CN109575114A

CN109575114A - 一种水稻粒形粒重相关基因、蛋白、分子标记及应用

Info

Publication number: CN109575114A
Application number: CN201910089642.6A
Authority: CN
Inventors: 高振宇; 钱前; 阮班普; 胡江; 董国军; 曾大力; 张光恒; 郭龙彪
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: CN109575114B

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，公开了水稻粒形粒重基因TGW2(Seq ID No：1、2)、其编码的蛋白质(Seq ID No：3)及上述基因或蛋白质在调控植物粒形和粒重中的应用。本发明还公开了上述基因的5’非编码区DNA序列、突变基因、突变蛋白在调控植物粒形粒重中的应用。本发明还公开了与上述基因紧密连锁的分子标记及其应用。TGW2基因的克隆和应用，可通过调控水稻粒形粒重，有效提高水稻的产量。

Description

一种水稻粒形粒重相关基因、蛋白、分子标记及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地，涉及一种水稻粒形粒重相关基因、蛋白、分子标记及应用。

背景技术

水稻不仅是单子叶模式植物，而且是我国重要的粮食作物。水稻籽粒的大小是影响稻米产量和品质的重要因素，在长期的水稻育种过程中一直备受关注。水稻粒形和粒重是影响产量的直接因素，千粒重是稻谷产量三要素之一，而粒重主要由粒形决定。同时，粒形对稻米品质也有重要影响，尤其是稻米的外观品质(垩白粒率、垩白度)和碾磨加工品质(糙米率、精米率和整精米率)等。控制粒形的4个关键因素分别为粒长、粒宽、粒厚和长宽比。

但是，籽粒大小是由多个遗传位点控制的复杂数量性状，至今，科学家们利用图位克隆方法已成功克隆到一系列调控水稻粒形变异的数量性状遗传位点(QTL)。这些QTL主要通过调控水稻颖壳的大小来影响籽粒的形成，其中与粒宽和粒重相关的基因有GW2(SongXJ,Huang W,Shi M,Zhu MZ,Lin HX.A QTL for rice grain width and weight encodesa previously unknown RING-type E3ubiquitin ligase.Nat Genet.2007,39(5):623-630)、qSW5/GW5(Shomura A,Izawa T,Ebana K,Ebitani T,Kanegae H,Konishi S,YanoM.Deletion in a gene associated with grain size increased yields during ricedomestication.Nat Genet.2008,40(8):1023-1028；Weng J,Gu S,Wan X,Gao H,Guo T,SuN,Lei C,Zhang X,Cheng Z,Guo X,Wang J,Jiang L,Zhai H,Wan J.Isolation andinitial characterization of GW5,a major QTL associated with rice grain widthand weight.Cell Res.2008,18(12):1199-1209)、GS5(Li Y,Fan C,Xing Y,Jiang Y,LuoL,Sun L,Shao D,Xu C,Li X,Xiao J,He Y,Zhang Q.Natural variation in GS5plays animportant role in regulating grain size and yield in rice.Nat Genet.2011,43(12):1266-1269)、GW8(Wang S,Wu K,Yuan Q,Liu X,Liu Z,Lin X,Zeng R,Zhu H,Dong G,Qian Q,Zhang G,Fu X.Control of grain size,shape and quality by OsSPL16inrice.Nat Genet.2012,44(8):950-954)、GW7(Wang S,Li S,Liu Q,Wu K,Zhang J,Wang S,Wang Y,Chen X,Zhang Y,Gao C,Wang F,Huang H,Fu X.The OsSPL16-GW7regulatorymodule determines grain shape and simultaneously improves rice yield andgrain quality.Nat Genet.2015,47(8):949-954)和OsOTUB1(Wang S,Wu K,Qian Q,LiuQ,Li Q,Pan Y,Ye Y,Liu X,Wang J,Zhang J,Li S,Wu Y,Fu X.Non-canonicalregulation of SPL transcription factors by a human OTUB1-like deubiquitinasedefines a new plant type rice associated with higher grain yield.CellRes.2017,27(9):1142-1156)。因此，克隆水稻粒形基因，开发相应的分子标记，通过分子育种改良水稻粒形，可以同时提高水稻产量和改良水稻品质。

TGW2基因与水稻的类果重基因OsFWL1为同一基因。OsFWL1蛋白具有CLITCVCPC结构域，含2个跨膜区。在根、茎、穗和幼苗组织均有表达，亚细胞定位发现其在细胞膜上(XuJ,Xiong W,Cao B,Yan T,Luo T,Fan T,Luo M.Molecular characterization andfunctional analysis of"fruit-weight 2.2-like"gene family in rice.Planta.2013,238(4):643-655)。该蛋白与玉米的ZmCNR1同源性高(82％相似度)(Guo M,SimmonsCR.Cell number counts--the fw2.2and CNR genes and implications forcontrolling plant fruit and organ size.Plant Sci.2011,181(1):1-7)。但其功能至今尚不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种调控水稻粒形和粒重的水稻粒形粒重基因TGW2及其编码的蛋白质，并基于此开发其相关应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种蛋白在调控水稻粒形粒重中的应用，所述蛋白如(A)或(B)所示的序列：

(A)Seq ID No：3所示的氨基酸序列；

(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有相同功能的由(A)衍生的蛋白质；

所述粒形为粒宽。

其中的Seq ID No：3所示的蛋白质属于富含半胱氨酸结构域的新蛋白，具有181个氨基酸。对保守区域之外的非结构域区域进行氨基酸的取代、缺失、添加也可以得到调控粒形粒重功能的类似物，不会对蛋白的功能产生影响。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白的基因在调控水稻粒形粒重中的应用。

进一步地，编码所述水稻粒形粒重蛋白的基因TGW2如(a)、(b)、(c)或(d)所示的序列：

(a)Seq ID No：1所示的基因组核苷酸序列；

(b)Seq ID No：2所示的cDNA核苷酸序列；

(c)在所述(a)序列前还包括5’非编码区DNA序列，所述5’非编码区DNA序列如SeqID No：5所示的的核苷酸序列；

(d)在(a)、(b)或(c)所示的核苷酸序列的中添加和/或取代和/或缺失一个或几个核苷酸而生成的可编码具有调控粒形粒重功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。

其中Seq ID No：1所示的日本晴基因组核苷酸序列共有877个核苷酸，Seq ID No：2所示的日本晴cDNA序列共有546个核苷酸(包括终止子TAG)。对保守区域之外的区域进行核苷酸的添加、取代、缺失也可以编码得到调控粒形粒重功能的类似物，不会对蛋白的功能产生影响。

其中，Seq ID No：5所示的序列为培矮64s的5’非编码区DNA序列，对应地，该5’非编码区DNA序列对粒形粒重起到调控作用，培矮64s的粒宽及千粒重相对较小，正是由于该5’非编码区DNA序列的负调控作用。

进一步地,由于上述基因属于负调控基因，因此可通过基因敲除来提高水稻粒宽粒重；所述基因敲除载体为CRISPR/Cas9载体；所述用于敲除基因的靶标序列的靶点接头引物为：

cas-F1：ggcaCGATGAACACCCCACGCAC；

cas-R1：aaacGTGCGTGGGGTGTTCATCG；

或：

cas-F2：gccgGGCTGACGCGATGGTCCAC；

cas-R2：aaacGTGGACCATCGCGTCAGCC。

进一步地，所述(a)序列前还包括5’非编码区DNA序列，所述5’非编码区DNA序列如Seq ID No：4所示的核苷酸序列，Seq ID No：4所示的序列为93-11的5’非编码区DNA序列，对应地，该5’非编码区DNA序列对粒形粒重起到调控作用，93-11的粒宽及千粒重相对较大，正是由于该5’非编码区DNA序列的调控作用，因此，含有上述5’非编码区DNA序列的(a)序列可通过转基因方法转入水稻中以提高水稻的粒宽粒重。

一方面，本发明提供了一种水稻粒形粒重突变基因编码的蛋白，如Seq ID No：6或Seq ID No：7所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白的水稻粒形粒重基因TGW2的突变基因，如(a)、(b)、(c)或(d)所示的序列：

(a)Seq ID No：1的第107位和第134位各***T的基因组核苷酸序列；

(b)Seq ID No：2的第107位和第134位各***T的cDNA核苷酸序列；

(c)Seq ID No：1的第107位和第134位各***A的基因组核苷酸序列；

(d)Seq ID No：2的第107位和第134位各***A的cDNA核苷酸序列。

又一方面，本发明提供了一种上述突变蛋白、突变基因在调控水稻粒形粒重中的应用，所述粒形为粒宽。

此处的应用，对于突变基因来说，主要是通过将突变基因通过转基因的方法转入水稻中以提高水稻的粒宽粒重。

再一方面，本发明提供了一种与水稻粒形粒重基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记为P2-1、P2-2、P2-3、P2-4、P2-5、P2-6、P2-7、2-8或P2-9；所述各分子标记对应的引物序列分别为：

P2-1：

F,5’-TCTGCTCGAAATTAAGTTCAC-3’

R,5’-ACGCTAATAGTTTTCTCACTTTTG-3’；

P2-2：

F,5’-GGCTGCTACTACTGTGCT-3’

R,5’-CATATGCGGAAAAAGGGAAG-3’；

P2-3：

F,5’-CGCAATACCGGATATCTCAA-3’

R,5’-TAAGTGCCACATGAGACAAA-3’；

P2-4：

F,5’-TATTACACATTTGTAGTTAC-3’

R,5’-TAAAACTAGCATGGTGGTCC-3’；

P2-5：

F,5’-ATGTGAATGTAGTGTTGTAT-3’

R,5’-GCTCACTTCGGTGGCAATCC-3’；

P2-6：

F,5’-AGGAATTTGACTTGTGGGTG-3’

R,5’-TAGTTTGGGCTGCATATGTT-3’；

P2-7：

F,5’-GTTGATCTTTTGCTTTTCTAGT-3’

R,5’-CTAGGTTGAAAAGGCTCACT-3’；

P2-8：

F,5’-CTTTCTGAAGCACAAATATGGT-3’

R,5’-AGTAAACAAGCAACAGAGGA-3’；

P2-9：

F,5’-CCGTTGATCGAATCATGGA-3’

R,5’-TGTCTCTTCGTATTTGGTGG-3’。

再一方面，本发明提供了上述与水稻粒形粒重基因紧密连锁的分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用，所述应用为辅助选择与水稻粒形粒重相关性状。

上述分子标记是在进行水稻粒形粒重基因定位克隆过程中得到的与其紧密连锁的分子标记，因此，可通过上述获得的分子标记进行分子标记辅助选择育种，如筛选、鉴定与水稻粒形粒重相关性状。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、TGW2基因的精细定位和候选基因确定：

利用粒宽和粒重上存在显著差异的亲本培矮64s与93-11(图1，图2)构建了大规模的重组自交系(RIL)群体。结合RIL核心群体的高密度SNP图谱，我们检测到水稻第2号染色体上新的控制稻谷粒宽和粒重的主效QTL——qGW2/qTGW2(图3)。利用培矮64s为轮回亲本的大规模BC₄F₂群体将该QTL进一步精细定位于两个酶切扩增长度多态性(CAPS)标记P2-4和P2-5之间约7.6kb的物理距离内(图4a)，其中只有1个开放阅读框(ORF)，编码产物与调控细胞数目的蛋白同源性高，暂命名为TGW2。DNA测序发现，亲本培矮64s和93-11的TGW25’非编码区2kb内存在6个单核苷酸多态(SNP)和3个***缺失(InDel)(图4b)。

二、TGW2基因的鉴定和功能分析：

通过转基因技术，结果表明本发明获得了粒宽和千粒重显著减小的转基因过表达日本晴水稻植株、转培矮64s的TGW25’非编码区驱动的TGW2基因的日本晴水稻植株以及粒宽和千粒重显著增加的基因敲除培矮64s株系(图5–图12)，证明了本发明正确克隆了TGW2基因。氨基酸序列分析表明TGW2编码调控细胞数目的蛋白，对培矮64s背景的TGW2基因为93-11类型的近等基因系NIL-TGW2^93-11和TGW2基因为培矮64s类型的近等基因系NIL-TGW2^培矮64s的孕穗期幼穗的组织细胞学观察发现，NIL-TGW2^93-11的颖壳横切面细胞数目较NIL-TGW2^培矮64s显著增多(图13，图14)；利用流式细胞仪对近等基因系的幼穗细胞倍性检测结果显示，NIL-TGW2^93-11中进入代表有丝***的S期和G2/M期的细胞数目比NIL-TGW2^培矮64s显著增多(图15)，粒宽和千粒重也显著增加(图16；图17)，证明该基因编码蛋白调控细胞数目。

本发明采用图位克隆技术利用水稻BC₄F₂群体首次在水稻中克隆到粒形粒重基因TGW2并通过转基因过表达实验、培矮64s的基因5’非编码区驱动的TGW2基因表达实验和基因敲除实验以及近等基因系鉴定了基因的功能。TGW2基因的克隆和应用，可有效调控水稻粒形粒重和产量，TGW2基因也可应用于其它单子叶植物中用于调控粒形粒重和产量。同时本发明有助于水稻粒形粒重调控机理的阐明，并为水稻高产育种奠定扎实的理论基础。

附图说明

图1是水稻品种培矮64s和93-11的粒形表型；其中a为培矮64s的籽粒，b为93-11的籽粒，c-1cm标尺；

图2是水稻品种培矮64s和93-11的粒宽和千粒重比较；平均值±标准差(n＝10)；

图3控制稻谷粒宽和粒重的主效QTL——qGW2/qTGW2在水稻染色体上的位置；

图4TGW2基因的精细定位图；其中竖线上方标注分子标记，竖线下方数字代表交换个体数，ATG和TAG分别表示TGW2基因的起始密码子和终止密码子；

图5pCAMBIA1300S-TGW2过表达载体图谱(a)和pCAMBIA1300S-pTGW2^培矮64s-TGW2表达载体图谱(b)；

图6是TGW2过表达T₀代转基因水稻的粒形表型；其中a为日本晴的籽粒，b为转TGW2过表达载体株系的籽粒，c为转培矮64s的TGW25’非编码区驱动的TGW2基因表达载体株系的籽粒，d-1cm标尺；

图7是日本晴和转TGW2过表达载体株系、转培矮64s的TGW25’非编码区驱动的TGW2基因表达载体株系的粒宽和千粒重比较；平均值±标准差(n＝10)；

图8是日本晴与转TGW2过表达载体株系、转培矮64s的TGW25’非编码区驱动的TGW2基因表达载体株系的TGW2转录水平的表达比较；平均值±标准差(n＝3)；

图9pCAS9-TGW2-f载体图谱；

图10培矮64s和2个基因敲除系的TGW2基因结构；

图11是TGW2基因敲除株系的粒形表型；其中a为培矮64s的籽粒，b为基因敲除株系-1的籽粒，c为基因敲除株系-2的籽粒，d-1cm标尺；

图12是培矮64s和TGW2基因敲除株系的粒宽和千粒重比较；平均值±标准差(n＝10)；

图13是近等基因系NIL-TGW2^培矮64s和NIL-TGW2^93-11的颖壳横切；a为NIL-TGW2^培矮64s，b为NIL-TGW2^93-11，c-50μm标尺，d-50μm标尺；

图14是近等基因系NIL-TGW2^培矮64s和NIL-TGW2^93-11的颖壳细胞数目比较；平均值±标准差(n＝10)；

图15是近等基因系NIL-TGW2^培矮64s和NIL-TGW2^93-11的处于细胞周期不同时期的颖壳细胞比例比较；平均值±标准差(n＝3)；

图16是近等基因系NIL-TGW2^培矮64s和NIL-TGW2^93-11的粒形表型；其中a为NIL-TGW2^培矮64s的籽粒，b为NIL-TGW2^93-11的籽粒，c-1cm标尺；

图17是近等基因系NIL-TGW2^培矮64s和NIL-TGW2^93-11的粒宽和千粒重比较；平均值±标准差(n＝10)；

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料

粳稻品种为(Oryza sativa L.japonica)“日本晴”，籼稻品种为(Oryza sativaL.indica)“93-11”和“培矮64s”，转TGW2基因过表达株系和TGW2基因敲除株系，培矮64s背景的TGW2基因替换为93-11类型的近等基因系NIL-TGW2^93-11和TGW2基因为培矮64s类型的近等基因系NIL-TGW2^培矮64s。

2、STS和CAPS标记精细定位TGW2基因

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取0.2g水稻叶片，液氮冷冻研磨成粉状，转移至1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中。每一PCR反应用2μl DNA样品。

TGW2基因的初定位：将培矮64s与93-11杂交，F₁代开始自交单粒传13代产生RIL群体。结合RIL核心群体的高密度SNP图谱，检测到水稻第2号染色体上新的控制稻谷粒宽和粒重的主效QTL——qTGW2，贡献率分别为11％和18％(图3)。

TGW2基因的精细定位：利用培矮64s为轮回亲本的大规模BC₄F₂群体，同时在目标区间根据培矮64s和93-11的参考序列设计引物，筛选出具有多态的引物(表1)，将该QTL进一步精细定位于两个CAPS标记P2-4和P2-5之间约7.6kb的物理距离内(图4a)。

3、基因预测和比较分析：

通过RGAP网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)分析，该区间内存在1个ORF，基因组测序发现，亲本培矮64s和93-11在该基因5’非编码区2kb内存在6个SNP和3个InDel(图4b)。因此，该ORF可能是该性状的候选基因。

表1精细定位发展的分子标记

*F：正向引物；R：反向引物。

实施例2：

植物转化和功能分析：

为了验证该ORF为候选基因，我们用PCR扩增93-11的cDNA从起始密码子ATG至终止密码子TAG共546bp的序列，然后将该序列连接到双元表达载体pCAMBIA1300s中(图5a)，然后用PCR扩增培矮64s的5’非编码区2kb替换35S启动子构建了培矮64s的TGW25’非编码区驱动的TGW2基因表达载体(图5b)。通过农杆菌介导的植物转化方法将此2个载体分别转入日本晴，各得到转基因植株10株，所有转基因过表达T₀代植株的表型均为粒宽和千粒重显著减小(图6，图7)，并且基因转录水平的表达量显著升高(图8)。由此说明，该ORF就是控制粒宽和粒重性状的候选基因TGW2。为了进一步验证此结果，我们利用此ORF的第1外显子上的序列构建了一个CRISPR/Cas9载体(图9)。载体构建按照Ma等的方法(Ma XL,Chen LT,ZhuQL,Chen YL,Liu YG.Rapid decoding of sequence-specific nuclease-inducedheterozygous and biallelic mutations by direct sequencing of PCRproducts.Molecular Plant,2015,8:1285–1287)，主要步骤如下：

(1)靶位点选择：在目标区段找到NGG上游的第20位碱基A，将该段序列作为靶序列；

(2)靶点接头制备：将接头引物(cas-F1：ggcaCGATGAACACCCCACGCAC；cas-R1：aaacGTGCGTGGGGTGTTCATCG；cas-F2：gccgGGCTGACGCGATGGTCCAC；cas-R2：aaacGTGGACCATCGCGTCAGCC)溶解至10uM，各取20ul在PCR仪上90℃放置30秒，室温冷却；

(3)gRNA载体酶切：取10ng的pYLgRNA-U3质粒，在10ul反应体系中用5U BsaI(NEB公司)酶切15分钟；

(4)gRNA表达盒连接反应：酶切后的pYLgRNA-U3质粒与靶点接头连接反应体系如下：

1μl T4DNA连接酶缓冲液

10ng pYLgRNA-U3载体

1ul靶接头

0.1μl T4DNA连接酶

加双蒸水至10ul，将上述连接混合物室温放入PCR仪中，PCR执行程序：37℃5分钟，20℃5分钟，5个循环；

(5)扩增gDNA表达盒：第一轮扩增，2ul连接产物作为模板、U-F和gRNA-R引物各0.2uM，用KOD-Plus酶扩增15ul PCR体系，按照以下PCR程序扩增：95℃1分钟；95℃10秒、60℃15秒、68℃20秒，10个循环；95℃10秒、60℃15秒、68℃30秒，20个循环；第二轮扩增，将第一轮PCR产物用双蒸水稀释100倍，取1ul为模板，用引物对B1’/BL扩增相应的U3-gRNA，KOD-Plus酶扩增50ul的PCR反应体系，PCR程序为：95℃1分钟；95℃10秒、60℃15秒、68℃20秒，25个循环；

(6)将扩增的U3-gRNA产物纯化后取70ng与10ng未酶切的pYLCRISPR/Cas9-MH/B质粒，在15ul反应体系中用10U BsaI于37℃酶切10分钟后加1.5ul DNA连接酶缓冲液和35U的T4DNA连接酶，然后在PCR仪中进行如下反应：37℃5分钟，10℃5分钟，20℃5分钟，15个循环；

(7)转化大肠杆菌，用通用引物SP1(Seq ID No：30)和SP2(Seq ID No：31)进行测序鉴定。

通过农杆菌介导转化日本晴的愈伤组织，共获得8株T₀代转基因植株。通过测序，有2个转基因植株发生纯合突变(基因敲除系-1和基因敲除系-2)，基因敲除系-1在第1外显子CDS序列的第107位和第134位各发生了1个碱基T的***，基因敲除系-2在第1外显子CDS序列的第107位和第134位各发生了1个碱基A的***，导致氨基酸移码，翻译提前终止(图10)，基因敲除植株表现出粒宽和千粒重显著增加的表型(图11，图12)。以上结果充分证明，粒宽和粒重的表型就是由TGW2基因突变引起的。

为了研究TGW2在调控细胞数目中所扮演的角色，我们对培矮64s背景的TGW2基因替换为93-11类型的近等基因系NIL-TGW2^93-11和TGW2基因为培矮64s类型的近等基因系NIL-TGW2^培矮64s的孕穗期幼穗颖壳进行石蜡切片和组织细胞学观察，发现NIL-TGW2^93-11的颖壳横切面细胞数目较NIL-TGW2^培矮64s显著增多(图13，图14)；利用流式细胞仪对近等基因系的幼穗细胞倍性检测结果显示，与NIL-TGW2^培矮64s相比，NIL-TGW2^93-11中进入代表有丝***的S期和G2/M期的细胞数目显著增多(图15)，粒宽和千粒重也显著增加(图16；图17)。由此可见，该基因编码蛋白调控了颖壳细胞数目而使粒宽增加。

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。有必要指出，本发明不局限于以上实施例，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种水稻粒形粒重相关基因、蛋白、分子标记及应用

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 877

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgtatccct ccgcccctcc cgacgcgtat aacaagtaca gcgccggtgc tccaccgacg 60

gcgccgccgc cggcaacgta ccagctgccg acgatgaaca ccccacgcac cggcgggggg 120

ctgacgcgat ggtccaccgg ccttttccac tgcatggacg atcccggaaa ctgtaagtcc 180

ttcagtcagt cagttttccc acatgttctt cagagttcag agttcagagc aatagatggt 240

tgccggccca tggttgctca atcacacctg tcgtttctct catgcaggtc tcatcacatg 300

cgtgtgcccc tgcatcacct ttgggcaggt cgctgacatc gtggacaagg gcacctgccg 360

tgagttctcc cttcttctcc ttcttaccag cgaaagattt tggtccattc accagcttgt 420

tcgttgattc ggtgcgtgtg aaactgtgat cgattttgca gcatgcctcg cgagcgggac 480

ggcttacgcg ctcctctgcg cgtcggggat ggggtgcctg tactcgtgct tctaccggtc 540

caagatgagg gctcagttcg acctggacga aggggattgc cccgatttcc tcgtccattt 600

ctgctgcgag tactgcgcgc tgtgccagga gtaccgggag ctcaagaacc gcggcttcga 660

cttggggatc ggtaggtgca agcactgaag cacagtagat tcttcgcttg caagcaagaa 720

atatcttcta ctagtactac ttttttgagg agcactcgaa ctgacgaata gtgttttctg 780

gtaaggttgg gctgccaatg tggacaggca gaggcgaggc gtcaccggag cgtcggtgat 840

gggagctcct ggcgtcccgg tcggcatgat gaggtag 900

<210> 2

<211> 546

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgtatccct ccgcccctcc cgacgcgtat aacaagtaca gcgccggtgc tccaccgacg 60

gcgccgccgc cggcaacgta ccagctgccg acgatgaaca ccccacgcac cggcgggggg 120

ctgacgcgat ggtccaccgg ccttttccac tgcatggacg atcccggaaa ctgtctcatc 180

acatgcgtgt gcccctgcat cacctttggg caggtcgctg acatcgtgga caagggcacc 240

tgcccatgcc tcgcgagcgg gacggcttac gcgctcctct gcgcgtcggg gatggggtgc 300

ctgtactcgt gcttctaccg gtccaagatg agggctcagt tcgacctgga cgaaggggat 360

tgccccgatt tcctcgtcca tttctgctgc gagtactgcg cgctgtgcca ggagtaccgg 420

gagctcaaga accgcggctt cgacttgggg atcggttggg ctgccaatgt ggacaggcag 480

aggcgaggcg tcaccggagc gtcggtgatg ggagctcctg gcgtcccggt cggcatgatg 540

aggtag 572

<210> 3

<211> 181

<212> PRT

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Tyr Pro Ser Ala Pro Pro Asp Ala Tyr Asn Lys Tyr Ser Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Pro Thr Ala Pro Pro Pro Ala Thr Tyr Gln Leu Pro Thr Met

20 25 30

Asn Thr Pro Arg Thr Gly Gly Gly Leu Thr Arg Trp Ser Thr Gly Leu

35 40 45

Phe His Cys Met Asp Asp Pro Gly Asn Cys Leu Ile Thr Cys Val Cys

50 55 60

Pro Cys Ile Thr Phe Gly Gln Val Ala Asp Ile Val Asp Lys Gly Thr

65 70 75 80

Cys Pro Cys Leu Ala Ser Gly Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Cys Ala Ser

85 90 95

Gly Met Gly Cys Leu Tyr Ser Cys Phe Tyr Arg Ser Lys Met Arg Ala

100 105 110

Gln Phe Asp Leu Asp Glu Gly Asp Cys Pro Asp Phe Leu Val His Phe

115 120 125

Cys Cys Glu Tyr Cys Ala Leu Cys Gln Glu Tyr Arg Glu Leu Lys Asn

130 135 140

Arg Gly Phe Asp Leu Gly Ile Gly Trp Ala Ala Asn Val Asp Arg Gln

145 150 155 160

Arg Arg Gly Val Thr Gly Ala Ser Val Met Gly Ala Pro Gly Val Pro

165 170 175

Val Gly Met Met Arg

180

<210> 4

<211> 2000

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa93-11)

<400> 4

cttcatttta agaagatatt attttagcca agccggttta aaataaacga atcaaattta 60

cttaaatgag tatgtacaca caaatttact tcaaaaactt tattgttggt tatagatctg 120

cataagttca ttattagctt ttcattaatg attctaactc tgggaagctt caacagtgat 180

tctggaatcc atccactcgg agggtagtct gtgtagtcgc tagctgtgtt gccacttttg 240

gggacttgtt aggagtgtag tgcggctcag ctccttcccg ttgtttggag ttttgcttta 300

accgccgtag tttttctaag cttcagtttt ttattttgct ttttcttctt tcccctggta 360

taggccggtc tagctgattg tgttgtgtaa ctgtaacttt ttttttaata tattgacgtg 420

taatcttttg cgtattcgtg agaaaagctt caacagttat gcattattta gtacgacttg 480

actcttgacc gaagacttgt gagaaactct ttgggtcctt cctaacagcc gtgtcaaata 540

aaatcgaacc gagctcaccg taccaaacga aataggagta ctagttgtca cttgtcagag 600

ctgaagaatt gaacaagaag ttgtcctaac aaatttaaat aaaaaaaact gccattggcc 660

aattatgact gtaagattac agtttgttta tatcacacat ttatactctc tctctctctc 720

tcttcaaagt tacgggtttg tcctaactca gttttttttt cgagtttaac taaattcata 780

ggaaaacgta gtaacctcta caataataaa ttagttacat taaatatacc atttaataca 840

ttttttgtat tatttttttg ggggggtaaa tatcattatg tttttatatt aacttagtca 900

atttttcttt ataataattt gacgaggaca aatccaaaac aacttaatag aatgtagtac 960

aaacacatag aaaggaaaag gaaaagagtt ggcttttaca aaagagccaa ctttatatat 1020

gttatatcta agtgagacta gttaaaatca agaaattaga ggaaaaatgg aaatggtaaa 1080

agtggataga atatttcaaa ccattcatgt aattatactc catccattct aaaatataaa 1140

aatctagtat cagattagac attttatagt acaacaaatc tgattaaggg tgtgtttagt 1200

tcacgttaaa attgaaagtt tgactgaaat tggaacgata tgacagaaaa gttagaagtt 1260

tgtgtgtaga aaagttttga tgtgatgaaa aagttgaaag tttaaagaaa atgttgggaa 1320

ctaaaccaag cctaagcttt ctttttagat tcgtagtatt ataaaatatc taatccgata 1380

gttttgggac ggatggatcg aatagatgat atgaacaatt gaatactacg atgcggatgc 1440

acagctgcaa acactgtaac gatcattttt ttttgtgcat gatgataatg ttattgtaac 1500

tgccgcaaca agctgcaccg aacatgttca cagtttatac tcgccccttt caaaatacat 1560

caatttatgg ttggacaaga catatgattt gttcagatcc atagtaacag aataagctgc 1620

aacgaaggta cgagtagtac tgtagttaac agttgcctta aaagtttaca agtgatatta 1680

ctccaacggc tagacaatga agtgtgaatg atgagtacgc cctatatgtg ctggccgctg 1740

aggtatacag tatatgggcc aacggccaca tgacgaaaat atttattgac ttgaattggt 1800

tcctacactt cataccaact tgttgcttca attatccagc tttggaaact cgctgtttgt 1860

ttcttggttc gattaataat gagcccgacg gttcgacgta ctggagctgg agaatccttt 1920

aaaggacaac aaggtaagga gaaccaggtc ttgccttccg ctttagcaga ggcataaaca 1980

aaagtctgta ttcccaagca 2080

<210> 5

<211> 2002

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa 培矮64s)

<400> 5

cttcatttta agaagatatt attttagcca agccggttta aaataaacga atcaaattta 60

cttaaatgag tatgtacaca caaatttact tcaaaaactt tattgttggt tatagatctg 120

cataagttca ttattagctt ttcattaatg attctaactc tgggaagctt caacagtgat 180

tctgaaatcc atccactcgg agggtagtct gtgtagtcgc tagctgtgtt gccacttttg 240

gggacttgtt aggagtgtag tgcggctcag ccccttcctg ttgtttggag ttttgcttta 300

accgccgtag tttttctaag cttcagtttt ttattttgct ttttcttctt tcccctggta 360

tagaccggtc tagctgattg tgttgtgtaa ctgtaacttt tttttctaat atattgacgt 420

gtaatctttt gcgtattcgt gagaaaagct tcaacagtta tgcattattt agtacgactt 480

gactcttgac cgaagacttg tgagaagctc tttgggtcct tcctaacagc cgtgtcaaat 540

aaaatcgaac cgagctcacc gtaccaaacg aaataggagt actagttgtc acttgtcaga 600

gctgaagaat tgaacaagaa gttgtcctaa caaatttaaa taaaaaaaac tgccattggc 660

caattatgac tgtaagatta cagtttgttt atatcacaca tttatactct ctctctctct 720

cttcaaagtt acgggtttgt cctaactcag tttttttttc gagtttaact aaattcatag 780

gaaaacgtag taacctctac aataataaat tagttacatt aaatatacca tttaatacat 840

tttttgtatt attttttttg ggggggggta aatatcatta tgtttttata ttaacttagt 900

caatttttct ttataataat ttgacgagga caaatccaaa acaacttaat agaatgtagt 960

acaaacacat agaaaggaaa aggaaaagag ttggctttta caaaagagcc aactttatat 1020

atgttatatc taagtgagac tagttaaaat caagaaatta gaggaaaaat ggaaatggta 1080

aaagtggata gaatatttca aaccattcat gtaattatac tccatccatt ctaaaatata 1140

aaaatctagt atcagattag acattttata gtacaacaaa tctgattaag ggtgtgttta 1200

gttcacgtta aaattgaaag tttgactgaa attggaacga tatgacagaa aagttagaag 1260

tttgtgtgta gaaaagtttt gatgtgatgg aaaagttgaa agtttaaaga aaatgttggg 1320

aactaaacca agcctaagct ttctttttag attcgtagta ttataaaata tctaatccga 1380

tagttttggg acggatggat cgaatagatg atatgaacaa ttgaatacta cgatgcggat 1440

gcacagctgc aaacactgta acgatcattt ttttttgtgc atgatgataa tgttattgta 1500

actgccgcaa caagctgcac cgaacatgtt cacagtttat actcgcccct ttcaaaatac 1560

atcaatttat ggttggacaa gacatatgat ttgttcagat ccatagtaac agaataagct 1620

gcaacgaagg tacgagtagt actgtagtta acagttgcct taaaagttta caagtgatat 1680

tactccaacg gctagacaat gaagtgtgaa tgatgagtac gccctatatg tgctggccgc 1740

tgaggtatac agtatatggg ccaacggcca catgacgaaa atatttattg acttgaattg 1800

gttcctacac ttcataccaa cttgttgctt caattatcca gctttggaaa ctcgctgttt 1860

gtttcttggt tcgattaata atgagcccga cggttcgacg tactggagct ggagaatcct 1920

ttaaaggaca acaaggtaag gagaaccagg tcttgccttc cgctttagca gaggcataaa 1980

caaaagtctg tattcccaag ca 2081

<210> 6

<211> 110

<212> PRT

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 6

Met Tyr Pro Ser Ala Pro Pro Asp Ala Tyr Asn Lys Tyr Ser Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Pro Thr Ala Pro Pro Pro Ala Thr Tyr Gln Leu Pro Thr Met

20 25 30

Asn Thr Pro Arg His Arg Arg Gly Ala Asp Ala Met Val Ser Pro Ala

35 40 45

Phe Ser Thr Ala Trp Thr Ile Pro Glu Thr Val Ser Ser His Ala Cys

50 55 60

Ala Pro Ala Ser Pro Leu Gly Arg Ser Leu Thr Ser Trp Thr Arg Ala

65 70 75 80

Pro Ala His Ala Ser Arg Ala Gly Arg Leu Thr Arg Ser Ser Ala Arg

85 90 95

Arg Gly Trp Gly Ala Cys Thr Arg Ala Ser Thr Gly Pro Arg

100 105 110

<210> 7

<211> 110

<212> PRT

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 7

Met Tyr Pro Ser Ala Pro Pro Asp Ala Tyr Asn Lys Tyr Ser Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Pro Thr Ala Pro Pro Pro Ala Thr Tyr Gln Leu Pro Thr Met

20 25 30

Asn Thr Pro Arg His Arg Arg Gly Ala Asp Ala Met Val Thr Pro Ala

35 40 45

Phe Ser Thr Ala Trp Thr Ile Pro Glu Thr Val Ser Ser His Ala Cys

50 55 60

Ala Pro Ala Ser Pro Leu Gly Arg Ser Leu Thr Ser Trp Thr Arg Ala

65 70 75 80

Pro Ala His Ala Ser Arg Ala Gly Arg Leu Thr Arg Ser Ser Ala Arg

85 90 95

Arg Gly Trp Gly Ala Cys Thr Arg Ala Ser Thr Gly Pro Arg

100 105 110

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tctgctcgaa attaagttca c 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

acgctaatag ttttctcact tttg 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ggctgctact actgtgct 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

catatgcgga aaaagggaag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cgcaataccg gatatctcaa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

taagtgccac atgagacaaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

tattacacat ttgtagttac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

taaaactagc atggtggtcc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

atgtgaatgt agtgttgtat 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

gctcacttcg gtggcaatcc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

aggaatttga cttgtgggtg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

tagtttgggc tgcatatgtt 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

gttgatcttt tgcttttcta gt 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

ctaggttgaa aaggctcact 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

ctttctgaag cacaaatatg gt 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

agtaaacaag caacagagga 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

ccgttgatcg aatcatgga 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

tgtctcttcg tatttggtgg 20

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

ggcacgatga acaccccacg cac 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

aaacgtgcgt ggggtgttca tcg 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

gccgggctga cgcgatggtc cac 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

aaacgtggac catcgcgtca gcc 23

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

aaaggatcca tgtatccctc cgcccctccc ga 32

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

aaaggatcct acctcatcat gccgaccggg acg 33

Claims

1.一种蛋白在调控植物粒形粒重中的应用，其特征在于，所述蛋白如(A)或(B)所示的序列：

(A)Seq ID No：3所示的氨基酸序列；

所述粒形为粒宽。

2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因在调控植物粒形粒重中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，编码所述蛋白的基因如(a)、(b)、(c)或(d)所示的序列：

(a)Seq ID No：1所示的基因组核苷酸序列；

(b)Seq ID No：2所示的cDNA核苷酸序列；

(c)在所述(a)序列前还包括5’非编码区DNA序列，所述5’非编码区DNA序列如Seq IDNo：5所示的的核苷酸序列；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述(a)序列前还包括5’非编码区DNA序列，所述5’非编码区DNA序列如Seq ID No：4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，通过基因敲除来提高水稻粒宽粒重；所述基因敲除载体为CRISPR/Cas9载体；所述用于敲除基因的靶标序列的靶点接头引物为：

cas-F1：ggcaCGATGAACACCCCACGCAC；

cas-R1：aaacGTGCGTGGGGTGTTCATCG；

或：

cas-F2：gccgGGCTGACGCGATGGTCCAC；

cas-R2：aaacGTGGACCATCGCGTCAGCC。

6.一种水稻粒形粒重突变基因编码的蛋白，其特征在于，如Seq ID No：6或Seq ID No：7所示的氨基酸序列。

7.一种编码权利要求6所述蛋白的水稻粒形粒重基因的突变基因，如(a)、(b)、(c)或(d)所示的序列：

(a)Seq ID No：1的第107位和第134位各***T的基因组核苷酸序列；

(b)Seq ID No：2的第107位和第134位各***T的cDNA核苷酸序列；

(c)Seq ID No：1的第107位和第134位各***A的基因组核苷酸序列；

(d)Seq ID No：2的第107位和第134位各***A的cDNA核苷酸序列。

8.一种权利要求6所述蛋白、权利要求7所述基因在调控植物粒形粒重中的应用，所述粒形为粒宽。

9.一种与水稻粒形粒重基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为P2-1、P2-2、P2-3、P2-4、P2-5、P2-6、P2-7、2-8或P2-9；所述各分子标记对应的引物序列分别为：

P2-1：

F,5’-TCTGCTCGAAATTAAGTTCAC-3’

R,5’-ACGCTAATAGTTTTCTCACTTTTG-3’；

P2-2：

F,5’-GGCTGCTACTACTGTGCT-3’

R,5’-CATATGCGGAAAAAGGGAAG-3’；

P2-3：

F,5’-CGCAATACCGGATATCTCAA-3’

R,5’-TAAGTGCCACATGAGACAAA-3’；

P2-4：

F,5’-TATTACACATTTGTAGTTAC-3’

R,5’-TAAAACTAGCATGGTGGTCC-3’；

P2-5：

F,5’-ATGTGAATGTAGTGTTGTAT-3’

R,5’-GCTCACTTCGGTGGCAATCC-3’；

P2-6：

F,5’-AGGAATTTGACTTGTGGGTG-3’

R,5’-TAGTTTGGGCTGCATATGTT-3’；

P2-7：

F,5’-GTTGATCTTTTGCTTTTCTAGT-3’

R,5’-CTAGGTTGAAAAGGCTCACT-3’；

P2-8：

F,5’-CTTTCTGAAGCACAAATATGGT-3’

R,5’-AGTAAACAAGCAACAGAGGA-3’；

P2-9：

F,5’-CCGTTGATCGAATCATGGA-3’

R,5’-TGTCTCTTCGTATTTGGTGG-3’。

10.权利要求9所述的与水稻粒形粒重基因紧密连锁的分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于，所述应用为辅助选择与植物粒形粒重相关性状。