CN100366734C - 一种鸡***分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种鸡***分离纯化方法，涉及转基因、珍稀物种的保存和组织与细胞工程等领域。本发明先分离鸡***，然后进行Percoll分离、贴壁纯化，本发明首次对不同时期鸡胚的睾丸，比较以组合酶和Percoll介质梯度的分离方法，并依据睾丸细胞不同贴壁特性进行纯化，以探索合适的鸡***分离方法、时期、及***纯化的可能性。通过从鸡睾丸组织中分离出***，并经过Percoll梯度离心和贴壁纯化方法进一步对鸡***进行纯化，能制备出睾丸细胞数和存活率都较高的生精上皮细胞悬液，而且还能确保去除睾丸中其它体细胞成分。
Description
技术领域
本发明涉及转基因、珍稀物种的保存和组织与细胞工程等领域。
技术背景
***是雄性生殖细胞的母细胞，在动物一生中***一方面能自我更新产生新的干细胞以维持自身数量的恒定，一方面能够在自身基因或外来信号的调节下增殖分化为各阶段的***直至***。它是雄性成体干细胞中唯一与下一代遗传背景密切相关的细胞，由于这些潜在的价值，***日益成为许多研究转基因学者关注的对象。但***在人和动物的睾丸细胞中所占比率极小，有资料表明，每只睾丸中约有108个细胞，其中约有2×104干细胞，仅占细胞总数的0.02％左右。因此，***分离纯化方法的选择就显得尤为重要。1977年，Bellve等首次利用牛血清白蛋白(BSA)和单位重力速度沉淀法从未成年小鼠睾丸中获得A型***组份可达到90％的纯度。1986年，Bucci等采用组合酶消化法对大鼠的睾丸细胞进行分离，也获得纯度为76％的***。但这些试验不是消耗了大量的实验动物材料就是获得的***总数较少，远远不能满足实验的需要。经过几十年细胞生物学的发展，***的分离纯化技术也有了很大的进步。2000年，Fariborz等使用组合酶消化法并结合贴壁培养和Percoll梯度离心，从牛的睾丸中获得的A型***纯度达到了80％以上。张学明等，俞作仁等分别利用Percoll密度梯度离心法和BSA重力沉降法，并结合贴壁培养对小鼠和长白猪的睾丸细胞进行分离纯化，获得的***纯度达到了68.8％和94.2％。但这些研究仅在哺乳动物上有所报道。目前，国内外尚未见到鸡***分离纯化的相关报道。
发明内容
本发明目的在于为人们提供一种高纯度、高成活率的鸡***分离纯化方法。
本发明包括以下步骤：
1)分离鸡***：无菌收集出雏后3～15日龄公鸡睾丸，置于预热的无Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液中，去除附睾、脂肪垫及白膜，将组织分成小块，在磷酸盐缓冲液中吹打，静置后去上清液，沉淀的组织块用(I)1mg/ml胶原酶、0.25％胰蛋白酶、0.25％胰蛋白酶三步消化或(II)1mg/ml胶原酶、1.5mg/ml透明质酸酶或0.25％胰蛋白酶二步消化或(III)1mg/ml胶原酶、研磨、0.25％胰蛋白酶二步消化后，制成单细胞悬液。
2)Percoll分离、贴壁纯化：将单细胞悬液滴加到Percoll梯度上层，离心，将形成的细胞条带置于另一试管中，加入磷酸盐缓冲液稀释Percoll，用离心方法去除上清液，将试管中的沉淀物用DMEM培养液悬起，最后将细胞吹打均匀后，接种到用0.1％明胶预处理过的培养板中，在37℃±2℃、5％CO2条件下培养24h～36h后，弃去旧的培养液；然后用磷酸盐缓冲液清洗1～2次，最后再加入新鲜DMEM。
上述DMEM(Dulbecco’s modify Eagle’S medium液)，即：杜贝克氏改良的恩格氏培养液。
本发明首次对不同时期鸡胚的睾丸，比较以组合酶和Percoll介质梯度的分离方法，并依据睾丸细胞不同贴壁特性进行纯化，以探索合适的鸡***分离方法、时期、及***纯化的可能性。通过从鸡睾丸组织中分离出***，并经过Percoll梯度离心和贴壁纯化方法进一步对鸡***进行纯化，能制备出睾丸细胞数和存活率都较高的生精上皮细胞悬液，而且还能确保去除睾丸中其它体细胞成份。
本发明的优越性在于：
1、方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。
2、运用该技术获取的***纯度极高，能够满足一般试验的需要。
3、为禽类***的分离纯化提供了依据，同时也为今后鸡***进行的一系列研究提供了方法和途径。
4、该技术也适用于其它卵生动物的***的分离与纯化，可用于珍贵物种的利用与开发。
为进一步提高***纯度，可收集出雏后6日龄公鸡睾丸进行分离提纯。
具体实施方式
1、鸡***分离方法的确定
无菌收集出雏后3-6日龄公鸡两侧睾丸，置于预热的无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液(PBS)中，用尖头镊子去除睾丸的附睾，脂肪垫及其白膜，之后将组织分成1mm3左右的小块，在PBS中轻轻吹打1-2min，静置后去上清液，沉淀的组织块用以下3种方法进行消化处理：
方法1：1mg/ml胶原酶+1.5mg/ml透明质酸酶/0.25％胰蛋白酶二步消化
方法2：1mg/ml胶原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶三步消化
方法3：1mg/ml胶原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶二步消化
睾丸组织经方法1、方法2和方法3消化后获得的平均细胞存活率分别为90.6％，94.4％和89.3％；每睾平均活细胞数则分别为2.20×105个，3.24×105个和2.80×105个。
综合比较这3种方法，方法2获得的平均细胞存活率比方法1高出3.8％，比方法3高出5.1％；平均每睾活细胞数比方法1多1.04×105个，比方法3多0.44×105个。在细胞存活率方面，方法1与方法3没有明显的差异(P＞0.05)，但与方法2相比差异显著(P＜0.05)。在每睾获得的活细胞数上，方法2与方法3没有明显的差异但与方法1差异显著(P＜0.05)。因此，与方法1和3相比，方法2对鸡睾丸细胞的离散程度要明显优于前两者，且获得较高的细胞存活率和平均每睾活细胞数(见表1)。
表1不同处理方法对睾丸细胞的分离效果
| 重复次数 | 睾丸数(只) | 细胞总数(10<sup>6</sup>) | 活细胞数(10<sup>6</sup>) | 活细胞率(％) | 活细胞数/每睾(10<sup>5</sup>) | |
| 法1 | 123平均 | 22201820 | 5.175.474.004.88 | 4.654.903.694.21 | 89.9<sup>a</sup>89.6<sup>a</sup>92.3<sup>a</sup>90.6<sup>a</sup> | 2.11<sup>A</sup>2.45<sup>A</sup>2.05<sup>A</sup>2.20<sup>A</sup> |
| 法2 | 123平均 | 14181817 | 5.755.456.275.82 | 5.525.075.915.50 | 96.0<sup>b</sup>93.0<sup>b</sup>94.3<sup>b</sup>94.4<sup>b</sup> | 3.94<sup>B</sup>2.82<sup>B</sup>3.28<sup>B</sup>3.24<sup>B</sup> |
| 法3 | 123平均 | 20192220 | 6.126.326.336.26 | 5.495.665.615.59 | 89.7<sup>a</sup>89.6<sup>a</sup>88.6<sup>a</sup>89.3<sup>a</sup> | 2.74<sup>B</sup>2.98<sup>B</sup>2.55<sup>B</sup>2.80<sup>B</sup> |
注：同列肩注中不同字母表示差异显著(P＜0.05)
2、适宜的鸡***提取时间的确定
分别从孵化15d，19d鸡胚和出雏后6d、13d幼雏公鸡中，无菌收集两侧睾丸，置于盛有事先预热的无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液培养皿中，在解剖显微镜下用尖头摄子去除睾丸的附睾，脂肪垫及其白膜等附属组织后，将睾丸组织分成1mm3左右的小块，在PBS中轻微吹打1～2min，静置5min后去上清液。沉淀加入10倍于组织块的1mg/ml胶原酶I在37℃±1℃，5％CO2条件下作用16～20min，静置后吸去上清液，用0.25％胰蛋白酶在同样条件下作用4～6min，移上清液于10ml试管中并加小牛血清(或含有10％小牛血清的DMEM(即杜贝克氏改良的恩格氏培养液)培养液)终止消化。剩余的组织块再加适量胰蛋白酶重复消化一次，倒置显微镜下见有单细胞和细胞团出现即可用小牛血清终止消化，悬液通过350目过滤筛，滤液移入10ml离心管中，1000r/min离心5min后吸去上清液，沉淀再用1.5mlDMEM(即杜贝克氏改良的恩格氏培养液)培养液重悬，轻微吹打均匀制成单细胞悬液。接种到0.1％明胶预处理过的培养板孔中，接种密度约为3×105个/ml，置体外培养条件为5％CO2，95％空气，38.5℃饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，培养24h后，弃去旧的培养液，PBS清洗1～2次后，重新加入新鲜的DMEM培养液。在倒置显微镜下各任选3个视野，分别计细胞总数和圆形的***数，并计算均值和标准差。
结果表明：从4个不同时期鸡睾丸细胞悬液中获得的***纯度平均为31.6％，其中出壳6d雏鸡的睾丸细胞悬液获得的***纯度为33.8％，分别比胚胎期15d、19d和出雏13d公鸡***纯度高2.6％，4.3％和3.1％，且四个时期获得的***纯度差异显著(P＜0.05)。
从以上结果可见：在同样的分离条件下，出壳6d雏鸡获得的***纯度比胚胎期和出壳13d雏鸡***纯度都高(见表2)。
表2不同日龄鸡***分离前后的效果
| 细胞总数(个) | ***数(个) | ***纯度(％) | |
| 孵化15d鸡胚孵化19d鸡胚出壳6d雏鸡出壳13d雏鸡平均 | 687.9±23.7607.8±41.8660.7±33.0624.4±19.6639.9±29.5 | 214.6±13.2179.3±31.1223.3±21.3191.7±20.0202.2±21.4 | 31.2<sup>a</sup>29.5<sup>b</sup>33.8<sup>c</sup>30.7<sup>d</sup>31.6 |
注：同列肩注中不同字母表示差异显著(P＜0.05)
3、适宜的鸡***纯化方法
获取的单细胞悬液将用以下两种方法进行处理：
方法1：接种到0.1％明胶预处理过的培养板孔中(标记为A)，接种密度约为3×105个/ml，置于二氧化碳培养箱中体外培养，二氧化碳培养箱中培养内：CO2浓度为5％、空气浓度为95％、温度为38.5℃，且饱和湿度，培养24h后，弃去旧的培养液，PBS缓冲液清洗1～2次后，重新加入新鲜的DMEM培养液。在倒置显微镜下任选3个视野，分别计细胞总数和圆形的***数，并计算均值和标准差；然后继续培养，观察***在体外培养的生长情况。
方法2：缓慢滴加到Percoll梯度上层，2500r/min离心20min后，用100μl移液器将形成的细胞条带取出至5ml离心管中，并加入2.5mlPBS缓冲液稀释Percoll，800r/min离心5min后，去上清液，再加入PBS缓冲液稀释Percoll；为了使Percoll减少到最低量，重复此过程三次，沉淀用3ml DMEM(杜贝克氏改良的恩格氏培养液)培养液悬起，吹打均匀后，等量分成两份，分别接种到0.1％明胶预处理过的六孔培养板中，并标记B和C，接种密度约为3×105个/ml，37℃±2℃，5％CO2条件下培养，并定时观察贴壁情况。
B孔中当见有混杂其中的体细胞贴壁时(接种后约5h)，小心倾斜培养板，用吸管吸取未贴壁的***和培养液，另行接种培养，待大多数细胞贴壁之后(接种后约12h～24h)，弃去旧的培养液，PBS清洗1～2次后，重新加入新鲜的DMEM培养液。在倒置显微镜下任选3个视野，分别计细胞总数和圆形的***数，并计算均值和标准差。
C孔接种的细胞悬液，则不经任何处理，连续培养24h～36h后，弃去旧的培养液，PBS清洗1～2次后，重新加入新鲜的DMEM(杜贝克氏改良的恩格氏培养液)培养液，以下过程与C孔处理相同.
结果表明：出壳6d雏鸡睾丸经A、B、C三种方式处理后，获得的***纯度平均分别为33.8％，66.4％和82.0％。其中C方式经过Percoll分离和贴壁纯化后获得的***纯度最高，比A和B方式分别高15.6％和48.2％。B组合经Percoll分离后获得的***纯度比A组合高32.6％，三个方式获得***纯度差异极显著(P＜0.01)(见表3)。
表3不同方式分离纯化鸡***效果的比较
| 分离方法 | 重复次数 | 细胞总数 | ***数 | ***纯度％ | |
| ABC | 组合酶组合酶+Percoll组合酶+Percoll+贴壁纯化 | 10810 | 223.3±21.3218.1±25.3215.0±18.8 | 75.5±24.3145.1±21.9176.2±16.6 | 75.5/223.3(33.8)<sup>a</sup>145.1/218.1(66.4)<sup>b</sup>176.2/215.0(82.0)<sup>c</sup> |
注：同列肩注中不同字母表示差异极显著(P＜0.01)
通过以上试验表明：鸡睾丸组织经“1mg/ml胶原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶”二酶三步消化之后，获得的平均细胞活率为94.4％，每睾平均活细胞数为3.24×105个。因此，对鸡睾丸细胞的分离有不可替代的优势，不仅因为用这种方法处理鸡睾丸组织能制备出睾丸细胞数和存活率都较高的生精上皮细胞悬液，而且还能确保去除睾丸中其它体细胞成份。
在***提取时间上，本实验分别比较了四个时期的分离效果(孵化15d，19d鸡胚和出雏后6d、13d幼雏公鸡)。结果发现，从出雏后6d公鸡的睾丸细胞悬液中获得的***纯度为33.8％，分别比胚胎期15d、19d和出雏13d公鸡***纯度高2.6％，4.3％和3.1％。因此，鸡***的提取时间尤以出雏后6d公鸡为佳。在***的纯化方面，本试验尝试着以“组合酶消化+Percoll梯度离心+贴壁纯化”方法纯化鸡***，获得的***纯度达到了82.0％左右。
Claims (2)
1.一种鸡***分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
1)分离鸡***：无菌收集出雏后3～15日龄公鸡睾丸，置于预热的无Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液中，去除附睾、脂肪垫及白膜，将组织分成小块，在磷酸盐缓冲液中吹打，静置后去上清液，沉淀的组织块用(I)1mg/ml胶原酶、0.25％胰蛋白酶、0.25％胰蛋白酶三步消化或(II)1mg/ml胶原酶、1.5mg/ml透明质酸酶或0.25％胰蛋白酶二步消化或(III)1mg/ml胶原酶、研磨、0.25％胰蛋白酶二步消化后，制成单细胞悬液；
2)Percoll分离、贴壁纯化：将单细胞悬液滴加到Percoll梯度上层，离心，将形成的细胞条带置于另一试管中，加入磷酸盐缓冲液稀释Percoll，用离心方法去除上清液，将试管中的沉淀物用DMEM培养液悬起，最后将细胞吹打均匀后，接种到用0.1％明胶预处理过的培养板中，在37℃±2℃、5％CO2条件下培养24h～36h后，弃去旧的培养液；然后用磷酸盐缓冲液清洗1～2次，最后再加入新鲜DMEM。
2.根据权利要求1所述鸡***分离纯化方法，其特征在于所述收集出雏的3～15日龄公鸡睾丸为收集出雏后6日龄公鸡睾丸。
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