CN110205312B - 一种κ-卡拉胶酶及其基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种κ‑卡拉胶酶及其基因与应用，该κ‑卡拉胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述κ‑卡拉胶酶的基因来自于红树林沉积物微生物宏基因组测序数据集，本发明对该酶进行了异源表达与纯化，经检测，该酶催化卡拉胶降解的最适温度为50℃，而且在高温高pH条件下，仍具有50％以上的活力，具有高稳定性。本发明提供的κ‑卡拉胶酶具有良好的实用性，在卡拉胶寡糖的工业生产中有较强的应用潜力。

Description

一种κ-卡拉胶酶及其基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于红树林沉积物的高温κ-卡拉胶酶及其基因与应用。

背景技术

卡拉胶是一种从红藻中提取得到的亲水胶体，是D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖单元由β-1,4-糖苷键交替连接形成的，被广泛应用于食品等相关领域。卡拉胶经降解后会生成卡拉胶寡糖，卡拉胶寡糖具有免疫调节、抗肿瘤活性、抗辐射功能、抗菌和抗病毒活性、抗氧化活性及抗凝血作用，在药品、食品、化妆品等领域具有很强的应用潜力。因此，卡拉胶的降解及降解效率的提升就显得十分重要。

目前，降解卡拉胶的主要方法有酸水解法和酶水解法。酸水解法的过程中存在环境污染、设备损耗较大等问题；酶水解法与酸水解法相比反应条件较为温和，对环境的污染程度也较小。因此，使用酶解法是较为理想的卡拉胶降解手段。但是，目前已经报道的卡拉胶酶热稳定性较差，大多数卡拉胶酶在0-30℃之间可以维持较高活性，但当温度超过40℃时会损失较多酶活性；此外，当pH大于6.0时，多数卡拉胶酶同样会丧失大部分活性。

然而，由于卡拉胶在低于40℃的条件下会发生凝固，需要在较高的温度下进行降解，因此，最适温度较低、热稳定性较差等缺点限制了这些酶在卡拉胶寡糖生产中的应用。从自然界中筛选具有高稳定性的卡拉胶酶，这对卡拉胶寡糖的工业化生产具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种κ-卡拉胶酶及其基因与应用，该κ-卡拉胶酶的基因来源于红树林沉积物微生物宏基因组测序数据集，该酶催化卡拉胶降解的最适温度为50℃，而且在高温高pH条件下，仍具有50％以上的活力，具有高稳定性。

为此，第一方面，本发明提供了一种κ-卡拉胶酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供一种基因，其编码所述κ-卡拉胶酶。

进一步，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含本发明所述的基因。

第四方面，本发明提供一种细胞，其表达本发明所述的κ-卡拉胶酶，和/或包含本发明所述的基因或核酸构建体。

进一步，所述细胞可为原核细胞或真核细胞。

进一步，所述细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸杆菌细胞、放线菌细胞、酵母菌细胞或藻类细胞等。

第五方面，本发明提供一种生产κ-卡拉胶酶的方法，其包括以下步骤：在允许表达所述κ-卡拉胶酶的条件下培养本发明所述的细胞；和从所得培养物中纯化κ-卡拉胶酶。

第六方面，本发明提供所述κ-卡拉胶酶在制备卡拉胶寡糖中的应用。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种κ-卡拉胶酶，该酶可催化卡拉胶降解为卡拉胶寡糖。本发明提供的κ-卡拉胶酶的最适作用温度为50℃，在40℃-80℃范围内能保持50％以上的活力，具有较宽的作用温度范围；最适作用pH值为7.0，在pH 6.0-9.0范围内能保持50％以上的活力。本发明提供的κ-卡拉胶酶具有优良的热稳定性，在70℃下保温2h仍可维持55％以上的相对酶活。因此，本发明提供的κ-卡拉胶酶具有良好的实用性，在卡拉胶寡糖的工业生产中有较强的应用潜力。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1为纯化后的CgkM1蛋白的SDS-PAGE图；

图2为温度对CgkM1蛋白的相对酶活的影响；

图3为pH对CgkM1蛋白的相对酶活的影响；

图4为CgkM1蛋白的热稳定性检测结果。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

除非另外定义，本公开中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1κ-卡拉胶酶基因cgkM1基因的获取

本实施例的红树林沉积物样品获取自福建省漳州市，通过分析红树林沉积物微生物宏基因组测序数据集，得到一个κ-卡拉胶酶基因，命名为cgkM1基因，其核苷酸序列为SEQID NO.2所示的序列。对cgkM1基因进行全序列合成，即得到κ-卡拉胶酶基因cgkM1基因。

实施例2cgkM1基因的克隆表达

将实施例1合成的cgkM1基因连接至pEASy^@-Blunt E1载体(购自全式金)，连接方法按照载体的说明书进行，获得pEASy-cgkM1重组载体；将获得的重组载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养平板上，37℃培养过夜；将阳性克隆接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在16℃条件下，经12h诱导目的蛋白的表达。

实施例3CgkM1蛋白的分离纯化

离心收集实施例2诱导表达得到的菌体，重悬于裂解缓冲液(0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH₂PO₄，pH 8.0)中进行裂解，将裂解得到的悬液在4℃条件下以5000rpm，20min进行离心，收集上清液。将上清液与Ni-NTA Agarose(购自QIAGEN)混匀，按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得CgkM1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，进行SDS-PAGE电泳分析，电泳检测结果见图1，第3泳道即为纯化后的CgkM1蛋白。

实施例4酶活检测

酶活检测步骤如下：将10μL实施例3纯化得到的CgkM1蛋白纯化液与240μL 0.4％(w/v)卡拉胶溶液混合，于不同温度、pH下水浴20min后，100℃金属浴10min灭活蛋白；加入750μL DNS溶液(酒石酸钾钠18.2g，3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH 2.1g，苯酚0.5g，加蒸馏水至100mL)，混匀后于100℃金属浴10min，再置于冰上3min；最后使用紫外分光光度计在550nm波长下测定吸光值，并以此计算还原糖含量。卡拉胶酶酶活(U)定义为：一定条件下，每分钟生成1μmol还原糖所需的酶量。在最适条件下的相对酶活定义为100％，并据此确定CgkM1蛋白的最适温度和最适pH。检测结果见图2和图3所示，CgkM1蛋白具有较高的κ-卡拉胶酶活性，由图2可知，其最适作用温度为50℃，在40℃-80℃范围内能保持50％以上的活力，具有较宽的作用温度范围；由图3可知，其最适pH值为7.0，在pH 6.0-9.0范围内能保持50％以上的活力，具有广泛的pH作用范围。

实施例5热稳定性检测

将实施例3纯化得到的CgkM1蛋白纯化液分别置于20℃-90℃下保温2h，之后按照实施例4所述的酶活检测步骤测定酶的相对活性，将未经保温酶液的相对酶活定义为100％。检测结果见图4所示，由图4可知，CgkM1蛋白具有极佳的热稳定性，在70℃下保温2h后仍维持55％以上的相对酶活。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

<120> 一种κ-卡拉胶酶及其基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 680

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Ile Arg Thr Leu Gly Thr Val Leu Leu Ala Ser Ala Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Pro Ala Arg Gly Glu Tyr Gln Leu Val Trp Gln Asp Glu Phe Asp

20 25 30

Gly Thr Gln Leu Asp Leu Ala Lys Trp Gln Pro Gln Ile Gly Thr Gly

35 40 45

Cys Pro Ser Leu Cys Gly Trp Gly Asn Asn Glu Leu Gln Tyr Tyr Arg

50 55 60

Ala Glu Asn Ala Thr Val Ala Gly Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ala Arg

65 70 75 80

Glu Glu Ser Tyr Gly Gly Arg Asp Tyr Thr Ser Ala Arg Leu Arg Thr

85 90 95

Lys Asn Leu Ala Asp Phe Glu Arg Gly Arg Phe Glu Met Arg Ala Arg

100 105 110

Met Pro Ile Gly Arg Gly Leu Trp Ala Ala Phe Trp Met Leu Pro Thr

115 120 125

Tyr Glu Val Tyr Gly Gly Trp Ala Ala Ser Gly Glu Ile Asp Ile Met

130 135 140

Glu Tyr Leu Gly His Asp Thr Asp Arg Val Leu Gly Thr Leu His Tyr

145 150 155 160

Gly Gly Gln Phe Pro Ala Asn Thr Ser Ala Gly Ser Ser Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Gly Gly Ser Phe His Asp Glu Phe His Glu Phe Ala Leu Glu

180 185 190

Trp Asp Glu Cys Glu Met Arg Trp Phe Val Asp Gly Val Pro Tyr Trp

195 200 205

Thr Arg Ser Thr Trp Tyr Ser Thr Ala Ala Pro Tyr Pro Ala Pro Phe

210 215 220

Asp Gln Ala Phe His Leu Leu Leu Asn Leu Ala Val Gly Gly Asn Leu

225 230 235 240

Pro Gly Pro Pro Asp Gly Ser Thr Val Phe Pro Gln Glu Met Val Val

245 250 255

Asp Trp Val Arg Val Tyr Arg Glu Pro Ser Val Asp Leu Gly Asp Cys

260 265 270

Thr Val Val Phe Asp Asp Met Glu His Ala Asn Pro Phe Gly Asn Gly

275 280 285

Trp Phe Ser Phe Gly Gly Thr Val Gly Gly Gly Gly Ile Ser Ala Asn

290 295 300

Leu Thr Asp Leu Pro Pro Ile Glu Ala Cys Arg Ala Ser Leu Glu Ser

305 310 315 320

Gly Trp Gly Ser Gly Gly Thr Pro Gly Phe Phe Gly Gly Phe Gly Arg

325 330 335

Tyr Tyr Pro Leu Ala Leu Pro Asp Ala Thr His Phe Ser Phe Trp Ile

340 345 350

His Pro Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Thr Leu Glu Ile Asn Leu Gln Asp

355 360 365

Asp Asp Asn Gly Asp Gly Ser Ile Pro Gly Thr Pro Asp Gly Ala Asp

370 375 380

Asp Glu Phe Gln Phe Asp Cys Thr Val Gly Pro Pro Gly Ser Arg Val

385 390 395 400

Ile Ala Gly Gly Gly Trp Gln Arg Val Ser Ile Pro Leu Ala Asp Phe

405 410 415

Phe Asp Asp Asn Ser Tyr His Trp Gly Gly Asn Gly Val Phe Asp Pro

420 425 430

Ile Pro Pro Gly Asp Gly Gly Asn Gly Lys Leu Ile Ala Val Val Met

435 440 445

Thr Val Ile Gly Asp Ser Gly Ala Asp Val Thr Phe Arg Thr Asp Arg

450 455 460

Trp Ala Phe Leu Arg Gln Glu Ser Ala Ile Ser Gly Arg Val Phe Ala

465 470 475 480

Asp Val Asn Gly Asp Gly Ala Pro Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ile Pro

485 490 495

Asp Val Thr Val Asp Leu Val Asp Arg Ala Leu Gly Leu Val Val Asn

500 505 510

Thr Thr Val Thr Asp Gly Asn Gly Asp Tyr Ala Phe Gly Ala Leu Pro

515 520 525

Gly Gly Pro Tyr Arg Val Ala Val Asp Pro Ala Ser Val Pro Thr Gly

530 535 540

Ala Val Pro Thr Gly Asp Pro Asp Gly Val Asp Thr Pro His Ala Phe

545 550 555 560

Ala Ala Asp Val Ala Cys Leu Gln Thr Val Thr Gly Ala Asp Phe Ala

565 570 575

Tyr Ala Pro Gly Ala Thr Asp Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ser Arg Ala

580 585 590

Leu Leu Gln Asn Ala Pro Lys Pro Phe Gly Ala Ala Thr Arg Ile Arg

595 600 605

Phe Glu Leu Pro Arg Glu Glu Arg Ala Glu Ile Ala Val Tyr Asp Val

610 615 620

Thr Gly Arg Arg Val Val Thr Leu Leu Asp Glu Val Arg Pro Ala Gly

625 630 635 640

Pro His Thr Val Glu Trp Asp Gly Arg Asp Ala Gly Gly Arg Pro Ala

645 650 655

Ala Thr Gly Val Tyr Phe Tyr Ala Leu Arg Thr Gly Asp Arg Thr Ser

660 665 670

Val Lys Lys Met Ser Val Leu Arg

675 680

<210> 2

<211> 2043

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgatccgca ctctggggac cgtcctgctc gcgtcggcgg tcctcgcgct tcccgcgcgc 60

ggggagtacc agctcgtctg gcaggacgag ttcgacggca cgcagctcga cctggcgaag 120

tggcagccgc agatcggcac cggctgcccg tcgctgtgcg gctggggcaa caacgagctg 180

cagtactacc gggcggagaa cgccacggtt gccggcggct tcctcaccat cacggcccgc 240

gaggagtcct acggcggacg ggactacacg tccgcgcggc tccgcacgaa gaacctcgcc 300

gacttcgagc gcgggcgctt cgagatgcgg gcgcggatgc cgatcggccg ggggctgtgg 360

gccgcgttct ggatgctccc cacgtacgag gtgtacggcg gctgggccgc cagcggcgag 420

atcgacatca tggagtacct cgggcacgac acggatcgcg tgctgggcac gctgcactac 480

ggcggccagt tcccggcgaa cacgtccgcg ggcagctcgt atacgctgcc gcccggcggc 540

tccttccacg acgagttcca cgagttcgcg ctggagtggg acgagtgcga gatgcgctgg 600

ttcgtggacg gcgttcccta ctggacacgg agcacctggt actccacggc cgcaccgtat 660

cccgcgccct tcgatcaggc gttccacctc ctgctgaacc tggccgtggg cggcaacctc 720

ccgggcccgc ccgacggttc cacggtcttc ccgcaggaga tggtggtgga ctgggtgcgc 780

gtgtaccgcg agccctcggt ggacctgggc gactgcaccg tggtgttcga cgacatggag 840

cacgccaatc cgttcgggaa cggatggttc tcgttcggcg ggaccgtggg cggcggcggg 900

atcagcgcga acctcacgga ccttccgccg atcgaggcgt gccgggcgtc gctggagagc 960

ggctggggct ccgggggcac gcccgggttc ttcggcggct tcggccgcta ctacccgctc 1020

gcgctgccgg acgccacgca cttctcgttc tggatccacc ccgatccggg acaggagtac 1080

acgctggaga tcaacctcca ggacgacgac aacggcgacg gctcgatccc gggcacgccg 1140

gacggggccg acgacgagtt ccagttcgac tgcacggtgg gaccgcccgg ctcgcgtgtg 1200

atcgccggcg gcggctggca gcgcgtgtcg atcccgctgg ccgacttctt cgacgacaac 1260

tcgtaccact ggggcggcaa cggcgtgttc gacccgatcc cgcccgggga cggcggcaac 1320

gggaagctca tcgcggtggt catgacggtg atcggcgaca gcggggcgga cgtgacgttc 1380

cgcacggacc ggtgggcatt cctgcggcag gagagcgcga tctccggacg agtcttcgcg 1440

gacgtgaacg gggacggtgc gcccggcgga ggggaggcgg ggatcccgga cgtcacggtg 1500

gatctcgtgg atcgtgcgct cgggctggtc gtgaacacga ccgtcaccga cggcaacggc 1560

gactacgcgt tcggcgcgct gccgggtgga ccgtaccggg tggcggtgga tccggcctcg 1620

gttccgaccg gcgccgtgcc caccggcgac ccggacggcg tggacacccc gcacgcgttc 1680

gccgcggacg tggcgtgcct ccagacggta accggtgcgg acttcgccta cgcgcccggc 1740

gccaccgaca cggcggccgg cgccgcgtcg cgcgcgctgc tgcagaacgc gccgaaaccg 1800

ttcggcgccg ccacccgcat ccgcttcgag ctgccccgcg aggagcgcgc cgagatcgcc 1860

gtgtacgacg tgacgggccg gcgcgtggtc acgctgctcg acgaggtgcg ccccgccggt 1920

ccgcacacgg tggagtggga cggccgcgac gccggcgggc gtcccgccgc caccggcgtg 1980

tacttctacg ctcttcgcac cggggaccgc acctccgtga agaagatgtc ggtgctccgg 2040

tag 2043

Claims (8)

1.一种κ-卡拉胶酶，其特征在于，所述κ-卡拉胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的κ-卡拉胶酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求2或3所述的基因。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1所述的κ-卡拉胶酶，和/或包含权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的核酸构建体。

6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸杆菌细胞、放线菌细胞、酵母菌细胞或藻类细胞。

7.一种生产κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于包括以下步骤：在允许表达权利要求1所述κ-卡拉胶酶的条件下培养权利要求5或6所述的细胞；和从所得培养物中纯化κ-卡拉胶酶。

8.权利要求1所述的κ-卡拉胶酶在制备卡拉胶寡糖中的应用。

Images