CN107686479A - 一种近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用。本发明提供的荧光探针化合物结构式如式(1)所示。该探针化合物对铜离子具有良好的选择性和灵敏度且不受其他金属离子的干扰，成功实现了对环境水样和活细胞中的铜离子的定量和定性检测。

Description

一种近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种近红外荧光探针化合物及其制备方法以及其在铜离子检测中的应用。

背景技术

铜(Cu²⁺)被认为是继铁和锌之后生命中第三种重要的微量元素，它在各种生理病理过程中起重要作用。然而，高浓度的铜离子可以对自然环境和人体健康产生毒性和危害。据报道，细胞中过量的铜离子会引起一系列严重的健康问题，包括胃肠道紊乱，肾和神经永久性损伤等疾病。因此，发展有效、可靠的方法来检测环境和生物***中铜离子是非常有意义的。

传统的方法如电感耦合等离子体质谱法，原子吸收光谱和溶出伏安法可检测出环境样品中痕量的铜离子。然而这些方法存在仪器昂贵、处理复杂以及破坏性检测等缺点，难以满足在生物样品中的原位检测。相比之下，荧光方法因其灵敏度高、选择性好、操作简便、非破坏性检测等优点受到极大关注。

到目前为止，已经报道了许多荧光探针用于铜离子检测。根据反应机制不同，铜离子荧光探针可以分成两类：(一)铜离子与受体络合和(二)铜离子诱导的特异性反应。第一类铜离子荧光探针发展时间较早，通常利用铜离子顺磁效应引起荧光猝灭，多表现为“开-关”型(淬灭型)荧光变化。这类荧光探针的灵敏度较低且容易遭受一些离子半径和化学性质相近的竞争金属离子的干扰，如铁离子、钴离子、镍离子和汞离子。第二类铜离子荧光探针也称为活性探针，是利用铜离子特异性化学反应，诱导探针上的识别基团发生水解，释放荧光信号基团，引起荧光恢复。这类探针对铜离子具有较高的选择、在识别过程中可以有效避免铜离子的顺磁效应，输出信号为荧光增强型(恢复型)，因此在探针分子设计以及制备中得到了极大关注。遗憾地是，大多数报道的铜离子活性荧光探针发射位于紫外-可见光区，在生物应用中容易遭受背景荧光的干扰。近红外(650-900nm)荧光探针因其具有低的背景干扰，低的光损伤和深的组织穿透性等优点，为人们研究生命细胞中铜离子存在提供了可能。因此，利用一种增强型的近红外荧光探针高灵敏、高选择性检测环境水样和活细胞中的铜离子对于环境保护和人类疾病诊断是非常有意义的。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用。本发明提供的荧光探针对铜离子具有较高灵敏性和选择性且不受其他金属离子的干扰，成功实现了对环境水样和活细胞中的铜离子定量、定性检测，为环境保护和铜离子诱发的疾病诊断提供了一种非常有效的检测方法。

本发明提供了一种近红外荧光探针化合物，其化学结构式如式(1)所示，简称为DCM-P。

制备上述红外荧光探针化合物的方法，包括以下步骤：

(1)以4-(二氰基亚甲基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃为原料，在原料中加入吡啶甲酸、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和二氯甲烷，混合均匀，得混合液；所述4-(二氰基亚甲基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃简称为DCM-OH，所述4-二甲氨基吡啶简称为DMAP，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐简称为EDC，所述混合液配方比例为：

(2)将上述混合液在20-40℃下搅拌5-24小时；

(3)反应结束后，有黄色沉淀物析出，黄色沉淀物经过滤分离得到纯净的探针DCM-P。

步骤(1)所述混合液配方比例优选为：

步骤(1)所述混合液配方比例进一步优选为：

步骤(2)优选在20-40℃下中搅拌12-24小时。

该化合物的结构鉴定：

探针DCM-P核磁共振氢谱结果如下：

¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)：δ8.84(d,J＝3.2Hz，1H)，8.73(d，J＝8.3Hz，1H)，8.26(d，J＝7.7Hz，1H)，8.10(t，J＝7.5Hz,1H)，7.98–7.86(m，3H)，7.85–7.71(m，3H)，7.62(t，J＝7.5Hz，1H)，7.54(d，J＝16.0Hz，1H)，7.44(d，J＝8.2Hz，2H)，7.05(s，1H)。

探针DCM-P核磁共振碳谱结果如下：

¹³CNMR(126MHz,DMSO-d₆)：δ163.23，157.89，152.88，150.00，146.60，137.74，135.46，132.97，129.47，128.03，126.19,125.76，124.63，122.54，119.97，119.06，117.05，115.72，106.91，60.56。

探针DCM-P高分辨质谱结果如下：

ESI-MSm/z：[M+Na]⁺440.1032(实验测得值)，440.1006(理论计算值)。

本发明还提供了所述近红外荧光探针化合物在铜离子检测中的应用。

优选方案，所述铜离子包括环境水样中的铜离子与活细胞中外源性铜离子。

进一步优选方案，应用所述近红外荧光探针化合物检测环境水样中的铜离子，包括以下步骤：

(1)准确称取一定量4-(二氰基亚甲基)-2-(4-吡啶甲酰酯基苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃化合物(DCM-P)溶于色谱纯的二甲亚砜(DMSO)中,配制成浓度为1.0×10^-3mol/L的DCM-P储备液，并置于2℃-5℃的温度下保存；

(2)准确称取一定量的硝酸铜分别溶于去离子水中，配制成浓度为1.0×10^-2mol/L的铜离子储备液，并置于2℃-5℃的温度下保存；用去离子水稀释不同体积的铜离子储备液，得到不同浓度的铜离子标准溶液；

(3)在多个2mL的测试管中分别加入1mL的二甲亚砜，0.5mL的磷酸盐缓冲液，再分别加入0.02mL的步骤(1)所述DCM-P储备液，然后分别加入步骤(2)所述不同浓度的铜离子标准溶液，用去离子水定容到2mL，控制此时体系中DMSO:H₂O＝4:6v/v-6:4v/v，待混合液反应至少30分钟后，用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度，确定荧光强度与铜离子浓度的定量关系并制作标准曲线；

(4)在2mL的测试管中加入1mL的DMSO，0.5mL的磷酸盐缓冲液，再加入0.02mL的步骤(1)所述DCM-P储备液，然后加入待测溶液，用去离子水定容到2mL，待混合液反应一段时间后测定其荧光强度，根据标准曲线确定待测液中铜离子的浓度。

其中所述磷酸盐缓冲液优选为10mM、pH＝7.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄体系。

其中所述检测体系中DMSO与水相的体积比优选为5:5v/v。

其中所述混合反应优选30分钟-40分钟后测定溶液的荧光强度。

其中所述荧光分光光度计参数设置为激发狭缝10nm，发射狭缝10nm，激发波长560nm，发射波长677nm，扫描范围695-850nm。

进一步优选方案，应用所述近红外荧光探针化合物检测活细胞中外源性铜离子，包括以下步骤：

(1)将活细胞置于含有10％胚胎牛血清和1.0×10^-5mol/L探针DCM-P的DMEM培养基中，在37℃和5％二氧化碳条件下培养30分钟；

(2)先用吸管吸出培养基，再用37℃的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，然后用荧光倒置显微镜进行成像；

(3)向步骤(2)所述细胞中添加1.0×10^-5mol/L铜离子，继续培养30分钟，再用37℃的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，然后用荧光倒置显微镜进行成像。

本发明通过实验研究化合物DCM-P与多种金属离子的识别作用，发现DCM-P对铜离子具有特异性响应。该方法可在近红外区域(λ_em>650nm)实现对铜离子的高灵敏、高选择性荧光检测，并具有较大的斯托克斯位移(116nm)。在实际应用方面，化合物DCM-P不仅能定量检测环境水样中的铜离子，还能定性检测活细胞中外源性铜离子。本发明中近红外荧光探针的制备方法具有反应条件温和，产量较高，分离简单等优点。

附图说明

图1是本发明所提供探针DCM-P的氢谱，由图1可知，探针DCM-P比较纯净，没有其他杂质；

图2是本发明所提供探针DCM-P的碳谱；

图3是本发明所提供探针DCM-P的高分辨质谱；440.1032处的峰为[DCM-P+Na]⁺分子离子峰；

图4是本发明实施例14中不同浓度探针DCM-P加入铜离子后混合体系的荧光强度变化曲线；

图5是本发明实施例14中探针DCM-P在不同缓冲体系中加入铜离子后的荧光强度矩形图；

图6是本发明实施例14中探针DCM-P在不同水相与有机相比中加入铜离子后的荧光强度变化曲线；

图7是本发明实施例14中探针DCM-P加入铜离子后混合体系的荧光强度随pH的变化曲线图

图8是本发明实施例14中探针DCM-P加入铜离子后混合体系的荧光强度随反应时间的变化曲线；

图9是本发明实施例15中探针DCM-P加入不同浓度的铜离子后混合体系的荧光发射光谱图；

图10A是本发明实施例15中探针DCM-P加入不同浓度的铜离子后混合体系的荧光强度变化曲线,图10B为不同浓度铜离子的荧光发射强度的线性回归曲线；

图11是本发明实施例16中探针DCM-P加入不同金属离子后混合体系的荧光发射光谱图；

图12是本发明实施例17中探针DCM-P在其他金属离子共存下加入铜离子后混合体系的荧光强度矩形图；

图13是本发明实施例18中探针DCM-P在加入铜离子前后氢谱变化图；

图14是本发明实施例18中探针DCM-P与铜离子作用后高分辨质谱图；

图15是本发明实施例20中用探针DCM-P孵育的海拉细胞加入铜离子前后的显微成像图.

具体实施方式

以下通过对实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明对上述主体范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

准确称取187.4毫克DCM-OH、49.2毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有黄色固体析出，TLC点板监控，发现还有一部分原料DCM-OH未反应完全。将反应液过滤，得到纯净的探针DCM-P固体(产率为42％)。

实施例2

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有大量黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为85％)。

实施例3

准确称取187.4毫克DCM-OH、147.7毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有大量黄色固体析出，直接过滤，得到粗产物，在纯净二氯甲烷中重结晶得到纯净的探针DCM-P(产率为76％)。

实施例4

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、2.4毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为51％)。

实施例5

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、22.0毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有大量黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为84％)。

实施例6

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和57.5毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为35％)。

实施例7

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和287.6毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有大量黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为82％)。

实施例8

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入10毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有大量黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为83％)。

实施例9

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入50毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌12个小时；反应结束后，有黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为62％)。

实施例10

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入10毫升二氯甲烷，在20℃下搅拌12个小时；反应结束后，有黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为61％)。

实施例11

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入10毫升二氯甲烷，在40℃下搅拌12个小时；反应结束后，有大量黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为88％)。

实施例12

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌5个小时；反应结束后，有黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为53％)。

实施例13

准确称取187.4毫克DCM-OH、81.3毫克吡啶甲酸、7.3毫克DMAP和138.0毫克EDC干燥的圆底烧瓶，然后加入20毫升二氯甲烷，在30℃下搅拌24个小时；反应结束后，有大量黄色固体析出，直接过滤，得到纯净的探针DCM-P(产率为87％)。

实施例14

一种近红外荧光在铜离子检测中的应用，具体步骤为：

(1)准确称取一定量的DCM-P溶于色谱纯的DMSO中,配制成浓度为1.0×10^-3mol/L的DCM-P储备液，并置于2-5℃的冰箱中保存；

(2)准确称取一定量的金属硝酸盐(Cu²⁺,Li⁺,Na⁺,K⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Hg²⁺,Ni²⁺,Zn^{2 +},Pb²⁺,Mn²⁺,Mg²⁺,Al³⁺,Cr³⁺)，分别溶于去离子水中，配制成浓度为1.0×10^-2mol/L的金属离子储备液，并置于2-5℃的冰箱中保存；

(3)在多个2mL的测试管中分别加入1mL的DMSO,0.5mL的磷酸盐缓冲液，再分别加入0.02mL的DCM-P储备液(1.0×10^-3mol/L)，然后分别加入不同浓度的铜离子标准溶液，用去离子水定容到2mL(此时体系中有机相DMSO:H₂O＝5:5v/v)，待混合液反应一段时间后，用荧光分光光度计(HitachiF-4500，Japan)测定各溶液的荧光强度，确定荧光强度与铜离子浓度的定量关系并制作标准曲线；

(4)在2mL的测试管中加入1mL的DMSO,0.5mL的磷酸盐缓冲液，再加入0.02mL的DCM-P储备液(1.0×10^-3mol/L)，然后加入待测溶液，用去离子水定容到2mL，待混合液反应一段时间后测定其荧光强度，根据标准曲线确定待测液中铜离子的浓度。

测试条件的优化和选择

1、探针DCM-P浓度的选择

应用荧光方法分析待测物质大多是通过配制成溶液后再进行检测。探针浓度的高低直接影响检测的灵敏度和线性范围。探针浓度过低，待测物与之作用产生的信号越弱，降低灵敏度。探针浓度过高，会发生分子聚集淬灭效应，降低标准曲线的线性度。在具体研究中，我们固定铜离子的浓度(1.0×10^-5)及其他实验条件，改变探针DCM-P的浓度，然后测定各溶液的荧光强度。由图4所示，当探针DCM-P浓度>0.8×10^-5mol/L时，DCM-P对铜离子具最佳的响应。考虑到方法的灵敏性和线性范围，探针的最优浓度选择为1.0×10^-5mol/L。(1.0×10^-5mol/L-3.0×10^-5mol/L均可以)

2、缓冲溶液的选择

在具体研究中，我们固定铜离子的浓度(1.0×10^-5mol/L)、探针DCM-P的浓度(1.0×10^-5mol/L)及其他实验条件，改变缓冲体系类型如三羟甲基氨基甲烷(Tris缓冲液)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES缓冲液)，磷酸盐(PBS缓冲液)，再测定相应溶液的荧光强度。由图5所示，探针在磷酸盐缓冲体系中与铜离子反应产生最佳荧光信号。

3、水相与有机相比例的选择

测试体系中有机相含量多少直接影响探针与待测物间反应情况。测试体系中有机相含量过低，降低探针在测试溶液中的溶解性，不利于探针与待测物间反应。测试体系中有机相含量过高，限制了探针的生物应用。在具体研究中，通过固定铜离子的浓度(1.0×10^{- 5}mol/L)、探针DCM-P的浓度(1.0×10^-5mol/L)、缓冲溶液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄体系)、及其他实验条件，改变测试体系中有机相与水相的比例，然后测定各溶液的荧光强度。由图6所示，在DMSO/H₂0＝4/6-6/4(v/v)的体系中，探针DCM-P和铜离子反应产生最佳荧光信号。因此，在分析检测中，有机相与水相的比例优选为4/6-6/4，进一步优选为5/5。

4、溶液pH的选择

在具体研究中，我们固定铜离子的浓度(1.0×10^-5mol/L)和探针DCM-P的浓度(1.0×10^-5mol/L)、缓冲溶液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄体系)、有机相与水相的比例(5/5，v/v)、及其他实验条件，改变测试体系中pH，然后测定各溶液的荧光强度。由图7所示，当溶液pH在7.0到10.0范围内，探针DCM-P和铜离子反应产生最佳荧光信号，表明探针DCM-P适用于生理pH范围(pH＝7.4)。本研究希望实现探针对活细胞内铜离子的识别作用，因此，选用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液来模拟细胞内环境。

5、反应时间的选择。

在具体研究中，我们固定铜离子的浓度(1.0×10^-5mol/L)和探针DCM-P的浓度(1.0×10^-5mol/L)、缓冲溶液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄体系)、有机相与水相的比例(5/5，v/v)、pH＝7.4及其他实验条件，然后测定溶液在不同反应时间下的荧光强度。由图8所示，溶液的荧光强度随着随着反应时间的增加而增加，在30分钟后达到最大值，然后趋于稳定，故最佳测试时间优选30-40分钟。

实施例15

在多个2mL的测试管中分别加入1mL的DMSO,0.5mL的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，再分别加入0.02mL的DCM-P储备液(1.0×10^-3mol/L)，然后分别加入不同浓度的铜离子溶液([Cu²⁺](×10^-6mol/L)：0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、6、8、10、14、18、20、25、30μM)，用去离子水定容到2mL，待混合液反应30分钟后，用荧光分光光度计(HitachiF-4500，Japan)测定各溶液的荧光强度。荧光测试参数为激发狭缝10nm，发射狭缝10nm，激发波长560nm，发射波长677nm，扫描范围695-850nm。图9是探针DCM-P与不同浓度的铜离子作用后的荧光发射光谱图。可以看到，随着铜离子浓度的增加，676nm处的荧光强度不断增加，当铜离子的浓度达到1.0×10^-5mol/L，检测体系的荧光强度趋于稳定。本发明中探针DCM-P与铜离子作用后荧光发射位于近红外区域，能有效避免背景荧光的干扰，因此在生物应用中具有明显优势。铜离子浓度与发射峰强度的关系如图10所示。可以看出，在铜离子浓度为0-8×10^-6mol/L范围内，检测体系的荧光强度与铜离子浓度呈现出良好的线性关系。线性方程为Y＝0.0799X+0.1617,R²＝0.9985，其中Y为归一化荧光强度，X为铜离子浓度，检出限为3.6×10^-8mol/L。

实施例16

在多个2mL的测试管中分别加入1mL的DMSO,0.5mL的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，再分别加入0.02mL的DCM-P储备液(1.0×10^-3mol/L)，然后分别加入0.02mL(1.0×10^-2mol/L)的不同金属离子的储备液(Li⁺,Na⁺,K⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Hg²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺,Pb²⁺,Mn²⁺,Mg²⁺,Al³⁺,Cr³⁺)，用去离子水定容到2mL，待混合液反应30分钟后，用荧光分光光度计(HitachiF-4500，Japan)测定各溶液的荧光强度。如图11所示，当相同浓度的各种金属离子分别加入到含有探针DCM-P的溶液中一段时间后，只有铜离子引起检测体系的荧光增强，而其他金属离子不会引起明显的荧光变化。表明探针DCM-P对铜离子的识别具有很好的选择性。

实施例17

为了进一步考察探针DCM-P对铜离子的选择性以及抗干扰性，我们测试了环境水样中可能存在的各种金属离子与铜离子共存时对检测体系荧光强度的影响。在图12中，none为仅含探针DCM-P(1.0×10^-5mol/L)时体系的荧光强度，白色矩形图代表不同金属离子(1.0×10^-4mol/L)和DCM-P(1.0×10^-5mol/L)混合后的荧光强度，黑色矩形图表示向含有不同金属离子(1.0×10^-4mol/L)和DCM-P(1.0×10^-5mol/L)的体系中加入同等浓度的铜离子(1.0×10^-4mol/L)后的荧光强度。由图12可知，探针DCM-P对铜离子检测几乎不受其他金属离子的干扰，具有较好的抗干扰性。

实施例18

探针DCM-P分子由4-(二氰基亚甲基)-2-(2-羟基基苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃和吡啶甲酰基两个片段组成。其中4-(二氰基亚甲基)-2-(2-羟基基苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃作为荧光信号单元，吡啶甲酰基作为识别单元。在与铜离子作用前，探针DCM-P的分子内电荷转移过程受阻，导致荧光发生淬灭。而加入铜离子后，吡啶甲酰基上的氮原子易于与铜离子配位，催化酯键水解，释放荧光信号单元。此时荧光信号单元中存在明显的分子内电子转移过程，在光激发下，产生近红外荧光发射。

为了证明上述反应机理，我们借助核磁共振谱监控了整个反应过程。结果如图13-14所示，在探针DCM-P与铜离子作用前，吡啶甲酰基上的质子信号峰分别出现在8.8,8.3,8.1和7.4ppm。在滴加铜离子之后，吡啶甲酰基上的质子信号峰消失，同时在10.1ppm处出现酚羟基的质子信号峰(图13)。此外，我们借助高分辨质谱对探针DCM-P与铜离子的产物进行表征，得到一个相应于荧光信号单元的离子碎片峰(图14)。

实施例19

本实施例将探针DCM-P用于环境水样中铜离子检测。

(1)水样取自湖南省长沙市的自来水，湘江河水，在分析测试前，经过0.22微米的膜过滤，pH调到7.4。

(2)考虑水样中铜离子浓度过低，我们采用标准加入法测定铜离子浓度。具体为：向预处理后的水样中加入已知浓度的铜离子(0，0.2μM，2μM)并在最优条件下测定荧光强度，通过标准曲线计算回收量和回收率。

为了验证探针在环境领域中的实用性，我们采用标准加入法测定了长沙市自来水以及湘江水样中铜离子浓度。当探针直接加入到水样中，荧光没有明显变化，当往水样中加入不同已知浓度的铜离子，荧光发生一定变化，将测得的荧光强度变化值代入标准曲线可以计算出铜离子的浓度。检测结果如表1所示，可以看到用该方法得到的回收率在98.5％-103％间，表明探针DCM-P能够满足检测水样中铜离子的要求。因此探针DCM-P可以作为一个定量检测水样中铜离子浓度的有力工具。

表1用探针DCM-P检测环境水样中铜离子的分析结果

实施例20

本实施例将探针DCM-P用于海拉细胞中铜离子检测。

(1)将海拉细胞置于含有10％胚胎牛血清和1.0×10^-5mol/L探针DCM-P的DMEM培养基中，在37℃和5％二氧化碳条件下培养30分钟。

(2)先用吸管吸出培养基，再用温热(37℃)的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，然后用荧光倒置显微镜(Nikon,EclipseTi-S)进行成像。

(3)向步骤(2)所述细胞中添加1.0×10^-5mol/L铜离子，继续培养30分钟，再用温热(37℃)的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，然后用荧光倒置显微镜(Nikon,EclipseTi-S)进行成像。

图15是海拉细胞荧光显微成像照片，其中A代表细胞在含有探针DCM-P培基培养30分钟后的明场图，B代表细胞先在含有探针DCM-P培基培养30分钟，再添加铜离子继续培养30分钟后的明场图。C和D分别为A和B的荧光成像图。可以看出，本实施提供的探针DCM-P可对细胞中的铜离子的分布进行准确确定。

Claims (12)

1.一种近红外荧光探针化合物，其化学结构式如式(1)所示，简称DCM-P。

。

2.一种制备权利要求1所述红外荧光探针化合物的方法，包括以下步骤：

(1)以4-(二氰基亚甲基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃为原料，在原料中加入吡啶甲酸、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和二氯甲烷，混合均匀，得混合液；所述4-(二氰基亚甲基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-1-苯并吡喃简称为DCM-OH，所述4-二甲氨基吡啶简称为DMAP，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐简称为EDC，所述混合液配方比例为：

(2)将上述混合液在20-40℃下搅拌5-24小时；

(3)反应结束后，有黄色沉淀物析出，黄色沉淀物经过滤分离得到纯净的探针DCM-P。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征是，步骤(1)所述混合液配方比例为：

4.根据权利要求2或3所述制备方法，其特征是，步骤(1)所述混合液配方比例为：

5.根据权利要求2或3所述制备方法，其特征是，步骤(2)是在在20-40℃下中搅拌12-24小时。

6.权利要求1-5之一所述近红外荧光探针化合物在铜离子检测中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征是，所述铜离子包括环境水样中的铜离子与活细胞中外源性铜离子。

8.根据权利要求7所述应用，其特征是，应用所述近红外荧光探针化合物检测环境水样中的铜离子，包括以下步骤：

(1)准确称取一定量DCM-P溶于色谱纯的二甲亚砜中,配制成浓度为1.0×10^-3mol/L的DCM-P储备液，并置于2℃-5℃的温度下保存；

(2)准确称取一定量的硝酸铜分别溶于去离子水中，配制成浓度为1.0×10^-2mol/L的铜离子储备液，并置于2℃-5℃的温度下保存；用去离子水稀释不同体积的铜离子储备液，得到不同浓度的铜离子标准溶液；

(3)在多个2mL的测试管中分别加入1mL的二甲亚砜，0.5mL的磷酸盐缓冲液，再分别加入0.02mL的步骤(1)所述DCM-P储备液，然后分别加入步骤(2)所述不同浓度的铜离子标准溶液，用去离子水定容到2mL，控制此时体系中DMSO:H₂O＝4:6v/v-6:4v/v，待混合液反应至少30分钟后，用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度，确定荧光强度与铜离子浓度的定量关系并制作标准曲线；

(4)在2mL的测试管中加入1mL的DMSO，0.5mL的磷酸盐缓冲液，再加入0.02mL的步骤(1)所述DCM-P储备液，然后加入待测溶液，用去离子水定容到2mL，待混合液反应一段时间后测定其荧光强度，根据标准曲线确定待测液中铜离子的浓度。

9.根据权利要求8所述应用，其特征是，所述磷酸盐缓冲液为10mM、pH＝7.4的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄体系。

10.根据权利要求8所述应用，其特征是，所述检测体系中DMSO与水相的体积比为5:5v/v。

11.根据权利要求8所述应用，其特征是，所述荧光分光光度计参数设置为激发狭缝10nm，发射狭缝10nm，激发波长560nm，发射波长677nm，扫描范围695-850nm。

12.根据权利要求7所述应用，其特征是，应用所述近红外荧光探针化合物检测活细胞中外源性铜离子，包括以下步骤：

(1)将活细胞置于含有10％胚胎牛血清和1.0×10^-5mol/L探针DCM-P的DMEM培养基中，在37℃和5％二氧化碳条件下培养30分钟；

(2)先用吸管吸出培养基，再用37℃的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，然后用荧光倒置显微镜进行成像；

(3)向步骤(2)所述细胞中添加1.0×10^-5mol/L铜离子，继续培养30分钟，再用37℃的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，然后用荧光倒置显微镜进行成像。