CN110257281A - 防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法 - Google Patents

防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法，其菌株为蜡样芽孢杆菌菌株SM02，从盐碱土中分离获得，可用于生物防治制剂，该蜡样芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景；此外，由该蜡样芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治杨树溃疡病，还能有效促进杨树生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂，该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治杨树溃疡病。

Description

防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体为防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法。
背景技术
杨树是我国重要的工业人工林树种，由于长期连作经营，导致林地生产力逐代下降，病害发生频繁，严重影响杨树生产的稳定和可持续发展。杨树溃疡病又叫水泡型溃疡病，是杨树上危害最严重的病害之一，其病原真菌有葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）、疡壳孢属（Dothichiza）、盾囊霉属（Coniothyrium）、腐皮壳属（Valsa）、棒盘孢属（Coryneum）、从赤壳属（Nectria）、茎点霉属（Phoma）等；在我国，多报道为葡萄座腔菌属（Botryosphaeria），该属真菌是一类世界广泛分布的病原真菌。杨树溃疡病主要发生在枝干部，引起皮层局部溃疡性坏死等。该病在4月份开始发病，5月下旬至6月形成第1个发病高峰，7～8月病势减缓，9月出现第2个发病高峰，10月以后病势减弱。目前，杨树溃疡病在我国各杨树栽植区均有发生且危害严重，是阻碍杨树产业发展的重要因素之一。
对于杨树溃疡病的防治，目前生产上主要依靠林业栽培管理措施和化学农药进行防治。但由于该病具有较长的潜伏期、较长的发病周期和多点危害的特点，在防治中需要一个生长周期多次处理、多次施用化学农药，才能较好的控制其危害。存在防治成本高、耗时长、污染环境等问题。因此，寻求新的经济高效、绿色环保的防治技术与途径已成为当前杨树溃疡病防治中迫切解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法，具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等优点，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌，菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株SM02；
从盐碱土中分离获得，其生物学特性为：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB（Luria-Bertani）培养基上该菌株形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央***、边缘整齐，后期有褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动；以大肠杆菌为对照，经革兰氏染色呈阳性；经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
更进一步地，蜡样芽孢杆菌菌株SM02的培养方法，包括以下步骤：
S1：普通培养保存采用LB培养基，配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0-7.2；
S2：实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0-7.2；
S3：固体培养基配方：固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐的比例为质量比98.7∶0.3；所述固料由质量比为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮=55∶25∶15∶5的组成；所述无机盐按质量百分比计，包含20%磷酸二氢钾，5%硫酸镁，10%硫酸铵，65%轻质碳酸钙；
S4：大量发酵培养配方：同S3中固体培养基配方。
本发明提供另一种技术方案：
防治杨树溃疡病的生物防治制剂，包括所述的蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02。
更进一步地，防治杨树溃疡病的生物防治制剂的制备方法如下：
S1：制备所述蜡样芽孢杆菌的种子液；
S2：将S1中制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养；
S3：将S2中培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。
本发明还提供一种技术方案为：
防治杨树溃疡病的生物防治方法，包括向具有溃疡病的杨树植株施用上述蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02或者上述生物防治制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法，其蜡样芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
2、本发明提供的防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法，由该蜡样芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治杨树溃疡病，还能有效促进杨树生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂，该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治杨树溃疡病。
具体实施方式
以下将详细说明本发明实施例，然而，本发明实施例并不以此为限。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中：防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌，菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株SM02，从盐碱土中分离获得，已于2019年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No. 17337；
其生物学特性为：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB（Luria-Bertani）培养基上该菌株形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央***、边缘整齐，后期有褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动；以大肠杆菌为对照，经革兰氏染色呈阳性；经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
本实施例中，蜡样芽孢杆菌菌株SM02的培养方法或繁殖方法，包括以下步骤：
步骤1）：普通培养保存采用LB培养基，配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0-7.2；
步骤2）：实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0-7.2；
步骤3）：固体培养基配方：固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐的比例为质量比98.7∶0.3；所述固料由质量比为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮=55∶25∶15∶5的组成；所述无机盐按质量百分比计，包含20%磷酸二氢钾，5%硫酸镁，10%硫酸铵，65%轻质碳酸钙；
步骤4）：大量发酵培养配方：同步骤3）中固体培养基配方。
本发明提供另一种用于防治杨树溃疡病的生物防治制剂，包括所述的蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02；
并且，还提供用于防治杨树溃疡病的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1）：制备所述蜡样芽孢杆菌的种子液；
步骤2）：将S1中制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养；
步骤3）：将S2中培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。
在本发明的一个具体实施方案中，上述制备方法包括以下步骤：
第一步：将所述蜡样芽孢杆菌的孢子移植到LB液体培养基，28-30℃摇床振荡培养3-5d得到种子液；
第二步：将第一步制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3-5 d；
第三步：将第二步培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8-9 d；活性菌可达到30-40亿/克；
其中，第一步中的LB液体培养基，配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0-7.2。
第二步中的固体培养基由固料和无机盐组成，所述固料和无机盐的质量比为98.7∶0.3；所述固料由质量比为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮=55∶25∶15∶5的组成；所述无机盐按质量百分比计，包含20%磷酸二氢钾，5%硫酸镁，10%硫酸铵，65%轻质碳酸钙。
第三步中的发酵培养基同第二步的固体培养基。
本发明还提供一种技术方案为：防治杨树溃疡病的生物防治方法，包括向具有溃疡病的杨树植株施用上述蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02或者上述生物防治制剂。
为了进一步更好的解释说明本发明，通过以下实施例做出更进一步的说明，使其公开更为充分：
实施例一：
1、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）SM02的分离与纯化：
本发明的蜡样芽孢杆菌（B. cereus）SM02是从盐碱土中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
第一步：蜡样芽孢杆菌的分离：土样的采集，在东营采集盐碱土，混匀；称取1 g土壤于100 mL无菌水中，置于30℃摇床中150 rpm震荡10 min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况；然后采用平板划线法，纯化蜡样芽孢杆菌菌株，并编号保存。
第二步：杨树溃疡病高效拮抗蜡样芽孢杆菌的筛选：
1）初筛：采用对峙培养法，制备PDA（Potato Dextrose Agar）平板，用打孔器在蜡样芽孢杆菌、杨树溃疡病边缘取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，30℃恒温培养，逐日观察蜡样芽孢杆菌对病原菌的抑制作用；
2）复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的蜡样芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
通过大量筛选工作得到一株能够高效防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌（B. cereus）SM02；实验证明，该蜡样芽孢杆菌菌液在防治杨树溃疡病中显示出非常高效的防治效果，使得杨树长势良好，因而，本发明的蜡样芽孢杆菌是具有广泛应用前景的蜡样芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治杨树溃疡病的生物防治制剂。
2、菌株鉴定：
（1）微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上该菌株形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央***、边缘整齐，后期有褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性（以大肠杆菌为对照）；经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形，中生或近中生，抱囊不膨大；
（2）分子生物学特性：该菌株的16s rRNA基因序列测定结果如下（SEQ-1）：
CTTCTATACATGCAGTAGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGACGAAGGGTGAT
（3）细胞形态和理化实验结果：
表1 蜡样芽孢杆菌（B. cereus）SM02的细胞形态和理化实验结果
实验项目 结果 实验项目 结果
革兰氏染色 阳性 碳水化合物产酸 +
细胞形状 杆状 葡萄糖 +
细胞直径﹥1 μm － 木糖 +
形成芽孢 + L-***糖 +
芽孢膨大 － 甘露醇 －
芽孢圆形 － 乳糖 －
伴孢晶体 － 发酵葡萄糖产气 +
接触酶 + 利用柠檬酸盐 +
氧化酶 + 50℃生长 +
厌氧生长 － pH 5.7生长 +
VP试验 + 7% NaCl生长 +
VP﹤pH 6 + 淀粉水解 +
VP﹥pH 7 － 分解酪素 +
硝酸盐还原 + 水解明胶 +
实施例二：
1、蜡样芽孢杆菌菌种发酵过程：
LB液体培养基配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0-7.2；
固料为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮=55∶25∶15∶5；无机盐溶液为20%磷酸二氢钾，5%硫酸镁，10%硫酸铵，65%轻质碳酸钙；固液比为98.7∶0.3（质量比）。
蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02大量固体发酵过程：
第一步：菌种种子液培养：将蜡样芽孢杆菌菌株（B. cereus）SM02从试管斜面中挑取少量细菌，移至LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养3-5 d，此为种子液；
第二步：固体生产菌种的培养：将种子液按10%的比例接种到固体培养基（500 mL三角瓶）中，30℃恒温培养3-5 d，中间多次振荡；
第三步：大量固体发酵：将第二步中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基，将接种的原料置于发酵室（30℃和相对湿度85%以上）中发酵培养8-9 d，即可得到芽孢杆菌原粉，活性菌可达到40亿/克。
试验结果表明：蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02发酵液防治杨树溃疡病效果显著，防治效果达到67.81%，且杨树长势良好，无药害产生。
实施例三：
为了明确蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02发酵液对杨树溃疡病的防治效果，为其推广应用提供依据，本发明于2018年4月-10月在德州市夏津县进行试验，现将试验结果报告如下：
1、供试材料及方法
1.1供试药剂：按本发明实施例1发酵方法生产的蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02发酵液（5亿/毫升菌液）；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂（山东乐邦化学品有限公司生产，市售）。
1.2试验材料与防治对象：试验材料为杨树，防治对象为杨树溃疡病。
1.3试验地情况：试验地设在德州市夏津县，试验土壤类型为褐土，有机质含量为0.53%，pH值为7.8，所有试验小区管理措施一致，施药时杨树溃疡病处于发病初期。
1.4试验设计及安排：本试验共3个处理，分别为蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02发酵液10倍液、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂100倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理60株，于2018年4月15日、5月20日、8月22日各喷洒一次，喷药器械为工农—16型喷雾器。
1.5试验调查及计算方法
1.5.1气象条件：第1次施药（4月15日）当日晴，风力3级，最高气温为19℃，最低气温为8℃，相对湿度为61%。第2次施药（5月20日），当日多云，风力3级，最高气温为26℃，最低气温为16℃，相对湿度为64%；第3次施药（8月22日），当日多云，风力3级，最高气温为28℃，最低气温为20℃，相对湿度为70%。
1.5.2药效及安全性调查
药效调查：最后一次施药后14 d进行调查，每个处理调查50株，调查主干下部树皮，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。
安全性调查：于第一次施药后7 d和14 d观察杨树的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
杨树溃疡病分级方法（以单株为单位）：
0级：无病班。
1级：病斑面积占整个树干面积的1/4以下。
2级：病斑面积占整个树干面积的1/4~2/4。
3级：病斑面积占整个树干面积的2/4~3/4。
4级：病斑面积占整个树干面积的3/4以上。
1.5.3药效计算方法
防治效果按式（1）、（2）计算：
（1）
（2）
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0————药剂处理前施药前病情指数；
PT1————药剂处理后施药后病情指数。
1.5.4对杨树的直接影响
观察药剂对杨树有无药害，记录药害的类型和程度，此外，也要记录对杨树长势的影响，用下列方式记录药害：
（a）如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高。
（b）在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：
① 按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋表示。
药害分级方法：
—：无药害；
＋：轻度药害，不影响林木生长；
＋＋：中度药害，可复原，不会造成林木减产；
＋＋＋：中度药害，影响林木正常生长，对林木产量和质量造成一定程度的损失；
＋＋＋＋：严重药害，林木生长受阻，产量和质量损失严重。
② 将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率，同时，要准确描述植物的药害症状（矮化、褪绿、畸形等）。
2结果
2.1供试药剂对杨树溃疡病的防治效果
表3结果显示，蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02发酵液和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂对杨树溃疡病均具有较好的防治效果，其中前者的防治效果达到60%以上。
从杨树溃疡病田间试验的病情指数来看（表3），最后一次施药后14 d，蜡样芽孢杆菌（B. cereus）SM02防治效果为67.81%，明显高于70%甲基硫菌灵可湿性粉剂49.51%的防治效果。
表2 三种药剂处理前杨树溃疡病病害情况
表3 三种药剂处理对杨树溃疡病的防治效果
2.2 杨树安全性调查：经施药7 d和14 d观察，各药剂处理区与对照区相比，杨树生长正常，无药害产生，说明蜡样芽孢杆菌菌液对杨树安全。
综上：（1）从病情指数和防治效果来看，蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02（保藏号CGMCC No. 17338）对杨树溃疡病具有较好的防治效果，最后一次施药后14 d其防治效果达到60%以上；（2）从杨树长势看，蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02对杨树具有明显的促进生长效果，没有药害，安全可靠。
综上所述：本发明提供的防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌及生物防治制剂和方法，其蜡样芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景；此外，由该蜡样芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治杨树溃疡病，还能有效促进杨树生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂，该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治杨树溃疡病。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.防治杨树溃疡病的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株SM02；
从盐碱土中分离获得，其生物学特性为：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB（Luria-Bertani）培养基上该菌株形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央***、边缘整齐，后期有褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动；以大肠杆菌为对照，经革兰氏染色呈阳性；经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
2.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌菌株SM02的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：普通培养保存采用LB培养基，配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0-7.2；
S2：实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0-7.2；
S3：固体培养基配方：固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐的比例为质量比98.7∶0.3；所述固料由质量比为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮=55∶25∶15∶5的组成；所述无机盐按质量百分比计，包含20%磷酸二氢钾，5%硫酸镁，10%硫酸铵，65%轻质碳酸钙；
S4：大量发酵培养配方：同S3中固体培养基配方。
3.防治杨树溃疡病的生物防治制剂，其特征在于，包括所述的蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02。
4.根据权利要求3所述的防治杨树溃疡病的生物防治制剂，其特征在于，制备方法如下：
S1：制备所述蜡样芽孢杆菌的种子液；
S2：将S1中制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养；
S3：将S2中培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。
5.防治杨树溃疡病的生物防治方法，其特征在于，包括向具有溃疡病的杨树植株施用上述蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌株SM02或者上述生物防治制剂。
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