RU2820832C1 - Способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени - Google Patents

Способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Download PDF

Info

Publication number
RU2820832C1
RU2820832C1 RU2023116732A RU2023116732A RU2820832C1 RU 2820832 C1 RU2820832 C1 RU 2820832C1 RU 2023116732 A RU2023116732 A RU 2023116732A RU 2023116732 A RU2023116732 A RU 2023116732A RU 2820832 C1 RU2820832 C1 RU 2820832C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
agent
causative agent
pasteurella multocida
control sample
Prior art date
Application number
RU2023116732A
Other languages
English (en)
Inventor
Олег Юрьевич Черных
Василий Александрович Баннов
Ирина Михайловна Донник
Федор Иванович Василевич
Андрей Георгиевич Кощаев
Роман Анатольевич Кривонос
Василий Иванович Белоусов
Александр Алексеевич Шевченко
Людмила Васильевна Шевченко
Марина Петровна Семененко
Сергей Николаевич Забашта
Николай Иванович Дмитрив
Павел Павлович Яковенко
Алина Юрьевна Манакова
Алексей Вадимович Басанкин
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина"
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина"
Application granted granted Critical
Publication of RU2820832C1 publication Critical patent/RU2820832C1/ru

Links

Abstract

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Разработан способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) у животных методом полимеразной цепной реакции. Способ осуществляется методом амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Выделяют ДНК возбудителя инфекционного заболевания сорбционным методом из материалов животных: кровь, сыворотку крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов, лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа, а также, используются корма, культуры микроорганизмов, смывы с поверхностей. Далее осуществляют постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени. Используют специфичные для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидные праймеры, зонды, флуоресцентные красители. Внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3', T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3', Т4Р: СУ5-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1, для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью 5'-3': Pm-F: 5'-AACGTCCAATCAGTTGCGCC-3', Pm-R: 5'-AGTGGGCTTGTCGGTAGTC-3', Pm-P R6G-5'-CTCAACACACCAAACTCTGCCCAAC-3'-BHQ1. Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности при выявлении возбудителя пастереллеза (Pasteurella multgbiSa). 1 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных с помощью полимеразной цепной реакции.
Известен в медицине способ диагностики криптоспоридиоза включающий гистологическое исследование биоптата, дофиксацию срезов метанолом, экспозицию при окраске карболовым фуксином осуществляют в течение 5-10 мин, в качестве деклорайзера применяют 5% серную кислоту. Способ обеспечивает положительный эффект в виде выявления объективных критериев диагностики криптоспоридиоза, обеспечивающих тактику лечения (патент РФ №2229128, кл. G01N 1/30, 2004 г.).
Наиболее близким по технической сущности является изобретение по патенту RU №2785435, кл. C12Q 1/68, 2022 г., способ выявления токсиген-ных pasteurella multocida методом ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из материала, постановку полимеразной цепной реакции.
Недостатком известного технического решения является недостаточные возможности выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале (кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов (легкие, селезенка и др.), лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа) и кормах, а также в культурах микроорганизмов, смывах с поверхностей методом амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», а также недостаточная точность при выявлении возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida).
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности при выявлении возбудителя пастереллеза (Pasteurella multgbiSa)]
Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающем выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из материала, постановку полимеразной цепной реакции, согласно изобретению, выделение ДНК проводят сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией осуществляют в один этап с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью 5'-3':
при этом для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный. ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) выделяют из материала по выбору: кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов, лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа, кормов, культур микроорганизмов, смывов с поверхностей.
Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что идентификацию ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) проводят с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда, за счет того, что выделение ДНК проводят сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией осуществляют в один этап с проведением 40 циклов амплификации, а также за счет внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью 5'-3':
при этом для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Claims (6)

1. Способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающий выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из материала, постановку полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, выделение ДНК проводят сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией осуществляют в один этап с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью 5'-3':
,
при этом для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
2. Способ по п. 1, где ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) выделяют из материала по выбору: кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов, лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа, кормов, культур микроорганизмов, смывов с поверхностей.
RU2023116732A 2023-06-23 Способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени RU2820832C1 (ru)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2820832C1 true RU2820832C1 (ru) 2024-06-10

Family

ID=

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2477321C1 (ru) * 2012-02-20 2013-03-10 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) Способ выявления патогенных штаммов и изолятов бактерии pasteurella multocida
RU2551962C1 (ru) * 2014-05-20 2015-06-10 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БАКТЕРИИ Pasteurella multocida КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА СЕРОГРУПП A, B, D, E, F В МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
RU2562167C1 (ru) * 2014-02-11 2015-09-10 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СПОСОБЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ И ИЗОЛЯТОВ БАКТЕРИИ Pasteurella multocida СЕРОГРУППЫ D У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.
RU2785435C1 (ru) * 2022-05-24 2022-12-07 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОКСИГЕННЫХ Pasteurella multocida МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2477321C1 (ru) * 2012-02-20 2013-03-10 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) Способ выявления патогенных штаммов и изолятов бактерии pasteurella multocida
RU2562167C1 (ru) * 2014-02-11 2015-09-10 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СПОСОБЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ И ИЗОЛЯТОВ БАКТЕРИИ Pasteurella multocida СЕРОГРУППЫ D У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.
RU2551962C1 (ru) * 2014-05-20 2015-06-10 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БАКТЕРИИ Pasteurella multocida КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА СЕРОГРУПП A, B, D, E, F В МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
RU2785435C1 (ru) * 2022-05-24 2022-12-07 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОКСИГЕННЫХ Pasteurella multocida МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
А.В. НЕФЕДЧЕНКО, А.Н. ШИКОВ и др., ВЫЯВЛЕНИЕ Pasteurella multocida И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПЯТИ ЕЕ КАПСУЛЬНЫХ ГРУПП ПРИ ПОМОЩИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ, СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2017, том 52, N 2, с. 401-408. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2680094C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных
EP1633884A1 (en) Identification of clonal cells by repeats in (eg.) t-cell receptor v/d/j genes
CN111088380A (zh) 布鲁氏菌lf-rpa检测引物和探针及检测试剂盒
CN114457197A (zh) Raa荧光法检测fpv的引物探针组及试剂盒
RU2681473C1 (ru) Тест-система для обнаружения генома вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
RU2820832C1 (ru) Способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2703401C1 (ru) Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней
CN111926110B (zh) 非洲猪瘟病毒实时荧光pcr扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒
RU2703394C1 (ru) Способ выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней
RU2700481C1 (ru) Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей
RU2819044C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя моракселлеза KPC (Moraxella bovis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2698662C1 (ru) Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей
RU2703400C1 (ru) Способ выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных
RU2814556C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2814548C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
CN111778343A (zh) 一种检测布鲁氏菌s2疫苗株的引物对、试剂盒及其应用
RU2782427C1 (ru) Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2785381C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2719719C1 (ru) Способ выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2728660C1 (ru) Способ определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле
RU2700478C1 (ru) Способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных
CN113817837B (zh) 一段来源于细粒棘球绦虫的游离dna序列及其应用
RU2726432C1 (ru) Тест-система для определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле
RU2696306C1 (ru) Способ выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных
RU2740097C1 (ru) Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов