CN110157749B - 应用枯草芽孢杆菌群体响应调控***合成mk-7的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了应用枯草芽孢杆菌群体响应调控***合成MK‑7的方法，属于遗传工程领域。本发明通过对磷酸激酶KinA截短突变，并用组成型启动子Pveg表达，使细胞能够在培养基营养丰富的情况下产生芽孢信号。应用本发明方法得到受Phr60‑Rap60群体响应调控的Spo0A***，通过对MK‑7合成途径的动态调控，实现了MK‑7的高效合成，不需要额外诱导剂，实现了目标产物高效合成与细胞生长之间的动态平衡。最终得到的枯草芽孢杆菌重组菌BS19、BS20摇瓶发酵生产MK‑7的产量分别高达170mg/L、360mg/L，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的17.89、37.89倍。

Description

应用枯草芽孢杆菌群体响应调控***合成MK-7的方法
技术领域
本发明涉及应用枯草芽孢杆菌群体响应调控***合成MK-7的方法，属于遗传工程领域。
背景技术
七烯甲萘醌(MK-7)是一类重要的脂溶性维生素，作为γ-谷氨酸羧化酶的辅因子，在调节钙的分配、促进骨骼发育逆转骨质疏松以及在保护血管，防止动脉粥样硬化和心血管疾病反应中起到重要作用。由于七烯甲萘醌对人体具有更好的亲和性和更长的半衰期，得到人们更多的关注。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)常被广泛用在食品酶制剂及重要营养化学品的生产中，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是高效合成MK-7的有效途径。然而，MK-7的合成途径十分复杂，导致重要前体磷酸烯醇式丙酮酸PEP大部分流向三羧酸TCA循环，而使得分支酸的合成受到限制，另外，异戊二烯焦磷酸也是细胞壁合成的重要物质，如果敲除则会抑制细胞的生长；MEP途径中间产物1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸酯(HMBPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)均对细胞有毒性。如何调整枯草芽孢杆菌代谢流供给，增加MK-7的合成是一个值得深入探讨的问题。
九州大学Hanai.T教授课题组采用来自费氏弧菌(Vibrio fischeri)的LuxR群体响应调控***，在大肠杆菌中实现了碳流从中心代谢途径到异丙醇途径的自动切换。麻省理工学院Prather.K教授课题组利用来自玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii)的Esa***，将EsaR的结合位点整合至大肠杆菌果糖磷酸激酶(pfkA)基因的启动子区，抑制了pfkA基因的转录，产物肌醇的产量提高了5.5倍。然而这些研究均使用异源的群体响应***进行调控，细胞代谢负担加重，***稳定性较弱，而若利用细胞自身的群体响应***对代谢网络进行动态调控，则不会对细胞的代谢造成额外负担。在七烯甲萘醌的研究中还未有使用群体响应动态调控的研究报道。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明构建了Phr60-Rap60-Spo0A的群体响应动态调控***，并改造Pspoiia和Pabrb启动子，获得受Spo0A-P调控转录活性不同的启动子库，并将获得的启动子动态调控七烯甲萘醌合成途径中关键基因HepS/T、ispH、pyk和uppS，最终得到的枯草芽孢杆菌重组菌BS19、BS20摇瓶发酵生产MK-7的产量分别高达170mg/L、360mg/L，分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的17.89、37.89倍，且重组菌BS20在发酵罐中发酵3天，MK-7的产量可达230mg/L。
本发明的第一个目的是提供一种应用枯草芽孢杆菌群体响应调控***合成MK-7的方法，所述方法包括在枯草芽孢杆菌的染色体上进行了如下改造：
(1)将组氨酸激酶KinA的基因进行截短突变并且进行了组成型表达，同时敲除组氨酸激酶KinB的基因；
(2)将含有Phag启动子的Rap60基因整合到染色体上，并在染色体上Rap60基因下游整合两个拷贝的信号分子Phr60的表达框；
(3)使用PabrB(cs-1)启动子替换丙酮酸激酶基因和十一碳烯基焦磷酸合成酶基因的启动子；所述PabrB(cs-1)启动子的序列如SEQ ID NO.14所示。
在一种实施方式中，步骤(1)中所述组氨酸激酶KinA的genebank ID为939230；所述截短突变是指敲除组氨酸激酶KinA基因的信号传导部分的PAS-A区域，敲除后的组氨酸激酶KinA基因kinA-ΔPAS-A的序列如SEQ ID NO.9所示；所述组氨酸激酶KinB的genebankID为937167。
在一种实施方式中，步骤(2)中所述Phag启动子序列如SEQ ID NO.16所示；所述转录因子Rap60的genebank ID为1115983；所述信号分子Phr60的表达框的序列如SEQ IDNO.17所示。
在一种实施方式中，步骤(3)中所述丙酮酸激酶基因pyk的genebank ID为936596；所述十一碳烯基焦磷酸合成酶基因uppS的genebank ID为939640。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrCPmena-menA::dacA，其是在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的基础上，用启动子P43替换menF、menB基因的天然启动子；用Phbs启动子替换menE基因的天然启动子；用含有P43启动子的entC基因替换dhbB基因；用Phbs启动子替换tkt基因的天然启动子；用含有P43启动子的ppsA基因整合到枯草芽孢杆菌染色体上，并敲除ptsG基因；将aroGfbr基因与启动子Phbs融合后整合到染色体上；利用P43启动子替换aroK基因的天然启动子；利用Phbs启动子替换ispA基因的天然启动子；利用P43启动子替换hepS/T基因的天然启动子；将kdpG基因与启动子Phbs融合后整合到染色体上；用P43启动子替换dxr基因、dxs基因、fni基因的天然启动子；在枯草芽孢杆菌基因组的ganA、thrC、dacA位点整合表达menA的开放阅读框，将最后得到的菌株命名为BS17。
在一种实施方式中，所述menF的genebank ID为937190；所述menB的genebank ID为937195；所述Phbs启动子的序列如SEQ ID NO.5所示；所述menE的genebank ID为937132；所述entC基因来源于E.coli K12，genebank ID为945511；所述dhbB的genebank ID为936582；所述tkt基因的genebank ID为937377；所述ppsA来源于E.coli K12，其genebankID为946209；所述ptsG的genebank ID为939255；所述aroGfbr基因的序列如SEQ ID NO.6所示；所述aroA的genebank ID为937853；所述aroK的genebank ID为938343；所述hepS/T，genebank ID为938998；所述kdpG的genebank ID为33073472；所述dxr的genebank ID为939636；所述dxs的genebank ID为938609；所述fni的genebank ID为938985；所述menA的开放阅读框的序列如SEQ ID NO.8所示；所述ganA的genebank ID为936313；所述thrC的genebank ID为936660；所述dacA的genebank ID为940000。
在一种实施方式中，所述方法还包括使用Pspoiia(cs-1,3)启动子表达七聚二烯丙基二磷酸合成酶基因和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶基因；所述Pspoiia(cs-1,3)启动子的序列如SEQ ID NO.12所示。
在一种实施方式中，所述七聚二烯丙基二磷酸合成酶基因HepS/T的genebank ID为938998；所述4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶基因ispH的genebank ID为937900。
本发明的第二个目的是提供一种生产七烯甲萘醌的重组菌，其特征在于，在枯草芽孢杆菌的染色体上进行了如下改造：
(1)将组氨酸激酶KinA的基因进行截短突变并且进行了组成型表达，同时敲除组氨酸激酶KinB的基因；
(2)将含有Phag启动子的Rap60基因整合到染色体上，并在染色体上Rap60基因下游整合两个拷贝的信号分子Phr60的表达框；
(3)使用PabrB(cs-1)启动子替换丙酮酸激酶基因和十一碳烯基焦磷酸合成酶基因的启动子；所述PabrB(cs-1)启动子的序列如SEQ ID NO.14所示。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS17的基础上还做了如下改造：将组氨酸激酶KinA的基因进行截短突变并且进行了组成型表达，敲除组氨酸激酶KinB的基因；将含有Phag启动子的Rap60基因整合到染色体上，并在染色体上Rap60基因下游整合两个拷贝的信号分子Phr60的表达框；最后构建得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrC Pmena-menA::dacA Pveg-kinA-ΔPAS-AΔkinB Phag-Rap60(Pnative-Phr60)2::hag，将其命名为BS18。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS18的基础上还做了如下改造：使用PabrB(cs-1)启动子替换丙酮酸激酶(pyk，genebank ID：936596)基因和十一碳烯基焦磷酸合成酶(uppS，genebank ID：939640)基因的启动子，最后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroKPhbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrC Pmena-menA::dacA Pveg-kinA-ΔPAS-AΔkinB Phag-Rap60(Pnative-Phr60)2::hagPabrB(cs-1)-pyk::pyk PabrB(cs-1)-uppS::uppS，将其命名为BS19。
在一种实施方式中，所述重组菌在BS19的基础上还做了如下改造：使用Pspoiia(cs-1,3)启动子表达七聚二烯丙基二磷酸合成酶(HepS/T，genebank ID：938998)基因和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(ispH，genebank ID：937900)基因，最后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fniPmena-menA::ganA Pmena-menA::thrC Pmena-menA::dacA Pveg-kinA-ΔPAS-AΔkinB Phag-Rap60(Pnative-Phr60)2::hag PabrB(cs-1)-pyk::pyk PabrB(cs-1)-uppS::uppS Pspoiia(cs-1,3)-ispH::ispH Pspoiia(cs-1,3)-HepS/T::HepS/T，将其命名为BS20。
本发明的第三个目的是提供一种生产七烯甲萘醌的方法，所述方法是应用所述的重组菌进行发酵生产。
本发明的有益效果：
(1)通过对磷酸激酶KinA截短突变，并用组成型启动子Pveg表达，使细胞能够在培养基营养丰富的情况下产生芽孢信号。
(2)应用本发明方法得到受Phr60-Rap60群体响应调控的Spo0A***，通过对MK-7合成途径的动态调控，实现了MK-7的高效合成。
(3)不需要额外诱导剂，实现了目标产物高效合成与细胞生长之间的动态平衡。
(4)应用本发明获得的菌株在添加蔗糖的情况下，MK-7的产量明显提高。
(5)最终得到的枯草芽孢杆菌重组菌BS19、BS20摇瓶发酵生产MK-7的产量分别为170mg/L、360mg/L，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的17.89、37.89倍。且重组菌BS20在发酵罐中发酵3天，MK-7的产量可达230mg/L。
生物材料
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168购自美国典型微生物保藏中心，保藏编号为ATCC No.27370。
表1菌株基因型
Figure BDA0002086871300000031
Figure BDA0002086871300000041
表2序列表
Figure BDA0002086871300000042
Figure BDA0002086871300000051
附图说明
图1：磷酸激酶KinA结构示意图与截短突变。
图2：信号分子Phr60-Rap60不同比例对Spo0A调控能力的影响；Pspoiia-GFP：菌株BS168-Pspoiia-GFP；Rap60：菌株BS17-2-Rap60-GFP；Phr60-Rap60：菌株BS17-2-Phr60-Rap60-GFP；2*Phr60-Rap60：菌株BS17-2-(Phr60)*2-Rap60-GFP。
图3：Spo0A结合位点个数与序列变化对启动子调控能力的变化。
图4：细胞浓度对Spo0A调控能力的影响。
图5：Phr60-Rap60-Spo0A动态调控MK-7合成途径。
图6：关键基因的转录水平。
图7：重组菌摇瓶发酵生产MK-7。
图8：重组菌发酵罐发酵生产MK-7。
具体实施方式
MK-7的萃取和HPLC检测：在发酵液中加入4倍体积异丙醇和正已烷混合物(1:2V/V)，涡旋振荡提取30min后，滤出提取液，8000r/min离心15min。收集上清液，此时MK-7溶解于该相中，置于-80℃冰箱中冷冻，使脂类物质结晶除去，收集滤液，HPLC检测MK-7的含量。
HPLC检测MK-7产量：采用Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18分离柱(5μm,250×4.6mm)，检测的温度在40℃，流动相使用甲醇：二氯甲烷(9:1，v/v)，流速为1mL/min，检测波长254nm，进样量10μL。
实施例1：重组菌BS17的构建
(1)重组菌BS1的构建
通过组成型启动子P43替换枯草芽孢杆菌染色体上menF的天然启动子来增强甲基萘醌异分支酸合成酶(menF，genebank ID：937190)基因的表达。使用无标记的遗传修饰策略，参见文章(Yan,X.,Yu,H.-J.,Hong,Q.,Li,S.P.,2008.Cre/lox system and PCR-basedgenome engineering in Bacillus subtilis.Appl Environ Microb.74,5556-5562)，具体构建过程如下：
(a)基因的克隆
①以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物menFup.FOR和menFup.REV扩增得到menF基因的上游同源臂序列menFup(序列如SEQ ID NO.1所示)。
②人工合成含有博莱霉素基因的lox71-zeo-lox66盒(序列如SEQ ID NO.2所示)。
③以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物P43.For和P43.Rev扩增得到P43启动子序列(序列如SEQ ID NO.3所示)。
④以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物menF.FOR和menF.REV扩增得到menF基因片段(序列如SEQ ID NO.4所示)。
(b)融合片段的获得
将步骤(a)中获得的四个片段menFup、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、menF基因片段进行重叠延伸PCR，PCR条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段menFup-lox71-zeo-lox66-P43-menF。
(c)同源重组
将步骤(b)中得到的融合片段转化到野生型菌株Bacillus subtilis 168感受态细胞中。由于融合片段中存在menF的上游序列与枯草芽孢杆菌168染色体上的menF的上游序列基因同源，融合片段中存在menF基因与枯草芽孢杆菌168染色体上的menF基因同源，通过同源重组，融合片段中的博来霉素抗性基因zeo和P43启动子替换枯草芽孢杆菌168染色体上menF基因天然启动子。具体步骤为：
①将步骤(b)中构建好的融合片段电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，融合片段添加量为100-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击时间5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL的博来霉素抗性的LB平板，37℃厌氧培养48h。博来霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌。
②挑选平板上长出的单菌落，利用引物BS1YZ.FOR和BS1YZ.REV进行菌落PCR验证，替换后扩增得到的片段长度为1350bp。并进行测序，测序正确的即为lox71-zeo-lox66-P43融合基因成功替换枯草芽孢杆菌168染色体上的menF基因天然启动子。最后通过Cre/lox重组***，敲除博来霉素抗性基因zeo，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF，将其命名为BS1。
表3引物序列表
Figure BDA0002086871300000061
(2)重组菌BS2的构建
在步骤(1)得到的菌株BS1的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌168染色体上二羟基萘甲酸合成酶(menB，genebank ID：937195)基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB，将其命名为BS2。
(3)重组菌BS3的构建
在步骤(2)得到的菌株BS2的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用Phbs启动子(序列如SEQ ID NO.5所示)替换枯草芽孢杆菌中O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶(menE，genebank ID：937132)基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE，将其命名为BS3。
(4)重组菌BS4的构建
在步骤(3)得到的菌株BS3的基础上，用含有P43启动子的来源于E.coli K12的异分支酸合酶(entC，genebank ID：945511)基因替换枯草芽孢杆菌染色体上的异分支酸(dhbB，genebank ID：936582)基因。具体构建过程如下：
(a)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到dhbB基因的上游同源臂序列dhbBup、dhbB下游同源臂序列dhbBdown、P43启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)；以E.coli K12基因组为模板，扩增得到entC基因序列，然后将五个片段dhbBup、lox71-zeo-lox66盒、P43启动子序列、entC基因序列、dhbBdown基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段dhbBup-lox71-zeo-lox66-P43-entC-dhbBdown。
(b)同源重组
将步骤(a)中得到的融合片段转化到BS3感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB，将其命名为BS4。
(5)重组菌BS5的构建
在步骤(4)得到的菌株BS4的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用Phbs启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上转酮酶(tkt，genebank ID：937377)基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbBPhbs-tkt，将其命名为BS5。
(6)重组菌BS6的构建
在步骤(5)得到的菌株BS5的基础上，将含有P43启动子的来源于E.coli K12的磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA，genebank ID：946209)基因整合到枯草芽孢杆菌染色体上的多糖脱乙酰酶C(yjeA，genebank ID：936440)基因和yjfA(genebank ID：939830)基因之间，并敲除染色体上的葡萄糖磷酸转运酶(ptsG，genebank ID：939255)基因。具体构建过程为：
(a)融合片段的获得
以E.coli K12基因组为模板，扩增得到ppsA基因，以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到yjeA基因和yjfA基因、P43启动子序列；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将五个片段yjeA、lox71-zeo-lox66盒、P43、ppsA、yjfA进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段yjeA-lox71-zeo-lox66-P43-ppsA-yjfA。
以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板分别扩增ptsG上游同源臂ptsGup和下游同源臂ptsGdown，将ptsGup、lox71-zeo-lox66、ptsGdown进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段ptsGup-lox71-zeo-lox66-ptsGdown。
(b)同源重组
将步骤(a)中得到的融合片段yjeA-lox71-zeo-lox66-P43-ppsA-yjfA和ptsGup-lox71-zeo-lox66-ptsGdown均转化到BS5感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG，将其命名为BS6。
(7)重组菌BS7的构建
在步骤(6)得到的菌株BS6的基础上，将人工合成的aroGfbr基因(序列如SEQ IDNO.6所示)与启动子Phbs(序列如SEQ ID NO.5所示)融合后整合到枯草芽孢杆菌染色体上应激蛋白(ytxj，genebank ID：937308)基因和3-脱氧-D-***糖-庚磺酸盐7-磷酸合成酶酶(aroA，genebank ID：937853)基因之间，具体构建过程为：
(a)融合片段的获得
人工合成aroGfbr基因(序列如SEQ ID NO.6所示)；以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到ytxj基因和aroA基因、Phbs启动子序列。然后将五个片段ytxj、lox71-zeo-lox66、Phbs、aroGfbr、aroA进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段ytxj-lox71-zeo-lox66-Phbs-aroGfbr-aroA。
(b)同源重组
将步骤(a)中得到的融合片段转化到BS6感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr，将其命名为BS7。
(8)重组菌BS8的构建
在步骤(7)得到的菌株BS7的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上莽草酸激酶(aroK，genebank ID：938343)基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbBPhbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK，将其命名为BS8。
(9)重组菌BS9的构建
在步骤(8)得到的菌株BS8的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用Phbs启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上法尼基二磷酸合酶(ispA，genebank ID：938652)基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbrP43-aroK Phbs-ispA，将其命名为BS9。
(10)重组菌BS10的构建
在步骤(9)得到的菌株BS9的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上七聚二烯丙基二磷酸合成酶(hepS/T，genebank ID：938998)基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menEP43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbrP43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T，将其命名为BS10。
(11)重组菌BS11的构建
在步骤(10)得到的菌株BS10的基础上，将来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)中的2-脱氢-3-脱氧-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(kdpG，genebank ID：33073472)基因与启动子Phbs融合后整合到枯草芽孢杆菌染色体上尿激酶(yclG，genebank ID：938292)基因和芽孢萌发响应蛋白(gerkA，genebank ID：938285)基因之间，具体构建过程为：
(a)融合片段的获得
以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)基因组为模板，合成kdpG基因；以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到yclG基因、Phbs启动子序列和gerkA基因；人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)。然后将五个片段yclG、lox71-zeo-lox66盒、Phbs启动子序列、kdpG、gerkA进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段yclG-lox71-zeo-lox66-Phbs-kdpG-gerkA
(b)同源重组
将步骤(a)中得到的融合片段转化到BS10感受态细胞中，然后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG，将其命名为BS11。
(12)重组菌BS12的构建
在步骤(11)得到的菌株BS11的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶酶(dxr，genebank ID：939636)基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr，将其命名为BS12。
(13)重组菌BS13的构建
在步骤(12)得到的菌株BS12的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌168中1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs，genebank ID：938609)基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menEP43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/TPhbs-kdpG P43-dxr P43-dxs，将其命名为BS13。
(14)重组菌BS14的构建
在步骤(13)得到的菌株BS13的基础上，采用与步骤(1)类似的方法，利用P43启动子替换枯草芽孢杆菌染色体上异戊烯焦磷酸异构酶酶(fni，genebank ID：938985)中基因的天然启动子，验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menEP43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/TPhbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni，将其命名为BS14。
(15)重组菌BS15的构建
在步骤(14)得到的菌株BS14的基础上，在枯草芽孢杆菌基因组ganA位点***menA的阅读框。ganA(genebank ID：936313)表达***半乳聚糖I型寡聚体外切水解酶。具体构建过程为：
(a)基因的克隆
①以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物mena-up::gana.FOR和mena-up::gana.rev扩增得到ganA基因的上游同源臂序列ganAup。
②人工合成含有博莱霉素基因的lox71-zeo-lox66盒(序列如SEQ ID NO.2所示)。
③以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组为模板，利用引物menA-orf.FOR和menA-orf.REV扩增1,4-二羟基-2-萘甲酸七戊烯基转移酶(menA)的开放阅读框，将扩增得到的基因片段进行琼脂糖凝胶检测大小为1537bp，切胶回收大小正确的片段，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.8的menA阅读框序列Pmena-menA。
④以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物menA-down::gana.FOR和mena-down:gana.rev扩增得到ganA基因的下游同源臂序列ganAdown。
(b)融合片段的获得
将步骤(a)中获得的四个片段ganAup、lox71-zeo-lox66盒、Pmena-menA、ganAdown基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段ganAup-lox71-zeo-lox66-Pmena-menA-ganAdown。
(c)同源重组
将步骤(b)中得到的融合片段转化到BS14感受态细胞中，并涂布于博来霉素抗性的LB平板，挑选平板上长出的单菌落，进行菌落PCR验证并进行测序。最后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA，将其命名为BS15。
表4引物序列表
Figure BDA0002086871300000091
(16)重组菌BS16的构建
在步骤(15)得到的菌株BS15的基础上，采用与步骤(15)类似的方法，在枯草芽孢杆菌基因组thrC位点***menA的阅读框。thrC(genebank ID：936660)翻译表达苏氨酸合成酶。验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrC，将其命名为BS16。
(17)重组菌BS17的构建
在步骤(16)得到的菌株BS16的基础上，采用与步骤(15)类似的方法，在枯草芽孢杆菌基因组dacA位点***menA的阅读框。dacA(genebank ID：940000)表达丙氨酸羧肽酶。验证正确后得到菌株Bacillus subtilis 168P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrC Pmena-menA::dacA，将其命名为BS17。
实施例2：组氨酸激酶KinA的截短突变以及利用组成型启动子表达
组氨酸激酶KinA、KinB只有在碳饥饿的情况下，自身才能磷酸化，然后使得DNA结合蛋白Spo0A磷酸化从而被激活，磷酸化的Spo0A与启动子结合，从而上调或下调相应的基因表达，发挥调控基因表达的能力。但是目的产物的高效合成，需要有效碳源的持续供应。因此，通过截短组氨酸激酶KinA，并利用组成型启动子Pveg表达截短的磷酸激酶KinA，截短PAS-A domain的突变方法如图1所示，使组氨酸磷酸激酶KinA能够持续的表达。
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到组氨酸激酶(kinA，genebankID：939230)的上游同源臂序列kinAup、截短后的组氨酸激酶基因片段kinA-ΔPAS-A(序列如SEQ ID NO.9所示)和Pveg启动子序列(序列如SEQ ID NO.10所示)，人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，然后将四个片段kinAup、lox71-zeo-lox66盒、Pveg启动子序列、kinA-ΔPAS-A基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段kinAup-lox71-zeo-lox66-Pveg-kinA-ΔPAS-A。
②同源重组
将步骤①中得到的融合片段转化到实施例1中得到的BS17感受态细胞中，并涂布于博来霉素抗性的LB平板，挑选平板上长出的单菌落，进行菌落PCR验证并进行测序。最后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，得到菌株Bacillus subtilis168,P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrC Pmena-menA::dacA Pveg-kinA-ΔPAS-A，将其命名为BS17-1。
实施例3：组氨酸激酶KinB的敲除
为了减少其他组氨酸磷酸激酶对调控***的影响，敲除另一个主要的磷酸激酶KinB(kinB，genebank ID：937167)，以保证调控***的单一性。在实施例2中得到的重组菌BS17-1的基础上，敲除枯草芽孢杆菌染色体上的磷酸激酶基因kinB。
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到kinBup、kinBdown、人工合成lox71-zeo-lox66盒序列，然后将三个片段kinBup、lox71-zeo-lox66盒、kinBdown进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段kinBup-lox71-zeo-lox66-kinBdown。
②同源重组
将步骤①中得到的融合片段转化到BS17-1受态细胞中，并涂布于博来霉素抗性的LB平板，挑选平板上长出的单菌落，进行菌落PCR验证并进行测序。最后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrC Pmena-menA::dacA Pveg-kinA-ΔPAS-AΔkinB，将其命名为BS17-2。
实施例4：Phr60-Rap60-Spo0A的群体响应动态调控***的构建
Spo0A的磷酸化水平受到了组氨酸激酶KinA的调控，在实施例3得到的菌株BS17-2中，将KinA进行了截短突变并且进行了组成型表达同时敲除了另一个主要的磷酸激酶KinB，这使Spo0A能够在营养丰富的情况下得到磷酸化修饰，从而发挥功能。但是，枯草芽孢杆菌中存在的Phr-Rap群体响应调控***仅仅能够控制Spo0A-P的磷酸化水平，并不能调控KinA的磷酸化程度，这使得KinA在细胞生长前期就具有了磷酸化的能力，这不利于七烯甲萘醌的动态调控合成，解决方式是KinA的磷酸化在细胞生长前期能够受到抑制，随着细胞的生长能够解除。据相关报道(DOI：10.1111/mmi.12939)Phr60-Rap60不仅能够抑制Spo0A的磷酸化水平，而且能够抑制KinA的磷酸化水平。所以在细胞中引入Phr60-Rap60群体响应***。并通过实验确定引入的Phr60和Rap60的比例关系，具体过程如下：
(1)重组载体pHT01-Pspoiia-GFP的构建
为了验证Phr60-Rap60对Spo0A-P磷酸化的影响，使用受Spo0A-P调控的Pspoiia启动子融合绿色荧光蛋白(GFP)，通过荧光值的变化表征Spo0A-P的调控能力。
①用引物Pspoiia.for和Pspoiia.rev扩增启动子Pspoiia(序列如SEQ ID NO.11所示)，利用引物GFP.for和GFP.rev扩增得到绿色荧光蛋白GFP基因(序列如SEQ ID NO.15)所示，通过Gibson多片段组装技术将俩个片段连接到pHT01质粒上，最终获得重组载体pHT01-Pspoiia-GFP。
表5引物序列表
Figure BDA0002086871300000111
(2)在实施例3得到的重组菌BS17-2的基础上，在枯草芽孢杆菌染色体上***异源转录因子Rap60(genebank ID：1115983)。
①融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到Rap60基因的上游同源臂序列Rap60up、Rap60基因片段和Phag启动子序列(序列如SEQ ID NO.16所示)，人工合成lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，然后将四个片段Rap60up、lox71-zeo-lox66盒、Phag启动子序列、Rap60基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段Rap60up-lox71-zeo-lox66-Phag-Rap60。
②同源重组
将步骤①中得到的融合片段转化到BS17-2感受态细胞中，并涂布于博来霉素抗性的LB平板，挑选平板上长出的单菌落，进行菌落PCR验证并进行测序。最后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr::lox72P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::lacA Pmena-menA::thrC Pmena-menA::dacA Pveg-kinA-ΔPAS-AΔkinB Phag-Rap60，将其命名为BS17-2-Rap60。
(3)在步骤(2)得到的重组菌BS17-2-Rap60的基础上，在枯草芽孢杆菌染色体Rap60基因下游，分别不***、***一个拷贝、***两个拷贝的信号分子Phr60的表达框(序列如SEQ ID NO.17所示)，Phr60的genebank ID为1115984，得到三株菌BS17-2-Rap60，BS17-2-Phr60-Rap60，BS17-2-(Phr60)*2-Rap60。
(4)将(1)中构建得到的重组质粒pHT01-Pspoiia-GFP分别转化野生型Bacillussubtilis 168和步骤(3)中得到的三株菌后，得到四株菌，分别命名为BS168-Pspoiia-GFP，BS17-2-Rap60-Pspoiia-GFP，BS17-2-Phr60-Rap60-Pspoiia-GFP，BS17-2-(Phr60)*2-Rap60-Pspoiia-GFP。
(5)GFP荧光值的测定
将步骤(4)中构建的4株菌使用LB培养基培养，每个小时使用96孔板通过酶标仪检测荧光值的变化，荧光蛋白激发波长：395nm，发射波长509nm。结果如图2所示，仅表达Rap60的菌株，荧光值很弱说明Spo0A不能激活启动子Pspoiia的表达，表达两个Phr60的细胞，荧光强度明显高于表达一个拷贝的细胞，说明信号分子浓度越高激活Spo0A磷酸化程度越高，越能够激活启动子的表达。因此，将菌株BS17-2-(Phr60)*2-Rap60作为接下来实验的出发菌株，将其命名为BS18，其基因型为Bacillus subtilis 168,P43-menF P43-menB Phbs-menEP43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/TPhbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrC Pmena-menA::dacAPveg-kinA-ΔPAS-AΔkinB Phag-Rap60(Pnative-Phr60)2::hag，用于后续的实验。
实施例5：Spo0A-P调控基因表达与细胞浓度之间的关系
由于本发明基于细胞浓度与基因表达强度之间的关系，为了确定细胞浓度对Spo0A-P的影响，检测构建好的群体响应Phr60-Rap60-Spo0A与细胞生长之间的关系，在pHT01质粒上使用Pspoiia和Pabrb启动子表达GFP蛋白，分别构建得到重组质粒pHT01-Pspoiia-GFP和pHT01-Pabrb-GFP，然后将重组质粒转入到实施例4中得到的菌株BS18中，检测随着细胞生长荧光值的变化，结果如图4，从图中可以看出当细胞生长到1.433左右时，启动子的转录能力受到Spo0A-P的调控。
实施例6：突变启动子的获得
(1)上调启动子的获得
为了获得受Phr60-Rap60调控能力不同的启动子，将受Spo0A-P上调的启动子Pspoiia(序列如SEQ ID NO.11所示)上的四个Spo0A结合位点分别进行突变，获得3个不同转录能力的启动子Pspoiia(cs-3)、Pspoiia(OA-3)、Pspoiia(cs-1，3)，将这些启动子融合GFP基因(序列如SEQ ID NO.15所示)，使用荧光值的变化表征不同启动子的转录能力。
结果表明：突变后的Pspoiia(cs-1，3)启动子(序列如SEQ ID NO.12所示)的转录能力比原始提高约7倍，因此将启动子Pspoiia(cs-1，3)，用于增强七烯甲萘醌合成途径中的关键基因表达。
(2)下调启动子的获得
将受Spo0A-P下调的启动子Pabrb(序列如SEQ ID NO.13所示)上的Spo0A-P结合位点进行保守序列突变，获得3个不同转录能力的启动子PabrB(OA-2)、PabrB(cs-1)、PabrB(cs-2)，并将这些启动子融合GFP基因(序列如SEQ ID NO.15所示)，使用荧光值的变化表征不同启动子的转录能力。
结果表明：如图3所示，PabrB(cs-1)(序列如SEQ ID NO.14所示)启动子的转录能力仅有原来的18％，因此将启动子PabrB(cs-1)，用于抑制七烯甲萘醌竞争途径关键基因的表达。
实施例7：重组菌BS19的构建
为了增加MK-7的合成，在重组菌BS18的基础上使用PabrB(cs-1)启动子原位替换丙酮酸激酶(pyk，genebank ID：936596)基因和十一碳烯基焦磷酸合成酶酶(uppS，genebankID：939640)基因的启动子获得重组菌株BS19，随着细胞的生长逐渐限制碳流量向竞争途径的流量。最终相关基因的转录水平如图6所示。具体构建过程如下：
(1)基因的克隆
①以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到pyk基因的上游同源臂序列pykup、pyk基因片段，人工合成PabrB(cs-1)启动子序列(序列如SEQ ID NO.14所示)、lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，然后将四个片段pykup、lox71-zeo-lox66盒、PabrB(cs-1)启动子序列、pyk基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段pykup-lox71-zeo-lox66-PabrB(cs-1)-pyk。
②以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到uppS基因的上游同源臂序列uppSup、uppS基因片段，人工合成PabrB(cs-1)启动子序列(序列如SEQ ID NO.14所示)、lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，然后将四个片段uppSup、lox71-zeo-lox66盒、PabrB(cs-1)启动子序列、uppS基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段uppSup-lox71-zeo-lox66-PabrB(cs-1)-uppS。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS18感受态细胞中，并涂布于博来霉素抗性的LB平板，挑选平板上长出的单菌落，进行菌落PCR验证并进行测序。最后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::lacA Pmena-menA::thrCPmena-menA::dacA Pveg-kinA-ΔPAS-AΔkinB Phag-Rap60(Pnative-Phr60)2::hag PabrB(cs-1)-pyk::pyk PabrB(cs-1)-uppS::uppS，将其命名为BS19。
实施例8：重组菌BS20的构建
采用与实施例7类似的方法，在实施例7得到的重组菌BS19的基础上使用实施例6中得到的Pspoiia(cs-1,3)启动子表达七聚二烯丙基二磷酸合成酶(HepS/T，genebank ID：938998)基因和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(ispH，genebank ID：937900)基因，获得重组菌株BS20，并随着细胞的生长，使碳通量流向MK-7的合成途径。最终相关基因的转录水平如图6所示。
(1)融合片段的获得
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到HepS/T基因的上游同源臂序列HepS/Tup、HepS/T基因片段、lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，然后将四个片段HepS/Tup、lox71-zeo-lox66盒、Pspoiia(cs-1,3)启动子序列、HepS/T基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段HepS/Tup-lox71-zeo-lox66-Pspoiia(cs-1,3)-HepS/T。
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，分别扩增得到ispH基因的上游同源臂序列ispHup、ispH基因片段，lox71-zeo-lox66盒序列(序列如SEQ ID NO.2所示)，然后将四个片段ispHup、lox71-zeo-lox66盒、Pspoiia(cs-1,3)启动子序列、ispH基因片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段ispHup-lox71-zeo-lox66-Pspoiia(cs-1,3)-ispH。
(2)同源重组
将步骤(1)中得到的融合片段转化到BS19感受态细胞中，并涂布于博来霉素抗性的LB平板，挑选平板上长出的单菌落，进行菌落PCR验证并进行测序。最后通过Cre/lox重组***，敲除菌株中博来霉素抗性基因zeo，最后得到菌株Bacillus subtilis 168,P43-menFP43-menB Phbs-menE P43-entCΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsAΔptsG Phbs-aroGfbr P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA::ganA Pmena-menA::thrCPmena-menA::dacA Pveg-kinA-ΔPAS-AΔkinB Phag-Rap60(Pnative-Phr60)2::hag PabrB(cs-1)-pyk::pyk PabrB(cs-1)-uppS::uppS Pspoiia(cs-1,3)-ispH::ispH Pspoiia(cs-1,3)-HepS/T::HepS/T，将其命名为BS20。
实施例9：菌株的发酵
种子培养基配方(质量百分比)：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％。
摇瓶发酵培养基配方(质量百分比)：大豆蛋白胨3-8％，葡萄糖3-8％，蔗糖3-8％，KH2PO30.06％。
发酵罐发酵培养基配方(质量百分比)：大豆蛋白胨3-8％，葡萄糖3-8％，蔗糖3-8％，KH2PO3 0.06％。
(1)种子液制备：
将实施例1、7、8中构建得到的重组菌BS1～BS17、BS19、BS20分别接种到种子培养基中，在37℃、220rpm下培养12h得到枯草芽孢杆菌种子液。
(2)摇瓶发酵培养
将步骤(1)中得到的种子液以5％的接种量转入250mL摇瓶中，装液量为15mL。发酵条件40℃，220rpm培养6天，发酵结果如图7所示，BS19在发酵6天之后产量达到170mg/L，BS20在发酵6天之后产量达到360mg/L，其MK-7产量是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的37.89倍。
(3)发酵培养
将步骤(1)中得到的种子液以15％的接种量转入发酵培养基，使用15-L发酵罐对重组菌株BS20进行发酵，发酵条件40℃，罐压0.05Mpa，通气量10vvm，搅拌500rpm，通过流加葡萄糖的方式控制葡萄糖的浓度在5g/L。发酵结果如图8所示，产量达到230mg/L，且发酵后期发酵液的pH偏碱。
表6重组菌株发酵生产MK-7
Figure BDA0002086871300000131
Figure BDA0002086871300000141
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 应用枯草芽孢杆菌群体响应调控***合成MK-7的方法
<160> 37
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 846
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 1
gcattcatcg tcatatcatc atagctgagc ggagggtttt ccatatcctg cggcgtttgt 60
gagttcccat atttttcgac atcctgatag gaatcctcac tgtcatatgg cgctctgatt 120
tcttcatcat catcaaattc aaattgcccg aatggtgttt cttcttcaat cggacggtct 180
ttggaaacca cgtcctgtga cgaatactcc gcgagggttg tggcagtcgg aagcgcttca 240
agtcgttcga aagggatttc ctttccgctg acttcacaaa tgccatacgt accgttttct 300
atcgccttca atgaatgctc aatgtcccga aggtgctctc tctcatgcaa gtctagagcg 360
atgtctttct cacgctcgta aagttctgtc gcctgatcgc cgggatggtt gtcgtatgcc 420
gaaagctcac cccacgaatc ataaggaaag gctgagttaa gctgaaaatg atcattgtct 480
ttgaaacggt ttaagatatc ttttttcgtt tgttccagtt cattttttaa atgctgaagc 540
tgttctttcg taagcaatgt gatcgcctcg tttctctgtg atgcatacct ttagtatgaa 600
cagatcgcct gagaactttc ataaatggcg ggtggaggaa tataggaggt tttcctttta 660
tggtaagcgg atacaacctt tgctatcagt ggagaaagaa atttaagctt tgtttctttt 720
tcatttctga aattaggttt ataataggta aggcaggcca tttggactgc atgatctgtg 780
tttgacacaa aggagacaca ggtgtatggt attaaaagca ttttaaggat tatggaggaa 840
tgtctc 846
<210> 2
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg 60
tacccgggga tcctctagag ataccgttcg tatagcatac attatacgaa gttatcttga 120
tatggctttt tatatgtgtt actctacata cagaaaggag gaactaaaca tggccaagtt 180
gaccagtgcc gttccggtgc tcaccgcgcg cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac 240
cgaccggctc gggttctccc gggacttcgt ggaggacgac ttcgccggtg tggtccggga 300
cgacgtgacc ctgttcatca gcgcggtcca ggaccaggtg gtgccggaca acaccctggc 360
ctgggtgtgg gtgcgcggcc tggacgagct gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac 420
gaacttccgg gacgcctccg ggccggccat gaccgagatc ggcgagcagc cgtgggggcg 480
ggagttcgcc ctgcgcgacc cggccggcaa ctgcgtgcac ttcgtggccg aggagcagga 540
ctgaataact tcgtatagca tacattatac gaacggtaaa tcgtcgac 588
<210> 3
<211> 300
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 3
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
<210> 4
<211> 847
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 4
atggtgacaa cggtgcagcg tacgttccga aaggaagttc tacatgcatt acataaagcc 60
aaagaagtca accatgctgt cttaataagc tattcgagac aaatcgagtc tcttgaccct 120
ctatcatttt tcaattacgg agcaaaaaaa tatacaggca atcgattttt ttggtcagat 180
cctgaaagtg aattgacaat agtcggtctt ggcaaagaag cggttttcca gacaaatcaa 240
aaaaacagcg agcggtatcg tgaggttttt gaacaatggg agcgctttaa aaagacggct 300
tttcatattt atgaagaaga aaagctgcag cattctgcag tgggacctgt gttattcgga 360
ggattttctt ttgacccttg cgaagaaaga ggttcacaat gggaccattt ctcggaaggg 420
gatttctttg tgcctgcgct tatgctgacg atgactgctg aaggcccgtt cttaacagtt 480
aacagatggg taagcggagg agaagacgca gaagctgttt tagaaggctt aaaagctttt 540
gcggcggaat ttatggttcc cgatttcaag caagaagatc aggctgtgat tgcagcagcc 600
gaagagctgg ataaggatga ttggctgaaa gcaatcgaaa cggccacaag ccaaattaaa 660
gagaaacaat atgataaggt tgttcttgcc cgagagctgc tgctcacgtt tgacggtcca 720
atccaaattg aaccggtgct taaaacgctt ctggacgatc agcagacaag ctatgttttt 780
gcaattgaac aagaaggcaa aacctttgtc ggcgcgtctc cggaaagact gatcaaaaga 840
gacggcg 847
<210> 5
<211> 328
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 5
cttaataatg gaaaaggatc aaggaatagg atgaaaaaag gaaaaaaagg aatattcgtt 60
cggtaaatca ccttaaatcc ttgacgagca agggattgac gctttaaaat gcttgatatg 120
gctttttata tgtgttactc tacatacaga aattcttcac tttgttggac aaacattcct 180
cagagtgcag tttttcttaa aaagccgttt aattgtcttt ctcttacttg ctctcatttt 240
tttctgagac aggtttagaa tcagactgaa ctgtgaagaa atgataataa acgaactgaa 300
tgtatccttt tgggaggagg tgaaaggc 328
<210> 6
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcaccctg caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 7
<211> 936
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 7
atgaaccaaa caaataaggg tgagggtcag acagcgccgc aaaaagaaag catggggcag 60
atcctttggc agttaacccg tcctcatacg ttaaccgcat cgtttgtgcc tgtgctgctc 120
ggaaccgttt tggcgatgtt ttatgtgaag gttgatctgc tgctgttttt ggctatgctg 180
ttttcttgcc tatggatcca gatcgcgacg aacttattta atgaatacta tgattttaaa 240
cgcggattag atacagcaga atcagtcgga atcggagggg ccattgtacg ccacggaatg 300
aagcctaaaa cgattttgca attagctctt gcctcatacg ggattgccat tttgctcggt 360
gtctatattt gtgccagcag cagctggtgg cttgcgctga tcggccttgt cggcatggcg 420
atcggctacc tgtatacagg cgggccgctg ccgattgcgt acacgccgtt cggtgaatta 480
ttctcaggca tttgcatggg ttcggtgttt gtgctgattt cgtttttcat tcagacagat 540
aagatcaata tgcagagcat tttgatttcc atcccgattg cgattcttgt cggcgcgatt 600
aacctgtcga acaacattcg tgatattgaa gaggacaaaa aaggcggacg caaaacattg 660
gcgattttga tggggcataa gggagctgtt actctgttag ctgcgtcgtt tgccgtcgct 720
tatatctggg ttgtcggctt ggttattacc ggtgccgcaa gcccatggct gtttgtcgtc 780
tttttgagcg tgcctaagcc ggttcaggca gtgaagggct tcgtccagaa cgaaatgccg 840
atgaatatga ttgtcgcaat gaaatcaaca gcccaaacaa atacattttt cggattcctg 900
ctctcgatcg gattattgat cagctatttc cgataa 936
<210> 8
<211> 1537
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 8
cttgacagcg ggtttttcat acagctgttt cattaattgc agcatatcaa aaattccctt 60
cccgtttttt cgacaatcac atgattattt gacgatcaga tgctcaaaaa gtttcatttt 120
ttccctaatc tccctcaaat taatatatcg gcgtatgttt ttgaaaatga atctttatac 180
ctgcaagggc aagaatggaa tgtttcgagc tgattcataa taaaggaaaa gatacctgga 240
gtcaaaagat ctttttaact tttaaaaagt gtaatgtact taaaaaaatt tttctgtacc 300
tgttcgttca agtgaaagca gaaacctaat gaaatcaggg cgagaagcgt ataataagaa 360
agaaaacgcc ttcttgcggt atcttgtgaa ataagggaga agtcattatg atagataagg 420
aagcaaaagg agttttttat taagctgccg gctgaaaaaa agtaagcctt ttaatagaaa 480
ggaagaggaa gatgaaccaa acaaataagg gtgagggtca gacagcgccg caaaaagaaa 540
gcatggggca gatcctttgg cagttaaccc gtcctcatac gttaaccgca tcgtttgtgc 600
ctgtgctgct cggaaccgtt ttggcgatgt tttatgtgaa ggttgatctg ctgctgtttt 660
tggctatgct gttttcttgc ctatggatcc agatcgcgac gaacttattt aatgaatact 720
atgattttaa acgcggatta gatacagcag aatcagtcgg aatcggaggg gccattgtac 780
gccacggaat gaagcctaaa acgattttgc aattagctct tgcctcatac gggattgcca 840
ttttgctcgg tgtctatatt tgtgccagca gcagctggtg gcttgcgctg atcggccttg 900
tcggcatggc gatcggctac ctgtatacag gcgggccgct gccgattgcg tacacgccgt 960
tcggtgaatt attctcaggc atttgcatgg gttcggtgtt tgtgctgatt tcgtttttca 1020
ttcagacaga taagatcaat atgcagagca ttttgatttc catcccgatt gcgattcttg 1080
tcggcgcgat taacctgtcg aacaacattc gtgatattga agaggacaaa aaaggcggac 1140
gcaaaacatt ggcgattttg atggggcata agggagctgt tactctgtta gctgcgtcgt 1200
ttgccgtcgc ttatatctgg gttgtcggct tggttattac cggtgccgca agcccatggc 1260
tgtttgtcgt ctttttgagc gtgcctaagc cggttcaggc agtgaagggc ttcgtccaga 1320
acgaaatgcc gatgaatatg attgtcgcaa tgaaatcaac agcccaaaca aatacatttt 1380
tcggattcct gctctcgatc ggattattga tcagctattt ccgataataa aaaagaccgc 1440
tcgtttcatg cggtcttttt ttgttacaat cgaccgcatt ttgtaaaaaa attcatagaa 1500
ccttgcagca gacagggacg tctagtacat ggacagc 1537
<210> 9
<211> 1490
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
tggaacagga tgaagaagaa acaggccatc aatccctaaa ctgcgaaaaa catgaaatcg 60
aacctgcaag cccggaatcg actacatata taacggatga ttatgaacgg ttggttgaaa 120
atctcccgag tccgctatgc atcagtgtca aaggcaagat cgtctatgta aacagcgcga 180
tgctttcaat gctgggagcc aaaagcaagg atgctattat tggtaaatcg tcctatgaat 240
ttattgaaga agaatatcat gatatcgtga aaaacaggat tatacgaatg caaaaaggaa 300
tggaagtcgg aatgattgaa cagacgtgga aaaggcttga tggcacacct gttcatttag 360
aagtgaaagc atccccgacc gtctacaaaa accagcaggc tgagctgctg ctgctgatcg 420
atatctcttc aaggaaaaaa ttccaaacca tcctgcaaaa aagccgtgaa cgatatcagc 480
tgctgattca aaattccatt gataccattg cggtgattca caatggaaaa tgggtattta 540
tgaatgaatc gggaatttcc ctgtttgaag cggctacata tgaggattta attggcaaaa 600
acatatacga tcagctgcat ccttgcgatc acgaggatgt aaaagagaga atccaaaaca 660
ttgccgagca aaaaacagaa tctgaaattg tcaagcaatc ctggttcacc tttcagaaca 720
gggtcatcta tacggagatg gtctgcattc cgacgacctt ttttggtgaa gcggccgtcc 780
aggtcattct tcgggacatc tcagagagaa aacaaacaga agaattgatg ctgaaatcgg 840
aaaaattatc aatcgcaggg cagctcgcgg cgggaatcgc ccatgagatc cgcaaccctc 900
ttacagcgat caaaggattt ttacagctga tgaaaccgac aatggaaggc aacgaacatt 960
actttgatat tgtgttttct gaactcagcc gtatcgaatt aatactcagt gaactgctca 1020
tgctggcgaa acctcagcaa aatgctgtca aagaatattt gaacttgaaa aaattaattg 1080
gtgaggtttc agccctgtta gaaacgcagg cgaatttaaa tggcattttt atcagaacaa 1140
gttatgaaaa agacagcatt tatataaacg gggatcaaaa ccaattaaag caggtattca 1200
ttaatttaat caaaaatgca gttgaatcaa tgcctgatgg gggaacagta gacattatca 1260
taaccgaaga tgagcattct gttcatgtta ctgtcaaaga cgaaggggaa ggtatacctg 1320
aaaaggtact aaaccggatt ggagagccat ttttaacaac aaaagaaaaa ggtacggggc 1380
ttggattaat ggtgacattt aatatcattg aaaaccatca gggagttata catgtggaca 1440
gccatcctga aaaaggcaca gcgtttaaaa tttcatttcc aaaaaaataa 1490
<210> 10
<211> 320
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 10
tatgggaagt gctccgtaat acgctgacaa gagagaaagg gcttggaggt attgaaacaa 60
gaggagttct gagaattggt atgccttata agtccaatta acagttgaaa acctgcatag 120
gagagctatg cgggtttttt attttacata atgatacata atttaccgaa acttgcggaa 180
cataattgag gaatcataga attttgtcaa aataatttta ttgacaacgt cttattaacg 240
ttgatataat ttaaatttta tttgacaaaa atgggctcgt gttgtacaat aaatgtagtg 300
aaaggaggtg aaatgtacac 320
<210> 11
<211> 574
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 11
ctggtgtaga cggcgtaaaa acaggctata caggcgaagc gaaatattgt ctgactgctt 60
cggctaaaaa aggaaacatg cgggccatag cggttgtatt cggagcgagc acgcctaaag 120
aaagaaacgc gcaagtgaca aaaatgcttg acttcgcctt tagccaatat gaaacgcatc 180
ctttatataa acgaaatcaa acagtagcaa aagtaaaggt caaaaaaggg aaacaaaaat 240
ttatcgaact cactacatct gagccgattt caatattgac gaaaaaaggc gaggatatga 300
acgatgtgaa aaaagaaatc aagatgaagg acaatattag tgctccgatt caaaaaggcc 360
aagagcttgg cactcttgtt ctgaaaaagg atggagaagt actcgctgaa agtcctgttg 420
ctgcaaaaga agatatgaag aaagccgggt ttatcacatt cttaaagcgg acgatgggag 480
actggacaaa atttaagtaa ttatgaccac tagtttgtga aggaattcat tcatcgaaac 540
actcattatc cgatcatatc aaggaggaat gagc 574
<210> 12
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ctggtgtaga cggcgtaaaa acaggctata caggcgaagc gaaatattgt ctgactgctt 60
cggctaaaaa aggaaacatg cgggccatag cggttgtatt cggagcgagc acgcctaaag 120
aaagaaacgc gcaagtgaca aaaatgcttg acttcgcctt tagccaatat gaaacgcatc 180
ctttatataa acgaaatcaa acagtagcaa aagtaaaggt caaaaaaggg aaacaaaaat 240
ttatcgaact cactacatct gagccgattt caatattgac gaaaaaaggc gaggatatga 300
acgatgtgaa aaaagaaatc aagatgaagg acaatattag tgctccgatt caaaaaggcc 360
aagagcttgg cactcttgtt ctgaaaaagg atggagaagt actcgctgaa agtcctgttg 420
ctgcaaaaga agatatgaag aaagccgggt ttatcacatt cttaaagcgg acgatgggag 480
actggacaaa atttaagtaa ttatttgtcg aaaatgacca ctagttttgt cacggtgaag 540
gaattcattc tttgtcgaaa aatcgaaaca ctcattatcc gatcatatca aggaggaatg 600
agc 603
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<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 13
catctcctgc gactgtcgta tatgcatggc cgatatgtaa ttttccgctc ggataataaa 60
tcggtgttgt aatgtaaaat gtattgtttt cttgcggcat cttgaaacct cctaatcaga 120
atgtcaaaaa gctcccgccc aaaggacgag agcggcgata agtgcaaatc atatatgaat 180
attatttata tttatccttt atctatgata ccatcttagc ctttaagatc aagaatatat 240
acatacgccc tgaaaaagaa taattaaaat taaaaatctt taatgaaaat aaaaaaagtc 300
tgttcgtgtc gaattttgtc gtatataatc aaatgaaata aaaaactttg gttcgaaagt 360
cttgatttaa aaggattttt agtaggataa tagctttatt aaatatttat aaaatgctgt 420
tatttcggta gtttccaaga cattactgac tataagaact aattcttaca atcaatagta 480
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<212> DNA
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catctcctgc gactgtcgta tatgcatggc cgatatgtaa ttttccgctc ggataataaa 60
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tatttcggta gtttccaaga cattactgac tataagaact aattcttaca atcaatagta 480
aacaaaatga ttgacgatta ttggaaacct tgttatgcta tgaaggtaag gattttttgt 540
cgaaaataat ttgtcgaaag aaaaatataa tttaaacaaa taagtatctc ttgggaggag 600
a 601
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
atgggtaagg gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaagctgc ctgttccttg gccaacactt 180
gtcactactc ttacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240
cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggagaggac catcttcttc 300
aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga caccctcgtc 360
aacagaatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag 420
ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactgta caaataa 717
<210> 16
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
aactgctgaa cttttggata tcgataatat tcaagacgta gaagtcatga caatattgac 60
tatggcagag ccatttgaaa agtctactgc gaatttattg gctcccatta ttgtgaatcg 120
caagaacatg atggctaagc aagtcgtttt acacgactcc tcatatacga caaagcatcc 180
gattggagga gaatcatgct agttttatcg cggaaaataa acgaagcgat tcaaataggt 240
gctgatattg aagtaaaagt gattgcggtt gaaggggatc aagtgaagct tggaattgac 300
gccccaaagc atattgatat tcacaggaaa gaaatttact tgaccattca ggaagaaaat 360
aaccgtgcag cagcgttatc cagcgatgtg atctccgcat tatcctcaca aaaaaagtga 420
ggattttttt atttttgtat taacaaaatc agagacaatc cgatattaat gatgtagccg 480
ggaggaggcg caaaagactc agccagttac aaaataaggg cacaaggacg tgccttaaca 540
acatattcag ggaggaacaa aaca 564
<210> 17
<211> 396
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 17
gctttttcgg aaaagcaatg gaacaggcgg aagaatttaa cgattctctg tttcaagatc 60
tgcttaacgt tctgaaagcc ctgtttatcg aaacaggctc aagacagaaa gtgatgaacg 120
ctcttgaagc cttacgcaca ggccaaggat acccgtactt tgaagaactt gcactgatcg 180
ctgccgaatt ttatacaatg gataaacgca tggaagattc aatctacttt tacaacgaaa 240
tggtttgtgc gcaaagacag atccaacgcg gagattttct gtatgaagtt taaaggctta 300
ttttctgctg tcctgattgt ttcactgctt gtgggcgcag gatactcatt tgttcatcat 360
gatgaagttt cagtggcaag cagaaatgcg acataa 396
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
gcattcatcg tcatatcatc atagctgagc 30
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
tgtgaaattg ttatccgctc gagacattcc tccataatcc ttaaaatgct tttaatacc 59
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
tgataggtgg tatgttttcg cttgaac 27
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
gtgtacattc ctctcttacc tataatgg 28
<210> 22
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
tttaaggatt atggaggaat gtctcgagcg gataacaatt tcacacagga aac 53
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
aatcatacct accacaatat catgctcaag 30
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
ttccatatcc tgcggcgttt gt 22
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
acgaagttat tcagtcctgc tcctc 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
cttgacagcg ggtttttcat acagc 25
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
gctgtccatg tactagacgt ccc 23
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
actggcttgg acggtggtt 19
<210> 29
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
gtatgaaaaa cccgctgtca agtcctcctt gttctcttag cccttcg 47
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
ctgggaaaac cctggcggct gatgctccgc tcgatatgg 39
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
cgccaatcgc tgacctgaag 20
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
ctggtgtaga cggcgtaaaa acag 24
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
gctcattcct ccttgatatg atcggataat ga 32
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
tatcaaggag gaatgagcat gggtaaggga gaagaacttt t 41
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
ccaagcttct gcagttattt gtacagttca tccatgccat gt 42
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
ctgtacaaat aactgcagaa gcttggcgta atcatg 36
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
gccgtctaca ccagttgctc aaaaaaatct cggtcagatg ttac 44

Claims (10)

1.一种应用枯草芽孢杆菌群体响应调控***合成MK-7的方法，其特征在于，在枯草芽孢杆菌的染色体上进行了如下改造：
(1)将组氨酸激酶KinA的基因进行截短突变并且进行了组成型表达，同时敲除组氨酸激酶KinB的基因；所述截短突变是指敲除组氨酸激酶KinA基因的信号传导部分的PAS-A区域，敲除后的组氨酸激酶KinA基因kinA-ΔPAS-A的序列如SEQ ID NO.9所示；
(2)将含有Phag启动子的Rap60基因整合到染色体上，并在染色体上Rap60基因下游整合两个拷贝的信号分子Phr60的表达框；
(3)使用PabrB(cs-1)启动子替换丙酮酸激酶基因和十一碳烯基焦磷酸合成酶基因的启动子；所述PabrB(cs-1)启动子的序列如SEQ ID NO.14所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述组氨酸激酶KinA的genebank ID为939230；所述组氨酸激酶KinB的genebank ID为937167。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述Phag启动子序列如SEQ IDNO.16所示；所述转录因子Rap60的genebank ID为1115983；所述信号分子Phr60的表达框的序列如SEQ ID NO.17所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述丙酮酸激酶基因pyk的genebank ID为936596；所述十一碳烯基焦磷酸合成酶基因uppS的genebank ID为939640。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用Pspoiia(cs-1,3)启动子表达七聚二烯丙基二磷酸合成酶基因和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶基因；所述Pspoiia(cs-1,3)启动子的序列如SEQ ID NO.12所示。
6.一种生产七烯甲萘醌的重组菌，其特征在于，在枯草芽孢杆菌的染色体上进行了如下改造：
(1)将组氨酸激酶KinA的基因进行截短突变并且进行了组成型表达，同时敲除组氨酸激酶KinB的基因；所述截短突变是指敲除组氨酸激酶KinA基因的信号传导部分的PAS-A区域，敲除后的组氨酸激酶KinA基因kinA-ΔPAS-A的序列如SEQ ID NO.9所示；
(2)将含有Phag启动子的Rap60基因整合到染色体上，并在染色体上Rap60基因下游整合两个拷贝的信号分子Phr60的表达框；
(3)使用PabrB(cs-1)启动子替换丙酮酸激酶基因和十一碳烯基焦磷酸合成酶基因的启动子；所述PabrB(cs-1)启动子的序列如SEQ ID NO.14所示。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，步骤(1)中所述组氨酸激酶KinA的genebank ID为939230；所述组氨酸激酶KinB的genebank ID为937167。
8.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，步骤(2)中所述Phag启动子序列如SEQ IDNO.16所示；所述转录因子Rap60的genebank ID为1115983；所述信号分子Phr60的表达框的序列如SEQ ID NO.17所示。
9.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，步骤(3)中所述丙酮酸激酶基因pyk的genebank ID为936596；所述十一碳烯基焦磷酸合成酶基因uppS的genebank ID为939640。
10.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求6的基础上做了如下改造：使用Pspoiia(cs-1,3)启动子表达七聚二烯丙基二磷酸合成酶基因和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶基因；所述Pspoiia(cs-1,3)启动子的序列如SEQ ID NO.12所示。
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