CN108478803A - 氧化还原超敏感二硫键桥连前药自组装纳米粒的构建 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，设计合成了一系列含有二硫键的不同长度碳链相连(二硫键中的硫原子分别位于酯键的α、β和γ位)的小分子前药，以紫杉醇‑香茅醇为例，合成方法简单易行。在此基础上，制备了小分子前药自组装纳米药物传递***，制备方法简便，稳定性好，实现了药物的高效包载和递送。发现了二硫键具有氧化还原双重敏感性，能够在肿瘤细胞高表达的ROS和GSH的作用下断裂，释放出紫杉醇。尤其二硫键位于羰基α位的紫杉醇‑香茅醇前药(α‑PTX‑SS‑CIT)显现出氧化还原双重超敏性，在ROS或GSH的作用下，α‑PTX‑SS‑CIT前药都能够快速断裂释放出紫杉醇发挥药效，显著的提高了紫杉醇的抗肿瘤效果，具有广阔的发展前景。

Description

氧化还原超敏感二硫键桥连前药自组装纳米粒的构建
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，包括氧化还原超敏感二硫键桥连紫杉醇-香茅醇前药的合成及前药自组装纳米粒的构建，以及其在药物传递中的应用。
背景技术
癌症严重威胁着全人类的健康，据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年有超过800万人死于癌症。化疗是癌症治疗中最常用和最有效的策略之一，尤其是对于那些不能通过手术切除和转移扩散的肿瘤。但大部分化疗药是细胞毒性药物，且存在溶解度低、稳定性差、治疗窗窄和药动学性质不佳等缺点。而现有的制剂策略递送效率低，肿瘤靶向性较差，导致化疗临床效果不佳且毒副作用严重。例如，紫杉醇(Paclitaxel,PTX)作为一线化疗药在临床上被广泛用于治疗非小细胞肺癌和乳腺癌等。但是，由于紫杉醇的水溶性极低，市售的溶液剂泰素(Taxol)使用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作为增溶剂和助溶剂，会引起很严重的辅料相关的毒副作用，极大地限制了其在临床上的应用。因此，如何改善化疗药物的不良性质并提高递送效率是临床上亟待解决的难题。
近年来，前体药物和纳米技术在药物传递领域的广泛应用极大地丰富了抗肿瘤药物的递送策略，且已经有多个制剂成功上市，如伊立替康(SN-38前体药物)，紫杉醇白蛋白纳米粒，阿霉素脂质体等。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质。前药策略可以通过巧妙的结构修饰来改善化疗药物的不良性质，包括溶解度低，稳定性差，毒副作用大等。此外，基于纳米技术构建新型的纳米给药***可以显著改善药物的药动学性质，延长化疗药物的体内循环时间，并能够通过主动靶向或被动靶向提高药物在肿瘤部位的蓄积，增加药物的细胞摄取，控制药物的释放速度，进而提高抗肿瘤效果，降低毒副作用。在此基础上，基于小分子前体药物的自组装纳米药物递送***将前体药物和纳米技术的优点结合到一起，以其载药量高、稳定性好、毒副作用低等优势，已成为近几年化疗药物递送研究的热点。
不论是前药还是纳米递药***，智能触发药物在靶部位的选择性释放对于制剂的有效性和安全性都非常重要。与正常细胞相比，肿瘤细胞内存在更高浓度的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和谷胱甘肽(GSH)，这种特殊的肿瘤细胞氧化还原微环境已被广泛用于设计刺激-响应型药物递送***。我们通过对二硫键的化学性质进行分析，发现其具有良好的还原响应性，并推测二硫键可能也具有氧化敏感性，能够同时对肿瘤细胞高表达的ROS进行响应，有望开发成为肿瘤微环境氧化还原双重响应型超敏化学键。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种具有氧化还原超敏感二硫键桥连前药，并将该前药用于自组装纳米粒，从而实现载药量高、稳定性好、毒副作用低的效果，进而提高抗肿瘤活性。
本发明的目的是设计和合成氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药，制备前药自组装纳米药物传递***，探讨二硫键氧化敏感的机制，并比较二硫键在化学桥连中的位置对前体药物的氧化还原响应性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布和抗肿瘤效率的影响。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明所述的氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药，选择紫杉醇和香茅醇作为模拟药物，但并不仅限于此，本发明将紫杉醇和香茅醇通过(a)2,2'-二硫代二乙酸相连，二硫键位于酯键羰基的α位。同时，将紫杉醇和香茅醇以(b)3,3'-二硫代二丙酸和(c)4,4'-二硫代二丁酸相连合成对照前药，二硫键分别位于酯键羰基的β和γ位，其结构式为：
本发明提供的二硫键桥连紫杉醇-香茅醇小分子前药合成方法，包括如下步骤：首先将二元酸成酸酐，然后与香茅醇成酯得到中间产物。中间产物与紫杉醇成酯，得到终产物。
具体地，本发明提供了二硫键桥连紫杉醇-香茅醇小分子前药合成方法：
氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药的合成：将2,2'-二硫代二乙酸溶解于乙酸酐中，室温下搅拌1-2个小时。将所得产物溶于二氯甲烷中，并加入香茅醇和DMAP，室温条件下搅拌1-2小时。通过柱层析分离得到中间产物。将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于无水二氯甲烷中，冰浴1-2小时，然后加入紫杉醇，室温条件下搅拌24-48小时。所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
对照前药的合成：将二元酸(3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸)溶解于乙酸酐中，室温下搅拌1-2个小时。将所得产物溶于二氯甲烷中，并加入香茅醇和DMAP，室温条件下搅拌1-2小时。通过柱层析分离得到中间产物。将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于无水二氯甲烷中，冰浴1-2小时，然后加入紫杉醇，室温条件下搅拌24-48小时。所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
本发明还提供了所述的二硫键桥连小分子前药自组装纳米粒，所述的小分子前药纳米粒可以是非PEG化的小分子前药纳米粒、PEG修饰的小分子前药纳米粒、包载荧光物质或疏水性药物的小分子前药纳米粒和主动靶向的小分子前药纳米粒。
本发明中所述的紫杉醇可以用其他含有活性羟基或氨基的抗癌药物，如紫杉烷类化合物、核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物所代替。
香茅醇可以用其他含有不饱和键和活性羟基的碳链替代，如维生素E、油酸-乙二醇酯、油醇、亚麻醇或亚油醇所代替。
本发明提供的二硫键桥连小分子前药自组装纳米粒的制备方法如下：
将一定量的二硫键桥连小分子前药或小分子前药与PEG修饰剂/荧光物质的混合物溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。最后，采用透析法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。所述的PEG修饰剂为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG等，优选的PEG修饰剂为DSPE-PEG。所述PEG的分子量为1000、2000和5000，优选的PEG分子量为2000。所述的疏水性荧光物质为香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy-5和Cy-7，优选的荧光物质为香豆素-6和DiR。小分子前药与PEG修饰剂的重量比为：90:10～70:30，在此范围条件下，紫杉醇可以发挥最好的抗肿瘤效果。
(1)非PEG化的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。采用透析法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
(2)PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的PEG修饰剂(TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG或PE-PEG)和前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。采用透析法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
(3)包载荧光物质或疏水性药物的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的荧光物质(香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy-5或Cy-7)和前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。采用透析法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
(4)主动靶向的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的茴香胺修饰的DSPE-PEG(DSPE-PEG-AA)和前药溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。采用透析法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
本发明以抗肿瘤药物紫杉醇和香茅醇为模拟药物，设计合成了含有二硫键的不同长度碳链相连(二硫键中的硫原子分别位于酯键的α、β和γ位)的紫杉醇-香茅醇小分子前药。所设计的三种前药都能在水中自发形成均匀稳定的纳米粒。我们发现二硫键桥连前体药物具有氧化还原双重响应性，能够在肿瘤细胞高表达的ROS和GSH的作用下断裂，释放出紫杉醇。与此同时，我们还发现二硫键在碳链中的位置(α、β和γ位)会进一步影响前药自组装纳米粒的氧化还原响应性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布和抗肿瘤效果。其中，二硫键位于羰基α位的紫杉醇-香茅醇前药(α-PTX-SS-CIT)显现出氧化还原双重超敏性，在ROS或GSH的作用下，α-PTX-SS-CIT前药都能够快速断裂释放出紫杉醇发挥药效，显著的提高了紫杉醇的抗肿瘤效果，具有广阔的发展前景。
本发明的二硫键桥连紫杉醇-香茅醇小分子前药首次被发现可以自组装形成均匀的纳米体系。该纳米药物传递***的优势在于：(1)采用一步纳米沉淀的方法，制备工艺简单，易于产业化；(2)粒径小且均一(～85nm)，有利于纳米粒通过EPR效应富集于肿瘤部位；(3)超高的载药量(>55％)，有利于减小因辅料和生物材料而引发的不良反应；(4)易于表面修饰，可通过PEG和主动靶向修饰以有效避免网状内皮***摄取和提高肿瘤细胞对纳米粒的摄取；(5)肿瘤微环境氧化还原双重响应释药，显著提高了紫杉醇的抗肿瘤效果，降低了毒副作用。
本发明具有以下有益效果：(1)设计合成了系列二硫键桥连紫杉醇-香茅醇小分子前药，合成方法简单易行；(2)制备了均匀的小分子前药自组装纳米粒，制备方法简单易行，稳定性好，实现紫杉醇的高效包载；(3)发现了二硫键具有氧化还原双重敏感性，能够在肿瘤细胞高表达的ROS和GSH的作用下断裂，释放出紫杉醇，显著提高了紫杉醇的抗肿瘤效果，降低了毒副作用。进一步揭示了二硫键氧化敏感机制；(4)发现了二硫键在碳链中的位置(α、β和γ位)会影响前药自组装纳米粒的氧化还原响应性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布和抗肿瘤效果，并对相应机制进行了探讨。其中，二硫键位于羰基α位的紫杉醇-香茅醇前药(α-PTX-SS-CIT)显现出氧化还原双重超敏性，在ROS或GSH的作用下，α-PTX-SS-CIT前药都能够快速断裂释放出紫杉醇发挥药效，显著的提高了紫杉醇的抗肿瘤效果，具有广阔的发展前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的二硫键位于羰基α位的紫杉醇-香茅醇前药(α-PTX-SS-CIT)的1HNMR谱图和质谱图。
图2为本发明实施例2的二硫键位于羰基β位的紫杉醇-香茅醇前药(β-PTX-SS-CIT)的1HNMR谱图和质谱图。
图3为本发明实施例3的二硫键位于羰基γ位的紫杉醇-香茅醇前药(γ-PTX-SS-CIT)的1HNMR谱图和质谱图。
图4为本发明实施例4的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的透射电子显微镜图。
图5为本发明实施例5的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的胶体稳定性图。
图6为本发明实施例6的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒体外药物释放试验图。
图7为本发明实施例6的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的氧化还原响应药物释放机制图。
图8为本发明实施例6的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒在过氧化氢条件下前药分子量变化图。
图9为本发明实施例7的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞毒性图。
图10为本发明实施例7的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞内药物释放实验图
图11为本发明实施例8的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞摄取图。
图12为本发明实施例9的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的血药浓度-时间曲线图。
图13为本发明实施例10的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的组织分布图。
图14为本发明实施例11的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：二硫键位于羰基α位的紫杉醇-香茅醇小分子前药(α-PTX-SS-CIT)的合成
将适量2,2'-二硫代二乙酸加入到50mL圆底烧瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，室温下搅拌2个小时，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥。将所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入适量香茅醇和DMAP，室温条件下搅拌1小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到中间产物。最后将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴1小时，然后加入适量紫杉醇，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化既得。上述反应全程都在N2保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示，核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(d,2H,Ar-H,J＝7.3Hz),7.70(d,2H,Ar-H,J＝7.4Hz),7.55(t,1H,Ar-H,J＝7.4Hz),7.45-7.25(Ar-H,10H),6.22(s,1H,10-H),6.18(t,1H,J＝8.6Hz,13-H),5.92(dd,1H,J＝3.0Hz,J＝6.4Hz,3'-H),5.62(d,1H,J＝7.0Hz,2-H),5.44(d,J＝3.5Hz,1H,H-2’,PTX),5.00(t,1H,(CH3)2CCH),4.89(d,1H,J＝8.0Hz,5-H),4.37(dd,1H,J＝6.5Hz,J＝4.2Hz,7-H),4.24(d,1H,J＝8.4Hz,20α-H),4.14(d,1H,J＝8.4Hz,20β-H),4.06(m,2H,CH2 OCO),3.75(d,1H,J＝7.0Hz,3-H),3.48(dd,4H,CH2 SSCH 2),2.49(m,1H,6α-H),2.38(s,3H,4-COCH3),2.26(m,2H,14-H),2.16(s,3H,10-COCH3),1.93(m,2H,CH 2CH2OH),1.91(t,1H,6β-H),1.87(s,3H,18-CH3),1.61(s,3H,19-CH3),1.61(s,3H,(CH3 )2CCH,cis-),1.53(s,3H,(CH3 )2CCH,trans-),1.45(m,2H,(CH3)2CCHCH2 ),1.39(m,2H,CH2 CH(CH3)CH2),1.19(s,3H,17-CH3),1.17(s,3H,16-CH3),1.14(m,1H,CH2CH(CH3)CH2),0.84(d,3H,CH2CH(CH3 )CH2).MS(ESI)m/z for C61H73NO17S2Na[M+Na]+:1178.6.
实施例2：二硫键位于羰基β位的紫杉醇-香茅醇小分子前药(β-PTX-SS-CIT)的合成
将适量3,3'-二硫代二丙酸加入到50mL圆底烧瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，室温下搅拌2个小时，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥。将所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入适量香茅醇和DMAP，室温条件下搅拌1小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到中间产物。最后将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴1小时，然后加入适量紫杉醇，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化既得。上述反应全程都在N2保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例2中前药的结构，结果如图2所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(d,2H,Ar-H,J＝7.3Hz),7.69(d,2H,Ar-H,J＝7.4Hz),7.55(t,1H,Ar-H,J＝7.4Hz),7.45-7.33(Ar-H,10H),7.00(d,1H,J＝9.2Hz,-NH-),6.23(s,1H,10-H),6.18(t,1H,J＝8.6Hz,13-H),5.93(dd,1H,J＝3.0Hz,J＝6.4Hz,3'-H),5.63(d,1H,J＝7.0Hz,2-H),5.46(d,J＝3.5Hz,1H,H-2’,PTX),5.00(t,1H,(CH3)2CCH),4.90(d,1H,J＝8.0Hz,5-H),4.38(dd,1H,J＝6.5Hz,J＝4.2Hz,7-H),4.24(d,1H,J＝8.4Hz,20α-H),4.14(d,1H,J＝8.4Hz,20β-H),4.04(m,2H,CH2 OCO),3.76(d,1H,J＝7.0Hz,3-H),2.80(t,4H,CH2 CH2 SSCH2 CH2),2.60(t,4H,CH2 CH2SSCH2 CH2 ),2.49(m,1H,6α-H),2.39(s,3H,4-COCH3),2.29(m,2H,14-H),2.16(s,3H,10-COCH3),1.94(m,2H,CH2 CH2OH),1.87(t,1H,6β-H),1.87(s,3H,18-CH3),1.61(s,3H,19-CH3),1.61(s,3H,(CH3 )2CCH,cis-),1.53(s,3H,(CH3 )2CCH,trans-),1.52(m,2H,(CH3)2CCHCH2 ),1.36(m,2H,CH2 CH(CH3)CH2),1.19(s,3H,17-CH3),1.17(s,3H,16-CH3),1.12(m,1H,CH2 CH(CH3)CH2),0.84(d,3H,CH2CH(CH3 )CH2).MS(ESI)m/z for C63H77NO17S2Na[M+Na]+:1206.2.
实施例3：二硫键位于羰基γ位的紫杉醇-香茅醇小分子前药(γ-PTX-SS-CIT)的合成
将适量4,4'-二硫代二丁酸加入到50mL圆底烧瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，室温下搅拌2个小时，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥。将所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入适量香茅醇和DMAP，室温条件下搅拌1小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到中间产物。最后将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴1小时，然后加入适量紫杉醇，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化既得。上述反应全程都在N2保护下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例3中前药的结构，结果如图3所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(d,2H,Ar-H,J＝7.3Hz),7.68(d,2H,Ar-H,J＝7.4Hz),7.54(t,1H,Ar-H,J＝7.4Hz),7.45-7.34(Ar-H,10H),6.87(d,1H,J＝9.2Hz,-NH-),6.23(s,1H,10-H),6.19(t,1H,J＝8.6Hz,13-H),5.90(dd,1H,J＝3.0Hz,J＝6.4Hz,3'-H),5.63(d,1H,J＝7.0Hz,2-H),5.45(d,J＝3.5Hz,1H,H-2’,PTX),5.00(t,1H,(CH3)2CCH),4.92(d,1H,J＝8.0Hz,5-H),4.38(dd,1H,J＝6.5Hz,J＝4.2Hz,7-H),4.24(d,1H,J＝8.4Hz,20α-H),4.15(d,1H,J＝8.4Hz,20β-H),4.01(m,2H,CH2 OCO),3.76(d,1H,J＝7.0Hz,3-H),2.60(t,4H,CH2CH2 CH2 SSCH2 CH2CH2),2.51(t,4H,CH2 CH2CH2SSCH2CH2 CH2 ),2.46(m,1H,6α-H),2.39(s,3H,4-COCH3),2.33(m,2H,14-H),2.16(s,3H,10-COCH3),1.96(t,4H,CH2 CH2 CH2SSCH2 CH2 CH2),1.94(m,2H,CH2 CH2OH),1.91(t,1H,6β-H),1.88(s,3H,18-CH3),1.68(s,3H,19-CH3),1.61(s,3H,(CH3 )2CCH,cis-),1.53(s,3H,(CH3 )2CCH,trans-),1.45(m,2H,(CH3)2CCHCH2 ),1.36(m,2H,CH2 CH(CH3)CH2),1.19(s,3H,17-CH3),1.17(s,3H,16-CH3),1.12(m,1H,CH2 CH(CH3)CH2),0.84(d,3H,CH2CH(CH3 )CH2).MS(ESI)m/z for C65H81NO17S2Na[M+Na]+:1234.7.
实施例4：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的制备
精密称取DSPE-PEG2k 2mg和前药8mg，用1mL乙醇将其溶解，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒(α-PTX-SS-CIT纳米粒，β-PTX-SS-CIT纳米粒或γ-PTX-SS-CIT纳米粒)。在25℃的条件下用去离子水透析除去纳米制剂中的有机溶剂。如表1所示，纳米粒的粒径都在85nm左右，载药量都在55％以上。
表1.PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的粒径、粒径分布、表面电荷和载药量
通过透射电子显微镜测定实施例4中制备的小分子前药自组装纳米粒的粒径和形态，结果如图4，透射电镜图表明载药纳米粒为均一的球形，粒径在85nm左右。
实施例5：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的胶体稳定性试验
将实施例4中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒(α-PTX-SS-CIT纳米粒，β-PTX-SS-CIT纳米粒或γ-PTX-SS-CIT纳米粒)取出1mL，加入到20mL含有10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育12小时，并且在预定的时间点(0,2,4,6,8和12小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图5所示，PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒在12小时内粒径无明显变化，显示出良好的胶体稳定性。
实施例6：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体外释放试验
以含30％乙醇的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质，考察二硫键桥连的小分子前药自组装纳米粒的体外释放情况。将1mL实施例4中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒(紫杉醇含量为200μg/mL)加入到30mL释放介质中，在37℃条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相色谱测定释放出的紫杉醇浓度。向释放介质中加入一定浓度的双氧水(H2O2，1mM,5mM,10mM)或二硫苏糖醇(DTT,1mM,5mM,10mM)，以分别考察纳米粒在氧化条件和还原条件下的释放情况。因此使用高效液相色谱法(HPLC)在227nm的波长下测定紫杉醇的累积释放量。
结果如图6所示，所制备的二硫键桥连小分子前药纳米粒具有明显的还原响应性，随着时间的延长以及DTT浓度的增加，紫杉醇的释放量也随之增加，并且二硫键在碳链中的位置对还原响应性具有很大影响。α-PTX-SS-CIT纳米粒还原响应能力最强，药物释放速度最快。γ-PTX-SS-CIT纳米粒次之，β-PTX-SS-CIT纳米粒的还原响应能力最弱，药物释放速度最慢。二硫键桥连小分子前药纳米粒的还原响应药物释放机制如图7所示，二硫键在DTT的作用下断裂，生成亲水性的巯基，进而促进相邻酯键的水解和紫杉醇的释放。因此，紫杉醇的释放速度与二硫键和酯键之间的碳链长度成反比，α-PTX-SS-CIT前药中硫原子位于酯键的α位，碳链最短，药物释放最快。对于γ-PTX-SS-CIT前药，虽然碳链最长，但γ位的巯基可以进攻羰基上的碳原子，生成稳定的五元环脱落，进而促进紫杉醇的快速释放。因此，γ-PTX-SS-CIT纳米粒在还原条件下具有比β-PTX-SS-CIT纳米粒更快的释药速度。
同时我们发现，二硫键桥连小分子前药纳米粒具有明显的氧化敏感性，随着时间的延长以及H2O2浓度的增加，紫杉醇的释放量也随之增加。同时，二硫键在碳链中的位置对氧化响应性具有很大影响，各组纳米粒氧化响应药物释放速率大小顺序为：α-PTX-SS-CIT纳米粒>β-PTX-SS-CIT纳米粒>γ-PTX-SS-CIT纳米粒。当H2O2浓度为1mM时，α-PTX-SS-CIT纳米粒在6h内释放了90％以上的紫杉醇。相比之下，紫杉醇从γ-PTX-SS-CIT纳米粒中释放的非常缓慢，即使H2O2浓度为10mM时，24小时内仅释放35％的紫杉醇。这是二硫键首次被发现具有氧化敏感性，我们对相关机制进行了探讨。如图7所示，我们认为二硫键的氧化响应机制类似于单硫键，即通过将二硫键的硫原子氧化为亲水性的亚砜或砜，进而促进相邻酯键的水解和紫杉醇的释放。为了证实我们的假设，我们采用高分辨质谱研究了前药自组装纳米粒与H2O2孵育后前药分子量的变化。质谱结果如图8所示，β-PTX-SS-CIT的分子量由1206.48810[M+Na]+变为1222.46333[M一氧化物+Na]+，1238.48152[M二氧化物+Na]+和1254.45497[M三氧化物+Na]+，证实了二硫键上的硫原子被氧化为亚砜和砜。α-PTX-SS-CIT和γ-PTX-SS-CIT的质谱显示了相似的结果。通过质谱结果可以证明，二硫键的氧化敏感药物释放机制是通过H2O2将二硫键氧化为极其亲水的亚砜或砜基，进而促进相邻酯键的水解。因此，紫杉醇的释放速率与硫原子和酯键之间的的碳链长度成反比，α-PTX-SS-CIT纳米粒表现出最快的药物释放速度。
综合小分子前药纳米粒在氧化还原条件下药物的释放情况，我们发现α-PTX-SS-CIT前药具有显著的氧化还原双重超敏性，在ROS或GSH的作用下，α-PTX-SS-CIT前药都能够快速断裂释放出紫杉醇。
实施例7：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞毒性
采用MTT法考察PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒对人鳞状上皮癌细胞(KB细胞)，人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)和鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至3000cells/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加100μL泰素或实施例4中制备的α-PTX-SS-CIT纳米粒，β-PTX-SS-CIT纳米粒或γ-PTX-SS-CIT纳米粒。每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加100μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药后48和72h，将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
为了确定与KB细胞孵育后前药纳米粒释放的紫杉醇的量，在固定的时间点(48和72小时)收集细胞和培养基(紫杉醇初始当量浓度：50,100和200ng/mL)。超声处理和离心后，通过UPLC-MS-MS测量上清液中游离紫杉醇的浓度。
结果如图9所示，β-PTX-SS-CIT纳米粒和γ-PTX-SS-CIT纳米粒的细胞毒性类似，但低于泰素溶液，二者相近的细胞毒性可能是由于其药物释放速率相当。相比之下，α-PTX-SS-CIT纳米粒表现出与紫杉醇相近的细胞毒性，这可能是由于α-PTX-SS-CIT纳米粒释放紫杉醇的速度较快。这些结果表明体外细胞毒性与前药纳米粒中的紫杉醇的释放速率密切相关，即紫杉醇释放的越快细胞毒性越大。如图10所示，前药纳米粒与KB细胞孵化后(48和72小时)，α-PTX-SS-CIT纳米粒比β-PTX-SS-CIT纳米粒和γ-PTX-SS-CIT纳米粒释放了更多的紫杉醇。这与体外释放实验非常一致，证实了α-PTX-SS-CIT前药具有氧化还原双重超敏性，与β-PTX-SS-CIT和γ-PTX-SS-CIT前药相比，能够在肿瘤部位更加快速的释放出紫杉醇。
实施例8：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的细胞摄取
采用流式细胞仪测定PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒在KB细胞的摄取情况。将KB细胞以5000cells/mL的密度接种到12孔板上，置培养箱中孵育24h使其贴壁，待细胞贴壁后加游离的香豆素-6或香豆素-6标记的前药纳米。香豆素-6的浓度为200ng/mL。在37℃孵化0.5h或2h后，将细胞清洗，收集并分散在PBS中，用流式细胞仪考察细胞对香豆素-6的摄取情况。
实验结果如图11所示，小分子前药自组装纳米粒处理的细胞显示出比游离香豆素-6处理的细胞更高的细胞内荧光强度。因此，制备的小分子前药自组装纳米粒比游离香豆素-6具有更高的细胞摄取效率。
实施例9：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的药代动力学研究
取体重在200-250g之间的SD大鼠，随机分组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射紫杉醇溶液剂(泰素)以及实施例4中制备的α-PTX-SS-CIT纳米粒，β-PTX-SS-CIT纳米粒或γ-PTX-SS-CIT纳米粒。紫杉醇的剂量为2.5mg/kg。于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。
实验结果如图12所示，由于半衰期短，泰素中的紫杉醇迅速从血液中清除。相比之下，小分子前药自组装纳米粒比泰素的循环时间明显延长。α-PTX-SS-CIT纳米粒，β-PTX-SS-CIT纳米粒和γ-PTX-SS-CIT纳米粒的曲线下面积(AUC)分别为泰素溶液的8.4倍，11.9倍和16.6倍。并且二硫键(α，β或γ)的位置对药代动力学行为有显著的影响，γ-PTX-SS-CIT纳米粒与α-PTX-SS-CIT纳米粒和β-PTX-SS-CIT纳米粒相比血液循环时间更长。同时，前体药物释放的紫杉醇的AUC值依次为α-PTX-SS-CIT纳米粒>β-PTX-SS-CIT纳米粒>γ-PTX-SS-CIT纳米粒。
实施例10：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的组织分布实验
将人口腔上皮癌细胞悬液接种于裸鼠，当肿瘤体积达到400mm3时，尾静脉注射给药：游离的DiR和DiR标记的前药自组装纳米粒，DiR的给药剂量为1mg/kg。4小时或24小时后，将裸鼠处死，分离出主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤，用活体成像仪进行分析。
结果如图13所示，与DiR溶液剂相比，PEG化的小分子前药自组装纳米粒在肿瘤组织的荧光强度显著增加。同时，DiR溶液组中荧光主要分布在肺部，在肿瘤组织中几乎没有分布。相比之下，PEG化的小分子前药自组装纳米粒主要分布在肝脏和肿瘤组织，并且肿瘤中的荧光信号强度从4到24小时逐渐增加。此外，小分子前药自组装纳米粒的生物分布与其药代动力学行为完全一致，γ-PTX-SS-CIT纳米粒和β-PTX-SS-CIT纳米粒的体内循环时间较长，表现出比α-PTX-SS-CIT纳米粒更强的肿瘤蓄积能力。
实施例11：PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的体内抗肿瘤实验
将KB细胞悬液(5x 106cells/100μL)接种于雌性裸鼠右侧背部侧皮下。待肿瘤体积生长至150mm3时，将荷瘤小鼠随机分为5组，每组五只:空白对照组(PBS),泰素组，α-PTX-SS-CIT纳米粒，β-PTX-SS-CIT纳米粒和γ-PTX-SS-CIT纳米粒。每隔1天给药1次，连续给药5次，按紫杉醇计算，给药剂量为8mg/kg。给药后，每天观察小鼠的存活状态，称体重，测量肿瘤体积。
实验结果如图14所示，与对照组相比，泰素表现出一定的肿瘤抑制活性(～330mm3)。相比之下，小分子前药自组装纳米粒显示出比紫杉醇更强的抗肿瘤活性(<200mm3)，肿瘤体积几乎没有增长。值得注意的是，二硫键在链接键中的位置会显著影响小分子前药自组装纳米粒的抗肿瘤性能，α-PTX-SS-CIT纳米粒比β-PTX-SS-CIT纳米粒和γ-PTX-SS-CIT纳米粒表现出更强的肿瘤抑制活性，肿瘤体积显著减少(～100mm3)。这是由于α-PTX-SS-CIT前药具有氧化还原双重超敏性，与β-PTX-SS-CIT前药和γ-PTX-SS-CIT前药相比，能够在肿瘤氧化还原微环境中更快的释放出紫杉醇。
如图14所示，各组裸鼠体重没有明显变化。说明这些PEG化的小分子前药自组装纳米粒在具有明显的抗肿瘤效果的同时，没有对机体造成显著的非特异性毒性，是安全有效的抗癌药物传递***。

Claims (10)

1.氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药，其特征在于，以抗肿瘤药物和含有不饱和键和活性羟基的碳链通过二硫键桥连。
2.如权利要求1所述的氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为含有活性羟基或氨基的抗癌药物，选自紫杉烷类化合物、核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物，所述的含有不饱和键和活性羟基的碳链为维生素E、油酸-乙二醇酯、油醇、亚麻醇或亚油醇。
3.如权利要求1或2所述的氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药，其特征在于，其结构式为：
4.如权利要求3所述的氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药的制备方法，其特征在于，采用如下步骤制备：
首先将二元酸成酸酐，然后与香茅醇成酯得到中间产物，中间产物与紫杉醇成酯，得到终产物。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
将2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸溶解于乙酸酐中，室温下搅拌1-2个小时，将所得产物溶于二氯甲烷中，并加入香茅醇和DMAP，室温条件下搅拌1-2小时，通过柱层析分离得到中间产物；将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于无水二氯甲烷中，冰浴1-2小时，然后加入紫杉醇，室温条件下搅拌24-48小时，所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
6.氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，其制备过程如下：
将一定量的二硫键桥连小分子前药或小分子前药与PEG修饰剂/疏水性荧光物质溶解到适量的乙醇中，搅拌下，将该乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，最后，采用透析法除去制剂中的乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
7.根据权利要求6所述的小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，所述的PEG为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG、PE-PEG和DSPE-PEG-AA，小分子前药与PEG修饰剂的比例为90:10～70:30，所述的疏水性荧光物质为香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy-5和Cy-7。
8.权利要求1-3任何一项所述的氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药或权利要求6-7任何一项所述的小分子前药自组装纳米粒在药物传递***中的应用。
9.权利要求1-3任何一项所述的氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药或权利要求6-7任何一项所述的小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-3任何一项所述的氧化还原超敏感二硫键桥连小分子前药或权利要求6-7任何一项所述的小分子前药自组装纳米粒在注射给药、口服给药或局部给药***中的应用。
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