CN110241150A - β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种糖的发酵方法，尤其涉及β‑1，3‑葡聚糖的放大发酵方法，属于微生物发酵技术领域。本发明通过对菌株发酵培养过程中接种量、底物浓度、发酵时间、氮胁迫条件的控制，直接以蔗糖为碳源，通过生物转化合成β‑1，3‑葡聚糖的工艺，经检测蔗糖转化率＞68.2％，β‑1，3‑葡聚糖的产量＞38.4mg/mL。通过该工艺可以实现蔗糖的直接生物转化合成β‑1，3‑葡聚糖的工业化生产。最终产物β‑1,3‑葡聚糖在日化、环保、食品、农业等行业具有广泛的应用前景。

Description

β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法
技术领域
本发明涉及一种糖的发酵方法，尤其涉及β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
β-1，3-葡聚糖是一类主链结构由β-1，3-糖苷键连接，通常含有不同比例和大小的β-1，3，β-1，4，β-1，6糖苷键连接的支链的大分子多糖。20世纪60年代，就已证明β-1，3葡聚糖具有增强哺乳动物免疫活力、抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、降低胆固醇和血脂、促进伤口愈合等作用，显示了其在药学领域的潜在应用价值，受到广泛的关注；近年来的研究表明，β-1，3葡聚糖应用在日化产品中，可以起到保湿、抗炎、抗衰老、去皱、去头屑、退黄、加快修复、增加皮肤弹性的作用。应用于畜禽养殖可以增强畜禽的机体免疫力、改善胃肠功能，为逐步替代抗生素的滥用起到了推进作用。同时发现β-1,3-葡聚糖可以作为叶面肥使用，在小麦的生长试验中，长势极其优良，还能消除除草剂的部分毒性。为全面推广绿色农业技术，进一步拓展了β-1，3葡聚糖应用领域。
传统生产β-葡聚糖的方法是从香菇、酵母、燕麦、青稞中提取获得。由于受到原料生产规模、生产周期的限制，通过提取方式生产β-葡聚糖远远不能满足的市场需求。为了改进β-葡聚糖生产方式，提升β-葡聚糖的产量，近年来，国内外研究中开展了高产β-葡聚糖的微生物的筛选研究，目前已经筛选出的适于规模化生产β-葡聚糖微生物包括啤酒酵母、枯草芽孢杆菌等，国外已经开展了通过微生物发酵培养规模化生产β-葡聚糖细菌来源的β-葡聚糖酶的尝试，但我国微生物发酵生产β-葡聚糖的相关研究起步较晚，以啤酒酵母为主，其他来源较少。啤酒酵母生产β-葡聚糖仍存在原料转化利用率低，产品纯度低、品质差等缺点，难以适应当前市场对高品质β-葡聚糖的需求。针对上述缺陷，申请人于2017年7月19日申请了《一种高产β-1，3-葡聚糖枯草芽孢杆菌及其应用》，申请号：201710590529.7，通过直接将蔗糖转化为β-1，3-葡聚糖，实现蔗糖高效转化。该申请公开了实验部分，生产时，可能会出现工艺问题，产率低下等一系列问题，如何进一步利用该方法实现工业化生产，产量如何，仍属未知。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的无法实现工业生产的缺陷，提出β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法，进一步解决工业化生产的难题。
本发明通过以下技术方案解决技术问题：β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法，包括以下步骤：
第一步、制备菌种活化培养基，按照KH2PO4 0.3-1.0g/L；CaCl2 0.3-1.0g/L，MgSO40.6-1.2g/L，FeSO4·7H2O 0.6-1.2g/L，蔗糖3.0-8.0g/L，琼脂12.0-18.0g/L的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调pH 6.5-7.0，115℃灭菌30分钟；
第二步、菌种活化，将菌株划线接种于第一步所得菌种活化培养基，25-30℃静置恒温培养2-3天；
第三步、制备种子培养液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化钠3.0-5.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，115-121℃灭菌20-30分钟；
第四步、培养种子液，从菌种活化培养基上刮取活化菌种转接到100mL液体种子培养液中，于28-32℃摇床中以150-300rpm的速度震荡培养48-72h，至培养液OD600值在0.6-0.9之间，作为初级发酵培养的种子液备用；
第五步、制备初级发酵培养液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化钠3.0-5.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，115-121℃灭菌20-30分钟；
第六步、培养放大发酵种子液，按照种子液∶初级发酵培养液(V/V)比1∶300-800的比例，将种子液接种到初级发酵培养液中，于发酵罐25-35℃，发酵1-2天，调pH 6.5-7.0，搅拌速率150-200rpm，通气量0.4-0.5vvm，至发酵培养液OD600值大于0.9，作为放大发酵培养的种子液备用；
第七步、制备放大发酵培养液，按照蔗糖120g/L的质量浓度称取，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；
第八步、放大发酵培养，按照初级发酵培养液∶放大发酵培养液(V/V)比1∶300-800的比例，将初级发酵液接种到放大发酵培养液中，于发酵罐25-35℃，发酵5-9天，其中发酵第1-2天需控制pH为7.0，误差不超过±0.1，搅拌速率为150-200rpm，通气量为0.4-0.5vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5，误差不超过±0.1，搅拌速率为400-600rpm，通气量为0.7-0.8vvm，最终获得β-1，3-葡聚糖粗品。
以上方法中，所述菌株是保藏号为CGMCC No.12176的枯草芽孢杆菌(Bucillussubtilis)。
所述发酵液是将底物蔗糖转化为β-1,3-葡聚糖。
所述底物的蔗糖转化率＞68.2％，β-1,3-葡聚糖的产量＞38.4mg/mL。
本发明通过对菌株发酵培养过程中接种量、底物浓度、发酵时间、氮胁迫条件的控制，直接以蔗糖为碳源，通过生物转化合成β-1,3-葡聚糖的工艺，经检测蔗糖转化率＞68.2％，β-1,3-葡聚糖的产量＞38.4mg/mL。通过该工艺可以实现蔗糖的直接生物转化合成β-1,3-葡聚糖的工业化生产。最终产物β-1,3-葡聚糖在日化、环保、食品、农业等行业具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为发酵液的HPLC图谱。
具体实施方式
以下实施例的发酵液图谱如图1所示，图中葡萄糖、果糖、蔗糖的HPLC图谱(其中A、B分别为标准品图谱和供试液图谱)。图中1、2、3分别为葡萄糖、果糖和蔗糖。
实施例1
(1)菌种活化培养基制备：按照KH2PO4 0.3g/L；CaCl2 0.3g/L，MgSO4 0.6g/L，FeSO4·7H2O 0.6g/L，蔗糖5.0g/L，琼脂12.0g/L的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调pH 6.5-7.0，115℃灭菌30分钟；(2)菌种活化：取枯草芽孢杆菌菌种，划线接种于菌种活化培养基，25℃静置恒温培养2天；(3)种子培养液制备：按照蛋白胨8.0g/L，酵母浸粉3.0g/L，氯化钠3.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0，115℃灭菌30分钟；(4)种子培养：从菌种活化培养基上刮取活化菌种转接到100mL液体种子培养液中，于28℃摇床中以150rpm的速度震荡培养48h，至培养液OD600值大于0.7，作为发酵培养的种子液备用；(5)初级发酵培养液制备：按照蛋白胨2.0g/L，酵母浸粉1.5g/L，蔗糖120g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；(6)初级发酵培养：按照种子液∶初级发酵培养液(V/V)比1∶400的比例，将种子液接种到初级发酵培养液中，于发酵罐30℃，搅拌速率150rpm，通气量0.4vvm，发酵1天，至培养液OD600值大于0.9；(7)放大发酵培养液制备：按照蔗糖120g/L的质量浓度称取，重蒸水溶解定容，调培养液pH7.0，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；(8)放大发酵培养：按照初级发酵培养液∶放大发酵培养液(V/V)比1∶400的比例，将初级发酵培养液接种到放大发酵培养液中，于发酵罐30℃，发酵7天，其中发酵1-2天搅拌速率为150rpm，通气量为0.4vvm，待氮源耗尽时，调搅拌速率为400rpm，通气量为0.6vvm，得β-1，3-葡聚糖粗品产量为39.4mg/mL。
实施例2
(1)菌种活化培养基制备：按照KH2PO4 0.4g/L；CaCl2 0.4g/L，MgSO4 0.7g/L，FeSO4·7H2O 0.8g/L，蔗糖6.0g/L，琼脂12.0g/L的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调pH 7.0，115℃灭菌30分钟；(2)菌种活化：取枯草芽孢杆菌菌种，划线接种于菌种活化培养基，25℃静置恒温培养2天；(3)种子培养液制备：按照蛋白胨9.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，氯化钠4.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0，115℃灭菌30分钟；(4)种子培养：从菌种活化培养基上刮取活化菌种转接到100mL液体种子培养液中，于28℃摇床中以150rpm的速度震荡培养54h，至培养液OD600值大于0.8，作为发酵培养的种子液备用；(5)初级发酵培养液制备：按照蛋白胨2.0g/L，酵母浸粉1.5g/L，蔗糖120g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；(6)初级发酵培养：按照种子液∶初级发酵培养液(V/V)比1∶600的比例，将种子液接种到初级发酵培养液中，于发酵罐30℃，搅拌速率200rpm，通气量0.4vvm，发酵1天，至培养液OD600值大于0.9；(7)放大发酵培养液制备：按照蔗糖120g/L的质量浓度称取，重蒸水溶解定容，调培养液pH7.0，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；(8)放大发酵培养：按照初级发酵培养液∶放大发酵培养液(V/V)比1∶600的比例，将初级发酵培养液接种到放大发酵培养液中，于发酵罐30℃，发酵7天，其中发酵1-2天搅拌速率为200rpm，通气量为0.4vvm，待氮源耗尽时，调搅拌速率为500rpm，通气量为0.6vvm，得β-1，3-葡聚糖粗品产量为43.5mg/mL。
实施例3
(1)菌种活化培养基制备：按照KH2PO4 0.4g/L；CaCl2 0.4g/L，MgSO4 0.7g/L，FeSO4·7H2O 0.7g/L，蔗糖6.0g/L，琼脂12.0g/L的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调pH 6.5，115℃灭菌30分钟；(2)菌种活化：取枯草芽孢杆菌菌种，划线接种于菌种活化培养基，25℃静置恒温培养2天；(3)种子培养液制备：按照蛋白胨9.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，氯化钠4.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0，115℃灭菌30分钟；(4)种子培养：从菌种活化培养基上刮取活化菌种转接到100mL液体种子培养液中，于28℃摇床中以150rpm的速度震荡培养48h，至培养液OD600值大于0.8，作为发酵培养的种子液备用；(5)初级发酵培养液制备：按照蛋白胨2.0g/L，酵母浸粉1.5g/L，蔗糖120g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；(6)初级发酵培养：按照种子液∶初级发酵培养液(V/V)比1∶500的比例，将种子液接种到初级发酵培养液中，于发酵罐30℃，搅拌速率200rpm，通气量0.5vvm，发酵1天，至培养液OD600值大于0.9；(7)放大发酵培养液制备：按照蔗糖120g/L的质量浓度称取，重蒸水溶解定容，调培养液pH7.0，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；(8)放大发酵培养：按照初级发酵培养液∶放大发酵培养液(V/V)比1∶500的比例，将初级发酵培养液接种到放大发酵培养液中，于发酵罐30℃，发酵7天，其中发酵1-2天搅拌速率为200rpm，通气量为0.5vvm，待氮源耗尽时，调搅拌速率为500rpm，通气量为0.8vvm，得β-1，3-葡聚糖粗品产量为49.7mg/mL。
除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (4)

1.β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法，包括以下步骤：
第一步、制备菌种活化培养基，按照KH2PO4 0.3-1.0g/L；CaCl2 0.3-1.0g/L，MgSO4 0.6-1.2g/L，FeSO4·7H2O 0.6-1.2g/L，蔗糖3.0-8.0g/L，琼脂12.0-18.0g/L的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调pH 6.5-7.0，115℃灭菌30分钟；
第二步、菌种活化，将菌株划线接种于第一步所得菌种活化培养基，25-30℃静置恒温培养2-3天；
第三步、制备种子培养液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化钠3.0-5.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，115-121℃灭菌20-30分钟；
第四步、培养种子液，从菌种活化培养基上刮取活化菌种转接到100mL液体种子培养液中，于28-32℃摇床中以150-300rpm的速度震荡培养48-72h，至培养液OD600值在0.6-0.9之间，作为初级发酵培养的种子液备用；
第五步、制备初级发酵培养液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化钠3.0-5.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，115-121℃灭菌20-30分钟；
第六步、培养放大发酵种子液，按照种子液∶初级发酵培养液(V/V)比1∶300-800的比例，将种子液接种到初级发酵培养液中，于发酵罐25-35℃，发酵1-2天，调pH 6.5-7.0，搅拌速率150-200rpm，通气量0.4-0.5vvm，至发酵培养液OD600值大于0.9，作为放大发酵培养的种子液备用；
第七步、制备放大发酵培养液，按照蔗糖120g/L的质量浓度称取，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；
第八步、放大发酵培养，按照初级发酵培养液∶放大发酵培养液(V/V)比1∶300-800的比例，将初级发酵液接种到放大发酵培养液中，于发酵罐25-35℃，发酵5-9天，其中发酵第1-2天需控制pH为7.0，误差不超过±0.1，搅拌速率为150-200rpm，通气量为0.4-0.5vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5，误差不超过±0.1，搅拌速率为400-600rpm，通气量为0.7-0.8vvm，最终获得β-1，3-葡聚糖粗品。
2.根据权利要求1所述β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法，其特征在于：所述菌株是保藏号为CGMCC No.12176的枯草芽孢杆菌(Bucillussubtilis)。
3.根据权利要求1所述β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法,其特征在于：所述发酵液是将底物蔗糖转化为β-1,3-葡聚糖。
4.根据权利要求3所述β-1，3-葡聚糖的放大发酵方法,其特征在于：所述底物的蔗糖转化率＞68.2％，β-1,3-葡聚糖的产量＞38.4mg/mL。
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