CN114317384A - 生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。所述重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL‑fcoA2、164FL‑fcoA1;所述重组枯草芽孢杆菌164FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码果糖6‑磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖‑1‑磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段,以及在xylA‑xylB位点整合编码GDP‑甘露糖脱水酶、GDP‑L‑岩藻糖合成酶、α‑1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得;所述重组枯草芽孢杆菌164FL‑fcoA2通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得;所述重组枯草芽孢杆菌164FL‑fcoA1通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得。本发明的重组枯草芽孢杆菌能够利用比较廉价的碳源高产量生产2’‑FL。
Description
技术领域
本发明属于枯草芽孢杆菌重组菌株构建技术领域,具体涉及一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。
背景技术
母乳对于婴幼儿的生长发育和健康至关重要,而母乳中的母乳寡糖(human milkoligosaccharides,HMOs)在其中起到关键的作用,它们的生理功能包括抑制病原菌生长,促进益生菌生长,促进婴幼儿免疫***的发育,促进婴幼儿大脑发育,保护呼吸***及泌尿***,预防过敏性疾病,等等。2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)是其中含量最为丰富的一种三糖分子,可用于添加到母乳替代品中缩小其与母乳的功能差距,兼具医学和营养学价值。
2’-FL可以通过在人乳中分离出来,也可以通过化学手段合成,但这两种方法成本较高。近年来有文献报道可以通过代谢工程和发酵工程技术,利用微生物生产2’-FL,极具工业化的潜力。在生物体内,2’-FL可以以GDP-L-岩藻糖和乳糖为底物,在α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fucosyltransferase)的催化下合成。所以,代谢工程的工作集中在构建或优化GDP-L-岩藻糖的合成途径,乳糖转运途径的优化及消耗途径的敲除,以及筛选表达特异高效的α1,2-岩藻糖基转移酶基因。其中,在微生物体内GDP-L-岩藻糖的合成可以通过两种途径实现,一种是从头合成途径,主要包括果糖-6-磷酸经由5个酶促反应催化生成GDP-L-岩藻糖,这个途径在培养基中添加廉价的碳源,如甘油、葡萄糖等。另一种是补救合成途径,可以由岩藻糖经2个酶促反应催化生成GDP-L-岩藻糖,这个途径需要往培养基中添加相对昂贵的岩藻糖作为底物。
目前,在大肠杆菌、酿酒酵母和谷氨酸棒状杆菌中已成功实现2’-FL的合成。作为GRAS(Generally Regarded As Safe)菌种,枯草芽孢杆菌不产致热源、内毒素,无毒副作用,可以减轻后续的分离纯化成本,天然适合用来表达生产人乳寡糖。目前还没有实现利用枯草芽孢杆菌进行2’-FL从头合成的技术或报道。
发明内容
本发明的目的是,提供一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用;提供一种利用枯草芽孢杆菌进行2’-FL从头合成的技术方案。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下:
生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌为:重组枯草芽孢杆菌164FL、重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2、重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1;
所述重组枯草芽孢杆菌164FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段,以及在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得;
所述重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得;
所述重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得。
作为优选实施方案,所述编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO:1所示的序列,或者是与SEQ ID NO:1具有85%以上同源性且具有相同功能的序列;所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO:2所示的序列,或者是与SEQ IDNO:2具有85%以上同源性且具有相同功能的序列。
作为优选实施方案,所述在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合的编码乳糖渗透酶的基因片段是SEQ ID NO:3所示的序列或者与SEQ ID NO:3具有85%以上同源性且具有相同功能的序列;在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合的编码乳糖渗透酶的基因片段是SEQ ID NO:4所示的序列或者与SEQ ID NO:4具有85%以上同源性且具有相同功能的序列。
作为优选实施方案,所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC 6051a。
本发明还提供生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,包括如下步骤:
步骤1,在枯草芽孢杆菌的基因组manA位点整合编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因序列;消除抗性基因后,在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的基因序列,得到重组枯草芽孢杆菌164FL;
步骤2,将编码大肠杆菌BL21乳糖渗透酶的lacY基因整合到重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点上,得到重组枯草芽孢杆菌为164FL-fcoA2;
步骤3,将编码大肠杆菌BL21乳糖渗透酶的lacY基因整合到重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点上,得到重组枯草芽孢杆菌为164FL-fcoA1。
作为优选实施方案,所述步骤1中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC6051a;所述编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因序列如SEQ ID NO:1所示,所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
作为优选实施方案,所述步骤2中编码乳糖渗透酶的lacY基因序列如SEQ ID NO:3所示;所述步骤3中编码乳糖渗透酶的lacY基因序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了所述生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用,使用所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖。
作为优选实施方案,所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖的碳源选自甘油、葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜或果糖。
作为优选实施方案,所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖的培养基中包含18-22g/L的乳糖和24-26g/L的甘油。
与现有的技术相比,本发明的有益效果为:
1,本发明技术方案通过培养重组枯草芽孢杆菌,利用比较廉价的碳源生产2’-FL,能够减轻后续的分离纯化成本。
2,在摇瓶发酵实验中,2’-FL发酵产量达到5.5g/L,补料发酵2’-FL产量达到27.8g/L。该技术在人乳寡糖的生产、食品药物开发等方面具有非常好的应用前景。
3,与国外2’-FL的主流生产菌株大肠杆菌相比,本发明的生产菌株枯草芽孢杆菌为食品安全菌株,产品不会受内毒素污染,更适合奶粉配方原料的生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中重组枯草芽孢杆菌164FL的构建示意图。
图2为本发明实施例4中重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1摇瓶发酵生产2’-FL的结果示意图。
图3为本发明实施例4中重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1补料发酵生产2’-FL时产物随时间变化的结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。实施例中未注明具体条件的操作,按照常规条件或制造商建议的条件进行。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明,均为商业化产品。
以下各实施例中使用的生物材料来源如下:
枯草芽孢杆菌ATCC 6051a为美国模式培养物收藏库(American type culturecollection)的模式菌株,6051a为其收藏号,可从美国ATCC保藏中心购买获得。
大肠杆菌BL21(DE3)为常用大肠杆菌实验菌株,可直接购买获得。
pUC57-futC为生工生物工程(上海)股份有限公司合成的futC片段连接在pUC57载体上。
各实施例中使用的2×Phanta Master Mix(货号P511-01)购自南京诺唯赞生物科技有限公司;限制性内切酶QuickCutTM Dpn I(货号1609)购自TaKaRa;红霉素(货号E808819)、氯霉素(货号C804169)和D-木糖(货号D856756)购自上海麦克林生化科技有限公司,2’-FL标准品购自上海惠诚生物科技有限公司。
实施例中的缩写符号说明:
manA:果糖6-磷酸异构酶
manB:磷酸甘露糖变位酶
manC:甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶
gmd:GDP-甘露糖脱水酶
wcaG:GDP-L-岩藻糖合成酶
futC:α-1,2岩藻糖基转移酶
实施例1:重组枯草芽孢杆菌164FL的构建
重组枯草芽孢杆菌164FL是在枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组上整合了两段DNA序列,即在manA位点整合了manA-manB-manC cassette(SEQ ID NO:1),消除红霉素抗性基因后,在xylA-xylB位点整合了gmd-wcaG-futC cassette(SEQ ID NO:2),参见图1,为重组枯草芽孢杆菌164FL的构建示意图。重组枯草芽孢杆菌164FL的具体构建方法如下:
首先制备线性DNA片断manA-manB-manC,由6个片段经过融合PCR获得,这6个片段分别是U-manA、ermC、t7m、manB、manC和D-manA。以枯草芽孢杆菌ATCC 6061a基因组为模板,扩增U-manA和D-manA;以大肠杆菌BL21(DE3)为模板,扩增manB和manC;以合成的抗性基因DNA片断ermC为模板,扩增ermC;以通过的大肠杆菌表达质粒pET28a为模板,扩增t7m。其中,扩增U-manA的F端引物序列(SEQ ID NO:5):5’-GCGACGTTTTTGAAAAAGAAAATTCAG-3’;扩增U-manA的R端引物序列(SEQ ID NO:6):5’-CCTGCTTCTTTTTAGGATCCAGGAAAATCCCCCGCTTTATTCGTTC-3’;扩增ermC的F端引物序列(SEQ ID NO:7):5’-GAAATCGAATAAAGCGGGATTTTCCTGCAGGGCCTAAAAAGAAGCAGG-3’;扩增ermC的R端引物序列(SEQ ID NO:8):5’-CCGATGGGGAAGATCCGCCACGAATTCGGTACCCCCGCATATGTAC-3’;扩增t7m的F端引物序列(SEQ ID NO:9):5’-GTACATATGCCCGGGGCCGAATTCGTGGGCCCGATCTTCCCCATCGG-3’;扩增t7m的R端引物序列(SEQ ID NO:10):5’-CTGGATAGAGTTTCGACTGCATGGTATATCTCCTTTCTTAAAGTTAAAC-3’;扩增manC的F端引物序列(SEQ ID NO:11):5’-GTTTAACTTTAAGAAAGGAGGATAATGGCCAGTCGAAACTCTATCCAG-3’;扩增manC的R端引物序列(SEQ ID NO:12):5’-TTAAAGCAGGTTAATTTTTTCATAGTAGTTCCTCCTTACCGTAGCGATCCGC-3’;扩增manB的F端引物序列(SEQ ID NO:13):5’-GCGGATCGCTACGGACGGGTGTAAGGACTATGAAAAAATTAACCTGCTTTAA-3’;扩增manB的R端引物序列(SEQ ID NO:14):5’-AAAAAGTTCAGTCGTCATAGTAGTTCCTCCTTGTTCCAACGTCAGCAG-3’;扩增D-manA的F端引物序列(SEQ ID NO:15):5’-CTGCTGACGTTGCTGAACGAGTAAGACTACTATGACGACCCGTTATTTTT-3’;扩增D-manA的R端引物序列(SEQ ID NO:16):5’-TTACGGGAGACGATACATTCTGC-3’。
使用2×Phanta Master Mix扩增上述6个DNA片段,PCR配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix,2.5μL F端引物(10μM),2.5μL R端引物(10μM),0.5μL模板,19.5μLddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火55℃15S,延伸72℃X min(因为酶的延伸效率为2kb/min,所以X为所扩增片段长度kb除以2),循环数30。上述PCR产物使用QuickCutTM Dpn I进行消模板处理,操作方法参照商品说明书,然后用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行纯化回收,回收方法按说明书操作,使用Nanodrop测定DNA片段的浓度。
使用融合PCR的方法将上述6个片段融合,融合PCR的方法如下:
PCR反应配置体系为10μL 2×Phanta Master Mix,6个片段各200ng,添加ddH2O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应,PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火60℃15S,延伸72℃3min,循环数10;再进行二轮融合PCR,反应配置体系为25μL 2×PhantaMaster Mix,2.5μL U-manA的F端引物(10μM),2.5μL D-manA的R端引物(10μM),1μL第一轮PCR反应产物,19μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火55℃15S,延伸72℃3min,循环数30,从而获得融合片段manA-manB-manC。
再将获得的manA-manB-manC转化到枯草芽孢杆菌ATCC 6051a中,并均匀涂在含有10μg/mL红霉素抗性平板上,置于37℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子,阳性转化子为manA-manB-manC cassette整合到枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组上的菌落。以所挑取的阳性转化子菌株为模板,用2×Phanta Master Mix扩增整合的片段,PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的转化子命名为枯草芽孢杆菌164M。
然后再进行线性片断gmd-wcaG-futC的制备,它主要由6个片段经过融合PCR获得,分别是U-xylAB、ermC、t7g、gmd-wcaG、futC和D-xylAB。分别以枯草芽孢杆菌ATCC 6061a基因组为模板,扩增U-xylAB和D-xylAB;以大肠杆菌BL21(DE3)为模板,扩增gmd-wcaG;以人工合成的DNA片断为模板,扩增ermC;以常用质粒pET28a为模板,扩增t7g,以futC的人工合成DNA片断为模板,扩增futC。PCR扩增的引物序列如下:扩增U-xylAB的F端引物序列(SEQ IDNO:17):5’-GCATCCTCGGTTTCCGCAACTGCATTTAGG-3’;扩增U-xylAB的R端引物序列(SEQ IDNO:18):5’-CCTGCTTCTTTTTAGGATCCCTGCAGGTTTCCCCCTTAAAAATAAATTC-3’;扩增ermC的F端引物序列(SEQ ID NO:19):5’-GAATTTATTTTTAAGGGAAATCACCTGCAGTCCTAAAAAGAAGCAGG-3’;扩增ermC的R端引物序列(SEQ ID NO:20):5’-CCGATGGGGTCGGGCTCGCCACGAATTCGGTACCCCCGGGCATATGTAC-3’;扩增t7g的F端引物序列(SEQ ID NO:21):5’-GTACATATGCCGGGTACCGTTCGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGG-3’;扩增t7g的R端引物序列(SEQ ID NO:22):5’-CCGGTATGAGAGCGACTTTTGGGTATATCCTCCTTTCTTAAAGTTAAAC-3’;扩增gmd-wcaG的F端引物序列(SEQ IDNO:23):5’-GTTTAACTTAAAGGAGGATATACCATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACCGG-3’;扩增gmd-wcaG的R端引物序列(SEQ ID NO:24):5’-CTTTGAAAGCCATAGTTCCTCCTTACCCCCGAAAGCGGTCTTGATTC-3’;扩增futC的F端引物序列(SEQ ID NO:25):5’-GAATCAAGACCGCTTTCGGGGTAGGAACTACTATGGCTTTCAAAG-3’;扩增futC的R端引物序列(SEQ ID NO:26):5’-GTTCTTCGGTTGATCTCCAGACAATAACATCAAGCGTTGTATTTCTGAGATTTAAC-3’;扩增D-xylAB的F端引物序列(SEQ ID NO:27):5’-GTTAAATCTCAGAAATACAACGCTTAATGATGTTATCTGGAGATCAACCGAAGAAC-3’;扩增D-xB的R端引物序列(SEQ ID NO:28):5’-GTATGATCGCATTTAAGTATTAC-3’。使用2×Phanta MasterMix扩增上述6个DNA片段,PCR配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix,2.5μL F端引物(10μM),2.5μL R端引物(10μM),0.5μL模板,19.5μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火55℃15S,延伸72℃X min(因为酶的延伸效率为2kb/min,所以X为所扩增片段长度kb除以2),循环数30。上述PCR产物使用QuickCutTM Dpn I进行消模板处理,操作方法参照商品说明书,然后用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行纯化回收,回收方法按说明书操作,使用Nanodrop测定DNA片段的浓度。再利用融合PCR的方法将上述6个片段融合,融合PCR的方法如下:首轮PCR反应配置体系为10μL 2×Phanta Master Mix,6个片段各200ng,添加ddH2O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应,PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火60℃15S,延伸72℃3min,循环数10。二轮PCR中,反应配置体系为25μL 2×PhantaMaster Mix,2.5μL U-xylAB的F端引物(10μM),2.5μL D-xylAB的R端引物(10μM),1μL第一轮PCR反应产物,19μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火55℃15S,延伸72℃3min,循环数30,从而获得融合片段gmd-wcaG-futC。
获得的gmd-wcaG-futC转化到164M后,即可完成枯草芽孢杆菌164FL的构建,主要步骤如下:将gmd-wcaG-futC转化164M中,均匀涂在含有10μg/mL红霉素抗性平板上,置于37℃恒温箱培养过夜;通过菌落PCR鉴定所长出的转化子;以所挑取的阳性转化子菌株为模板,用2×Phanta Master Mix扩增整合的片段,PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的菌株命名为重组枯草芽孢杆菌164FL。
实施例2:重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2的构建
重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2是在枯草芽孢杆菌164FL的基础上,将编码大肠杆菌BL21(DE3)乳糖渗透酶的lacY(SEQ ID NO:3)整合到164FL的fcoA2位点。重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2的构建的具体操作如下:
首先构建fcoA2-PxylA-lacY,它由5个片断(U-fcoA2、Cmg、PxylA、lacYg和D-fcoA2)构成。U-fcoA2和D-fcoA2分别以枯草芽孢杆菌ATCC6061a基因组为模板扩增而来;lacYg以大肠杆菌BL21(DE3)为模板;PxylA和Cmg由人工合成片断为模板扩增。其中,PCR扩增的引物序列如下:扩增U-fcoA2的F端引物序列(SEQ ID NO:29):5’-GTATTTCCATGCCCACCATC-3’;扩增U-fcoA2的R端引物序列(SEQ ID NO:30):5’-CAACTTTTTTTATTGTCTTTGTGAAAGCTGATGCTCCGCTCGATATGGGCG-3’;扩增Cmg的F端引物序列(SEQ ID NO:31):5’-CGCCCATATCGAGCGCATCAGCTTTCACAAACTATGACAATAAAAAAAGTTG-3’;扩增Cmg的R端引物序列(SEQ ID NO:32):5’-GTTATAATATTAGATTCTAGTCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAG-3’;扩增PxylA的F端引物序列(SEQ ID NO:33):5’-CTAACCTGCCCCGTTAGTTGAAGAAGAATTCTATCTAATATTATAAC-3’;扩增PxylA的R端引物序列(SEQ ID NO:34):5’-AGTTTGTGTTTTTTAAATAGTATTTTTATTCCTCCTTGTCGGGTTGATTTAAG-3’;扩增lacYg的F端引物序列(SEQ ID NO:35):5’-CTTAAATCAACCCGGGAACAAGGAGGAATAAAAATTATTTAAAAAACACAAACT-3’;扩增lacYg的R端引物序列(SEQ ID NO:36):5’-GCTAAGAGAACAAGGAGGAGAATGTGTTACTTCATTCACCTGACGAC-3’;扩增D-fcoA2的F端引物序列(SEQ ID NO:37):5’-GTCGTCAAATGAAGTCGCTTAACACATTCTCCTCCTTGTTCTCTTAGC-3’;扩增D-fcoA2的R端引物序列(SEQ ID NO:38):5’-GATTTATAAATTGACAATGTCCAGC-3’。分别使用2×Phanta Master Mix扩增上述5个DNA片段,PCR配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix,2.5μL F端引物(10μM),2.5μL R端引物(10μM),0.5μL模板,19.5μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火55℃15S,延伸72℃X min(因为酶的延伸效率为2kb/min,所以X为所扩增片段长度kb除以2),循环数30。上述PCR产物使用QuickCutTM Dpn I进行消模板处理,操作方法参照商品说明书,然后用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行纯化回收,回收方法按说明书操作,使用Nanodrop测定DNA片段的浓度。
再使用融合PCR的方法将上述5个片段融合,融合PCR的方法如下:首先运行首轮PCR,配置体系为10μL 2×Phanta Master Mix,6个片段各200ng,添加ddH2O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应,PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火60℃15S,延伸72℃2.5min,循环数10。再进行第二轮PCR反应,配置体系为25μL2×Phanta Master Mix,2.5μL U-fcoA2的F端引物(10μM),2.5μL D-fcoA2的R端引物(10μM),1μL第一轮PCR反应产物,19μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火55℃15S,延伸72℃2.5min,循环数30。获得融合片段fcoA2-PxylA-lacY。
得到的fcoA2-PxylA-lacY转化至164FL,过程如下:将PCR产物fcoA2-PxylA-lacY转化到实施例1构建的枯草芽孢杆菌164FL中,均匀涂在含有10μg/mL氯霉素抗性平板上,置于37℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子,阳性转化子为fcoA2-PxylA-lacY cassette整合到枯草芽孢杆菌164FL的基因组上的菌落。以所挑取的阳性转化子菌株为模板,用2×Phanta Master Mix扩增整合的片段,PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的菌株命名为重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2。
实施例3:重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1的构建
重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1将乳糖渗透酶lacY整合到枯草芽孢杆菌164FL上,将一个DNA片断(SEQ ID NO:4)整合到164FL的fcoA1位点。首先是制备线性DNA fcoA1-PxylA-lacY,它是由5个片段经过融合PCR获得,这5个片段分别是U-fcoA1、Cmy、PxylA、lacYy和D-fcoA1。其中,U-fcoA1和D-fcoA1以枯草芽孢杆菌ATCC 6061a基因组为模板扩增;lacYy以大肠杆菌BL21(DE3)为模板;PxylA和Cmy以人工合成的DNA片断为模板。PCR扩增的引物序列如下。扩增U-fcoA1的F端引物序列(SEQ ID NO:39):5’-CTATACAACAATCTCACCCGCC-3’;扩增U-fcoA1的R端引物序列(SEQ ID NO:40):5’-CTTTTTTTATTGTCATAGTTTGTGAAACCTTTGATGATCGATTCTGTC-3’;扩增Cmy的F端引物序列(SEQ ID NO:41):5’-GACAGAATCGATCATCAAAGAAAGGTTTCACAAACTATGACAAAAAAAG-3’;扩增Cmy的R端引物序列(同Cmg的R端引物SEQ ID NO:32):5’-GTTATAATATTAGATTCTAGAATTCTTCTTCAACTAACGGCAGGTTAG-3’;扩增PxylA的F端引物序列(SEQ ID NO:33):5’-CTAACCTGCCCCGTTAGTTGAAGAAGAATTCTAGAATCTAATATTATAAC-3’;扩增PxylA的R端引物序列(SEQ ID NO:34):5’-AGTTTGTGTTAAATAGTACATTTTTTATTCCTCCTTGTTCCCGGGTTGATTTAAG-3’;扩增lacYy的F端引物序列(SEQ ID NO:35):5’-CTTAAATCCGGGAACAAGGAGGAATAAAAAATGTACTATTTAAAAAACACAAACT-3’;扩增lacYy的R端引物序列(SEQ ID NO:42):5’-GAAATGATTCGATACAAAGAATCATTAAGCGACTTCATTCACCTGACGA-3’;扩增D-fcoA1的F端引物序列(SEQ ID NO:43):5’-TCGTCAGATGAAGTCGCTTAATGATTCTTTGTATCGAATCAGCTTTTTTC-3’;扩增D-fcoA1的R端引物序列(SEQ ID NO:44):5’-CTTTTCCGGTCCGTTGACAGGCTG-3’。再使用2×Phanta Master Mix扩增上述5个DNA片段,PCR配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix,2.5μL F端引物(10μM),2.5μL R端引物(10μM),0.5μL模板,19.5μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火55℃15S,延伸72℃X min(因为酶的延伸效率为2kb/min,X为所扩增片段长度kb除以2),循环数30。上述PCR产物使用QuickCutTM Dpn I进行消模板处理,操作方法参照商品说明书,然后用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行纯化回收,回收方法按说明书操作,使用Nanodrop测定DNA片段的浓度。再使用融合PCR的方法将上述5个片段融合,先进行首轮PCR反应,配置体系为10μL 2×Phanta Master Mix,6个片段各200ng,添加ddH2O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应,PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火60℃15S,延伸72℃2.5min,循环数10。再进行第二轮PCR反应,配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix,2.5μL U-fcoA1的F端引物(10μM),2.5μL D-fcoA1的R端引物(10μM),1μL第一轮PCR反应产物,19μLddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min,然后变性95℃15S,退火55℃15S,延伸72℃2.5min,循环数30,从而得到融合片段fcoA1-PxylA-lacY。
得到的fcoA1-PxylA-lacY片段转化至重组枯草芽孢杆菌164FL后,得到重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1。过程如下:先将fcoA1-PxylA-lacY转化到实施例1构建的枯草芽孢杆菌164FL中,并均匀涂在含有10μg/mL氯霉素抗性平板上,置于37℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子,以所挑取的阳性转化子菌株为模板,用2×Phanta MasterMix扩增整合的片段,PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的菌株命名为重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1。
实施例4:重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵产2’-FL
发酵培养基选择为LB培养基,组分为10g/L蛋白胨,5g/L酵母粉和10g/L NaCl。将制备的重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2或164FL-fcoA1分别在LB固体板上划线活化,然后挑取单菌落培养在装有3mL LB的试管,在37℃恒温振荡培养箱中200rpm过夜培养。取过夜培养物0.5mL接种到装有50mL新鲜LB培养基的500mL摇瓶中,继续在37℃恒温振荡培养箱中200rpm培养。待细胞长到OD600 0.8~1.0(4h左右),添加终浓度1%(m/V)的木糖诱导。在细胞生长12h后,添加不同浓度的乳糖和碳源(甘油、葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜或果糖等)。然后每隔12h取样检测细胞生长状况,同时通过液相检测2’-FL生产情况。方法如下:使用岛津HPLC设备,型号为20AVP,使用Aminex HPX-87H column(300×7.8mm)(Bio-Rad,USA)柱子,流动相5mM H2SO4,流速控制为0.6mL/min,柱子温度控制为65℃,为开启视差检测器(型号RID-10A)进行检测。
摇瓶发酵结果显示,以甘油为碳源时164FL能生产2’-FL,产量为120mg/L。在fcoA2位点敲入lacY,所构建的164FL-fcoA2可以使产量提高26.06倍,而在fcoA1位点敲入lacY,所构建的164FL-fcoA1可以使产量提高40.35倍。参见图2,为重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1摇瓶发酵生产2’-FL的结果示意图。菌种164FL-fcoA1的碳源实验结果显示:使用甘油、葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜或果糖等都能产生2’-FL,甘油为最佳碳源。乳糖浓度实验确定乳糖最佳添加量为20g/L。摇瓶发酵实验结果,当使用碳源为甘油浓度为25g/L,乳糖浓度为20g/L时,164FL-fcoA1达到最大产量,为5.56g/L。
实施例5:重组枯草芽孢杆菌补料发酵产2’-FL
以164FL-fcoA1菌种为例补料发酵产2’-FL。首先是制备发酵的种子培养液。过程如下:首先将制备的重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1在LB固体板上划线活化,然后挑取单菌落培养在装有3mL LB的试管,在37℃恒温振荡培养箱中200rpm过夜培养。取过夜培养物0.5mL接种到装有50mL新鲜LB培养基的500mL摇瓶中,继续在37℃恒温振荡培养箱中200rpm培养8h。将种子培养物接种到发酵培养基中,接种量为7.5%。发酵培养基的组分为:甘油25g/L、酵母粉5g/L、乳糖20g/L、蛋白胨30g/L、磷酸二氢钾12g/L、硫酸铵14g/L、六水合氯化镁3g/L、玉米浆10g/L以及消泡剂1g/L。5L发酵罐的装液量为3L,115℃灭菌20min使用。发酵初始pH为6.5。发酵控制参数为:通气量控制在5L/min,转速为700rpm,温度控制在37℃,发酵3h后加入终浓度1%的木糖;流加甘油和氨水控制发酵罐的pH在6.5左右。发酵过程中甘油控制>20%,乳糖控制>10%。定时取样,通过液相测定所生成2’-FL产量以及检测甘油和乳糖消耗情况。液相检测方法与实施例4中一致。参见图3,为重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1补料发酵生产2’-FL时产物随时间变化的结果示意图。补料发酵结果显示,在培养过程中2’-FL产量一直在积累,并在发酵的144h达到最高产量,为27.8g/L。
上述仅为本发明的部分优选实施例,本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说,在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改,所作的任何变化和更改,均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院上海高等研究院
<120> 生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgacgtttt taggaaaaag aaaattcgag gcatctcaaa gagaaatggg gaaagcggca 60
tttacgatgg ggctcttcgg cattactgaa ggagcgattc catttgcggc gcaggaccct 120
ctgcgcgtta ttccaagtat tatggcaggc tcaatgacag gttctgtgat agccatgatt 180
ggcaatgtgg gagacagagt ggcgcacggc ggacctatcg ttgcagtgct tggcgcagtt 240
gatcatgtct tgatgttttt tattgctgtg attgcaggat ctcttgtcac tgctctgttc 300
gtcaatgtac taaaaaagga tattacggcg tctcctgtgc tcagtgaaac tgcaccgacc 360
tccgcgccaa gtgaagctgc ggcagcaaat gaaataaagc agccaattca aagccaaaaa 420
gctgagatgt cggaatttaa aaaactgaca gacattatca gcccggaatt aattgaacca 480
aatttatcgg gggaaacgag tgatgacatc atagatgaat tgattcagaa attgtcacga 540
agaggtgcgc tgctttcaga gagcgggttt aaacaagcca ttttgaatcg tgaacaacag 600
ggaacaacgg cgattggcat gaatatcgcg attccgcacg gaaagtctga ggcggtcagg 660
gagccgagtg ttgcctttgg gatcaaacga tcaggcgttg attggaatag cctggatgga 720
tcagaagcta aattaatctt tatgattgct gtaccgaaag agagcggggg aaaccagcat 780
ctcaaaatac tgcagatgct atctcgaaag ctaatggatg acaattatag ggagcggctg 840
ctctccgtgc aaacaacaga agaagcatac aagctgctag aagaaatcga ataaagcggg 900
ggattttcct gcagggatcc taaaaagaag caggttcctc catacctgct tctttttaag 960
cttaagcttg cggccgctac cgttcgtata gcatacatta tacgaagtta tttaaaccgt 1020
gtgctctacg accaaaacta taaaaccttt aagaactttc tttttttaca agaaaaaaga 1080
aattagataa atctctcata tcttttattc aataatcgca tccgattgca gtataaattt 1140
aacgatcact catcatgttc atatttatca gagctcgtgc tataattata ctaattttat 1200
aaggaggaaa aaatatgggc atttttagta tttttgtaat cagcacagtt cattatcaac 1260
caaacaaaaa ataagtggtt ataatgaatc gttaataagc aaaattcata taaccaaatt 1320
aaggagggaa ataatgaacg agaaaaatat aaaacacagt caaaacttta ttacttcaaa 1380
acataatata gataaaataa tgacaaatat aagattaaat gaacatgata atatctttga 1440
aatcggctca ggaaaaggcc attttaccct tgaattagta aagaggtgta atttcgtaac 1500
tgccattgaa atagaccata aattatgcaa aactacagaa aataaacttg ttgatcacga 1560
taatttccaa gttttaaaca aggatatatt gcagtttaaa tttcctaaaa accaatccta 1620
taaaatatat ggtaatatac cttataacat aagtacggat ataatacgca aaattgtttt 1680
tgatagtata gctaatgaga tttatttaat cgtggaatac gggtttgcta aaagattatt 1740
aaatacaaaa cgctcattgg cattactttt aatggcagaa gttgatattt ctatattaag 1800
tatggttcca agagaatatt ttcatcctaa acctaaagtg aatagctcac ttatcagatt 1860
aagtagaaaa aaatcaagaa tatcacacaa agataaacaa aagtataatt atttcgttat 1920
gaaatgggtt aacaaagaat acaagaaaat atttacaaaa aatcaattta acaattcctt 1980
aaaacatgca ggaattgacg atttaaacaa tattagcttt gaacaattct tatctctttt 2040
caatagctat aaattattta ataagtaagt taagggatgc ataaactgca tcccttaact 2100
tgtttttcgt gtgcctattt tttgtgaatt gattatcgat cttttgcgcc atggataact 2160
tcgtatagca tacattatac gaacggtaca tatgcccggg ggtaccgaat tcgtggcgag 2220
cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc 2280
cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga 2340
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 2400
ttttgtttaa ctttaagaaa ggaggatata ccatggcgca gtcgaaactc tatccagttg 2460
tgatggcagg tggctccggt agccgcttat ggccgctttc ccgcgtactt tatcccaagc 2520
agtttttatg cctgaaaggc gatctcacca tgctgcaaac caccatctgc cgcctgaacg 2580
gcgtggagtg cgaaagcccg gtggtgattt gcaatgagca gcaccgcttt attgtcgcgg 2640
aacagctgcg tcaactgaac aaacttaccg agaacattat tctcgaaccg gcagggcgaa 2700
acacggcacc tgccattgcg ctggcggcgc tggcggcaaa acgtcatagc ccggagagcg 2760
acccgttaat gctggtattg gcggcggatc atgtgattgc cgatgaagac gcgttccgtg 2820
ccgccgtgcg taatgccatg ccatatgccg aagcgggcaa gctggtgacc ttcggcattg 2880
tgccggatct accagaaacc ggttatggct atattcgtcg cggtgaagtg tctgcgggtg 2940
agcaggatat ggtggccttt gaagtggcgc agtttgtcga aaaaccgaat ctggaaaccg 3000
ctcaggccta tgtggcaagc ggcgaatatt actggaacag cggtatgttc ctgttccgcg 3060
ccggacgcta tctcgaagaa ctgaaaaaat atcgcccgga tatcctcgat gcctgtgaaa 3120
aagcgatgag cgccgtcgat ccggatctca attttattcg cgtggatgaa gaagcgtttc 3180
tcgcctgccc ggaagagtcg gtggattacg cggtcatgga acgtacggca gatgctgttg 3240
tggtgccgat ggatgcgggc tggagcgatg ttggctcctg gtcttcatta tgggagatca 3300
gcgcccacac cgccgagggc aacgtttgcc acggcgatgt gattaatcac aaaactgaaa 3360
acagctatgt gtatgctgaa tctggcctgg tcaccaccgt cggggtgaaa gatctggtag 3420
tggtgcagac caaagatgcg gtgctgattg ccgaccgtaa cgcggtacag gatgtgaaaa 3480
aagtggtcga gcagatcaaa gccgatggtc gccatgagca tcgggtgcat cgcgaagtgt 3540
atcgtccgtg gggcaaatat gactctatcg acgcgggcga ccgctaccag gtgaaacgca 3600
tcaccgtgaa accgggcgag ggcttgtcgg tacagatgca ccatcaccgc gcggaacact 3660
gggtggttgt cgcgggaacg gcaaaagtca ccattgatgg tgatatcaaa ctgcttggtg 3720
aaaacgagtc catttatatt ccgctggggg cgacgcattg cctggaaaac ccggggaaaa 3780
ttccgctcga tttaattgaa gtgcgctccg gctcttatct cgaagaggat gatgtggtgc 3840
gtttcgcgga tcgctacgga cgggtgtaag gaggaactac tatgaaaaaa ttaacctgct 3900
ttaaagccta tgatattcgc gggaaattag gcgaagaact gaatgaagat atcgcctggc 3960
gcattggtcg cgcctatggc gaatttctca aaccgaaaac cattgtgtta ggcggtgatg 4020
tccgcctcac cagcgaaacc ttaaaactgg cgctggcgaa aggtttacag gatgcgggcg 4080
ttgacgtgct ggatattggt atgtccggca ccgaagagat ctatttcgcc acgttccatc 4140
tcggcgtgga tggcggcatt gaagttaccg ccagccataa tccgatggat tataacggca 4200
tgaagctggt tcgcgagggg gctcgcccga tcagcggaga taccggactg cgcgacgtcc 4260
agcgtctggc tgaagccaac gactttcctc ccgtcgatga aaccaaacgc ggtcgctatc 4320
agcaaatcaa cctgcgtgac gcttacgttg atcacctgtt cggttatatc aatgtcaaaa 4380
acctcacgcc gctcaagctg gtgatcaact ccgggaacgg cgcagcgggt ccggtggtgg 4440
acgccattga agcccgcttt aaagccctcg gcgcgcccgt ggaattaatc aaagtgcaca 4500
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gatatgcaga atgtatcgtc tcccatctgt aa 6212
<210> 2
<211> 6640
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatcctcgg tttccgcaac tgcatttagg accattaaag tctattgtca tatgtcccat 60
ttctccagag aagccgctta ctcctctata taaatgattg ttgataataa caccgatccc 120
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tttttctcca tatgcgccag catttgcctc attttcaata aaaacaggca cattgtactt 240
ctcttgtatc gaagatttta agtcaatatc tctccagttg gagttcggag tgaaaacaat 300
tttttgatct ttatcaatga gtccaggcac gcaaatacct ataccaataa gcccgtacgg 360
agattggggc atttgcgtaa taaagtgatg aatcatatca atcaaaatgt ctttcgttat 420
ttctggagaa ttggattcca aatggcggta ttgatcaaga acgattgttc cttcaaggtc 480
tgttaaaatg ccattaatat aatccacacc aacatctatt ccaacggagt atcctgcctt 540
tttattaaaa acaagcatga caggtcttct tccgccactt gattgtcctt gacctatttc 600
aaataccata ctttctttca ttaacgtgtt tacctgtgat gagacagttg atttatttaa 660
tccagtcatt tcagataatt ttgctcttga aataggtgaa tttttaagga tttcttttaa 720
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tccatttgtt taatctttaa attaagtatc aacatagtac atagcgaatc ttccctttat 840
tatatctaat gtgttcataa aaaactaaaa aaaatattga aaatactgac gaggttatat 900
aagatgaaaa taagttagtt tgtttaaaca acaaactaat aggtgatgta cttactatat 960
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ggccatttta cccttgaatt agtaaagagg tgtaatttcg taactgccat tgaaatagac 1620
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ataccttata acataagtac ggatataata cgcaaaattg tttttgatag tatagctaat 1800
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cgcatcgtca ttcaacaccg agcgcgtgga tcacatttat caggatccgc acacctgcaa 2700
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actgtatggt ctggtgcagg aaattccgca gaaagagacc acgccgttct acccgcgatc 3000
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<213> 大肠杆菌( Bacillus coli)
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<213> 大肠杆菌( Bacillus coli)
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<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaaataacg gttcagtcgt catagtagtt cctccttact cgttcagcaa cgtcagcag 59
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgctgacgt tgctgaacga gtaaggagga actactatga cgactgaacc gttattttt 59
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttacagatgg gagacgatac attctgc 27
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcatcctcgg tttccgcaac tgcatttagg 30
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctgcttctt tttaggatcc ctgcaggtga tttccccctt aaaaataaat tc 52
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaatttattt ttaaggggga aatcacctgc agggatccta aaaagaagca gg 52
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgatgggga agatcgggct cgccacgaat tcggtacccc cgggcatatg tac 53
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtacatatgc ccgggggtac cgaattcgtg gcgagcccga tcttccccat cgg 53
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccggtgatga gagcgacttt tgacatggta tatcctcctt tcttaaagtt aaac 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtttaacttt aagaaaggag gatataccat gtcaaaagtc gctctcatca ccgg 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctttgaaagc catagtagtt cctccttacc cccgaaagcg gtcttgattc 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaatcaagac cgctttcggg ggtaaggagg aactactatg gctttcaaag 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttcttcggt tgatctccag acaataacat cattaagcgt tgtatttctg agatttaac 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttaaatctc agaaatacaa cgcttaatga tgttattgtc tggagatcaa ccgaagaac 59
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gtatgatcgc aatcgtttta agtattac 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caactttttt tattgtcata gtttgtgaaa gctgatgctc cgctcgatat gggcg 55
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcccatatc gagcggagca tcagctttca caaactatga caataaaaaa agttg 55
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttataatat tagattctag aattcttctt caactaacgg ggcaggttag 50
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ctaacctgcc ccgttagttg aagaagaatt ctagaatcta atattataac 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtttgtgtt ttttaaatag tacatttttt attcctcctt gttcccgggt tgatttaag 59
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cttaaatcaa cccgggaaca aggaggaata aaaaatgtac tatttaaaaa acacaaact 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctaagagaa caaggaggag aatgtgttaa gcgacttcat tcacctgacg ac 52
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcgtcaggt gaatgaagtc gcttaacaca ttctcctcct tgttctctta gc 52
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gatttataaa ttgacaatgc agtccagc 28
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ctatacaaca acacatctca cccgcc 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctttttttat tgtcatagtt tgtgaaacct ttctttgatg atcgattctg tc 52
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gacagaatcg atcatcaaag aaaggtttca caaactatga caataaaaaa ag 52
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gaaaaaagct gattcgatac aaagaatcat taagcgactt cattcacctg acga 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cttttccggt ccgttttgac aggctg 26
Claims (10)
1.生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于:所述重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌164FL、重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2、重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1;
所述重组枯草芽孢杆菌164FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段,以及在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得;
所述重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA2通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得;
所述重组枯草芽孢杆菌164FL-fcoA1通过在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得。
2.如权利要求1所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于:所述编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO:1所示的序列,或者是与SEQ ID NO:1具有85%以上同源性且具有相同功能的序列;所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的融合基因片段是SEQ ID NO:2所示的序列,或者是与SEQ ID NO:2具有85%以上同源性且具有相同功能的序列。
3.如权利要求1所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于:所述在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点整合的编码乳糖渗透酶的基因片段是SEQ ID NO:3所示的序列或者与SEQ ID NO:3具有85%以上同源性且具有相同功能的序列;在重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点整合的编码乳糖渗透酶的基因片段是SEQ ID NO:4所示的序列或者与SEQ ID NO:4具有85%以上同源性且具有相同功能的序列。
4.如权利要求1所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于:所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC 6051a。
5.生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,包括如下步骤:
步骤1,在枯草芽孢杆菌的基因组manA位点整合编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因序列;消除抗性基因后,在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的基因序列,得到重组枯草芽孢杆菌164FL;
步骤2,将编码大肠杆菌BL21乳糖渗透酶的lacY基因整合到重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA2位点上,得到重组枯草芽孢杆菌为164FL-fcoA2;
步骤3,将编码大肠杆菌BL21乳糖渗透酶的lacY基因整合到重组枯草芽孢杆菌164FL的fcoA1位点上,得到重组枯草芽孢杆菌为164FL-fcoA1。
6.如权利要求5所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于:所述步骤1中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC 6051a;所述编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因序列如SEQ ID NO:1所示,所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,2岩藻糖基转移酶的基因序列如SEQ IDNO:2所示。
7.如权利要求5所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于:所述步骤2中编码乳糖渗透酶的lacY基因序列如SEQ ID NO:3所示;所述步骤3中编码乳糖渗透酶的lacY基因序列如SEQ ID NO:4所示。
8.权利要求1-4任一项所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用,其特征在于:使用所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖。
9.如权利要求8所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用,其特征在于:所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖的碳源选自甘油、葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜或果糖。
10.如权利要求8所述的生产2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用,其特征在于:所述重组枯草芽孢杆菌164FL、164FL-fcoA2、164FL-fcoA1发酵生成2’-岩藻糖基乳糖的培养基中包含18-22g/L的乳糖和24-26g/L的甘油。
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