CN105368767A - D-丙氨酸缺陷型筛选表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌1A751为出发菌株，敲除其染色体上D-丙氨酸消旋酶基因(<i>dal</i>)得到D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(<i>dal</i><i>^-</i>)；将来源于一种嗜热厌氧杆菌的纤维二糖-2-差向异构酶（CE酶）基因作亲本，在其上游融合P43启动子构建成P43-TsCE，将P43-TsCE构建至质粒pUB110中得pUB-P43-TsCE，将质粒pUB-P43-TsCE上的抗生素抗性基因卡那霉素和博来霉素用(<i>dal</i>)替代，构建成pUB-P43-TsCE-dal；将pUB-P43-TsCE-dal转化进宿主1A751(<i>dal</i><i>^-</i>)中，得一株表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其保藏编号CCTCC？NO：M？2015582。发酵液总酶活达7U/mL，具有重要的工业应用价值。

Description

D-丙氨酸缺陷型筛选表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，具体涉及一种CE酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

纤维二糖-2-差向异构酶（CE酶）可以催化多种醛糖C2位的差向异构化及异构化反应，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可合成多种碳水化合物。目前，CE酶能催化乳糖进行差向异构化反应生成依匹乳糖，利用单一底物乳糖生产依匹乳糖。

随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要的经济价值的当务之急。依匹乳糖最早是在杀菌后的乳糖溶液中发现的，它是乳糖的异构体。实验证明依匹乳糖不能被小鼠的肠酶消化，B.bifidum、B.longum、B.breve、B.adolescentis、B.catenulatum这些益生菌都能在含依匹乳糖的培养液中增值。证明依匹乳糖具有益生元效果。除此之外，依匹乳糖还能促进钙在小肠内的吸收，增加盲肠壁的重量，提升短链脂肪酸和其他有机酸的含量，降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量。由此可知依匹乳糖作为保健食品的原料具有很好的前景。

尽管依匹乳糖能够在高温高压下被化学方法合成，但这会产生很多副产物，因此该化学方法没有实际的应用价值。依匹乳糖还可以由p-硝基苯基半乳糖和甘露糖作为底物，经β-半乳糖苷酶催化合成，但该反应同样有β-1,3和β-1,6副产物出现，而且成本很高。所以用纤维二糖-2-差向异构酶催化得到依匹乳糖是目前生产依匹乳糖最可行的方法。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。Bacillussubtilis表达***没有明显的密码子偏好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯化等后续操作，并且遗传背景研究比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，可用于转化乳糖生成依匹乳糖，对依匹乳糖的食品生产具有重要的意义。

按照本发明提供的技术方案，一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌SK40.001(Bacillussubtilis)SK40.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2015582。

所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括敲除枯草芽孢杆菌1A751（MonikaWolf,AttilaGeczi,OrtwinSimon,RainerBorriss;Microbiology1995Vol.141No.2P281-290）染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )；将来源于嗜热厌氧杆菌(ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumJW/SL-YS485)（ShaoWL,DebloisS,WiegelJ;AppliedandEnvironmentalMicrobiology1995Vol.61NO.3P937-940）的纤维二糖-2-差向异构酶CE基因和P43启动子构建至质粒pUB110（KMKeggins,PSLovett,EJDuvall;PNAS1978Vol.75No.3P1423-1427）中得到pUB-P43-TsCE；用D-丙氨酸消旋酶基因dal代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记的可复制质粒pUB-P43-TsCE-dal；并转化枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )中表达，得1A751-pUB-P43-TsCE-dal，即获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌SK40.001，即CCTCCNO：M2015582。

所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，具体步骤为：

（1）在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal的上、下游各选取800-900bp长度的片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收；选取lox71-spc-lox66抗性基因片段作为筛选标记，将上、下游同源臂和lox71-spc-lox66片段通过融合PCR将三段基因连接在一起；将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1A751感受态中，在含有壮观霉素spc的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到D-丙氨酸缺陷型的宿主1A751(dal ^- )-spc；

（2）将pTSC(BacillusGeneticStockCenteraccessionno.ECE204)质粒导入上述宿主1A751(dal ^- )-spc中，在含有红霉素的平板上筛选，在IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的诱导下，表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，lox71和lox66位点发生重组，将spc抗性基因删除，并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )；

（3）在CE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子P43，并与CE酶基因组成表达单元P43-TsCE，然后构建至质粒pUB110中，得到质粒pUB-P43-TsCE；

（4）敲除质粒pUB-P43-TsCE上的抗生素抗性基因Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶基因dal构建至表达载体pUB-P43-TsCE中，得到质粒pUB-P43-TsCE-dal；

（5）将重组质粒pUB-P43-TsCE-dal转入宿主1A751(dal ^- )感受态中，在LB平板上筛选，从而获得重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-TsCE-dal，即SK40.001，即CCTCCNO：M2015582。

增强表达，在CE酶基因的上游添加P43启动子，P43启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1中1-300位所示。

所述质粒pUB-P43-TsCE-dal其中含有SEQIDNO.1中301-1476位所示的CE酶基因，和SEQIDNO.2所示的D-丙氨酸消旋酶基因dal，代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记。

一种枯草芽孢杆菌宿主1A751(dal ^- )，其为敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal以及所述的重组质粒pUB-P43-TsCE-dal转化的宿主。

所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的应用，用于在化学、食品及制药领域，具体用于生产依匹乳糖。

本发明的有益效果：本发明提供一株表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-TsCE-dal，可以乳糖为底物，生产依匹乳糖。该重组菌在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。

生物材料样品保藏：一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌SK40.001(Bacillussubtilis)SK40.001，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年9月28日，保藏编号为CCTCCNO：M2015582。

附图说明

图1：D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )的构建过程。

图2：食品级安全质粒pUB-P43-TsCE-dal构图。^aRep指代自主复制蛋白基因，利于增加基因拷贝数。

图3：重组枯草芽孢杆菌SK40.001发酵及酶活曲线。

具体实施方式

实施例1：D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )的构建

表1D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )的构建所用引物对

以质粒p7S6为模板，引物对P3/P4将lox71-spc-lox66抗生素抗性基因片段扩增并回收。

在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal两侧选择800-900bp长度的片段作为同源区域，将两端的同源区域分别用引物对P1/P2及P5/P6扩增并回收。

用引物对P1/P6将两端同源臂片段与抗生素lox71-spc-lox66通过PCR技术融合在一起。

PCR反应体系：0.2mLPCR管中按顺序加入以下试剂：上、下游引物（P1/P6）各1.5μL；5μLPhusionHFbuffer(5×)；2μL10mMdNTPmix(2.5mMeach)；2μL上游同源臂；0.5μLlox71-spc-lox66；2μL下游同源臂；0.5μLPhusionhigh-fidelityDNA聚合酶；加蒸馏水至终体积50μL。

PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸1min（30个循环）；72℃延伸10min。

将PCR产物转化至枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )感受态，在含有抗生素spc和D-丙氨酸的平板上进行筛选，得到一株1A751(dal ^- )-spc。

导入pTSC质粒（南京农业大学，闫新博士惠赠，NCBIaccessionno.EU864234），在IPTG的诱导下表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，lox71和lox66位点发生重组，抗性基因spc被删除（图1）。

最终获得D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )。

实施例2：食品级安全质粒pUB-P43-TsCE-dal的构建

表2食品级安全质粒pUB-P43-TsCE-dal的构建所需引物对

为增强表达，在CE酶基因的上游融合强启动子P43，构成P43-TsCE表达单元。利用引物对P7/P9扩增P43-TsCE片段。以pUB110(NCBI-GeneID：9507338)为出发载体，利用引物对P8/P10，扩增载体骨架pUB。然后将P43-TsCE和pUB片段进行PCR，形成多聚体。

PCR反应体系：0.2mLPCR管中按顺序加入以下试剂：5μLPhusionHFbuffer(5×)；2μL10mMdNTPmix(2.5mMeach)；2μLP43-TsCE；2μLpUB；0.5μLPhusionhigh-fidelityDNA聚合酶；加蒸馏水至终体积50μL。

PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸1min（30个循环）；72℃延伸10min。

将PCR所得形成的多聚体直接转化宿主1A751中，在含有Kan的平板上筛选，得到质粒pUB-P43-TsCE。

利用同样的方法，以枯草芽孢杆菌1A751染色体DNA为模板，引物对P13/P14扩增D-丙氨酸消旋酶基因(dal)。以质粒pUB-P43-TsCE为模板，引物对P11/P12扩增载体pUB-P43-TsCE（Kan^-,Blm^-）。将片段dal和pUB-P43-TsCE（Kan^-,Blm^-）相互PCR，转化宿主1A751(dal ^- )。在LB平板上筛选得到pUB-P43-TsCE-dal。（图2）。

实施例3：重组菌的发酵

1.CE酶活测定方法：1mL的反应体系中，加入800μL的用磷酸盐缓冲液（50mM，pH7.0）溶解的250mM乳糖，200μL的发酵液，65℃保温15min，然后加HCl至终浓度200mM以终止酶反应。

2.用HPLC检测依匹乳糖的生成量，计算酶活。酶活单位（U）：每分钟催化产生1μmol依匹乳糖所需要的酶的量。

3.用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37℃，200rpm，培养12~14h。以3%的接种量接种至发酵培养基中，37℃，200rpm，并定时取样，测定OD₆₀₀，酶活数据（图3）。

种子培养基：胰蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L)，NaCl(10g/L)，以双蒸水配制。

发酵培养基：葡萄糖(15g/L)，酵母膏(15g/L)，NaCl(8g/L)，MgSO₄(1g/L)，Na₂HPO₄(1g/L)，pH7.25，以双蒸水配制。

<210>SEQIDNO:1

<211>1476

<212>DNA

<213>质粒pUB-P43-TsCE-dal，1-300位为P43启动子，301-1476为CE酶基因

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<210>SEQIDNO:2

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<212>DNA

<213>D-丙氨酸消旋酶基因dal

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Claims (7)

1.一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌SK40.001(Bacillussubtilis)SK40.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2015582。

2.权利要求1所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )；将来源于嗜热厌氧杆菌(ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumJW/SL-YS485)的纤维二糖-2-差向异构酶CE基因和P43启动子构建至质粒pUB110中得到pUB-P43-TsCE；用D-丙氨酸消旋酶基因dal代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记的可复制质粒pUB-P43-TsCE-dal；并转化枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )中表达，得1A751-pUB-P43-TsCE-dal，即获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌SK40.001，即CCTCCNO：M2015582。

3.根据权利要求2所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于具体步骤为：

（1）在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal的上、下游各选取800-900bp长度的片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收；选取lox71-spc-lox66抗性基因片段作为筛选标记，将上、下游同源臂和lox71-spc-lox66片段通过融合PCR将三段基因连接在一起；将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1A751感受态中，在含有壮观霉素spc的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到D-丙氨酸缺陷型的宿主1A751(dal ^- )-spc；

（2）将pTSC质粒导入上述宿主1A751(dal ^- )-spc中，在含有红霉素的平板上筛选，在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，lox71和lox66位点发生重组，将spc抗性基因删除，并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal ^- )；

（3）在CE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子P43，并与CE酶基因组成表达单元P43-TsCE，然后构建至质粒pUB110中，得到质粒pUB-P43-TsCE；

（4）敲除质粒pUB-P43-TsCE上的抗生素抗性基因Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶基因dal构建至表达载体pUB-P43-TsCE中，得到质粒pUB-P43-TsCE-dal；

（5）将重组质粒pUB-P43-TsCE-dal转入宿主1A751(dal ^- )感受态中，在LB平板上筛选，从而获得重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-TsCE-dal，即SK40.001，即CCTCCNO：M2015582。

4.根据权利要求2或3所述的基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：增强表达，在CE酶基因的上游添加P43启动子，P43启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1中1-300位所示。

5.根据权利要求2或3所述的基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：所述质粒pUB-P43-TsCE-dal其中含有SEQIDNO.1中301-1476位所示的CE酶基因，和SEQIDNO.2所示的D-丙氨酸消旋酶基因dal，代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记。

6.一种枯草芽孢杆菌宿主1A751(dal ^- )，其特征在于其为敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal以及权利要求3所述的重组质粒pUB-P43-TsCE-dal转化的宿主。

7.权利要求1所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达纤维二糖-2-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：用于在化学、食品及制药领域，具体用于生产依匹乳糖。