CN110251685A - 紫杉醇-黄连素纳米药物的合成方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫杉醇‑黄连素纳米药物的合成方法，通过设计一条含有二硫键的紫杉醇‑黄连素偶联药物分子，实现偶联药物的自组装，得到抗癌纳米药物。本发明提供的紫杉醇‑黄连素纳米药物GSH响应灵敏，能够实现药物在肿瘤部位的快速释放，提高药物利用效率，并且对多种癌细胞体现出显著的癌细胞抑制效果。

Description

紫杉醇-黄连素纳米药物的合成方法与应用
技术领域
本发明涉及药物合成技术，具体涉及一种GSH响应的紫杉醇-黄连素纳米药物及其制备方法与应用。
背景技术
癌症致死率正在全世界范围内变得日趋严重。许多科学工作者在抗击癌症工作中做出了杰出贡献。在众多治疗方法中，化学药物疗法仍然是主要的癌症治疗方法。然而，大多数抗癌药物在到达病灶区域前就面临着溶解度低、副作用大以及多药耐药性等障碍。为了解决上述难题，纳米给药***如胶束、脂质体、树枝状大分子以及囊泡等受到了广泛的关注。然而，纳米载体的制备极其复杂，纳米载体的降解，代谢和***可引起明显的毒性问题。因此，开发无有毒溶剂或纳米载体的纳米药物制剂非常重要。
紫杉醇是从短叶红豆杉树皮中分离提取出的一种复杂的天然产物，可通过阻断细胞正常的***，抑制癌细胞增长，是目前临床化药疗法的一线用药。临床研究已经证实，紫杉醇主要适用于卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌，而且对食管癌、头颈癌等其他一些恶性肿瘤也具有一定疗效。然而，紫杉醇的水溶性较差，从而造成给药困难，极大地限制了这种天然活性产物针对肿瘤的治疗应用。临床上采用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作为助溶剂，然而聚氧乙烯蓖麻油可能导致患者产生过敏反应，而且，聚氧乙烯蓖麻油的使用降低了紫杉醇的抗癌活性。同时，紫杉醇由于选择性差，具有较强的毒副作用，易产生耐药性，以及无法透过血脑屏障等缺陷。
黄连素是一种水溶性的异喹啉生物碱，其已被发现除了具有很好的抗微生物效果之外，还能有效对抗腹泻、糖尿病、代谢综合征、***、冠状动脉疾病、高脂血症、肥胖和脂肪肝等疾病。近些年来，许多研究发现黄连素有很好的抗肿瘤效果，它可以选择性地在肿瘤细胞线粒体中累积，通过降低线粒体膜电位诱导癌细胞线粒体渗透性发生转变致使癌细胞死亡。
还原响应型药物载体是分子之间通过具有还原响应性的二硫键连接形成纳米结构的给药***。二硫键在人体的正常体温、pH和氧化等环境下非常稳定，在一定量的谷胱甘肽还原酶(GSH)或二硫苏糖醇(DTT)等还原剂存在下被还原生成巯基。癌细胞内外恰好存在氧化还原电位，细胞内的谷胱甘肽浓度(0.5～10mmol/L)是细胞外谷胱甘肽浓度(2～20μmol/L)的200倍以上，细胞外的谷胱甘肽浓度不足以还原二硫键。因此，含有二硫键的纳米药物进入靶细胞后被GSH还原，连接的二硫键断裂生成巯基，从而有效快速地释放药物。
本专利基于疏水性药物紫杉醇和亲水性药物黄连素通过二硫键相连接，在水中自组装形成具有肿瘤靶向性的无载体纳米药物，从而达到抗肿瘤作用，更重要的是解决了纳米载体带来的诸多临床安全性问题。
发明内容
发明目的：鉴于现有癌症治疗和药物载体存在的上述问题，本申请目的之一在于提供一种紫杉醇-黄连素偶联纳米药物；本发明的目的之二在于提供紫杉醇-黄连素偶联纳米药物的制备方法；本发明的目的之三在于提供紫杉醇-黄连素偶联纳米药物的应用。
技术方案：本发明所述的紫杉醇-黄连素纳米药物的合成方法，包括如下步骤：
(1)取盐酸黄连素，在高温真空条件下得到去甲基黄连素；
(2)取去甲基黄连素与溴乙醇反应，得到羟乙基取代的去甲基黄连素；
(3)将羟乙基取代的去甲基黄连素溶解于甲醇中，加入硼氢化钠的甲醇溶液，反应得到还原的羟乙基黄连素；
(4)取还原的羟乙基黄连素与二硫代二丙酸在4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为催化剂、二环己基碳二亚胺(DCC)作为缩合剂条件下反应得到二硫代二丙酸黄连素；
(5)二硫代二丙酸黄连素与紫杉醇反应得到紫杉醇-黄连素偶联药物前体；
(6)紫杉醇-黄连素偶联药物前体与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)反应得到紫杉醇-黄连素偶联药物；
(7)将紫杉醇-黄连素偶联药物溶解在有机溶剂中，滴到不良溶剂水中，超声，然后吹干有机溶剂，即得到紫杉醇-黄连素纳米药物。
其中，步骤(3)中，先将羟乙基取代的去甲基黄连素溶解于甲醇中，然后缓慢加入硼氢化钠的甲醇溶液，冰浴下反应12～24小时得到还原的羟乙基黄连素。其中，所述羟乙基取代的去甲基黄连素与硼氢化钠的物质的量比为1：1～2。
步骤(4)中，先依次将二硫代二丙酸、N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶溶解于吡啶中，在冰浴惰性气体条件下搅拌15～30分钟得到第一混合溶液，再向第一混合溶液中缓慢加入还原的羟乙基黄连素二氯甲烷溶液，冰浴条件下反应24～48小时得到二硫代二丙酸黄连素。
步骤(4)中，二硫代二丙酸的物质的量是还原的羟乙基黄连素的1～2倍。
步骤(4)中，DCC的物质的量是还原的羟乙基黄连素的1～2倍。
步骤(5)中，二硫代二丙酸黄连素与紫杉醇的物质的量之比为1:1。
进一步的，步骤(5)中，以4-二甲氨基吡啶作为催化剂、N,N'-二环己基碳二亚胺作为缩合剂，其中DCC的物质的量是二硫代二丙酸黄连素的1～2倍。
步骤(6)中，紫杉醇-黄连素偶联药物前体溶于氯仿溶液中，搅拌30min后，然后缓慢加入NBS的氯仿溶液，继续反应24h。
步骤(6)中，紫杉醇-黄连素偶联药物前体与NBS的物质的量之比为1:1～1.2。
步骤(7)中，反应温度为室温～50℃。
步骤(7)中，有机溶剂选自丙酮、异丙醇、甲醇、乙醇、吡啶、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(7)中，超声的温度为室温、超声的功率为300W、超声的时间为10～60min。
根据上述方法制备得到的纳米药物及其在制备抗癌药物中的应用也在本发明的保护范围内。其中，所述肿瘤包括肺癌和肝癌。
有益效果：本发明制备所得共组装GSH响应型紫杉醇-黄连素纳米药物中，疏水药物为紫杉醇，亲水药物为黄连素，利用紫杉醇-黄连素分子的特殊结构，既改善了疏水药物的水溶性，又使新得到的分子在水溶液中能够形成纳米粒子，从而提高了药物的被动靶向性，增强了药效，减少了可能的副作用。本发明所设计的新药物分子，结果确定，易于进行重复和表征，并且较好的治疗作用。
附图说明
图1为羟乙基取代的黄连素的氢谱；
图2为羟乙基取代的黄连素的高分辨质谱；
图3为还原的羟乙基黄连素的氢谱；
图4为还原的羟乙基黄连素的高分辨质谱；
图5为二硫代二丙酸黄连素的氢谱；
图6为二硫代二丙酸黄连素的高分辨质谱；
图7为紫杉醇-黄连素偶联药物前体的氢谱；
图8为紫杉醇-黄连素偶联药物前体的高分辨质谱；
图9为紫杉醇-黄连素偶联药物的氢谱；
图10为紫杉醇-黄连素偶联药物的高分辨质谱；
图11为紫杉醇-黄连素偶联纳米药物的透射电子显微镜形貌图；
图12为紫杉醇-黄连素偶联纳米药物的粒径分布图；
图13为紫杉醇-黄连素偶联纳米药物和紫杉醇的对A549的体外细胞毒性(MTT)图，图中横坐标为药物浓度，纵坐标为癌细胞存活率；
图14为紫杉醇-黄连素偶联纳米药物在37℃下在PBS中，在含有/不含有10mM谷胱甘肽(GSH)中的药物累计释放图，图中横坐标为时间，纵坐标为累计释放的药物。
具体实施方式
为清楚了解本发明的技术方案，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1合成去甲基黄连素
向250mL圆底烧瓶中加入盐酸黄连素10g，在真空度是30mmHg，190℃条件下加热60min，黄色的固体粉末逐渐变成暗红色粉末，得到去甲基黄连素粗产品。柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇20/1)分离，得暗红色去甲基黄连素粉末6.92g，收率80％。
实施例2合成羟乙基取代的黄连素
向250mL圆底烧瓶中加入实施例1中制备的去甲基黄连素10g(31.14mmol)、乙腈(CH3CN)20mL、碳酸钾5.16g(37.37mmol)，50℃下搅拌30min，然后加入溴乙醇4.67g(37.37mmol)，升温回流24h，柱层析(洗脱机：氯仿/甲醇20/1)分离，得黄色羟乙基取代的黄连素粉末12.2g，收率88％。1H NMR(600MHz,MeOD)δ9.95(s,1H),8.62(s,1H),8.05(d,J＝9.1Hz,1H),8.00(d,J＝9.0Hz,1H),7.59(s,1H),6.93(s,1H),6.13(s,2H),4.99–4.93(m,2H),4.54–4.50(m,2H),4.12(s,3H),4.00–3.96(m,2H),3.31–3.26(m,2H)；ESI-MS m/z[M+H]+＝366.13315。图1和图2分别为羟乙基取代的黄连素的氢谱图和高分辨质谱图，证明了制备该化合物成功。
实施例3合成还原的羟乙基黄连素
向250mL圆底烧瓶中加入实施例2中制备的羟乙基黄连素10g(22.47mmol)、甲醇(CH3OH)20mL，冰浴下搅拌，然后加入硼氢化钠(NaBH4)(1.28g,33.71mmol)的甲醇溶液，反应12h，得到还原的羟乙基黄连素粗产品，柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇20/1)分离，得白色还原的羟乙基黄连素粉末8.29g，收率95％。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.88(d,J＝8.4Hz,1H),6.79(d,J＝8.4Hz,1H),6.72(s,1H),6.59(s,1H),5.91(s,2H),4.26(d,J＝15.5Hz,1H),4.16–4.12(m,1H),4.04(dd,J＝10.3,5.8Hz,1H),3.88–3.81(m,5H),3.57–3.51(m,2H),3.22(dd,J＝15.9,3.3Hz,1H),3.17(dd,J＝10.4,4.7Hz,1H),3.10(d,J＝11.2Hz,1H),2.82(dd,J＝15.5,11.6Hz,1H),2.63(dd,J＝21.8,10.6Hz,2H)；ESI-MS m/z[M+H]+＝370.16589。图3和图4分别为还原的羟乙基黄连素的氢谱图和高分辨质谱图，证明了制备该化合物成功。
实施例4合成二硫代二丙酸黄连素
向100mL圆底烧瓶中加入实施例3中合成的二硫代二丙酸2.84g(13.54mmol)、催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二环己基碳二亚胺(DCC)(2.80g,13.54mmol)、吡啶(pydine)20mL，氮气保护，于冰浴下搅拌30min，向反应体系中加入还原的羟乙基黄连素(5g,13.54mmol)的二氯甲烷溶液，继续在冰浴下反应48h，得到二硫代二丙酸黄连素粗产品，减压蒸馏除去溶剂吡啶，然后柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇＝20/1)分离，得还原的二硫代二丙酸黄连素粉末4.18g，收率55％。1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.03(s,2H),6.91(s,1H),6.71(s,1H),5.96(s,2H),4.47(s,1H),4.42–4.37(m,2H),4.35–4.30(m,2H),3.86(d,J＝3.7Hz,3H),3.72(s,1H),3.64(dd,J＝17.0,4.3Hz,1H),3.37(s,1H),3.22(s,1H),3.11–3.09(m,1H),3.07–2.99(m,2H),2.96(dd,J＝13.5,6.2Hz,4H),2.82(t,J＝6.9Hz,2H),2.66(t,J＝7.0Hz,2H),2.59(t,J＝6.1Hz,1H).；ESI-MS m/z[M+H]+＝562.15688。图5和图6分别为二硫代二丙酸黄连素的氢谱图和高分辨质谱图，证明了制备该化合物成功。
实施例5合成二硫代二丙酸黄连素
向100mL圆底烧瓶中加入实施例3中合成的二硫代二丙酸5.69g(27.08mmol)、催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二环己基碳二亚胺(DCC)(2.80g,13.54mmol)、吡啶(pydine)20mL，氮气保护，于冰浴下搅拌30min，向反应体系中加入还原的羟乙基黄连素(5g,13.54mmol)的二氯甲烷溶液，继续在冰浴下反应48h，得到二硫代二丙酸黄连素粗产品，减压蒸馏除去溶剂吡啶，然后柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇＝20/1)分离，得还原的二硫代二丙酸黄连素粉末4.79g，收率63％。
实施例6合成二硫代二丙酸黄连素
向100mL圆底烧瓶中加入实施例3中合成的二硫代二丙酸5.69g(27.08mmol)、催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二环己基碳二亚胺(DCC)(2.80g,27.08mmol)、吡啶(pydine)20mL，氮气保护，于冰浴下搅拌30min，向反应体系中加入还原的羟乙基黄连素(5g,13.54mmol)的二氯甲烷溶液，继续在冰浴下反应48h，得到二硫代二丙酸黄连素粗产品，减压蒸馏除去溶剂吡啶，然后柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇＝20/1)分离，得还原的二硫代二丙酸黄连素粉末6.08g，收率80％。
实施例7合成紫杉醇-黄连素偶联药物前体
向100mL圆底烧瓶中加入实施例6中合成的二硫代二丙酸黄连素1.7g(2.97mmol)、催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二环己基碳二亚胺(DCC)(0.61g,2.97mmol)、吡啶(pydine)10mL，氮气保护，于冰浴下搅拌30min，向反应体系中加入紫杉醇(PTX)(2.54g,2.97mmol)的二氯甲烷溶液，继续在冰浴下反应48h，得到紫杉醇-黄连素偶联药物前体粗产品，减压蒸馏除去溶剂吡啶，然后柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇＝50/1)分离，得紫杉醇-黄连素偶联药物前体2.94g，收率71％。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝7.6Hz,2H),7.75(d,J＝7.2Hz,2H),7.61(t,J＝7.4Hz,1H),7.55–7.48(m,3H),7.44–7.37(m,6H),7.34(d,J＝7.5Hz,1H),7.06(s,1H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),6.78(d,J＝8.3Hz,1H),6.72(s,1H),6.58(d,J＝6.5Hz,1H),6.29(s,1H),6.24(t,J＝8.7Hz,1H),5.98(d,J＝9.0Hz,1H),5.91(s,2H),5.68(d,J＝7.1Hz,1H),5.53(s,1H),4.97(d,J＝9.0Hz,1H),4.44(t,J＝8.5Hz,1H),4.38(t,J＝9.4Hz,2H),4.32(d,J＝8.5Hz,1H),4.26(dd,J＝17.7,14.3Hz,2H),4.22–4.16(m,2H),3.81(d,J＝10.5Hz,4H),3.51(s,2H),3.22(d,J＝15.0Hz,1H),3.12(d,J＝24.4Hz,2H),2.91(t,J＝7.0Hz,2H),2.87(d,J＝5.1Hz,2H),2.85–2.75(m,4H),2.65(d,J＝14.5Hz,2H),2.54(d,J＝14.7Hz,2H),2.45(s,3H),2.40–2.33(m,1H),2.22(s,3H),2.19–2.13(m,1H),1.94(s,3H),1.91–1.81(m,2H),1.68(s,3H),1.23(s,3H),1.13(s,3H)；ESI-MS m/z[M+H]+＝1397.47749。图7和图8分别为紫杉醇-黄连素偶联药物前体的氢谱图和高分辨质谱图，证明了制备该化合物成功。
实施例8合成紫杉醇-黄连素偶联药物前体
向100mL圆底烧瓶中加入实施例6中合成的二硫代二丙酸黄连素1.7g(2.97mmol)、催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二环己基碳二亚胺(DCC)(1.22g,5.94mmol)、吡啶(pydine)10mL，氮气保护，于冰浴下搅拌30min，向反应体系中加入紫杉醇(PTX)(2.54g,2.97mmol)的二氯甲烷溶液，继续在冰浴下反应48h，得到紫杉醇-黄连素偶联药物前体粗产品，减压蒸馏除去溶剂吡啶，然后柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇＝50/1)分离，得紫杉醇-黄连素偶联药物前体3.52g，收率85％。
实施例9合成紫杉醇-黄连素偶联药物
向100mL圆底烧瓶中加入实施例8中合成的紫杉醇-黄连素偶联药物前体2g(1.43mmol)、氯仿(CHCl3)20mL，室温下搅拌30min，然后向反应体系加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(254.52mg,1.43mmol)的氯仿溶液，室温下继续反应24h，得到紫杉醇-黄连素偶联药物粗产品，柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇＝10/1)分离，得紫杉醇-黄连素偶联药物1.09g，收率52％。1H NMR(600MHz,MeOD)δ9.75(s,1H),8.70(s,1H),8.10(d,J＝8.4Hz,3H),8.00(d,J＝9.1Hz,1H),7.79(d,J＝8.5Hz,2H),7.67(d,J＝8.6Hz,1H),7.65(s,1H),7.60(d,J＝7.9Hz,2H),7.52(d,J＝7.5Hz,1H),7.47–7.43(m,6H),7.26(t,J＝7.2Hz,1H),6.94(s,1H),6.40(s,1H),6.10(s,2H),6.01(d,J＝10.1Hz,1H),5.78(d,J＝6.8Hz,1H),5.61(d,J＝7.2Hz,1H),5.46(d,J＝6.7Hz,1H),4.97(d,J＝7.9Hz,1H),4.94–4.91(m,2H),4.67(t,J＝4.0Hz,2H),4.56(d,J＝8.2Hz,2H),4.29(d,J＝11.0Hz,1H),4.16(s,2H),4.10(s,3H),3.76(d,J＝7.2Hz,1H),3.27–3.24(m,2H),2.86(d,J＝6.3Hz,2H),2.81(dd,J＝14.5,8.1Hz,4H),2.67(t,J＝6.8Hz,2H),2.37(s,3H),2.13(s,3H),1.87(s,2H),1.76(dd,J＝14.6,4.6Hz,2H),1.63(s,3H),1.28(s,3H),1.12(s,3H),1.09(s,3H),0.90(t,J＝7.0Hz,1H)；ESI-MS m/z[M+H]+＝1393.44253。图9和图10分别为紫杉醇-黄连素偶联药物的氢谱图和高分辨质谱图，证明了制备该化合物成功。
实施例10合成紫杉醇-黄连素偶联药物
向100mL圆底烧瓶中加入实施例8中合成的紫杉醇-黄连素偶联药物前体2g(1.43mmol)、氯仿(CHCl3)20mL，室温下搅拌30min，然后向反应体系加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(306.14mg,1.72mmol)的氯仿溶液，室温下继续反应24h，得到紫杉醇-黄连素偶联药物粗产品，柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇＝10/1)分离，得紫杉醇-黄连素偶联药物0.94g，收率45％。
实施例11合成紫杉醇-黄连素偶联药物
向100mL圆底烧瓶中加入实施例8中合成的紫杉醇-黄连素偶联药物前体2g(1.43mmol)、氯仿(CHCl3)20mL，室温下搅拌30min，然后向反应体系加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(254.52mg,1.43mmol)的氯仿溶液，60℃下继续反应24h，得到紫杉醇-黄连素偶联药物粗产品，柱层析(洗脱剂：氯仿/甲醇＝10/1)分离，得紫杉醇-黄连素偶联药物1.46g，收率70％。
实施例12制备紫杉醇-黄连素纳米药物
取实施例11中合成的紫杉醇-黄连素偶联药物2mg溶于1mL丙酮中，然后滴到10mL的去离子水中并搅拌，室温下以300W功率超声30min，吹掉里面的有机溶剂，得到紫杉醇-黄连素纳米药物。
实施例13制备紫杉醇-黄连素纳米药物
取实施例11中合成的紫杉醇-黄连素偶联药物2mg溶于1mL丙酮中，然后滴到10mL的去离子水中并搅拌，室温下以300W功率超声45min吹掉里面的有机溶剂，得到紫杉醇-黄连素纳米药物。
实施例14制备紫杉醇-黄连素纳米药物
取实施例11中合成的紫杉醇-黄连素偶联药物2mg溶于1mL丙酮中，然后滴到10mL的去离子水中并搅拌，室温下以300W功率超声60min吹掉里面的有机溶剂，得到紫杉醇-黄连素纳米药物。
实施例15制备紫杉醇-黄连素纳米药物
取实施例11中合成的紫杉醇-黄连素偶联药物2mg溶于1mL异丙醇中，然后滴到10mL的去离子水中并搅拌，室温下以300W功率超声60min吹掉里面的有机溶剂，得到紫杉醇-黄连素纳米药物。
实施例16制备紫杉醇-黄连素纳米药物
取实施例11中合成的紫杉醇-黄连素偶联药物2mg溶于1mL甲醇中，然后滴到10mL的去离子水中并搅拌，室温下以300W功率超声60min吹掉里面的有机溶剂，得到紫杉醇-黄连素纳米药物。
实施例17紫杉醇-黄连素纳米药物的相关表征
透射电子显微镜测量实施例16纳米颗粒的形态，结果显示所有纳米颗粒均显示棒状结构。动态光散射(DLS)方法检测实施例16纳米颗粒粒径，结果显示所有纳米颗粒平均粒径为100～250nm。图11是其纳米颗粒形态，呈规整的棒状结构，图12是动态光散射方法测量紫杉醇-黄连素纳米颗粒的平均粒径，其值为165nm。
实例18 MTT法癌细胞活力实验
A549人肺癌细胞接种量接种于96孔培养板，5％CO2、37℃培养箱中培养24h后，每孔加入不同浓度的实施例16的紫杉醇-黄连素纳米药物溶液、紫杉醇溶液各100μL，使最终的药物浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μM，继续培养24h；分别加入50μL的MTT，继续于5％CO2、37℃培养箱中继续培养4h，弃去培养基，加入150μL的DMSO，在平板摇床上摇匀，酶标仪495nm读板，根据测得的吸光度值计算细胞抑制率。数据表示为平均数±SD(n＝3)。
结果发现(如图13所示)，在培养24小时后，紫杉醇-黄连素纳米药物(IC50＝1.29μM)对A549的抑制效果要优于紫杉醇(IC50＝1.55μM)。
实施例19紫杉醇-黄连素纳米药物释放实验
通过透析法测量紫杉醇和黄连素从纳米药物中的释放。将实施例16紫杉醇-黄连素纳米药物用磷酸缓冲溶液(PBS)稀释，产生60μM的溶液。取1mL的溶液到透析袋中(MwCO:2000)，放置于30mL的PBS或者含有10mM谷胱甘肽的PBS缓冲溶液中透析55小时。在预定的时间从透析袋中取2mL的试样用于荧光检测(激发波长：380nm)，并补充2mL的PBS。
结果发现(如图14所示)，紫杉醇-黄连素纳米药物在不含谷胱甘肽的溶液中非常稳定。相比之下，在谷胱甘肽的存在下，在10小时内有50％左右的药物快速释放。

Claims (10)

1.一种紫杉醇-黄连素纳米药物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取盐酸黄连素，在高温真空条件下得到去甲基黄连素；
(2)取去甲基黄连素与溴乙醇反应，得到羟乙基取代的去甲基黄连素；
(3)将羟乙基取代的去甲基黄连素溶解于甲醇中，加入硼氢化钠的甲醇溶液，反应得到还原的羟乙基黄连素；
(4)取还原的羟乙基黄连素与二硫代二丙酸在4-二甲氨基吡啶作为催化剂、N,N'-二环己基碳二亚胺作为缩合剂条件下反应得到二硫代二丙酸黄连素；
(5)二硫代二丙酸黄连素与紫杉醇反应得到紫杉醇-黄连素偶联药物前体；
(6)紫杉醇-黄连素偶联药物前体与N-溴代丁二酰亚胺反应得到紫杉醇-黄连素偶联药物；
(7)将紫杉醇-黄连素偶联药物溶解在有机溶剂中，滴到不良溶剂水中，超声，然后吹干有机溶剂，即得到紫杉醇-黄连素纳米药物。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应在冰浴下进行，所述羟乙基取代的去甲基黄连素与硼氢化钠的物质的量比为1：1～2。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，先依次将二硫代二丙酸、N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶溶解于吡啶中，在冰浴惰性气体条件下搅拌15～30分钟得到第一混合溶液，再向第一混合溶液中缓慢加入还原的羟乙基黄连素二氯甲烷溶液，冰浴条件下反应24～48小时得到二硫代二丙酸黄连素。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，所述二硫代二丙酸的物质的量是还原的羟乙基黄连素的1～2倍。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，所述N,N'-二环己基碳二亚胺物质的量是还原的羟乙基黄连素的1～2倍。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(5)中，所述二硫代二丙酸黄连素与紫杉醇的物质的量之比为1:1。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(6)中，紫杉醇-黄连素偶联药物前体溶于氯仿溶液中，搅拌30～60min后，然后缓慢加入N-溴代丁二酰亚胺的氯仿溶液，继续反应24～48h。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(6)中，所述紫杉醇-黄连素偶联药物前体与N-溴代丁二酰亚胺的物质的量之比为1:1～1.2。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤(7)中，有机溶剂选自丙酮、异丙醇、甲醇、乙醇、吡啶、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。
10.权利要求1-9中任一方法制备所得纳米药物在制备抗癌药物中的应用。
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