CN110229843B - 陆地棉转化事件19pfa1-135-17及其特异性鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了陆地棉转化事件19PFA1‑135‑17及其特异性鉴定方法。本发明将EPSPS基因导入陆地棉CCRI24中，使基因在陆地棉CCRI24中过表达，得到转基因棉花，该转基因棉花为将序列1所示的外源DNA片段***目的棉花基因组第A10号染色体的第38496180‑38496245位间，替换掉第A10号染色体的第38496180‑38496245位间64bp的碱基序列，得到的棉花。试验证明，该转基因棉花不仅抗草甘膦方面具有高抗特性，而且第一果枝着生节位、果枝数和结铃数高于陆地棉CCRI24，株高和第一果枝长度低于陆地棉CCRI24。本发明为培育具有抗草甘膦的转基因棉花奠定基础，具有重要的应用价值。

Description

陆地棉转化事件19PFA1-135-17及其特异性鉴定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及陆地棉转化事件19PFA1-135-17及其特异性鉴定方 法。

背景技术

转化事件是由外源基因在基因组***位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。 通常，外源基因转化植物可以得到一个转化体群体，这个转化体群体包含大量独立的事件， 其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所***的染色***置的影 响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事 件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基 因的***也可能会影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不 同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基 因作物新品种中具有重要的应用价值。

我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，也是最大的纺织品和服装生产国与出口国。 棉花总产量占世界棉花产量的25％左右。棉花生产的兴衰，对我国国民经济的发展，乃至人 民生活水平的提高都产生着一定的影响。杂草严重威胁着棉花的产量和品质。一方面它和作 物争夺光、水和养分，另一方面作为农作物病虫害的中间寄主，传播病虫害。在发达国家， 主要农作物除草剂使用面积已达100％，除草剂销售量占农药总销售量的60％-70％。近年来， 我国随着棉花行间定向喷雾技术推广面积的逐渐扩大，各种灭生性除草剂在我国的使用量也 呈逐年上升趋势。

种植抗除草剂棉花可以扩大棉田杀草谱，使田间杂草防除变得简便易行，是降低除草成 本、提高植棉效益的有效途径。草甘膦(glyphosate)是目前广泛应用的内吸型广谱性除草剂， 它通过抑制植物体内芳香族氨基酸合成途径中的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5 -enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)的活性，阻断芳香族氨基酸的合 成，从而杀灭杂草，对植物无选择性。国内外科技工作者先后创制出转G6-EPSPS、CP4-EPSPS、 GR79-EPSPS等基因的抗除草剂棉花种质，为培育具有我国自主知识产权的抗草甘膦棉花品种 奠定了基础。近年来，商业化具有抗草甘膦除草剂的玉米、大豆以及油菜等作物的种植面积 逐年增加，经济效益显著，因此，为适应新的棉花生产竞争需求，培育具有自主权益的国内 抗草甘膦棉花品种迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗除草剂特性的转基因棉花培育方法。

本发明首先保护一种转基因棉花的培育方法，为将外源DNA片段***目的棉花基因组第 A10号染色体的第38496180-38496245位间，替换掉第A10号染色体的第38496180-38496245 位间64bp的碱基序列，得到转基因棉花；

所述转基因棉花的草甘膦抗性和/或第一果枝着生节位和/或果枝数和/或结铃数均高于 所述目的棉花；所述转基因棉花的株高和/或第一果枝长度低于所述目的棉花；

所述外源DNA片段可为含有EPSPS基因的DNA分子。所述EPSPS基因的核苷酸序列如序 列表中序列1自5’末端起第3658-5146位核苷酸所示。

上述培育方法中，所述外源DNA片段可通过含有外源DNA片段的重组载体导入所述目的 棉花。所述含有外源DNA片段的重组载体可为将表达盒A***pCambia1300载体的EcoRI和HindIII酶切位点间，且保持pCambia1300载体的其它序列不变，得到重组载体；表达盒A 的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第2942-5456位所示。所述含有外源DNA片段 的重组载体的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

上述培育方法中，所述外源DNA片段的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。

所述培育方法具体可为将序列表中序列1所示的外源DNA分子***目的棉花基因组第A10 号染色体的第38496180-38496245位间(序列表中序列1所示的外源DNA分子的5’末端紧 邻第A10号染色体的第38496245位，序列表中序列1所示的外源DNA分子的3’末端紧邻第 A10号染色体的第38496180位)，替换掉第A10号染色体的第38496180-38496245位间64bp 的碱基序列，得到转基因棉花。

上述任一所述转基因棉花在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:P201905。

本发明还保护用于鉴定植物样品是否来源于所述转基因棉花或其后代的方法，包括如下 步骤：检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A；所述DNA片段A由上述 任一所述外源DNA片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段、所述外源DNA片段和所述外源DNA 片段在所述转基因棉花的下游侧翼片段组成；

若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选 为所述转基因棉花或其后代；

若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或 候选不为所述转基因棉花或其后代。

上述任一所述外源DNA片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段可为所述目的棉花基因组 第A10号染色体自第38496245位核苷酸起向其3’方向延伸得到的长度为0-5Kb的任意一个 DNA片段。

上述任一所述外源DNA片段在所述转基因棉花的下游侧翼片段可为所述目的棉花基因组 第A10号染色体自第38496180位核苷酸起向其5’方向延伸得到的长度为0-5Kb的任意一个 DNA片段。

上述任一所述上游侧翼序列的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。

上述任一所述下游侧翼序列的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。

上文中，所述转基因棉花对草甘膦的抗性高于所述目的棉花可体现为：与目的棉花相比， 转基因棉花对于草甘膦的抗性明显增加(即涂抹草甘膦后，转基因棉花比目的棉花的叶片死 亡率低或整体长势好)。转基因棉花抗草甘膦特性的显著增加，在生产中可用于培育抗草甘 膦棉花。

上述方法中，所述“检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A”的方 法可为S1)或S2)或S3)。

S1)直接测序。

S2)用引物对1和/或引物对2对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行如 下判断：若有目的扩增产物，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；若 没有目的扩增产物，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；

所述引物对1可为能够扩增由所述外源DNA片段5’端和紧邻其所述上游侧翼序列部分 或全部片段组成的DNA分子甲的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子甲；

所述引物对2可为能够扩增含有所述外源DNA片段3’端和紧邻其所述下游侧翼序列的 部分或全部组成的DNA分子乙的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子乙。

S3)用能特异结合所述DNA分子甲或所述DNA分子乙的探针对所述待测植物样品的基因 组DNA进行Southern blot杂交，然后进行如下判断：若能得到杂交片段，则所述待测植物 样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；若不能得到杂交片段，则所述待测植物样品不为 或候选不为所述转基因棉花或其后代。

所述引物对1具体可由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列7所示的单 链DNA分子组成。所述引物对2具体可由序列表中序列6所示的单链DNA分子和序列表中序 列8所示的单链DNA分子组成。

本发明还保护一种用于鉴定待测植物样品是否来源于所述培养方法获得的转基因棉花或 其后代的试剂盒，包括上述任一所述引物对1和/或引物对2。

本发明还保护一种获得草甘膦抗性提高和/或第一果枝着生节位提高和/或果枝数提高和 /或结铃数提高和/或株高降低和/或第一果枝长度降低的棉花的方法，可包括如下步骤：

(1)按照上述任一所述培养方法获得转基因棉花；

(2)将所述转基因棉花自交或杂交，得到繁育后代，按照上述任一所述的方法鉴定所述 繁育后代，得到目标植株。

上述方法中，所述转基因棉花在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:P201905。

本发明还保护D1)-D6)中的任一种。

D1)采用上述任一所述培育方法获得的转基因棉花在棉花育种中的应用。

D2)上述任一所述外源DNA片段在调控棉花抗草甘膦中的应用。

D3)上述任一所述外源DNA片段在调控棉花第一果枝着生节位和/或果枝数和/或结铃数 和/或株高和/或第一果枝长度的应用。

D4)上述任一所述外源DNA片段在鉴定待测植物样品是否来源于上述任一所述培养方法 获得的转基因棉花或其后代中的应用。

D5)上述任一所述引物对1和/或引物对2在鉴定待测植物样品是否来源于上述任一所述 培育方法获得的转基因棉花或其后代中的应用。

D6)上述任一所述上游侧翼序列和/或下游侧翼序列在鉴定待测植物样品是否来源于上述 任一所述培育方法获得的转基因棉花或其后代中的应用。

上文中，所述目的棉花可为陆地棉。所述陆地棉具体可为陆地棉CCRI24。

本发明将EPSPS基因导入陆地棉CCRI24中，使EPSPS基因在陆地棉CCRI24中过表达， 得到转基因棉花19PFA1-135-17，转基因棉花19PFA1-135-17为将外源DNA片段***目的棉 花基因组第A10号染色体的第38496180-38496245位间，替换掉第A10号染色体的第38496180-38496245位间64bp的碱基序列，得到的棉花。试验证明，与陆地棉CCRI24相比，转基因棉花19PFA1-135-17的草甘膦抗性提高，第一果枝着生节位、果枝数和结铃数也显著提高，株高和第一果枝长度显著降低。本发明为培育具有抗草甘膦的转基因棉花奠定基础，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为19PFA1-135-17的序列分析。

图2为转基因棉花19PFA1-135-17的田间阳性分子鉴定和侧翼序列RB一侧***在基因组 中的分子验证。

图3为T5代转草甘膦棉花纯合株系19PFA1-135-17和陆地棉CCRI24的草甘膦抗性鉴定 结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规 生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的陆地棉CCRI24在文献“PAG1，a cotton brassinosteroidcatabolism gene，modulates fiber elongation”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。

下述实施例中的农杆菌LBA4404在文献“Constitutive expression of thevirulence genes improves the efficiency of plant transformation byAgrobacterium”中公开过， 公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。

下述实施例中涉及的引物的核苷酸序列见表1。

表1

	核苷酸序列(5’-3’)	在序列表中的位置
			引物1	GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT	-
引物2	ACCAGCCC	-
			引物3	GTAATACGACTCACTATAGGGC	-
引物4	ACTATAGGGCACGCGTGGT	-
			引物5	gccgaacttggttccttatataggaaaactc	-
引物6	gtctctttcacaatcaccgaccttatcttc	-
			引物7	gaagcttggcactggccgtcgttttacaa	序列5
引物8	ggctaccgcctaataggagctcgagtttct	-
			引物9	ctaataggagctcgagtttctccataataa	-
引物10	cctatagggtttcgctcatgtgttgagca	序列6
			引物11	TCATCCACACTATCTAAGCCC	序列7
引物12	CAGTTGGTTGTGAATGGGAG	序列8

注：“-”表示不存在。

实施例1、转EPSPS棉花的获得及农艺性状分析

一、转EPSPS棉花的获得

1、重组载体的构建

将表达盒A***pCambia1300载体(该质粒购于NTCC典型培养物保藏中心下属的BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号为：Biovectorpcambia1300)的EcoRI和HindIII酶切位点间，且保持pCambia1300载体的其它序列不变，得到重组载体(核苷酸序列如序列表中序列4所示)。上述表达盒A的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第2942-5456位所示。表达盒A从上游依次包括CSV-promoter启动子、EPSPS基因和NOS终止子；其中，CSV-promoter启动子的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第2942-3657 位核苷酸所示；EPSPS基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第3658-5146位核苷 酸所示；NOS终止子的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第5201-5453位核苷酸所示。

pCambia1300载体自身还包括表达盒B。表达盒B从上游起依次包括花椰菜花叶病毒的 CAMV35S的增强启动子、EPSPS基因和Ploy A终止子。

2、重组菌的获得

将步骤1获得的重组载体导入农杆菌LBA4404中，得到重组菌。

3、转EPSPS棉花的获得

采用农杆菌介导的方法将步骤2获得的重组菌转化陆地棉CCRI24的外植体(1500个)， 在含有草甘膦的培养基上培养诱导形成愈伤组织，选择转化的愈伤组织，愈伤组织在草甘膦 筛选培养基上形成胚性愈伤组织，挑选存活的胚性愈伤转化形成再生成棉花，最后共获得50 个T0代转EPSPS棉花，并将其用于筛选。

4、转EPSPS棉花的鉴定

(1)对收获的T1代转EPSPS棉花种子在温室种植，进行温室功效分析和分子分析。提 取T1代转EPSPS棉花叶片的DNA，采用5’-AGCACAGCCATCCAAGAACTA-3’和 5’-AACATAAGGGCGGAAGCGT-3’进行PCR扩增，检测目的基因是否存在，并统计材料的分离比。 根据孟德尔遗传定律，获得12个单拷贝的T1代转EPSPS棉花；

(2)采用Taqman PCR和Southern blot对上述步骤(1)获得的12个单拷贝的T1代转EPSPS棉花进一步验证。具体步骤如下：在始花期对获得的12个单拷贝的T1代转EPSPS棉 花材料和陆地棉CCRI24材料的EPSPS基因表达量进行分析，表明12个单拷贝的T1代转EPSPS棉花中有9个T1代转EPSPS棉花的表达量较陆地棉CCRI24大幅提高。

(3)在开花期测定上述步骤(2)获得的9个T1代转EPSPS棉花材料的农艺学性状和草 甘膦抗性。结果表明，9个T1代转EPSPS棉花中的第一果枝着生节位、果枝数、结铃数和草甘膦抗性较陆地棉CCRI24显著提高，株高和第一果枝长度较陆地棉CCRI24显著降低。

(4)在第一年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估9个T2代转EPSPS棉花的 农艺和品质性状及草甘膦抗性。结果表明：9个T2代转EPSPS棉花中共有2个T2代转EPSPS棉花的第一果枝着生节位、果枝数、结铃数和草甘膦抗性较陆地棉CCRI24显著提高，株高和第一果枝长度较陆地棉CCRI24显著降低。

(5)在第二年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估上述步骤(4)获得的2个 T2代转EPSPS棉花的农艺和品质性状及草甘膦抗性。结果表明：2个T2代转EPSPS棉花中共 有1个T2代转EPSPS棉花的第一果枝着生节位、果枝数、结铃数和草甘膦抗性较陆地棉CCRI24 显著提高，株高和第一果枝长度较陆地棉CCRI24显著降低。将该T2代转EPSPS棉花的种子 命名为19PFA1-135-17，将T2代转EPSPS棉花19PFA1-135-17进行自交，直至获得T5代转 EPSPS棉花纯合株系19PFA1-135-17，以下简称19PFA1-135-17。

T5代转EPSPS棉花种子(Gossypiumhirsutum L.)19PFA1-135-17已于2019年04月02 日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉)，分类命名为陆地棉种子ICR24-19PFA1-135-17，保藏编号为CCTCC NO:P201905。

二、转EPSPS基因棉花的农艺性状分析

1、草甘膦抗性鉴定

本实验中草甘膦溶液的溶剂为水，浓度为800PPM。

在试验田分别种植19PFA1-135-17与陆地棉CCRI24，随机区组设计，3次重复。小区间 设置1m的隔离带，小区面积≥20m²。

处理方式分别如下：

处理1：用毛笔向19PFA1-135-17的嫩叶表面涂抹清水(作为对照)；

处理2：用毛笔向19PFA1-135-17的嫩叶表面涂抹草甘膦溶液；

处理3：用毛笔向陆地棉CCRI24的嫩叶表面涂抹清水(作为对照)；

处理4：用毛笔向陆地棉CCRI24的嫩叶表面涂抹草甘膦溶液。

涂抹3-7天后，调查叶片损伤程度，分析19PFA1-135-17的草甘膦抗性。

抗性鉴定结果见表2。结果表明，与陆地棉CCRI24相比，19PFA1-135-17的草甘膦抗性 显著提高。

表2. 19PFA1-135-17和陆地棉CCRI24的草甘膦抗性

待测棉花	死亡率(％)
		19PFA1-135-17	4.00
陆地棉CCRI24	98.00

2、农艺性状

将T5代转EPSPS棉花纯合株系19PFA1-135-17与陆地棉CCRI24进行其它农艺性状的考 察与测定。在河南安阳设计小区试验，设置3个小区，3个小区设置完全相同，小区行长8m， 每行种植30株，行间距80cm，每个材料种植3行，小区共6行。采用Students’test对T5代转EPSPS棉花纯合株系19PFA1-135-17与陆地棉CCRI24的第一果枝着生节位、果枝数、结铃数、株高和第一果枝长度分别进行了统计分析。

统计结果见表3。结果表明，与陆地棉CCRI24相比，T5代转EPSPS棉花纯合株系19PFA1-135-17的第一果枝着生节位、果枝数和结铃数显著提高，株高和第一果枝长度显著降低。

表3.转基因棉花19PFA1-135-17和陆地棉CCRI24的农艺性状比较

3、其它方面的影响

由于启动子是组成型启动子，因此不仅在绿色组织(包括茎、叶、蕾、生长点)中表达， 其它组织也会受到一定影响。为了研究除了改良草甘膦抗性外，EPSPS基因对其它组织是否 产生影响，对T5代转EPSPS棉花纯合株系19PFA1-135-17与陆地棉CCRI24的纤维长度、断 裂比强度、马克隆值、整齐度指数和伸长率进行了检测。

统计结果见表4。结果表明，与陆地棉CCRI24相比，T5代转EPSPS棉花纯合株系19PFA1-135-17的纤维长度、断裂比强度、马克隆值、整齐度指数和伸长率均无显著差异。

表4.转基因棉花19PFA1-135-17和陆地棉CCRI24的纤维品质数据比较

三、19PFA1-135-17的DNA序列的表征分析

采用分子生物学的方法分析19PFA1-135-17基因组的***物和与***物相连接侧翼连接 的基因组序列。具体步骤如下：

1、提取棉花的基因组。温室或大田条件下，取19PFA1-135-17的棉花的幼嫩叶片约100mg 置于2.0ml的EP管中，采用液氮冷冻EP管，然后采用冷冻研磨仪研磨，采用Qiagen公司 DNeasy Plant Mini Kit(50)(货号69104)中提供的方案提取基因组DNA。该方法可经本领 域技术人员改进以从任何组织(包括但不限于种子)提取DNA。

2、根据塔克拉公司的Genome Walking Kit进行PCR扩增。将提取的基因组DNA分装为 4管，分别用EcoRV、DraⅠ、StuⅠ、PvuⅡ四个酶进行酶切，对酶切后的产物纯化后加接头(接头由引物1与引物2结合形成)，然后通过3轮PCR：第一轮以接头为模板，分别以引 物3和引物5，引物3和引物8扩增；第二轮以第一轮PCR产物为模板，分别以引物4和引 物6，引物4和引物9扩增；第三轮以第二轮PCR产物为模板，分别以引物4和引物7，引物 4和引物10扩增。利用琼脂糖凝胶电泳分离从反应产生的扩增子，随后使用QIAGEN凝胶纯 化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的 pMD-19T-Simple(货号：D104A)试剂盒中提供的方案将凝胶纯化的扩增子克隆入T克隆载体 中，并转化大肠杆菌DH5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落PCR，阳性克 隆进行单克隆测序。

测序结果表明：转基因棉花19PFA1-135-17为将序列表中序列1所示的外源DNA分子插 入陆地棉CCRI24基因组第A10号染色体的第38496180-38496245位间(序列表中序列1所示 的外源DNA分子的5’末端紧邻第A10号染色体的第38496245位，序列表中序列1所示的外 源DNA分子的3’末端紧邻第A10号染色体的第38496180位)，替换掉第A10号染色体的第38496180-38496245位间64bp的碱基序列，得到的转基因棉花，且自第38496245位上游且紧邻第38496245位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列为序列2，自第38496180位下游且紧邻第38496180位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列为序列3(图1)。

实施例2、19PFA1-135-17繁育后代性状的获得和鉴定及其农艺性状分析

一、19PFA1-135-17繁育后代性状的获得

1、杂交

在开花前1天下午通过人手工或者人为行动除去第一棉花的花粉，并且采用蜡管套住花 的柱头，防止外来花粉与柱头接触，第二天上午待第二棉花的花粉散粉时，通过人手工收集 第二种棉花的花粉，并将该花粉与第一种植物的花柱或柱头接触，即完成杂交过程。其中， 第一棉花为实施例中的19PFA1-135-17时，第二棉花为其它棉花，或者第二棉花为 19PFA1-135-17，第一棉花为其它棉花。

吐絮期收获杂交铃，并将棉花自然晒干，轧花，并采用浓硫酸脱绒，即获得杂交种子。 种植，获得杂种后代，即为19PFA1-135-17繁育后代。

2、自交

在开花前1天，采用自交夹直接夹住19PFA1-135-17的花蕾或者采用细线捆绑花蕾，防 止开花时外来花粉与19PFA1-135-17的柱头接触；或者通过网袋将整个棉花植株套住，可以 有效的防止通过昆虫等传粉，能够实现棉花的自花授粉。通过上述步骤可以完成自交。

吐絮期收获杂交铃，并将棉花自然晒干，轧花，并采用浓硫酸脱绒，即获得自交种子， 种植，得到自交后代，即为19PFA1-135-17繁育后代。

二、19PFA1-135-17繁育后代性状的鉴定及其农艺性状分析

(一)19PFA1-135-17繁育后代性状的鉴定方法

以19PFA1-135-17繁育后代的基因组DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，若PCR 扩增产物含有19PFA1-135-17的扩增子(扩增子是指一条或者一段采用PCR扩增技术合成的 DNA分子)，说明19PFA1-135-17繁育后代具有和19PFA1-135-17相同的性状，若PCR扩增 产物不含19PFA1-135-17的扩增子，说明19PFA1-135-17繁育后代不具有和19PFA1-135-17 相同的性状。具体鉴定方法如下：

1、鉴定方法1

(1)以19PFA1-135-17繁育后代的基因组DNA为模板，采用引物7和引物11组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增体系如下：2×MASTRE PCR MIX 10μl、引物7(10μM)0.5μl、引物11(10μM)0.5μl、模板DNA(50ng/μl)1μl、超纯水8μl，总体积20μl。

PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，32个循环；72℃5min。

(2)将步骤(1)获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：若PCR 扩增产物含有约500bp的DNA片段，则说明19PFA1-135-17繁育后代含有19PFA1-135-17的 扩增子，19PFA1-135-17繁育后代具有19PFA1-135-17性状；否则不具有19PFA1-135-17性 状。

实验结果见图2中左图(M为DNA Marker，1为19PFA1-135-17繁育后代)。

2、鉴定方法2

(1)以19PFA1-135-17繁育后代的基因组DNA为模板，采用引物10和引物12组成的引 物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增体系如下：2×MASTRE PCR MIX 10μl、引物10(10μM)0.5μl、引物12(10μM)0.5μl、模板DNA(50ng/μl)1μl、超纯水8μl，总体积20μl。

PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，32个循环；72℃5min。

(2)将步骤(1)获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：若PCR 扩增产物含有约1000bp的DNA片段，则说明19PFA1-135-17繁育后代含有19PFA1-135-17的 扩增子，19PFA1-135-17繁育后代具有19PFA1-135-17性状；否则不具有19PFA1-135-17性 状。

实验结果见图2中右图(M为DNA Marker，2为19PFA1-135-17繁育后代)。

(二)19PFA1-135-17繁育后代性状的抗草甘膦性与农艺性状分析

按照实施例1中的步骤二中1的方法检测上述步骤(一)中获得的具有19PFA1-135-17 扩增子的19PFA1-135-17繁育后代和陆地棉CCRI24的抗草甘膦性与农艺性状分析。

草甘膦抗性鉴定结果见图3和表5。结果表明，与陆地棉CCRI24相比，19PFA1-135-17 繁育后代的草甘膦抗性显著提高。

表5.草甘膦抗性

株系编号	死亡率(％)
		19PFA1-135-17	0.00
陆地棉CCRI24	100.00

农艺性状分析结果见表6。结果表明，与陆地棉CCRI24相比，19PFA1-135-17繁育后代 的第一果枝着生节位、果枝数和结铃数显著提高，株高和第一果枝长度显著降低。

表6.转基因棉花19PFA1-135-17和陆地棉CCRI24的农艺性状比较

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 陆地棉转化事件19PFA1-135-17及其特异性鉴定方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5678

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgactcta 300

gctagaggat cgatccgaac cccagagtcc cgcggcggta gcctcagcgt attcgaatct 360

agcaccaaga gcttcaaggt gagcgaagaa ctgagggtag gactttctga tgtggtgtgc 420

accggtgatt ctaagtggag catctgctct gagaccaaga agggtgagaa gcatgatcat 480

tctgtggtca ccgtgaccat cagcggtgat accaccagca aggtgagcag aaccagtaac 540

ggagagagaa tcggcggtct ctcttgctct aagaccaagt ctttcaagct cagctctggt 600

gtcagagatt ctatcgcatt ccttgagtct aagagtagca acgttttccc aggtggtatc 660

accctcagcg aaggcagcag cagcggtaag agcttgcacg gcgtcggtga aggaatcacc 720

atctctagta acagcgtgga gaggtctacc acctctcacg gtaagggtat caccttctct 780

aacgatatca gcacccatct ctctaagaac gttcacagct tccttctcac cctggaggtc 840

gtgttctcta aggttagaaa gtctaacctc acctgggaga agagcagcgg cggtaaggat 900

agcagcggaa ccagggtaat caccaggaac gagcactcta cctggtctgt acttctgacc 960

accagggatg gagattcttc taaggtcatc ggaggcagta gctctaacac cgaaatcaga 1020

gagggtgtca agtgtctgtc taagaggagc gtgggacttg atatcaccgg tgagtctaag 1080

ttcgagtccg tcaggaagaa gaggaccgag gaacataagg gcggaagcgt actgggagga 1140

tctttcggcg gaaacctcca ctgtaccacc tctaactgga ccggaaacgg agatagggag 1200

tctaccatcg ttggaggaca cccaagcacc aagtctttcg agggcttcaa gaaggtcacc 1260

ctgaggtctc ttaccaaggg aatcagggta atcggtaacg aaagttgtac cagaggtgag 1320

agcagcaaca cccataagga atctggccac tgcaccagcg ttacctgggt taagggtaac 1380

accagcctgt ggtctagcac cgaaacctct gatcacggcg tcatcaccaa caagctcaac 1440

accagcaccc caatctctga ggcatctgag catagcttcg gcatcctcag aggtagccac 1500

accaacaact ctggtttcac cctcagcgag agcagcggcg aggaggtatc tagtggtgta 1560

gttcttggat ggctgtgctc taagttcacc tctgagttct ctagctggat gcacgataac 1620

gtcgaaggta gctggaagag cgtcggatcc cttctccgcc gtggaaacag aagacatgac 1680

cttaagagga cgaagctcag agccaattaa agtcatccca ctcttcttca atccccacga 1740

tgaagaaatt ggataagctc gtggatgctg ctgagtcttc agagaaaccg ataagggaga 1800

tttcctttga ctggatttag agagattgga gataagagat gggttctgca caccattgca 1860

gattctgcta acttgagcca tggtcgatcg acagatctgc gaaagctcga gagagataga 1920

tttgtagaga gagactggtg atttcagcgt gtcctctcca aatgaaatga acttccttat 1980

atagaggaag gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 2040

tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc 2100

tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag 2160

cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt 2220

tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt 2280

gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt 2340

agacgagagt gtcgtgctcc accatgttat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg 2400

ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac 2460

tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg 2520

tgccaccttc cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc 2580

cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg 2640

agactgtatc tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttggcaa 2700

gctgctctag ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 2760

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 2820

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 2880

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgaatt 2940

caagcttcca gaaggtaatt atccaagatg tagcatcaag aatccaatgt ttacgggaaa 3000

aactatggaa gtattatgtg aactcagcaa gaagcagatc aatatgcggc acatatgcaa 3060

cctatgttca aaaatgaaga atgtacagat acaagatcct atactgccag aatacgaaga 3120

agaatacgta gaaattgaaa aagaagaacc aggcgaagaa aagaatcttg aagacgtaag 3180

cactgacgac aacaatgaaa agaagaagat aaggtcggtg attgtgaaag agacatagag 3240

gacacatgta aggtggaaaa tgtaagggcg gaaagtaacc ttatcacaaa ggaatcttat 3300

cccccactac ttatcctttt atatttttcc gtgtcactag tgaagacgta agcactgacg 3360

acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa agagacatag aggacacatg 3420

taaggtggaa aatgtaaggg cggaaagtaa ccttatcaca aaggaatctt atcccccact 3480

acttatcctt ttatattttt ccgtgtcatt tttgcccttg agttttccta tataaggaac 3540

caagttcggc atttgtgaaa acaagaaaaa atttggtgta agctattttc tttgaagtac 3600

tgaggataca acttcagaga aatttgtaag tttgtagatc taagagtaaa gaagaacaat 3660

ggcttcctct atgctctctt ccgctactat ggttgcctct ccggctcagg ccactatggt 3720

cgctcctttc aacggactta agtcctccgc tgccttccca gccacccgca aggctaacaa 3780

cgacattact tccatcacaa gcaacggcgg aagagttaac tgcatgcagg gatccgacgc 3840

tcttccagct accttcgacg ttatcgtgca tccagctaga gaactcagag gtgaacttag 3900

agcacagcca tccaagaact acaccactag atacctcctc gccgctgctc tcgctgaggg 3960

tgaaaccaga gttgttggtg tggctacctc tgaggatgcc gaagctatgc tcagatgcct 4020

cagagattgg ggtgctggtg ttgagcttgt tggtgatgac gccgtgatca gaggtttcgg 4080

tgctagacca caggctggtg ttacccttaa cccaggtaac gctggtgcag tggccagatt 4140

ccttatgggt gttgctgctc tcacctctgg tacaactttc gttaccgatt accctgattc 4200

ccttggtaag agacctcagg gtgaccttct tgaagccctc gaaagacttg gtgcttgggt 4260

gtcctccaac gatggtagac tccctatctc cgtttccggt ccagttagag gtggtacagt 4320

ggaggtttcc gccgaaagat cctcccagta cgcttccgcc cttatgttcc tcggtcctct 4380

tcttcctgac ggactcgaac ttagactcac cggtgatatc aagtcccacg ctcctcttag 4440

acagacactt gacaccctct ctgatttcgg tgttagagct actgcctccg atgaccttag 4500

aagaatctcc atccctggtg gtcagaagta cagaccaggt agagtgctcg ttcctggtga 4560

ttaccctggt tccgctgcta tccttaccgc cgctgctctt ctcccaggtg aggttagact 4620

ttctaacctt agagaacacg acctccaggg tgagaaggaa gctgtgaacg ttcttagaga 4680

gatgggtgct gatatcgtta gagaaggtga tacccttacc gtgagaggtg gtagacctct 4740

ccacgctgtt actagagatg gtgattcctt caccgacgcc gtgcaagctc ttaccgctgc 4800

tgctgccttc gctgagggtg ataccacctg ggaaaacgtt gctactctta gactcaagga 4860

atgcgataga atctctgaca ccagagctga gcttgaaaga cttggtctta gagcaagaga 4920

gaccgccgat tctctctccg ttactggttc tgctcacctt gctggtggta tcaccgctga 4980

tggtcacggt gaccacagaa tgatcatgct tctcaccctt cttggtctca gagcagatgc 5040

tccacttaga atcaccggtg cacaccacat cagaaagtcc taccctcagt tcttcgctca 5100

ccttgaagct cttggtgcta gattcgaata cgctgaggct accgccaagc tttcaaaacc 5160

aattaagtgt gaattacagg tgaccagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca 5220

ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct 5280

gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg 5340

ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata 5400

gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcaagcttg 5460

gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 5520

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 5580

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagggaatta 5640

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaac 5678

<210> 2

<211> 2000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

agggttgata agcatgttga acttgttttc tagtaatgta atggaaatgc taatgggtta 60

tgatatatat gtgcatagca ttcgtgcggg ttattataac cgggttaagt cccgaaggca 120

ttcgtgcggg ttattataac cgggttaagt cccgaaggca ttcgtgtggg ttattataac 180

cgggttaagt cccaaaggca ttcgtgctgg ttgttacatc cgagccaaat tctgaaagta 240

tttatgtttg gaaaggtgcg attctgtcgt aataattccg attaatgtgc tcataatccc 300

taatatgacc aggtatggat cgtatataca ttggaaaaat ttggtacagt ataagttgtg 360

attatgtaat ccaataatgc tctcccggcc atttcttagg gttatatgaa gtctatagct 420

cacttgagtt acatgaaatt gattcaaatg aaatttagtt aagtttgact tcgagtgtgt 480

aaacatattg atagaagtgt aaattaaaat gaatatgtga tcttgtgcat aggcatttat 540

ttatccttat gaatgctatt tcttttgtgt ttttgtttca aatgatttcc ttacttataa 600

acttactaag catcaaaaca cttactctgt tgcttaaatt ctcggtatta tagattttgt 660

tcgttagcta tcggactcgg aagtgtcaaa gtcgaagtca tccacactat ctaagcccct 720

ttttgctact cttttagttg aactttgata atggcatgta taggactaac ctttgttgtt 780

aattaagtat cttttggtaa tgtatattcg tatagccatg cgaaaatggc ttgtatattt 840

tgagtatagc attataatca ttttgtatat atggtcttat gatatggtta ttgagtggta 900

tggaaatgct tggtaatgat tagccattgg aatggctaat catgatcata tttggtgcta 960

tgtatgtcaa attgctagct aatccatgga aacaatgaaa taggtcaaat cactaaaaat 1020

agtagaaatg gaattaaata atgaataagt tatggaatcg aagcttgatg agtctatttt 1080

catatggaag aagcaaaata ggtatatgag ctatatttta tgagatgttt aaatttttgt 1140

gaaacagggc cagagcgatt tctggatccc cttttatgac ttttgaaatt caccataaat 1200

tttacaaaga taattataag tcatgattta tatgtacaga ttcattattg agtctagttt 1260

tattagagac aaacggaata gtcatttaag ctctgtacaa gaagatatct gatttgtaat 1320

acatagaggt cagagtagtc gaaccctaaa ataggggaga ctttaactaa taaactgtac 1380

taattggccc gaccaaaaat tttggaaaac aattagtaga tagatgtata agtctagttt 1440

caggaaaaat ttatggaact ggatttcgag ttttggaact cgagatatga tttttaaagc 1500

gactgtgatg cagttagcca gcttgtctgg aaattttaaa atgaattgta tgagctcttt 1560

aagtaatgaa ttaagtccgt taacacctcg tgttcgactc cggcaatggt ctcgggtaca 1620

gggcgttaca taaagtgatg agtgacatca ttcccatgag gataggattt tggtgaaaag 1680

atggttaagt tattataatg aaatgctatg tcaaattagt aataagaatg caatggcaat 1740

gtcgaaagtt aataatgaag acagtatgcg taattgaaga ataactgaga atgctaaggc 1800

aatgcaagag taaaaatgca atggcaatta cgagaatgat tgtgtaaata aaataatata 1860

taaatgaaca aataaacaac taagaatatt atggaaaaga ttctacattt agggataaag 1920

gatatacgat gttgatacgt aaggtcggga ttactaagaa tctaccctta ctgtaaaaaa 1980

tgcctcagta aaatcataat 2000

<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tatacctggt ataggatttt gtgcaagtat acatggcagt tcaagtgata aagtgtgaca 60

gccctaattt gaccctagtc ggaaagtggt ttcgggacca caaaatccga gtcgtaaaaa 120

taattaaccg tcatatttga tgcttattat atgtatatat gcatgtgtga aaattttatg 180

tttgaatttt gttaattgta agtgaatttt attaaatagg acttatatga gaaaatttag 240

aaatgtgcta gacaaaggta aaagtgatct aatagtgcat gatgtcaaaa aaaatgtact 300

tgcatgtcaa attagccaaa ttttagatag tggccggcca tgttatagat taaagaatat 360

tataactatt ttatgctaat agtttatgtt acaaaatgaa ataatgaata aggttaataa 420

aatacaagtt agtgggagga gaaaccaaag ttagcctatg ttttctcctc cattgccgta 480

actagagaaa gaagaggaag aaaagtcttt ggggaagaaa attcggctaa ggtggatacc 540

taaagtaagg taagttcaat gtcattcttg gaaaacttat gcaccatttg gatgattagt 600

ttaacttcta cctattttat ggtttgaaga taggttttgt atgagttaag tttcggttaa 660

ggtggattgt tttgatgtca ttagcatgct aagtgtgaag ctttgtaatg atacatgtga 720

tggtggattg attaattggg ttttataagg aaattatgcc atagccgaat gtgtcttgaa 780

gaagatgtca tatgtgctta ttataagtat atgtatattc ggctaatgag tttgaattga 840

agtttcgata ggttgtgggt tgagtggccg agtgaactat aggctttgca aggatggaat 900

ttacttataa gttgtgtgtg tatggcttta tttgttaatg acatttaaca ttatttttca 960

tttatatata tttgtgcatt catttttttg gggagatatg gtaagggata gattgatgtt 1020

ctaacggttt aatggagttt gaactagtaa atacttaatt gttggtattt atatgtgaaa 1080

gagatgaact tgaacttatt aagttgcatg aataaatctt ttgtttatct tagggttaaa 1140

ttaaagaaaa tgccattggg tgcttgaata aaataattag agattatttt atatatataa 1200

atcaaaaggt tcggctttgt aaatgaattt aagagtttaa atcttgaata atgttatgca 1260

taggtttcgg ccatgaatcc ttgtgttata acacttgctt aataatgaaa gaacatgagc 1320

ttaaagcttg agtaacactc ggctttagtg taagttaaaa tttgttagaa aataatttcc 1380

aagttagtag attatgtgtt aagtgaggga tttagattgt atatatatgt atacatattt 1440

atattgaatt attaaggcta tgatagccaa ttgagggttt cggccaaaat attaaaataa 1500

attggtgtga atgtttgagt gatgaatttg actcttgtgt cgatttggga cgatatgtgt 1560

atttatatga aactaaatga tgttaaataa attcgattat gcatggtatt aagctagtat 1620

tatgttcgtt ggtacatgag tagagcatat gtatgatgtt taatatctag ttaataacat 1680

catttgtact taattgtatg gtatacatgt attaaatcga atagctaaat tgataagtta 1740

tttaataaaa tctatttgtt gaatcaagct caagagctaa gagggtcaaa atcagataaa 1800

ggaaaagaaa aagcaatcga gtagtccatc cgcaactatt caaaatatcc gaggtaagtc 1860

tttgagtaac ggaacttagc ttatgatttt ataggtatca tattaaagca tagtagataa 1920

attgtgatct tatggttcta tataaattac atagtgaaac aaatgatttt tattttatat 1980

gacttggagc cgaatggtta 2000

<210> 4

<211> 11931

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgactcta 300

gctagaggat cgatccgaac cccagagtcc cgcggcggta gcctcagcgt attcgaatct 360

agcaccaaga gcttcaaggt gagcgaagaa ctgagggtag gactttctga tgtggtgtgc 420

accggtgatt ctaagtggag catctgctct gagaccaaga agggtgagaa gcatgatcat 480

tctgtggtca ccgtgaccat cagcggtgat accaccagca aggtgagcag aaccagtaac 540

ggagagagaa tcggcggtct ctcttgctct aagaccaagt ctttcaagct cagctctggt 600

gtcagagatt ctatcgcatt ccttgagtct aagagtagca acgttttccc aggtggtatc 660

accctcagcg aaggcagcag cagcggtaag agcttgcacg gcgtcggtga aggaatcacc 720

atctctagta acagcgtgga gaggtctacc acctctcacg gtaagggtat caccttctct 780

aacgatatca gcacccatct ctctaagaac gttcacagct tccttctcac cctggaggtc 840

gtgttctcta aggttagaaa gtctaacctc acctgggaga agagcagcgg cggtaaggat 900

agcagcggaa ccagggtaat caccaggaac gagcactcta cctggtctgt acttctgacc 960

accagggatg gagattcttc taaggtcatc ggaggcagta gctctaacac cgaaatcaga 1020

gagggtgtca agtgtctgtc taagaggagc gtgggacttg atatcaccgg tgagtctaag 1080

ttcgagtccg tcaggaagaa gaggaccgag gaacataagg gcggaagcgt actgggagga 1140

tctttcggcg gaaacctcca ctgtaccacc tctaactgga ccggaaacgg agatagggag 1200

tctaccatcg ttggaggaca cccaagcacc aagtctttcg agggcttcaa gaaggtcacc 1260

ctgaggtctc ttaccaaggg aatcagggta atcggtaacg aaagttgtac cagaggtgag 1320

agcagcaaca cccataagga atctggccac tgcaccagcg ttacctgggt taagggtaac 1380

accagcctgt ggtctagcac cgaaacctct gatcacggcg tcatcaccaa caagctcaac 1440

accagcaccc caatctctga ggcatctgag catagcttcg gcatcctcag aggtagccac 1500

accaacaact ctggtttcac cctcagcgag agcagcggcg aggaggtatc tagtggtgta 1560

gttcttggat ggctgtgctc taagttcacc tctgagttct ctagctggat gcacgataac 1620

gtcgaaggta gctggaagag cgtcggatcc cttctccgcc gtggaaacag aagacatgac 1680

cttaagagga cgaagctcag agccaattaa agtcatccca ctcttcttca atccccacga 1740

tgaagaaatt ggataagctc gtggatgctg ctgagtcttc agagaaaccg ataagggaga 1800

tttcctttga ctggatttag agagattgga gataagagat gggttctgca caccattgca 1860

gattctgcta acttgagcca tggtcgatcg acagatctgc gaaagctcga gagagataga 1920

tttgtagaga gagactggtg atttcagcgt gtcctctcca aatgaaatga acttccttat 1980

atagaggaag gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 2040

tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc 2100

tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag 2160

cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt 2220

tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt 2280

gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt 2340

agacgagagt gtcgtgctcc accatgttat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg 2400

ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac 2460

tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg 2520

tgccaccttc cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc 2580

cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg 2640

agactgtatc tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttggcaa 2700

gctgctctag ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 2760

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 2820

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 2880

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgaatt 2940

caagcttcca gaaggtaatt atccaagatg tagcatcaag aatccaatgt ttacgggaaa 3000

aactatggaa gtattatgtg aactcagcaa gaagcagatc aatatgcggc acatatgcaa 3060

cctatgttca aaaatgaaga atgtacagat acaagatcct atactgccag aatacgaaga 3120

agaatacgta gaaattgaaa aagaagaacc aggcgaagaa aagaatcttg aagacgtaag 3180

cactgacgac aacaatgaaa agaagaagat aaggtcggtg attgtgaaag agacatagag 3240

gacacatgta aggtggaaaa tgtaagggcg gaaagtaacc ttatcacaaa ggaatcttat 3300

cccccactac ttatcctttt atatttttcc gtgtcactag tgaagacgta agcactgacg 3360

acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa agagacatag aggacacatg 3420

taaggtggaa aatgtaaggg cggaaagtaa ccttatcaca aaggaatctt atcccccact 3480

acttatcctt ttatattttt ccgtgtcatt tttgcccttg agttttccta tataaggaac 3540

caagttcggc atttgtgaaa acaagaaaaa atttggtgta agctattttc tttgaagtac 3600

tgaggataca acttcagaga aatttgtaag tttgtagatc taagagtaaa gaagaacaat 3660

ggcttcctct atgctctctt ccgctactat ggttgcctct ccggctcagg ccactatggt 3720

cgctcctttc aacggactta agtcctccgc tgccttccca gccacccgca aggctaacaa 3780

cgacattact tccatcacaa gcaacggcgg aagagttaac tgcatgcagg gatccgacgc 3840

tcttccagct accttcgacg ttatcgtgca tccagctaga gaactcagag gtgaacttag 3900

agcacagcca tccaagaact acaccactag atacctcctc gccgctgctc tcgctgaggg 3960

tgaaaccaga gttgttggtg tggctacctc tgaggatgcc gaagctatgc tcagatgcct 4020

cagagattgg ggtgctggtg ttgagcttgt tggtgatgac gccgtgatca gaggtttcgg 4080

tgctagacca caggctggtg ttacccttaa cccaggtaac gctggtgcag tggccagatt 4140

ccttatgggt gttgctgctc tcacctctgg tacaactttc gttaccgatt accctgattc 4200

ccttggtaag agacctcagg gtgaccttct tgaagccctc gaaagacttg gtgcttgggt 4260

gtcctccaac gatggtagac tccctatctc cgtttccggt ccagttagag gtggtacagt 4320

ggaggtttcc gccgaaagat cctcccagta cgcttccgcc cttatgttcc tcggtcctct 4380

tcttcctgac ggactcgaac ttagactcac cggtgatatc aagtcccacg ctcctcttag 4440

acagacactt gacaccctct ctgatttcgg tgttagagct actgcctccg atgaccttag 4500

aagaatctcc atccctggtg gtcagaagta cagaccaggt agagtgctcg ttcctggtga 4560

ttaccctggt tccgctgcta tccttaccgc cgctgctctt ctcccaggtg aggttagact 4620

ttctaacctt agagaacacg acctccaggg tgagaaggaa gctgtgaacg ttcttagaga 4680

gatgggtgct gatatcgtta gagaaggtga tacccttacc gtgagaggtg gtagacctct 4740

ccacgctgtt actagagatg gtgattcctt caccgacgcc gtgcaagctc ttaccgctgc 4800

tgctgccttc gctgagggtg ataccacctg ggaaaacgtt gctactctta gactcaagga 4860

atgcgataga atctctgaca ccagagctga gcttgaaaga cttggtctta gagcaagaga 4920

gaccgccgat tctctctccg ttactggttc tgctcacctt gctggtggta tcaccgctga 4980

tggtcacggt gaccacagaa tgatcatgct tctcaccctt cttggtctca gagcagatgc 5040

tccacttaga atcaccggtg cacaccacat cagaaagtcc taccctcagt tcttcgctca 5100

ccttgaagct cttggtgcta gattcgaata cgctgaggct accgccaagc tttcaaaacc 5160

aattaagtgt gaattacagg tgaccagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca 5220

ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct 5280

gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg 5340

ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata 5400

gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcaagcttg 5460

gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 5520

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 5580

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagggaatta 5640

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 5700

agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 5760

atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc tccgctgcta 5820

tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 5880

gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 5940

ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 6000

gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac 6060

caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 6120

cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 6180

cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat 6240

tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga 6300

caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga 6360

gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt 6420

gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat 6480

cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac 6540

cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg 6600

tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg 6660

ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc 6720

gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc 6780

tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg 6840

ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt 6900

gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa 6960

atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca 7020

agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt 7080

tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac 7140

cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc 7200

ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga 7260

tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag cccttacgac atatgggcca 7320

ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 7380

cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg 7440

cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 7500

caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 7560

gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 7620

agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 7680

caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca 7740

gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat 7800

taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag taaatgagca aatgaataaa 7860

tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca 7920

ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct 7980

gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac 8040

ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 8100

aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 8160

gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 8220

ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 8280

atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 8340

ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 8400

gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 8460

atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 8520

cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 8580

ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 8640

gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 8700

gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag 8760

atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg 8820

acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg 8880

gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 8940

agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 9000

aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 9060

atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag 9120

atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 9180

agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 9240

ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 9300

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 9360

tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 9420

tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 9480

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 9540

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 9600

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 9660

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 9720

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 9780

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 9840

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 9900

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 9960

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 10020

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 10080

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 10140

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 10200

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 10260

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 10320

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 10380

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 10440

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 10500

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 10560

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 10620

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 10680

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 10740

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 10800

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 10860

tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 10920

atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 10980

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 11040

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 11100

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 11160

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 11220

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 11280

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 11340

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 11400

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 11460

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 11520

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 11580

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 11640

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 11700

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 11760

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 11820

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 11880

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg g 11931

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gaagcttggc actggccgtc gttttacaa 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

cctatagggt ttcgctcatg tgttgagca 29

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

tcatccacac tatctaagcc c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cagttggttg tgaatgggag 20

Claims (5)

1.用于鉴定植物样品是否来源于转基因棉花或其后代的方法，包括如下步骤：

检测待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A；所述DNA片段A由外源DNA片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段、所述外源DNA片段和所述外源DNA片段在所述转基因棉花的下游侧翼片段组成；

若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；

若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；

所述上游侧翼序列的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

所述下游侧翼序列的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

所述外源DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述转基因棉花为将外源DNA片段***目的棉花基因组第A10号染色体的第38496180-38496245位间，替换掉第A10号染色体的第38496180-38496245位间64bp的碱基序列获得的；

所述转基因棉花的草甘膦抗性、第一果枝着生节位、果枝数和结铃数均高于所述目的棉花；所述转基因棉花的株高和/或第一果枝长度低于所述目的棉花。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A的方法为直接测序。

3.一种获得草甘膦抗性提高、第一果枝着生节位提高、果枝数提高、结铃数提高、株高降低和第一果枝长度降低的棉花的方法，包括如下步骤：

（1）获得权利要求1中所述转基因棉花；

（2）将所述转基因棉花自交或杂交，得到繁育后代，按照权利要求1至2所述的方法鉴定所述繁育后代，得到目标植株。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述转基因棉花的保藏编号为CCTCC NO:P201905。

5.权利要求1所述方法在棉花育种中的应用。

Images