液及其应用 - Google Patents

一种通用型微生物病原体裂解液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种通用型微生物病原体裂解液及其应用。具体地，所述裂解液包括：30‑60mM的Tris‑HCl、3‑6％(w/w)的非离子表面活性剂、300‑600mM异硫氰酸胍，和20‑80mM的KCl，其中，裂解液的pH为7.0‑10.0，百分比以所述裂解液总重量计。本发明的裂解液适用于多种来源的病原体微生物，且核酸提取速度快、提取率高，价格低廉，意外地，本发明的裂解液还能提高PCR扩增效率。

Description

一种通用型微生物病原体裂解液及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通用型微生物病原体裂解液及其应用。
背景技术
病原体是指能引起疾病的微生物和寄生虫，其中微生物占绝大多数，包括病毒、衣原体、支原体、细菌和真菌等。感染性疾病是全世界共同面对的不可忽视的公共卫生问题，其发病率也在人类各种疾病中居首位。建立快速有效的病原体检测方法在感染性疾病的预防、检测以及治疗方面均起着至关重要的作用。
传统的微生物病原体检测方法主要包括培养法、免疫学检测和核酸检测等，其培养鉴定法操作比较繁琐，对操作人员技术水平要求比较高，且检测周期长，一般需要5-7天时间，在时效上不能满足临床诊断和治疗的需求，因此可能延误对患者的治疗。同样，在传染病疫情爆发时，实验室仅依赖传统培养方法也不能满足疫情防控的需要。
随着核酸检测技术的快速发展，核酸分子诊断也被推向了前所未有的高水平。常用核酸检测技术的第一步就是对样品进行核酸提取。现在检测机构常用的病原体核酸提取的方法包括Trizol提取法(Life Technology)，柱提法(Qiagen、Roche)和磁珠法(Chemagen、Thermo、金麦格)。Trizol法提取的核酸得率相对较低，且步骤较为繁杂，整个提取过程耗时1-2小时，直接影响检测效率。柱提法和磁珠法的试剂盒在一定程度上提高了核酸提取效率，简化了核酸提取的步骤，也提高了提取的速度，但整个提取过程仍需0.5-1小时。此外，这些提取试剂盒的价格都极为昂贵，造成检测成本较高。因此，临床基因诊断需要操作简单、快速、价格低廉的样品前处理试剂，尤其是对于临床样品量较大的病例，简单快速的核酸提取显得尤为重要。
而现有针对病原体的核酸快速裂解试剂针对的样品类型单一，不适用于多样化的微生物病原体样品类型。
因此，针对临床各种类型病原微生物感染性疾病的分子诊断，迫切需要开发一种核酸提取速度快、提取率高，价格低廉的病原微生物通用型(如全血、粪便、尿液、咽拭子等样品中存在的各种类型的细菌、DNA/RNA病毒等)裂解液。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸提取速度快、提取率高，价格低廉的病原微生物通用型裂解液。
本发明第一方面提供了一种微生物病原体裂解液，所述裂解液包括组分：
30-60mM的Tris-HCl、
3-6％(w/w)的非离子表面活性剂、
300-600mM异硫氰酸胍，和
20-80mM的KCl，
其中，裂解液的pH为7.0-10.0，百分比以所述裂解液总重量计。
在另一优选例中，所述裂解液溶剂为水。
在另一优选例中，所述裂解液的pH为7.0-10.0，较佳地，8.0-10.0，更佳地，9.0-10.0，最佳地，10。
在另一优选例中，所述裂解液的pH值经浓度为0.9-1.1M且pH为9-10的Tris-HCl调节得到，较佳地，浓度为1M且pH为10的Tris-HCl。
在另一优选例中，所述Tris-HCl浓度为40-60mM，较佳地，40-55，更佳地，45-55mM。
在另一优选例中，所述非离子表面活性剂浓度为4-6％(w/w)，较佳地，4-5.5％(w/w)，更佳地，4.5-5.5％(w/w)，所述百分比以所述裂解液总重量计。
在另一优选例中，所述非离子表面活性剂浓度为4-6％(v/v)，较佳地，4-5.5％(v/v)，更佳地，4.5-5.5％(v/v)，所述百分比以所述裂解液总体积计。
在另一优选例中，所述非离子表面活性剂选自：TritonX-100、Tween20，或其组合，较佳地，TritonX-100。
在另一优选例中，所述异硫氰酸胍的浓度为400-600mM，较佳地，400-550mM，最佳地，450-500mM。
在另一优选例中，所述KCl的浓度为20-60mM，较佳地，40-60mM，更佳地，40-50mM。
在另一优选例中，所述裂解液包括：
40-60mM的Tris-HCl、
4-6％(v/v)的非离子表面活性剂、
400-600mM异硫氰酸胍，和
20-60mM的KCl，
其中，裂解液的pH为7.0-10.0，所述百分比以所述裂解液总体积计。
在另一优选例中，所述裂解液包括：
45-55mM的Tris-HCl、
4.5-5.5％(v/v)的非离子表面活性剂、
450-550mM异硫氰酸胍，和
40-60mM的KCl，
其中，裂解液的pH为7.0-10.0，所述百分比以所述裂解液总体积计。
在另一优选例中，所述裂解液包括：
50mM的Tris-HCl、
5％(v/v)的非离子表面活性剂、
500mM异硫氰酸胍，和
40-50mM的KCl，
其中所述百分比以所述裂解液总体积计。
在另一优选例中，所述裂解液包括：
50mM的Tris-HCl、
5％(v/v)的TritonX-100、
500mM异硫氰酸胍，和
50mM的KCl，
其中所述百分比以所述裂解液总体积计。
在另一优选例中，所述微生物病原体选自：病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌，或其组合。
在另一优选例中，所述微生物病原体具有DNA和/或RNA。
本发明第二方面提供了一种微生物病原体裂解试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)如本发明第一方面所述的裂解液；
(2)至少一个容纳所述裂解液的容器。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书。
在另一优选例中，每个容器中装有0.5-10mL所述裂解液，较佳地1-5mL。
在另一优选例中，所述微生物病原体选自：病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌，或其组合。
在另一优选例中，所述微生物病原体具有DNA和/或RNA。
本发明第三方面提供了一种微生物病原体快速裂解提取核酸的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与如本发明第一方面所述的裂解液进行混合，得混合物；
(2)将所述混合物孵育一端时间后离心，收集上清液，即为核酸提取液。
在另一优选例中，所述混合物孵育时间为1-10min，较佳地，2-8min，更佳地，3-6min。
在另一优选例中，对于液体样品，所述样品与裂解液混合时的体积比为1:0.5-5，较佳地，1:1-3，更佳地1:1-2。
在另一优选例中，对于固体样品，所述样品与裂解液混合时的用量比(mg/μL)为1:0.5-10，较佳地，1:1-5，更佳地1:1-3。
在另一优选例中，所述样品选自：菌液、全血、血清、血浆、尿液、唾液、咽拭子、粪便，或其组合。
在另一优选例中，所述离心的转速为1000-5000rpm，较佳地，2000-4000rpm。
在另一优选例中，所述核酸提取液不进行处理直接用于PCR扩增。
在另一优选例中，所述处理包括：除杂、脱盐。
在另一优选例中，所述微生物病原体选自：病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌，或其组合。
在另一优选例中，所述核酸为DNA和/或RNA。
在另一优选例中，所述核酸提取液可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于低温下(-15～-25℃)长期保存。
本发明第四方面提供了一种微生物病原体快速裂解检测方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第一方面所述的裂解液进行混合，得混合物；
(2)将所述混合物孵育一端时间后离心，收集上清液；
(3)将所述上清液做为荧光PCR反应的样品，将样品与样品特异性的引物和探针反应，进行荧光PCR检测。
在另一优选例中，所述检测为定量检测和/或定性检测。
在另一优选例中，所述上清液中包含提取后的核酸。
在另一优选例中，所述上清液不进行任何用于PCR扩增。
在另一优选例中，所述处理包括：除杂、脱盐。
在另一优选例中，所述混合物孵育时间为1-10min，较佳地，2-8min，更佳地，3-6min。
在另一优选例中，对于液体样品，所述样品与裂解液混合时的体积比为1:0.5-5，较佳地，1:1-3，更佳地1:1-2。
在另一优选例中，对于固体样品，所述样品与裂解液混合时的用量比(mg/μL)为1:0.5-10，较佳地，1:1-5，更佳地1:1-3。
在另一优选例中，所述样品选自：菌液、全血、血清、血浆、尿液、唾液、咽拭子、粪便，或其组合。
在另一优选例中，所述离心的转速为1000-5000rpm，较佳地，2000-4000rpm。
在另一优选例中，所述微生物病原体选自：病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌，或其组合。
在另一优选例中，所述微生物病原体具有DNA和/或RNA。
在另一优选例中，所述方法是非诊断非治疗的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1示出了不同配比的裂解液对核酸提取效果的影响。
图2示出了裂解液中KCl浓度对核酸提取效果的影响。
图3示出了一个实施例裂解液的核酸提取灵敏度测试结果。
图4示出了一个实施例裂解液针对咽拭子样品的提取效果。
图5示出了一个实施例裂解液针对粪便样品的提取效果。
图6示出了一个实施例裂解液与其他市售提取试剂的核酸提取效果的比较结果。
图7示出了裂解液成分及裂解程序对核酸提取效果的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，经过综合性能的优化，开发了一种通用型微生物病原体裂解液。本发明的通用型微生物病原体裂解液，能够实现临床上各种来源病原体的核酸快速提取，整个提取过程可小于10min，极大地提高了提取效率，令人惊讶的是，使用本发明的裂解液提取的核酸不仅对后续PCR扩增无干扰，而且还能增强其扩增效率。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“微生物病原体裂解液”、“微生物病原体通用型快速裂解液”和“本发明的裂解液”可互换使用，指本发明的微生物病原体裂解液。
微生物病原体裂解液
本发明提供了一种微生物病原体裂解液，所述裂解液包括组分：
30-60mM的Tris-HCl、3-6％(w/w)的非离子表面活性剂、300-600mM异硫氰酸胍，和20-80mM的KCl，其中，裂解液的pH为7.0-10.0，百分比以所述裂解液总重量计。
本发明裂解液的溶剂为水或基本上为水。
本发明的裂解液中异硫氰酸胍除了具有裂解微生物病原体的功能，还能够使DNA酶/RNA酶失活，从而有效阻止核酸的降解，保证核酸提取率，并且异氰酸胍能够是裂解后的各种蛋白残留物失活，从而抑制残留物对PCR扩增效果的影响。在另一优选例中，所述异硫氰酸胍的浓度为400-600mM，较佳地，400-550mM，最佳地，450-500mM。
Tris-HCl能够使裂解体系处于合适的pH环境。
在另一优选例中，所述裂解液的pH值经浓度为0.9-1.1M且pH为9-10的Tris-HCl调节得到，较佳地，浓度为1M且pH为10的Tris-HCl。
在另一优选例中，所述Tris-HCl浓度为40-60mM，较佳地，40-55，更佳地，45-55mM。
在另一优选例中，所述裂解液的pH为7.0-10.0，较佳地，8.0-10.0，更佳地，9.0-10.0，最佳地，10。
非离子表面活性剂够破坏生物体膜结构，使膜内的物质释放出来。本发明的裂解液对非离子表面活性剂没有特别要求，可使用本领域常用的非离子表面活性剂。
在另一优选例中，所述非离子表面活性剂选自：TritonX-100、Tween20，或其组合，较佳地，TritonX-100。
在另一优选例中，所述非离子表面活性剂浓度为4-6％(w/w)，较佳地，4-5.5％(w/w)，更佳地，4.5-5.5％(w/w)，所述百分比以所述裂解液总重量计。
在另一优选例中，所述非离子表面活性剂浓度为4-6％(v/v)，较佳地，4-5.5％(v/v)，更佳地，4.5-5.5％(v/v)，所述百分比以所述裂解液总体积计。
意外地，KCl的加入进一步提高了核酸提取率，和PCR扩增效率，有助于缩短PCR扩增次数，进一步减少分析时间。
在另一优选例中，所述KCl的浓度为20-60mM，较佳地，40-60mM，更佳地，40-50mM。
典型地，本发明的裂解液通过本领域常用的溶液配置方法制备。通常，将本发明的裂解液各组分按配比溶解在水中混匀即可。
在另一优选例中，所述裂解液包括：50mM的Tris-HCl、5％(v/v)的TritonX-100、500mM异硫氰酸胍，和50mM的KCl，其中所述百分比以所述裂解液总体积计。
微生物病原体裂解试剂盒
本发明进一步提供了一种微生物病原体裂解试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)如上所述的裂解液；
(2)至少一个容纳所述裂解液的容器。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书。
在另一优选例中，每个容器中装有0.5-10mL所述裂解液，较佳地1-5mL。
在另一优选例中，所述微生物病原体选自：病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌，或其组合。
在另一优选例中，所述微生物病原体具有DNA和/或RNA。
微生物病原体快速裂解提取核酸的方法
本发明还提供了一种微生物病原体快速裂解提取核酸的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与如上所述的裂解液进行混合，得混合物；
(2)将所述混合物孵育一端时间后离心，收集上清液，即为核酸提取液。
在另一优选例中，所述混合物孵育时间为1-10min，较佳地，2-8min，更佳地，3-6min。
在另一优选例中，对于液体样品，所述样品与裂解液混合时的体积比为1:0.5-5，较佳地，1:1-3，更佳地1:1-2。
在另一优选例中，对于固体样品，所述样品与裂解液混合时的用量比(mg/μL)为1:0.5-10，较佳地，1:1-5，更佳地1:1-3。
在另一优选例中，所述样品选自：菌液、全血、血清、血浆、尿液、唾液、咽拭子、粪便，或其组合。
在另一优选例中，所述核酸提取液不进行处理直接用于PCR扩增。
在另一优选例中，所述微生物病原体选自：病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌，或其组合。
微生物病原体快速裂解检测方法
本发明还提供了一种微生物病原体快速裂解检测方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与如上所述的裂解液进行混合，得混合物；
(2)将所述混合物孵育一端时间后离心，收集上清液；
(3)将所述上清液做为荧光PCR反应的样品，将样品与样品特异性的引物和探针反应，进行荧光PCR检测。
在另一优选例中，所述检测为定量检测和/或定性检测。
在另一优选例中，对于液体样品，所述样品与裂解液混合时的体积比为1:0.5-5，较佳地，1:1-3，更佳地1:1-2。
在另一优选例中，对于固体样品，所述样品与裂解液混合时的用量比(mg/μL)为1:0.5-10，较佳地，1:1-5，更佳地1:1-3。
在另一优选例中，所述样品选自：菌液、全血、血清、血浆、尿液、唾液、咽拭子、粪便，或其组合。
在另一优选例中，所述核酸提取液不进行处理直接用于PCR扩增。
在另一优选例中，所述微生物病原体选自：病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌，或其组合
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的裂解液裂解病原体速度快，整个核酸提取过程可小于10min，有效提高提取效率，节约分析时间；
(2)本发明的裂解液适用于各种样品来源的不同种类的病原微生物，适用性广；
(3)本发明的裂解液提取样品中的核酸损失小，提取率高，且无需纯化即可直接用于PCR扩增；
(4)意外地，KCl的加入能够提高PCR扩增效率，有助于缩短PCR扩增次数，进一步缩短检测时间；
(5)本发明的裂解液组分简单且无昂贵的组分，不引入影响分析的物质，可提高核酸检测灵敏度，且成本低廉，适合大批量样品的检测分析；
(6)本发明的提取方法裂解液价格低廉，提取速度快，提取率高、适合各种样品来源的不同病原体，且无需昂贵、复杂的核酸提取设备，仅需移液器和离心机即可完成操作。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。
实施例1
以金黄色葡萄球菌的培养型菌液样品为例，测试本发明裂解液各成分的不同配比对核酸提取效果的影响。
(1)按照表1配方，分别配制裂解液A、裂解液B、裂解液C，裂解液溶剂为水，百分比以裂解液总体积计。其中Tris-HCl为加入一定量的1M tris-HCl(pH＝10.0)母液(常温，18-25℃)，使定容后的裂解液中Tris(三羟甲基氨基甲烷)的浓度为相应浓度。
表1裂解液配方
试剂种类 裂解液A配方 裂解液B配方 裂解液C配方
Tris-HCl(pH10.0) 30mM 50mM 60mM
TritonX-100 3％(v/v) 5％(v/v) 6％(v/v)
异硫氰酸胍 300mM 500mM 600mM
KCl 20mM 50mM 80mM
(2)各取50μL金黄色葡萄球菌菌液置于离心管中(共3份)，分别加入50μL裂解液A、裂解液B、裂解液C，用移液器吹打混匀，然后将混合液在室温条件下孵育5min，然后3000rpm下离心2min，收集上清，分别为核酸样品A、B、C。
(3)分别取5μL核酸样品进行荧光PCR扩增。使用上游引物SA-F序列为5‘-TCATTATTCGACTAGATGTTG-3’(SEQ ID No.:1)下游引物SA-R序列为5‘-CTCTTTTACTTTAGCAACCGTTG-3’(SEQ ID No.:2)，探针SA-P序列为5‘-TTCGCTTAATTCGCTTAGGCGAT-3’(SEQ ID No.:3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ；并使用Takara公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTMII(货号RR820A)，按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为50℃2min(1cycle)；95℃5min(1cycle)；95℃10s，55℃40s(40cycles)。
从图1所示的荧光定量PCR检测结果显示，裂解液B配方的扩增效果最好，说明裂解液B的核酸提取率最高，由此可见，裂解液的最佳浓度难以预料，增加或降低各组分浓度(如裂解液C、裂解液A)都会导致核酸提取效率降低。
实施例2
微生物病原体通用型快速裂解液配方中KCl的最佳浓度的选择：
(1)配制0、20mM、40mM、50mM、60mM、80mM不同KCl浓度的裂解液，其它组分及浓度与实施例1裂解液B相同；
(2)分别取50μl金黄色葡萄球菌菌液置于离心管中，并分别加入50μl不同KCl浓度(0、20mM、40mM、50mM、60mM、80mM)的上述裂解液，用移液器吹打混匀，然后将混合液在室温条件下孵育5min，然后3000rpm下离心2min，收集上清，即得到核酸样品。
(3)分别取5μl核酸样品进行荧光PCR扩增。使用上游引物SA-F序列为5‘-TCATTATTCGACTAGATGTTG-3’(SEQ ID No.:1)，下游引物SA-R序列为5‘-CTCTTTTACTTTAGCAACCGTTG-3’(SEQ ID No.:2)，探针SA-P序列为5‘-TTCGCTTAATTCGCTTAGGCGAT-3’(SEQ ID No.:3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ；并使用Takara公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(货号RR820A)，按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为50℃2min(1cycle)；95℃5min(1cycle)；95℃10s，55℃40s(40cycles)。
从图2所示的荧光定量PCR检测结果显示，与KCl浓度为0的裂解液相比，KCl浓度为20mM、40mM、50mM、60mM的裂解液Ct值均有明显提前，KCl浓度为80mM的裂解液Ct值无明显变化。该结果表明KCl的加入能够提高PCR扩增效率，KCl浓度为20-60mM时PCR扩增效率相对不添加KCl的裂解液有明显提高，其中KCl浓度为50mM的裂解液扩增效果最佳。
实施例3
微生物病原体通用型快速裂解试剂盒制备及其使用方法(适用于菌液/血清/血浆/尿液检测)：
(1)制备微生物病原体通用型快速裂解试剂盒(50测试/盒)：微生物病原体通用型快速裂解液1瓶(配方如实施例1裂解液B，2.5mL/瓶)。
(2)标本采集：直接采用临床收集的病人血清/血浆/尿液，或取培养的菌液。
(3)检测步骤：将样品与裂解液各取50μL进行混合，用移液器吹打混匀，然后将混合液在室温条件下孵育5min，然后3000rpm下离心2min，收集上清，即为核酸提取物。
该核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20℃长期保存。
实施例4
微生物病原体通用型快速裂解试剂盒及其使用方法(适用于咽拭子检测)：
(1)制备微生物病原体通用型快速裂解试剂盒(50测试/盒)：微生物病原体通用型快速裂解液2瓶(配方如实施例1裂解液B，5mL/瓶)。
(2)标本采集：使用专用的采样拭子，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，然后迅速将拭子放采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
(3)检测步骤：待检拭子样品置于200μL的病原微生物样品裂解液中，充分搅拌洗脱拭子上的样品，在管壁挤压数次后弃拭子，在室温条件下孵育5min，然后3000rpm离心2min，收集上清，即为核酸提取物。
该核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20℃长期保存。
实施例5
微生物病原体通用型快速裂解试剂盒及其使用方法(适用于粪便检测)：
(1)制备微生物病原体通用型快速裂解试剂盒(50测试/盒)：微生物病原体通用型快速裂解液1瓶(配方如实施例1裂解液B，5mL/瓶)。
(2)标本采集：采集0.1-0.3g粪便样品，采集后立即放入无菌采便管内，加入1mL无菌生理盐水，振荡混匀，8000rpm离心2min，弃上清，重复以上步骤再次洗涤沉淀，弃上清后用1mL无菌生理盐水重悬沉淀。
(3)检测步骤：将样品悬液与裂解液分别取100ul混合并充分振荡混匀，室温孵育5min，然后3000rpm离心2min，收集上清，即为核酸提取物。
该核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20℃长期保存。
实施例6
使用本发明的裂解液从不同浓度的金黄色葡萄球菌的菌液提取的核酸进行灵敏度试验：
(1)挑取平板培养的金黄色葡萄球菌单菌落，置于1mL生理盐水中并充分混匀，然后将菌液分别用生理盐水稀释至1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL、1×10CFU/mL。
(2)以上4个稀释度的菌液各取50μL置于离心管中，分别加入50μL裂解液(配方如实施例1裂解液B)，用移液器吹打混匀，然后将混合液在室温条件下孵育5min，然后3000rpm下离心2min，收集上清，即为核酸样品。
(3)取5μL核酸样品进行荧光PCR扩增。使用上游引物SA-F序列为5‘-TCATTATTCGACTAGATGTTG-3’(SEQ ID No.:1)，下游引物SA-R序列为5‘-CTCTTTTACTTTAGCAACCGTTG-3’(SEQ ID No.:2)，探针SA-P序列为5‘-TTCGCTTAATTCGCTTAGGCGAT-3’(SEQ ID No.:3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ；并使用Takara公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(货号RR820A)，按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为50℃2min(1cycle)；95℃5min(1cycle)；95℃10s，55℃40s(40cycles)。
由图3所示的检测结果可知，本发明裂解液提取金黄色葡萄球菌菌液，其检测灵敏度可达1×102CFU/mL，显著高于现有技术通常能达到的1×102至1×104CFU/mL，更有利于及早检出。
实施例7
使用本发明的裂解液对咽拭子中提取的疱疹病毒核酸进行荧光PCR检测：
(1)取三个口腔疱疹病毒感染病人的咽拭子，刷拭口腔壁，然后迅速将拭子放采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
(2)将待检拭子样品置于200μL的裂解液(配方如实施例1裂解液B)中，充分搅拌洗脱拭子上的样品，在管壁挤压数次后弃拭子，在室温条件下孵育5min，然后3000rpm离心2min，收集上清，即为核酸样品。
(3)取5μL核酸样品进行荧光PCR扩增。使用上游引物HSV-F序列为5‘-CGCCAGCGCTCGCACTT-3’(SEQ ID No.:4)，下游引物HSV-R序列为5‘-CCGCAGGGTAAAGAAGTG-3’(SEQ ID No.:5)，探针HSV-P序列为5‘-ACGAACTGCGAACGCTTCG-3’(SEQ ID No.:6)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ；并使用Takara公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTM II(货号RR820A)，按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为50℃2min(1cycle)；95℃5min(1cycle)；95℃10s，55℃40s(40cycles)。
图4所示的检测结果显示，本发明裂解液提取的三份咽拭子样品进行荧光PCR检测均为口腔疱疹病毒阳性。
实施例8
使用本发明的裂解液对粪便样品中提取的大肠杆菌核酸进行荧光PCR检测：
(1)采集0.1-0.3g粪便样品，采集后立即放入无菌采便管内，加入1mL无菌生理盐水，振荡混匀，8000rpm离心2min，弃上清，重复以上步骤再次洗涤沉淀，弃上清后用1mL无菌生理盐水重悬沉淀。
(2)将样品悬液与裂解液(配方如实施例1裂解液B)分别取100μL混合并充分振荡混匀，室温孵育5min，然后3000rpm离心2min，收集上清，即为核酸样品。
(3)取5μL核酸样品进行荧光PCR扩增。使用上游引物ECO-F序列为5‘-TACGCCCAGTAATTCCGATTA-3’(SEQ ID No.:7)，下游引物ECO-R序列为5‘-CAGAAGAAGCACCGGCTAA-3’(SEQ ID No.:8)，探针ECO-P序列为5‘-CGCTTGCACCCTCCRTATTACC-3’(SEQ ID No.:9)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ；并使用Takara公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(货号RR820A)，按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为50℃2min(1cycle)；95℃5min(1cycle)；95℃10s，55℃40s(40cycles)。
由图5所示的检测结果可知，本发明裂解液提取的粪便样品进行荧光PCR检测为大肠杆菌阳性。
实施例9
以金黄色葡萄球菌的培养型菌液样品为例，本发明的裂解液提取的核酸与Qiagen柱提试剂(QIAamp DNA Mini Kit，货号51306)提取的核酸用于荧光定量PCR的对比实验结果：
(1)Qiagen柱提试剂操作步骤：a.取100μL金黄色葡萄球菌菌液，7500rpm离心5min，去上清，加入180μL Buffer ATL、20μL Proteinase K，vortex 15s混匀，然后56℃孵育10min，中间混匀数次；b.向上步样品中加入200μL Buffer AL，Vortex15s混匀，然后在70℃孵育10min；c.加入200μL无水乙醇，Vortex 15s混匀；d.将上步产物转移至DNA结合柱中，8000rpm离心1min；e.向结合柱中加入500μL Buffer AW1，8000rpm离心1min；f.向结合柱中加入500μL Buffer AW2，14000rpm离心3min；g.将结合柱转移至1.5mL离心管中，加入200μLBuffer H2O，室温放置1min后，8000rpm离心1min洗脱，收集的洗脱液，即为核酸样品。
(2)本发明裂解液操作步骤：取50μL金黄色葡萄球菌菌液置于离心管中，并加入50μL裂解液(配方如实施例1裂解液B)，用移液器吹打混匀，然后将混合液在室温条件下孵育5min，然后3000rpm下离心2min，收集上清，即为核酸样品。
(3)分别取5μL核酸样品进行荧光PCR扩增。使用上游引物SA-F序列为5‘-TCATTATTCGACTAGATGTTG-3’(SEQ ID No.:1)，下游引物SA-R序列为5‘-CTCTTTTACTTTAGCAACCGTTG-3’(SEQ ID No.:2)，探针SA-P序列为5‘-TTCGCTTAATTCGCTTAGGCGAT-3’(SEQ ID No.:3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ；并使用Takara公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(货号RR820A)，按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为50℃2min(1cycle)；95℃5min(1cycle)；95℃10s，55℃40s(40cycles)。
从图6所示的荧光定量PCR检测结果可知，本发明裂解液的Ct值比Qiagen柱提试剂的Ct值提前3.45，说明本发明裂解液的核酸得率比Qiagen柱提试剂高，约为Qiagen柱提试剂的12倍。
实施例10
以提取并纯化的金黄色葡萄球菌DNA样品为模板，测试本发明的裂解液成分及操作过程对荧光PCR检测效果的影响：
(1)取50μL提取并纯化的金黄色葡萄球菌DNA样品，并加入50μL裂解液(配方如实施例1裂解液B)，用移液器吹打混匀，然后将混合液在室温条件下孵育5min，然后3000rpm下离心2min，收集上清，即为核酸样品1。
(2)取50μL提取并纯化的金黄色葡萄球菌DNA样品，并加入50μL H2O，移液器吹打混匀，然后将混合液在室温条件下孵育5min，然后3000rpm下离心2min，收集上清，即为核酸样品2。
(3)取50μL提取并纯化的金黄色葡萄球菌DNA样品，并加入50μL H2O，移液器吹打混匀，即为核酸样品3。
(4)分别取5μL核酸样品1、核酸样品2、核酸样品3，然后分别进行荧光PCR扩增。使用上游引物SA-F序列为5‘-TCATTATTCGACTAGATGTTG-3’(SEQ ID No.:1)，下游引物SA-R序列为5‘-CTCTTTTACTTTAGCAACCGTTG-3’(SEQ ID No.:2)，探针SA-P序列为5‘-TTCGCTTAATTCGCTTAGGCGAT-3’(SEQ ID No.:3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ；并使用Takara公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(货号RR820A)，按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为50℃2min(1cycle)；95℃5min(1cycle)；95℃10s，55℃40s(40cycles)。
从图7所示的荧光定量检测结果显示，核酸样品1的Ct值比核酸样品2提前2.17，说明本发明裂解液成分能够使PCR扩增效率提高约5倍；核酸样品2和核酸样品3的Ct值无明显差别，说明本裂解液及其使用操作过程对荧光PCR检测效果无不利影响。
综上所述，本发明的裂解液对样品裂解速度快，核酸提取率高，且本发明裂解液的成分及其使用过程对PCR检测效果无不利影响，使得裂解后得到的核酸提取液可以直接用于PCR扩增和检测，意外地，本发明的裂解液还能提高PCR扩增效率，进一步加快了检测速度，且实验证明，本发明的裂解液对各种样品来源的病原体都有效，适用性广，成本低廉，非常适合大规模样品的病原体快速检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市浦东新区疾病预防控制中心
<120> 一种通用型微生物病原体裂解液及其应用
<130> P2019-0722
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
tcattattcg actagatgtt g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
ctcttttact ttagcaaccg ttg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ttcgcttaat tcgcttaggc gat 23
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
cgccagcgct cgcactt 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ccgcagggta aagaagtg 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
acgaactgcg aacgcttcg 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
tacgcccagt aattccgatt a 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
cagaagaagc accggctaa 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
cgcttgcacc ctccrtatta cc 22

Claims (10)

1.一种微生物病原体裂解液，其特征在于，所述裂解液包括组分：
30-60mM的Tris-HCl、
3-6％(w/w)的非离子表面活性剂、
300-600mM异硫氰酸胍，和
20-80mM的KCl，
其中，裂解液的pH为7.0-10.0，百分比以所述裂解液总重量计。
2.如权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液溶剂为水。
3.如权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述KCl的浓度为20-60mM，较佳地，40-60mM，更佳地，40-50mM。
4.如权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液包括：
50mM的Tris-HCl、
5％(v/v)的非离子表面活性剂、
500mM异硫氰酸胍，和
40-50mM的KCl，
其中所述百分比以所述裂解液总体积计。
5.如权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液包括：
50mM的Tris-HCl、
5％(v/v)的TritonX-100、
500mM异硫氰酸胍，和
50mM的KCl，
其中所述百分比以所述裂解液总体积计。
6.一种微生物病原体裂解试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)如权利要求1所述的裂解液；
(2)至少一个容纳所述裂解液的容器。
7.一种微生物病原体快速裂解提取核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将样品与如权利要求1所述的裂解液进行混合，得混合物；
(2)将所述混合物孵育一端时间后离心，收集上清液，即为核酸提取液。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品选自：菌液、全血、血清、血浆、尿液、唾液、咽拭子、粪便，或其组合。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微生物病原体选自：病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌，或其组合。
10.一种微生物病原体快速裂解检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将样品与如权利要求1所述的裂解液进行混合，得混合物；
(2)将所述混合物孵育一端时间后离心，收集上清液；
(3)将所述上清液做为荧光PCR反应的样品，将样品与样品特异性的引物和探针反应，进行荧光PCR检测。
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