CN110186891B - 一种特异性结合铜离子和半胱氨酸的多肽荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性结合铜离子和半胱氨酸的多肽荧光探针。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；用荧光发光物质修饰所述多肽的N端形成多肽荧光探针P，该探针能够靶向结合Cu2+，具有选择性好、毒性低、检测限低，而且制备简单、检测方便，为生物和环境样品中的铜离子的检测提供了一种高效的检测方法；探针P与Cu2+结合形成P‑Cu探针，该探针能够特异性的识别Cys，为生物体及环境样品中Cys的快速检测提供了一种高效的检测方法。

Description

一种特异性结合铜离子和半胱氨酸的多肽荧光探针
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种特异性结合铜离子和半胱氨酸的多肽荧光探针。
背景技术
Cu2+与Cys(半胱氨酸)是人体中不可缺少的小分子，参与调控体内多种生理活动。Cu2+对于基因表达、免疫调节、造血等有着重要作用，适量的Cu2+会对机体的生理过程起到促进作用，但当体内的Cu2+过量时会在肝脏聚集引发肝硬化、肝腹水，并且阿兹海默症、唐氏综合征等疾病也与体内铜的代谢失衡有关。Cys对生物体内蛋白质的合成、翻译修饰等生物功能起着至关重要的作用。当体内Cys不足时会导致头发褪色脱落、发育迟缓、肌肉无力等症状，但是当体内Cys过多时会引起神经中毒。同时，Cu2+与Cys在工业、制造业中的大量使用，造成了环境中的Cu2+和Cys污染，这些污染物会随动物植物进入人体在体内富集，给人的生命健康带来巨大危害。
因此开发简单快速检测Cu2+与Cys的方法对于疾病诊断、环境监测、食品药品分析等有重大的现实意义。Shen等以1,8-萘酰亚胺为荧光团设计合成了一个新型的小分子化学传感器，这个小分子荧光探针对Cys的选择性很高，加入Cys后探针的荧光猝灭，向体系中加入Cu2+后，Cu2+与Cys发生络合，探针的荧光恢复。Liu等以菲醌化合物作为荧光团，开发了在纯水体系中检测Cu2+和Cys的小分子荧光探针，基于铜离子的强烈顺磁猝灭效应识别Cu2+，而Cys的巯基能够与铜离子配位，将铜离子从探针分子上移除下来，以此达到对Cys检测的目的。但是上述探针普遍存在灵敏度低、毒性高、制备复杂、生物相容性差以及检测限高等缺点。
因此，研究开发一种能够特异性识别Cu2+和Cys，并且毒性低，检测灵敏的新的多肽荧光探针十分重要。而本发明开发的一种多肽荧光探针P在检测Cu2+时，不受其他离子干扰，具有选择性高、生物相容性好、制备简单、检测限较低的特点，可用于特异性检测Cu2+，并且该探针与Cu2+形成的配合物P-Cu探针能够特异性的检测Cys含量。
发明内容
本发明提供了一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种上述多肽在制备多肽荧光探针中的应用。
本发明还提供了一种特异性识别Cu2+的多肽荧光探针P，所述多肽荧光探针P是将发光物质修饰到上述多肽序列的N端制备得到的。
优选地，所述发光物质为荧光素类、罗丹明类、香豆素类、喹啉类、萘酰亚胺、多芳基乙烯类中的任一种。
优选地，所述发光物质为丹磺酰氯。
本发明还提供了一种特异性识别Cu2+的多肽荧光探针P在检测Cu2+含量中的应用，所述多肽荧光探针P与Cu2+以1:1配位结合，所述Cu2+的最低检测限为52nM，所述Cu2+的检测方法包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：向10mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入10-5mol/L的多肽荧光探针P，再加入浓度为0.0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25μM的Cu2+，并检测波长为540nm处溶液的荧光强度，以Cu2+浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线；
(2)样品中Cu2+含量的测定：向10mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入一定浓度的待测样品，并检测540nm处溶液的荧光强度；
(3)计算待测样品中Cu2+的含量：将步骤(2)所得的荧光强度值带入步骤(1)制备的标准曲线中，计算出待测样品中Cu2+的含量。
本发明还提供了一种特异性识别Cu2+的多肽荧光探针P在制备细胞成像试剂中的应用。
本发明还提供了一种特异性识别Cys的多肽荧光探针P-Cu，所述多肽荧光探针P-Cu是由上述多肽荧光探针P与Cu2+以1:1配位结合形成的。
本发明提供了一种特异性识别Cys的多肽荧光探针P-Cu在检测Cys含量中的应用，所述多肽荧光探针P-Cu与Cys以2:1配位结合，所述Cys的最低检测限为43nM，所述检测方法包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：向10mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入10-5mol/L的多肽荧光探针P-Cu，再加入浓度为0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2μM的Cys，并检测波长为515nm处溶液的荧光强度，以Cys浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线；
(2)样品中Cys含量的测定：向10mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入一定浓度的待测样品，并检测515nm处溶液的荧光强度；
(3)计算待测样品中Cys的含量：将步骤(2)所得的荧光强度值带入步骤(1)制备的标准曲线中，计算出待测样品中Cys的含量。
本发明还提供了一种特异性识别Cys的多肽荧光探针P-Cu在制备细胞成像试剂中的应用。
本发明的有益效果是：①本发明提供的一种多肽，该多肽通过固相法直接合成，制备简单，可用于制备多肽荧光探针；②以该多肽制备的多肽荧光探针P以多肽为主要结构单元，具有生物相容性好、毒性低的优点；③该多肽探针对Cu2+有较好的响应，不受其它同主族金属离子干扰，特异性强；④该多肽探针与Cu2+形成的P-Cu探针对Cys有较好的响应，不受其它氨基酸以及S2-离子干扰，特异性好。
附图说明
图1荧光多肽的结构图，其中(a)为多肽荧光多肽探针P的结构图，(b)为P-Cu探针的结构图；
图2荧光多肽探针P的阳离子识别光谱图；
图3荧光多肽探针P对Cu2+识别时其他金属离子干扰的柱状图；
图4荧光多肽探针P对Cu2+的荧光滴定趋势图；
图5荧光多肽探针P对Cu2+的检测限；
图6P-Cu探针的氨基酸识别光谱图；
图7P-Cu探针对Cys识别时其他氨基酸干扰的柱状图；
图8P-Cu探针对Cys的荧光滴定趋势图；
图9P-Cu探针对Cys的检测限；
图10多肽荧光探针的不同pH响应图；
图11细胞成像图，其中a为向HeLa细胞中加10μM P孵育1h后的荧光场图，b为其对应的明场图，c为其对应的荧光场与明场叠加图；d为向HeLa细胞中加入10μM的P后再加入10μM的Cu2+孵育1h后的荧光场图，e为其对应的明场图，f为其对应的荧光场与明场叠加图；g为向HeLa细胞中加入10μM的P-Cu后再加入5μM的Cys孵育1h后的荧光场图，h为其对应的明场图，i为其对应的荧光场与明场叠加图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
实施例1 多肽及多肽荧光探针P以及多肽荧光探针P-Cu
1.1制备方法
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；由20％的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(2)将4eq N端由Fmoc保护的氨基酸与4eq HOBt 和4eq HBTU用DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加6eq DIEA，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs；
(3)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂用20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(4)重复步骤(2)和(3)，直到合成目标序列的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。
(5)将4eq荧光发光物质丹磺酰氯与4eq HOBt和4eq HBTU用DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加6eq DIEA，溶液混合后加入到反应器中，反应6hrs。
(6)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别用5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测丹磺酰氯缩合完全，树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA：TIS：水＝95：2.5：2.5)，反应3hrs；
(7)将步骤(6)所得的反应液加入到冰***中，沉淀多肽。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰***再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰***洗涤2次后得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得到纯肽，再经冻干得到多肽荧光探针P，结构如图1中的(a)所示；
(8)将步骤(7)所得的多肽荧光探针P与Cu2+以1:1混合，形成多肽荧光探针P-Cu，结构如图1中的(b)所示。
1.2结果
根据上述步骤制备的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，制备的荧光多肽探针的P的结构如图1中的(a)所示，多肽荧光探针P-Cu的结构图如图1中的(b)所示。
实施例2 多肽荧光探针P对Cu2+检测的特异性研究
2.1多肽荧光探针P的阳离子选择性评价实验
HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，分别加入10-5mol/L的多肽荧光探针P以及10-5mol/L的金属阳离子(Ag+，Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+，Mn2+，Na+，Ni2+，Pb2+)，检测溶液的荧光发射光谱变化。结果如图2所示，仅有Cu2+的存在的情况下，探针P的荧光实现明显淬灭，其他的15种金属离子均不能使多肽荧光探针P的荧光发生淬灭现象，说明多肽应荧光探针P能够识别Cu2+。
2.2多肽荧光探针P对Cu2+的特异性检测研究
HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，分别加入10-5mol/L的多肽荧光探针P以及10-5mol/L的各种金属阳离子(Ag+，Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Fe3+，Hg2+，K+，Mg2+，Mn2+，Na+，Ni2+，Pb2+)，检测溶液的荧光发射光谱变化，然后再向以上含有阳离子的溶液中分别加入10- 5mol/L的Cu2+，检测溶液的荧光发射光谱，取最大发射波长所对应的值作图。结果如图3所示，尽管存在其他阳离子，Cu2+仍然能够导致荧光多肽探针的荧光淬灭，说明多肽荧光探针P能够特异性检测Cu2+，不受其他阳离子的干扰。
2.3多肽荧光探针P与Cu2+的结合比测定
向HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中加入10-5mol/L的多肽荧光探针P，再向其中加入不同浓度的Cu2+(0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0eq)，检测溶液的荧光发射光谱变化，取发射波长为540nm处所对应的值作荧光滴定趋势图。结果如图4所示，随着Cu2+浓度的增大，在540nm处的荧光强度不断降低，当加入1.0eq的Cu2+后，540nm处的荧光强度不再发生变化，说明所加入的Cu2+已经达到饱和，即多肽荧光探针P与Cu2+以1:1的化学计量比结合。
2.4多肽荧光探针P对Cu2+检测限的测定
首先，通过10次重复性实验测出仅有多肽荧光探针P时的荧光数据来确定空白条件下的标准偏差σ；
其次，通过逐次递增Cu2+浓度，在发射波长为540nm处测得系列荧光数据，作图得到一条线性相关系数为0.9908的直线，结果如图5所示；
最后，利用检测限LOD＝3σ/k公式计算多肽荧光探针P对Cu2+的最低检测限，其中σ是空白条件下标准偏差，k是曲线斜率。通过计算得出多肽荧光探针P对Cu2+的最低检测限为52nM。
实施例3 多肽荧光探针P-Cu对半胱氨酸(Cys)检测的特异性研究
3.1多肽荧光探针P-Cu对氨基酸检测的选择性评价实验
向HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中分别加入10-5mol/L的多肽荧光探针P-Cu以及10- 5mol/L的半胱氨酸(Cys)，谷氨酸(Glu)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，苯丙氨酸(Phe)，丙氨酸(Ala)，谷氨酰胺(Gln)，苏氨酸(Thr)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，赖氨酸(Lys)，色氨酸(Trp)，脯氨酸(Pro)，甘氨酸(Gly)，缬氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)，精氨酸(Arg)，组氨酸(His)，谷胱甘肽(GSH)以及S2-，检测溶液的荧光发射光谱变化。结果如图6所示，只有加入Cys时才引起荧光强度的显著化，而其他的物质都不会引起荧光强度显著变化。
3.2多肽荧光探针P-Cu对Cys的检测的特异性分析
向HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中分别加入10-5mol/L的P-Cu以及10-5mol/L的(Glu，Asp，Asn，Phe，Ala，Gln，Thr，Ser，Tyr，Lys，Trp，Pro，Gly，Val，Met，Leu，Ile，Arg，His，GSH以及S2-)，检测溶液的荧光发射光谱变化，然后再向以上含有其他物质的溶液中分别加入10- 5mol/L的Cys，检测溶液的荧光发射光谱，取最大发射波长所对应的值作图。结果如图7所示，尽管存在其他氨基酸和阴离子，Cys仍然能够导致荧光多肽探针的恢复，说明多肽荧光探针P-Cu对Cys的检测不受其他氨基酸和S2-的干扰，具有特异性。
3.3多肽荧光探针P-Cu与Cys的结合比的测定
向HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中加入10-5mol/L的P-Cu的探针，再向其中加入不同浓度的Cys(0.0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55，0.6，0.65，0.7，0.75，0.8eq)，检测溶液的荧光发射光谱变化，取发射波长为515nm处所对应的值作出荧光滴定趋势图。结果如图8所示，随着Cys浓度的增大，在515nm处的荧光强度不断增强，当加入的0.5当量的Cys后，515nm处的荧光强度不再发生变化，说明所加入的Cys已经达到饱和，即多肽荧光探针P-Cu与Cys以2:1的化学计量比结合。
3.4多肽荧光探针P-Cu对Cys检测限的测定
首先，通过10次重复性实验测出仅有P-Cu时的荧光数据，确定空白条件下的标准偏差σ；
其次，通过逐次递增Cys浓度，在发射波长为515nm处测得系列荧光数据，作图可观察到得到一条线性相关系数为0.9967的直线，结果如图9所示；
最后，利用检测限LOD＝3σ/k公式计算P-Cu探针检测Cys时的最低检测限，其中σ是空白条件下标准偏差、k是曲线斜率。计算得出多肽荧光探针P-Cu对Cys的最低检测限为43nM。
实施例4 多肽探针的pH响应性测定
在不同pH(2，4，6，8，10，12)的HEPES缓冲溶液中，测荧光多肽探针P、多肽荧光探针P-Cu以及多肽荧光探针P-Cu+Cys的荧光发射光谱，取荧光强度最大值做图。结果如图10所示，该体系的pH适用范围很广，不仅能用于监测环境中的Cu2+、Cys还能够用于细胞中Cu2+、Cys的检测。
实施例5 多肽探针的细胞成像
(1)将HeLa细胞培养在DMEM介质中，在37℃下，向该细胞中加入10μM的探针P孵育1h，然后洗涤3次，通过Zeissz正置荧光显微镜进行观察，暗场成像；
(2)将HeLa细胞培养在DMEM介质中，在37℃下，向该细胞中加入10μM的探针P，再加入10μM的Cu2+，孵育1h，然后洗涤3次，通过Zeiss正置荧光显微镜进行观察，暗场成像；
(3)HeLa细胞培养在DME介质中，在37℃下，向该细胞中加入10μM的探针P-Cu，再加入5μM的Cys，孵育1h，然后洗涤3次，通过Zeiss正置荧光显微镜进行观察，暗场成像。
细胞成像结果如图11所示，探针P加入后细胞有较强的荧光，然后加入Cu2+细胞荧光明细被猝灭，最后再加入Cys细胞荧光恢复。这说明探针P能够渗透活的HeLa细胞，并且能够检测细胞中的Cu2+和Cys。其中a为向HeLa细胞中加入10μM的P孵育1h后的荧光场图，b为其对应的明场图，c为其对应的荧光场与明场叠加图；d为向HeLa细胞中加10μM的P后再加入10μM的Cu2+孵育1h后的荧光场图，e为其对应的明场图，f为其对应的荧光场与明场叠加图；g为向HeLa细胞中加入10μM的P-Cu后再加入5μM的Cys孵育1h后的荧光场图，h为其对应的明场图，i为其对应的荧光场与明场叠加图。
Figure GDA0002405235030000081
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一种特异性结合铜离子和半胱氨酸的多肽荧光探针
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Asp Glu Lys Glu Asp
1 5

Claims (9)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种特异性识别Cu2+的多肽荧光探针P，其特征在于，所述的多肽荧光探针P由荧光发光物质与如权利要求1所述的多肽组成，所述荧光发光物质修饰在所述多肽的N端。
3.如权利要求2所述的多肽荧光探针P，其特征在于，所述的荧光发光物质为荧光素类、罗丹明类、香豆素类、喹啉类、萘酰亚胺、多芳基乙烯类中的任一种。
4.如权利要求3所述的多肽荧光探针P，其特征在于，所述的荧光发光物质为丹磺酰氯。
5.一种如权利要求2所述的多肽荧光探针P在检测Cu2+含量中的应用，其特征在于，所述的多肽荧光探针P与Cu2+ 以1:1配位结合，所述Cu2+的最低检测限为52nM，所述应用包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：向10mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入10-5mol/L的多肽荧光探针P，再加入浓度为0.0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25μM的Cu2+，并检测波长为540nm处溶液的荧光强度，以Cu2+浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线；
(2)样品中Cu2+含量的测定：向10mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入一定浓度的待测样品，并检测540nm处溶液的荧光强度；
(3)计算待测样品中Cu2+的含量：将步骤(2)所得的荧光强度值带入步骤(1)制备的标准曲线中，计算出待测样品中Cu2+的含量。
6.一种如权利要求2所述的多肽荧光探针P在制备检测Cu2+的细胞成像试剂中的应用，其特征在于，所述多肽荧光探针P对Cu2+的最低检测限为52nM。
7.一种特异性识别Cys的多肽荧光探针P-Cu，其特征在于，所述多肽荧光探针P-Cu是由如权利要求2所述的多肽荧光探针P与Cu2+以1:1配位结合形成的配合物。
8.一种如权利要求7所述的多肽荧光探针P-Cu在检测Cys含量中的应用，其特征在于，所述多肽荧光探针P-Cu与Cys以2:1配位结合，所述Cys的最低检测限为43nM，所述应用包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：向10mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入10-5mol/L的多肽荧光探针P-Cu，再加入浓度为0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2μM的Cys，并检测波长为515nm处溶液的荧光强度，以Cys浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线；
(2)样品中Cys含量的测定：向10mM，pH7.4的HEPES缓冲液中加入一定浓度的待测样品，并检测515nm处溶液的荧光强度；
(3)计算待测样品中Cys的含量：将步骤(2)所得的荧光强度值带入步骤(1)制备的标准曲线中，计算出待测样品中Cys的含量。
9.一种如权利要求7所述的多肽荧光探针P-Cu在制备检测Cys的细胞成像试剂中的应用，其特征在于，所述多肽荧光探针P-Cu对Cys的最低检测限为43nM。
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