CN104357572A

CN104357572A - 一种细菌快速裂解试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN104357572A
Application number: CN201410662477.6A
Authority: CN
Inventors: 金鑫; 张钦; 张平; 周正峰; 朱坤
Original assignee: BEIJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER Co Ltd; NANJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER Co Ltd; NANJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2015-02-18

Abstract

本发明涉及一种细菌快速裂解试剂盒及其检测方法，可对临床及食品样本中细菌的核酸进行快速提取，提取的核酸可直接用于PCR或荧光PCR检测，也可置于-20℃长期保存。

Description

一种细菌快速裂解试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种细菌快速裂解试剂盒及其检测方法，可对临床及食品样本中细菌的核酸进行快速提取。

背景技术

感染性疾病是全世界共同面对的不可忽视的公共卫生问题，其发病率也在人类各种疾病中居首位，其中细菌是引起感染性疾病的一类重要病原体。建立快速有效的细菌检测方法在感染性疾病的预防、检测以及治疗方面均起着至关重要的作用。目前国内外对细菌的检测方法主要包括培养法、免疫学检测和核酸检测等。传统培养鉴定法操作比较繁琐，对操作人员技术水平要求比较高，且检测周期长，一般需要5-7天时间，在时效上不能满足临床诊断和治疗的需求，因此可能延误对患者的治疗。同样，在传染病疫情爆发时，实验室仅依赖传统培养方法也不能满足疫情防控的需要。免疫学主要应用抗原抗体特异结合的特点进行细菌的检测，常见的方法有免疫层析、免疫渗滤、免疫荧光、ELISA 等。方法操作简便快速，但灵敏度不足，通常在10⁵CFU/ml，对一些样本中含量极少的病原微生物会发生漏检，不能完全满足检测需求。核酸检测操作简便，通常几小时就能得出分析结果，且检测灵敏度比免疫法更高，因此核酸检测成为快速检测方法的趋势。核酸检测的第一步就是对样本进行核酸提取。细菌检测的样本大多为临床样本、食品样本或环境样本。这些样本往往细菌含量较低，核酸提取效率的高低是至关重要的，直接影响到实验的阳性检出率。现在检测机构用得较多的细菌核酸提取的方法包括Trizol提取法（Life Technology），柱提法（Qiagen, Roche）和磁珠法（Chemagen、Thermo、金麦格）。Trizol提取法提取的核酸得率相对较低，且步骤较为繁杂，整个提取过程耗时1-2小时，直接影响检测效率。柱提法和磁珠法的试剂盒在一定程度上提高了核酸提取效率，简化了核酸提取的步骤，也提高了提取的速度，但整个提取过程仍需0.5-1小时。除了提取时间长，这些提取试剂盒的价格都极为昂贵，每一个样本的的提取约需30-50元不等。同时对于含抑制物比较强的粪便、牛奶等样本，以及细胞壁比较厚的革兰氏阳性菌，目前的核酸提取方法提取效果都不理想。因此，临床基因诊断需要操作简单、快速、价格低廉的样本前处理试剂，尤其对于临床样本量较大的病例，简单快速的核酸提取显得尤为重要。

现有核酸提取试剂提取临床样本、食品样本中的细菌核酸存在操作时间长、成本高、提取效率低等问题，本发明成功解决了以上问题。本发明提出了一种对临床或食品样本中细菌进行快速裂解的试剂盒及其检测方法，整个提取过程不超过10分钟，既简化核酸提取过程，同时也大大节约成本，且无需进行纯化便可直接用于扩增。由于本试剂盒具有核酸得率高、实验操作简单、实验条件简易、成本低等优点，可广泛用于病原微生物检测，流行病学调查、菌群调查的核酸检测，对细菌高通量筛选尤为适用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种细菌快速裂解试剂盒，提取的核酸可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。

为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为：

1）从各种去污剂着手，筛选裂解细菌能力强的去污剂和最佳配比，以使整个裂解过程只需5分钟加热便能最大程度地释放细菌样本核酸。

2）在裂解细胞、释放核酸的同时，由于核酸的质量会影响PCR扩增的效果，需采用防止核酸降解的技术。

3）针对各种复杂的样本类型，如粪便、牛奶、食品等，确定相应的处理方法和检测步骤，以减少抑制物的干扰，最大程度保障后续的扩增检测。

通过反复的摸索，确定了细菌样本快速裂解试剂盒各组成成分及浓度，该试剂盒核酸得率高、实验操作简单，无需复杂的实验设备且成本低廉。

本发明所提供的细菌快速裂解试剂盒包括：（1）装有细菌裂解液的试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于细菌裂解液由月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、TE（pH7.4）组成。

本发明的另一个优选实施方案是细菌裂解液中月桂酰基肌氨酸钠的最佳浓度为5g/L。

本发明的另一个优选实施方案是细菌裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/L～200mmol/L。

本发明的另一个优选实施方案是细菌裂解液中TE（pH7.4）由10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA组成，pH为7.4。

本发明提供的细菌快速裂解试剂盒可以提取临床和食品样本中的细菌DNA，其中临床和食品样本包括菌液、咽拭子、肛拭子、粪便、牛奶、面包，细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

本发明另一个目的是提供一种细菌快速裂解的检测方法，包括不同样本类型的步骤如下：

1、菌液样本

（1）取过夜菌液100 μl离心弃上清收集菌体，或取一个菌落，将菌与50 μl 细菌裂解液混合，用枪头吹吸混匀；

（2）将混合物置于95 ℃孵育5 min；

（3）将孵育后的混合物在12,000 rpm条件下离心2 min，收集上清，即为细菌的核酸提取物。

2、咽拭子和肛拭子样本：

（1）待检拭子样本直接置于200 μl细菌裂解液中，充分搅拌洗脱拭子上的样本，在管壁挤压数次后弃拭子；

（2）震荡混匀，95 ℃孵育5 min；

（3）孵育后的样本12, 000 rpm离心2 min，收集上清，即为拭子样本的细菌核酸提取物。

3、粪便样本：

（1）采集0.1-0.2 g粪便样本，采集后立即放入无菌采便管内，加入1ml无菌生理盐水，震荡混匀，12, 000 rpm 离心2 min，弃上清，重复以上步骤再次洗涤沉淀，弃上清后用1 ml无菌生理盐水重悬沉淀，静置5min；

（2）取样本悬液（生理盐水悬液）25 μl，加入25 μl 细菌裂解液，震荡混匀，95℃孵育5 min；

（3）孵育后的样本12, 000 rpm离心2 min，收集上清，即为粪便样本的细菌核酸提取物。

4、牛奶样本：

（1）取牛奶0.5 ml于1.5 ml的无菌离心管中，12, 000 rpm离心5分钟，去最上层奶油与中间层上清，沉淀加1 ml无菌生理盐水吹打混匀；

（3）孵育后的样本12, 000 rpm离心2 min，收集上清，即为牛奶样本中的细菌核酸提取物。

5、面包样本：

（1）取面包0.3~0.5 g加入10ml无菌生理盐水中，震荡30s，静置5min；

（3）孵育后的样本12, 000 rpm离心2 min，收集上清，即为面包样本中的细菌核酸提取物。

该核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：①组分简单，且无昂贵的试剂，大大节约成本；②步骤简单，仅需三步；③提取速度快，整个提取过程不超过10分钟； ④样本中的核酸均保留在细菌裂解液中，核酸没有损失，且无需纯化，用于PCR扩增或荧光PCR检测，灵敏度高于现有技术。⑤无需核酸提取仪等复杂的设备，仅需水浴锅和离心机即可完成操作。对细胞壁厚的革兰氏阳性菌，含抑制物质较多的粪便、牛奶等样本具有更高的提取效率。

因此，本发明的试剂盒可广泛用于对临床和食品样本中细菌核酸进行快速提取，特别是待测样本数量较多时尤为适用。

附图说明

图1 显示本试剂盒对过夜培养的金黄葡萄球菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果。不同浓度梯度的金黄色葡萄球菌除浓度1×10²CFU/ml的样本无Ct值判为阴性外，其余浓度的样本扩增曲线均呈S型，浓度为1×10⁵CFU/ml、1×10⁴CFU/ml、1×10³CFU/ml的金黄色葡萄球菌样本的Ct值分别为23.81、27.9、30.97，可明确判为阳性。

图2 显示本试剂盒对过夜培养的沙门氏菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果。不同浓度梯度的沙门氏菌除浓度1×10¹CFU/ml的样本无Ct值判为阴性外，其余浓度的样本扩增曲线均呈S型，浓度为1×10⁵CFU/ml、1×10⁴CFU/ml、1×10³CFU/ml、1×10²CFU/ml的金黄色葡萄球菌样本的Ct值分别为23.47，26.51，29.65，32.93，可明确判为阳性。

图3 显示本试剂盒对过夜培养的蜡样芽胞杆菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果。不同浓度梯度的蜡样芽胞杆菌除浓度1×10²CFU/ml的样本无Ct值判为阴性外，其余浓度的样本扩增曲线均呈S型，浓度为1×10⁵CFU/ml、1×10⁴CFU/ml、1×10³CFU/ml、1×10²CFU/ml的金黄色葡萄球菌样本的Ct值分别为 20.77，25.06，29.02，可明确判为阳性。

图4 显示本试剂盒对咽拭子中提取的口腔链球菌属核酸进行荧光PCR检测结果。两份口腔链球菌阳性的咽拭子样本的扩增曲线均呈S型，Ct值分别为17.53和19.16，检测为口腔链球菌属阳性。

图5 显示本试剂盒对面包、牛奶、粪便样本中提取的金黄色葡萄球菌核酸进行荧光PCR检测结果。金黄色葡萄球菌阳性的面包、牛奶和粪便样本的扩增曲线均呈S型，Ct值分别为16.64、17.06和17.5，检测为金黄色葡萄球菌阳性。

图6 显示本试剂盒提取过夜培养的金黄色葡萄球菌的核酸与Qiagen柱提试剂提取的核酸进行荧光定量PCR的对比实验结果。Qiagen柱提试剂荧光PCR结果Ct值为16.64，本试剂盒荧光PCR结果Ct值为10.39，比Qiagen柱提试剂的Ct值提前6.25。两条扩增曲线均呈S型。

图7 显示不同二硫苏糖醇浓度的细菌样本裂解液进行PCR电泳检测结果。泳道1-9分别对应二硫苏糖醇浓度200mM、150mM、100mM 、50mM、20mM、10mM 、1mM 、0 mM和阴性对照。

具体实施方式

本发明实施方式的描述，旨在通过举例说明更好地理解本发明的本质，而不是限制本发明。

本发明实施方式所用的实验材料，如没有特别说明，均为市售产品。

实施例1：细菌样本快速裂解试剂盒制备及其使用方法（适用于菌液检测）

1. 制备细菌样本快速裂解试剂盒（50测试/盒）：细菌裂解液（1.25ml /管）2管。

2. 标本采集

取过夜生长的菌液100 μl，8, 000 rpm离心2 min，收集菌体，弃上清。

3. 检测步骤

菌体沉淀加入50 μl细菌裂解液，震荡混匀，95 ℃孵育5 min；孵育后的样本12, 000 rpm离心2 min，收集上清。

上清可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。

实施例2：细菌样本快速裂解试剂盒制备及其使用方法（适用于咽拭子和肛拭子）

1. 制备细菌样本快速裂解试剂盒（50测试/盒）：细菌裂解液（5ml/瓶）2瓶。

2. 标本采集、保存

1）咽拭子：用专用采样拭子，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将拭子放采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。

2）肛拭子：用专用采样拭子在生理盐水中浸湿，******2-3cm处，自***周围皱襞处拭取，或在***口内轻轻旋转涂擦；迅速将拭子放采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。

以上标本可立即用于测试，也可放置在-20℃±5℃条件下长期保存。

3．检测步骤

实施例3：细菌样本快速裂解试剂盒制备及其使用方法（适用于粪便）

2. 标本采集、保存

采集0.1~0.2 g粪便样本，采集后立即放入无菌采便管内，加入1ml无菌生理盐水，震荡混匀，12, 000 rpm 离心2 min，弃上清，重复以上步骤再次洗涤沉淀，弃上清后用1 ml无菌生理盐水重悬沉淀，静置5min。

3. 检测步骤

取样本悬液（生理盐水悬液）25 μl，加入25 μl 细菌裂解液，震荡混匀，95℃孵育5 min；孵育后的样本12, 000 rpm离心2 min，收集上清。

实施例4：细菌样本快速裂解试剂盒制备及其使用方法（适用于牛奶）

2. 标本采集、保存

取牛奶0.5 ml于1.5 ml的无菌离心管中，12, 000 rpm离心5分钟，去最上层奶油与中间层上清，沉淀加1 ml无菌生理盐水吹打混匀。

3. 检测步骤

实施例5：细菌样本快速裂解试剂盒制备及其使用方法（适用于面包）

2. 标本采集、保存

取面包0.3~0.5 g加入10ml无菌生理盐水中，震荡30s，静置5min；

3. 检测步骤

实施例6：使用本试剂盒从不同浓度的金黄色葡萄球菌液中提取的核酸进行灵敏度试验。

（1）将在BHI培养基中过夜培养的金黄色葡萄球菌用生理盐水稀释到1×10⁵CFU/ml、1×10⁴CFU/ml、1×10³CFU/ml、1×10²CFU/ml；

（2）以上4个稀释度的菌液各取100μl置于离心管中；

（3） 12,000 rpm离心1 分钟，弃上清；

（4）加入50 μl 细菌裂解液，震荡混匀；

（5）将混合物置于95 ℃孵育5 min；

（6）将孵育后的样本在12,000 rpm离心2分钟，收集上清，即得到样本的核酸；

（7）取2μl 核酸样本进行荧光PCR扩增。使用上游引物Staph F，序列为5’ -CAGCAGCCGCGGTAATA-3’ （SEQ ID NO：1）, 下游引物Staph R，序列为5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3’ （SEQ ID NO： 2）和探针Staph probe，序列为5’-CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC-3’ （SEQ ID NO： 3），探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。使用Takara公司的Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对金黄色葡萄球菌16S rDNA进行荧光PCR扩增，扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。

由附图1所示的检测结果可知，本试剂盒提取的金黄色葡萄球菌菌液的灵敏度为1×10³CFU/ml。

实施例7：使用本试剂盒从不同浓度的沙门氏菌液中提取的核酸进行灵敏度试验。

（1）将在BHI培养基中过夜培养的沙门氏菌用生理盐水稀释到1×10⁵CFU/ml、1×10⁴CFU/ml、1×10³CFU/ml、1×10²CFU/ml、1×10¹CFU/ml；

（2）以上5个稀释度的菌液各取100μl置于离心管中；

（3） 12,000 rpm离心1 分钟，弃上清；

（4）加入50 μl 细菌裂解液，震荡混匀；

（5）将混合物置于95 ℃孵育5 min；

（7）取2μl 核酸样本进行荧光PCR扩增。使用上游引物invA F ，序列为5’ - CCGCCAAACCTAAAACCAG -3’ (SEQ ID NO：7)，下游引物invA R 5’- GAGCTTTTTCCAGATCTTCACGC -3’ (SEQ ID NO：8) 和荧光探针invA probe，序列为5’- CTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAG -3’ (SEQ ID NO：9) ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系; 扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。

由附图2所示的检测结果可知，本试剂盒提取的沙门氏菌菌液的灵敏度为1×10²CFU/ml。

实施例8：使用本试剂盒从不同浓度的蜡样芽胞杆菌菌液中提取的核酸进行灵敏度试验。

（1）将在BHI培养基中培养18~24小时的蜡样芽胞杆菌菌液用生理盐水稀释到1×10⁵CFU/ml、1×10⁴CFU/ml、1×10³CFU/ml、1×10²CFU/ml；

（2）以上4个稀释度的菌液各取100μl置于离心管中；

（3） 12,000 rpm离心1 分钟，弃上清；

（4）加入50 μl 细菌裂解液，震荡混匀；

（5）将混合物置于95 ℃孵育5 min；

（7）取2μl 核酸样本进行荧光PCR扩增。使用上游引物murB F ，序列为5’ - CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG -3’ (SEQ ID NO：10)，下游引物murB R 5’-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3’ (SEQ ID NO：11) 和荧光探针murB probe，序列为5’- TGTAATGGTTGTTCGCAAATACACTC-3’ (SEQ ID NO：12) ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。

由附图3所示的检测结果可知，本试剂盒提取蜡样芽胞杆菌菌液，其检测灵敏度为1×10³CFU/ml。

实施例9：使用本试剂盒对咽拭子中提取的口腔链球菌属核酸进行荧光PCR检测。

（1）取两个健康人的咽拭子，刷拭牙龈及口腔壁，将拭子洗脱在400μl生理盐水中；

（2） 12,000 rpm离心1 分钟，弃上清；

（3）加入50 μl 细菌裂解液，震荡混匀；

（4）将混合物置于95 ℃孵育5min；

（5）将孵育后的样本在12,000 rpm离心2分钟，收集上清，即得到样本的核酸；

（6）取2μl 核酸样本进行荧光PCR扩增。上游引物Strep F，序列为5’ –AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO：4），下游引物Strep R，序列为5’ CGYCCATTGCCGAAGATTCC 3’（SEQ ID NO：5）和探针 Strep probe ，序列为5’ –AGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGG-3’（SEQ ID NO：6），探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。使用Takara公司的Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对口腔链球菌属16S rDNA进行荧光PCR扩增，扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。

如附图4所示的检测结果可知，本试剂盒提取的两份咽拭子样本进行荧光PCR检测均为口腔链球菌属阳性。

实施例10：使用本试剂盒对面包、牛奶、粪便样本提取的金黄色葡萄球菌核酸进行荧光PCR检测。

（1）样本准备：

a) 面包样本：取面包0.3~0.5 g加入10ml混有1×10⁷CFU/ml金黄色葡萄球菌的生理盐水中，震荡混匀，静置5min；

b) 牛奶样本：取牛奶0.5 ml于1.5 ml的无菌离心管中，12, 000 rpm离心5分钟，去最上层奶油与中间层上清，沉淀加1 ml混有1×10⁷CFU/ml金黄色葡萄球菌的生理盐水，震荡混匀。

c) 粪便样本：采集0.1~0.2 g粪便样本，采集后立即放入无菌采便管内，加入10ml混有1×10⁷CFU/ml金黄色葡萄球菌的生理盐水充分混匀，静置5min。

（2）取三种样本的生理盐水悬液25 μl，加入25 μl 细菌裂解液，震荡混匀，95℃孵育5 min；

（3）将孵育后的样本在12,000 rpm离心2分钟，收集上清，即得到样本的核酸；

（4）取2μl 核酸样本进行荧光PCR扩增，用上游引物Staph F，序列为5’ -CAGCAGCCGCGGTAATA-3’（SEQ ID NO：1）, 下游引物Staph R，序列为5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3’（SEQ ID NO：2）和探针Staph probe，序列为5’-CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC-3’（SEQ ID NO：3），探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。使用Takara公司的Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对金黄色葡萄球菌16S rDNA进行荧光PCR扩增，扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。

如附图5所示的检测结果可知，本试剂盒提取金黄色葡萄球菌阳性的面包、牛奶和粪便样本进行荧光PCR检测均为金黄色葡萄球菌阳性。

实施例11：以过夜培养的金黄色葡萄球菌为样本，本试剂盒提取的核酸与Qiagen柱提试剂（QIAamp DNA Mini Kit，货号51304）提取的核酸用于荧光定量PCR的对比实验结果。

两种核酸提取方法的操作步骤对比见下表：

操作步骤	Qiagen柱提试剂	本试剂盒
			样本处理	取1 ml过夜培养菌液，7500 rpm离心5 min，去上清，加入180 μl Buffer ATL、20 μl Proteinase K，vortex 15 s混匀	取200 μl过夜培养菌液，12000 rpm离心2 min，去上清，加入50 μl 细菌裂解液
裂解1	56 ℃孵育10 min，中间混匀数次	95 ℃孵育5 min
			样本处理2	向上步样本中加入200 μl Buffer AL，Vortex 15 s混匀
裂解2	70 ℃孵育10 min
				加入200 μl无水乙醇，Vortex 15 s混匀
柱结合	将上步产物转移至DNA结合柱中，8000 rpm离心1 min
			清洗1	向结合柱中加入500 μl Buffer AW1，8000 rpm离心1 min
清洗2	向结合柱中加入500 μl Buffer AW2，14000 rpm离心3 min
			DNA洗脱	将结合柱转移至1.5 ml离心管中，加入200 μl Buffer AE或H₂O，室温放置1 min后，8000 rpm离心1 min洗脱	12000 rpm离心2 min

分别取2μl核酸样本对金黄色葡萄球菌16S rDNA进行荧光PCR扩增。使用上游引物Staph F，序列为5’ -CAGCAGCCGCGGTAATA-3’（SEQ ID NO：1）, 下游引物Staph R，序列为5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3’（SEQ ID NO：2）和探针Staph probe，序列为5’-CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC-3’ （SEQ ID NO：3），探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。使用Takara公司的Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。

对比检测结果如附图6所示，本试剂盒的Ct值比Qiagen柱提试剂的Ct值提前6.25，说明本试剂盒的核酸得率比Qiagen柱提试剂高，约为对方的76倍。

实施例12：摸索裂解液配方中二硫苏糖醇的最佳浓度。

（1）配制0、1mM、10mM、20mM、50mM、100mM、150mM及200mM不同二硫苏糖醇浓度梯度的裂解液；

（2）取100μl过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液，12,000 rpm离心1 分钟，弃上清；

（3）加入50 μl 细菌裂解液，震荡混匀；

（4）将混合物置于95 ℃孵育2 min；

（6）取2μl核酸样本进行普通PCR扩增，使用上游引物Staph F，序列为5’ -CAGCAGCCGCGGTAATA-3’（SEQ ID NO：1）和下游引物Staph R，序列为5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3’（SEQ ID NO：2）。PCR体系为：50 mM Tris-HCl(pH8.3)，100 mM KCl，2 mM MgCl2， 0.2 mM dNTP，正、反向引物各50nM，1 M Betaine，DNA聚合酶0.2U/μl；扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30 s，58℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；

（7）取10μl PCR产物进行电泳。

电泳结果如附图7所示。含不同浓度二硫苏糖醇的裂解液均能得到288bp的目的条带，添加二硫苏糖醇能增强裂解效率。，浓度在0-20mM的范围内所得核酸的浓度随二硫苏糖醇浓度增加而递增，而在20mM-200mM的范围内，裂解效率变化不大。所以细菌裂解液中二硫苏糖醇浓度的优先范围为20mM-200mM。

<110> 南京美宁康诚生物科技有限公司

<120>一种细菌快速裂解试剂盒及其检测方法

<140>

<141>

<160>12

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。

<400>1

CAGCAGCCGCGGTAATA

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。

<400> 2

GGACTACCAGGGTATCTAATCC

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。

<400> 3

CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。

<400> 4

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。

<400> 5

CGYCCATTGCCGAAGATTCC

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。

<400> 6

AGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGG

<210>7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。

<400>7

CCGCCAAACCTAAAACCAG

<210>8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。

<400> 8

GAGCTTTTTCCAGATCTTCACGC

<210>9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。

<400> 9

CTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTAC

<210>10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。

<400> 10

CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG

<210>11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。

<400> 11

GTYGTAATGACAGGTGATGGA

<210>12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。

<400> 12

TGTAATGGTTGTTCGCAAATACACTC

Claims

1.一种细菌快速裂解试剂盒，试剂盒包括：（1）装有细菌裂解液的试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中细菌裂解液由月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、pH7.4的TE组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于细菌裂解液中月桂酰基肌氨酸钠的最佳浓度为5g/L。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于细菌裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/L～200mmol/L。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于细菌裂解液中pH7.4的TE由10mmol/L Tris、1mmol/L EDTA组成，pH为7.4。

5.根据权利要求1所述的试剂盒用于提取临床和食品样本中的细菌DNA，其中临床和食品样本包括菌液、咽拭子、肛拭子、粪便、牛奶、面包，细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

6.一种细菌快速裂解的检测方法，针对菌液样本包括如下检测步骤：

(1) 取过夜菌液100μl离心弃上清收集菌体，或取一个菌落，将菌与50μl细菌裂解液混合，用枪头吹吸混匀；

(2) 将混合物置于95℃孵育5min；

(3) 将孵育后的混合物在12,000rpm条件下离心2min，收集上清，即为细菌的核酸提取物。

7.一种细菌快速裂解的检测方法，针对咽拭子和肛拭子样本包括如下检测步骤：

(1) 待检拭子样本直接置于200μl细菌裂解液中，充分搅拌洗脱拭子上的样本，在管壁挤压数次后弃拭子；

(2) 震荡混匀，95℃孵育5min；

(3) 孵育后的样本12,000 rpm离心2min，收集上清，即为拭子样本的细菌核酸提取物。

8.一种细菌快速裂解的检测方法，针对粪便样本包括如下检测步骤：

(1) 采集0.1-0.2g粪便样本，采集后立即放入无菌采便管内，加入1ml无菌生理盐水，震荡混匀，12,000rpm 离心2min，弃上清，重复以上步骤再次洗涤沉淀，弃上清后用1ml无菌生理盐水重悬沉淀，静置5min；

(2) 取样本生理盐水悬液25μl，加入25μl 细菌裂解液，震荡混匀，95℃孵育5min；

(3) 孵育后的样本12,000rpm离心2min，收集上清，即为粪便样本的细菌核酸提取物。

9.一种细菌快速裂解的检测方法，针对牛奶样本包括如下检测步骤：

(1) 取牛奶0.5ml于1.5ml的无菌离心管中，12,000rpm离心5分钟，去最上层奶油与中间层上清，沉淀加1ml无菌生理盐水吹打混匀；

(3) 孵育后的样本12,000rpm离心2min，收集上清，即为牛奶样本中的细菌核酸提取物。

10.一种细菌快速裂解的检测方法，针对面包样本包括如下检测步骤：

(1) 取面包0.3~0.5g加入10ml无菌生理盐水中，震荡30s，静置5min；

(2) 取样本生理盐水悬液25μl，加入25μl细菌裂解液，震荡混匀，95℃孵育5min；

(3) 孵育后的样本12,000rpm离心2min，收集上清，即为面包样本中的细菌核酸提取物。