CN110143948B - Cdk4/6抑制剂、其药物组合物、制备方法及应用 - Google Patents

Cdk4/6抑制剂、其药物组合物、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CDK4/6抑制剂、其药物组合物、制备方法及应用，属于药物领域。该CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂在惰性溶剂中，将式(a)化合物与相应的活性试剂进行缩合反应，得到式(b)中间体，然后在酸或碱作用下，脱保护得到所述式(I)化合物。此外还公开了一种如式(I)所示的CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药在制备预防或***药物中的应用。本发明提供的这种CDK4/6抑制剂具有优异的抗CDK4/6的活性，可用于制备多种抗肿瘤药物制剂。
Figure DDA0002103440120000011

Description

CDK4/6抑制剂、其药物组合物、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及制药领域，具体而言，涉及一种CDK4/6抑制剂、其药物组合物、制备方法及应用。
背景技术
癌症等疾病的发生与多种癌基因和抑癌基因的失调有关，几乎所有的癌基因、抑癌基因的功能和效应，都是在细胞生长周期过程中发生作用。因此，可以说癌症是一种细胞周期性疾病(CCD)，调节或阻断异常细胞周期是癌症治疗的途径之一。
在已发现的与细胞周期调控有关的分子中，周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases,Cdks)是在细胞周期调控中起关键作用的蛋白激酶，其由于受周期蛋白的激活而得名。真核细胞中主要有三种类型的周期蛋白依赖性的蛋白激酶。
CDKs是一组丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白激酶，和周期蛋白cyclin协同作用，是细胞周期调控中的重要因子，参与细胞周期的不同时期。以CDKs为中心的细胞周期调控过程，任何环节的异常都会引起细胞周期异常，并有可能导致癌症的发生。
CDKs目前已发现有21个亚型，可以和cyclins(细胞周期蛋白)结合形成异二聚体，其中CDK为催化亚基，cyclin为调节亚基，不同的cyclin-CDK复合物，通过CDK活性，调节不同底物磷酸化，进而实现对细胞周期不同时相的推进和转化作用。CDK的活性依赖于其正调节亚基cyclin的顺序性表达和其负调节亚基CDI(cyclin dependent kinase inhibitor，CDK抑制因子)的浓度。同时，CDK的活性还受到磷酸化和去磷酸化，以及癌基因和抑癌基因的调节。
CDK各种亚型的功能，除了作用于细胞周期外，还包括对转录、DNA修复、分化和细胞程序死亡的调节。
在哺乳动物中至少存在9种CDK，即CDK1～9。在参与细胞周期的CDK亚型中国，CDK4/6发挥着关键性的作用，与癌症相关的细胞周期突变主要存在于G1期和G1/S期转化过程，CDK4/6与CyclinD结合形成有激酶活性的复合物，通过抑癌基因Rb产物pRb磷酸化，释放结合的转录因子E2F，启动与S期有关的基因转录，促使细胞周期由G1期向S期转移。
CDK4/6特异性的激活与一些肿瘤细胞的增殖密切相关，约80％的人类癌症中有Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb通路的异常。该通路的改变，导致了G1期的进程加速，使肿瘤细胞的增殖加快。对该通路的干预成为一种癌症治疗策略，CDK4/6是一种新的抗肿瘤靶点。
CDK4/6做为抗肿瘤靶点具有两大优势：(1)大部分的细胞增殖遗留与CDK4/6的增殖，但CDK4/6抑制剂不表现出“pan-CDK抑制剂”的细胞毒性，如骨髓抑制和肠道反应；(2)临床试验表明，如果细胞cyclin D水平升高或者P12INK4a失活，能够增加细胞对药物的敏感性，由于肿瘤细胞相对于正常细胞存在上述现象，因此在一定程度上增加了该类药物的靶向性。
目前，已经被FDA批准上市的CDK抑制剂药物包括：Pfizer公司的Palbociclib在2015年2月3日经FDA批准上市和Novartis公司的Ribociclib在2017年3月13日经FDA批准上市，这个药物均是做为CDK4/6抑制剂用于治疗转移性乳腺癌。另外，礼来、Astex、Tolero、G1等在内的医药公司陆续报道了一系列选择性性较好的CDK4/6抑制剂，用于治疗骨髓疾病、血液肿瘤、乳腺肿瘤、肺癌等疾病，目前均处于不同阶段的临床试验阶段。
通过对现有专利文献的检索发现，申请号为201710110337.1的中国发明专利申请公开了一种CDK4/6抑制剂与芳香化酶抑制剂联合在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，其涉及的CDK4/6抑制剂结构式为：
Figure BDA0002103440100000021
申请号为201711489600.9的中国发明专利申请公开了一种抗肿瘤药物组合物，包含活性成分和药学上可接受的辅料，所述的活性成分由吉西他滨和式
Figure BDA0002103440100000022
所示的CDK4/6激酶抑制剂或其药学可接受的盐组成，通过联合用药的方式，提高了其抗癌活性。
然而，现有报道的CDK4/6激酶抑制剂仍存在抗癌活性低、毒性大等不足。
为实现更好的癌症治疗效果，更好的满足临床和市场需求，我们期望能够开发出新一代的高效、低毒的CDK4/6抑制剂，期望能提高治疗的选择性和有效性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药，组合物，制备方法及其应用。本发明提供的这种CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药，可用于癌症的治疗和(或)预防。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种如式(I)所示的CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药：
Figure BDA0002103440100000031
其中，
R1包括从由-C1～6烷基、-C3～14环烷基、-C3～14杂环烷基、芳基、-C1～6烷烃-OR2、-C1～6烷烃-CO2R3组成的群组中选择的至少一个；R2和R3独立的代表H、C1～6烷基、环烷基、杂环烷基或芳基；如果R1含有羧基，则R1可以为羧酸的钾盐、钙盐、镁盐、铝盐、钠盐、铁盐；所有基团为未取代或任选的被一个或多个F、Cl、Br、D、OH、CN、烷氧基取代。
本发明中，如式(I)所示的CDK4/6抑制剂药学上可接受的盐可包括药学上可接受的无机酸盐或有机酸盐。所述的无机酸盐优选硫酸盐、亚硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐或高氯酸盐。所述的有机酸盐优选醋酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、庚酸盐、草酸盐、苯甲酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、顺丁烯二酸盐、羟基丁酸盐、枸橼酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、乳酸盐或扁桃酸盐。
本发明中，使用以下定义：
“C1～6烷基”是指1～6个饱和和/或不饱和碳原子和氢原子组成的直链或支链一价残基，例如甲基(Me)、乙基(Et)、丙基、异丙基、丁基(Bu)、异丁基、叔丁基(t-Bu)、乙烯基、戊烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等，其可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的选自如下定义的取代基所取代。
“环烷基”是指非芳族的含有3，4，5，6，7，8，9，10，11，12、13或14个碳原子的一价单环、双环或三环残基，每种都可以是饱和或不饱和的，并且可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的选自本发明定义的取代基所取代。
“杂环烷基”是指非芳族的含有3，4，5，6，7，8，9，10，11，12、13或14个碳原子的一价单环、双环或三环残基，其包括1，2，3，4，5或6个选自氮、氧和硫的相同或不相同的杂原子。每种都可以是饱和或不饱和的，并且可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的选自本发明定义的取代基所取代。
“芳基”是指苯基和萘基。可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的选自如下定义的取代基所取代，并且可以与一个C3～14环烷基、C3～14杂环烷基或5～6元芳杂环稠合，所述的环烷基、杂环烷基或5-6元芳杂环本身可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的选自本发明定义的取代基所取代。
5～6元芳杂环是指环中除碳原子以外还含有其他原子的五元或六元芳香杂环化合物，其含有1，2，3或4个选自氮、氧和硫的相同或不相同的杂原子。可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的选自如下定义的取代基所取代，并且可以与一个环烷基、杂环烷基、芳基或5～6元芳杂环稠合，所述的环烷基、杂环烷基、芳基或5～6元芳杂环本身可以是未取代的或被一个或多个相同或不同的选自本发明定义的取代基所取代。
“取代基”为卤素、氘、羧基、酯基、C1～6烷基、烷氧基、酰基、酰氨基、磺酰基、巯基、烷硫基、环烷基、杂环烷基、氨基、烷氨基、二烷氨基、氰基、二氟甲基、三氟甲基或带上述基团的C1～4的烷基。
进一步的，如式(I)所示的CDK-4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药为如下编号CDK4/6-01～04中的任一化合物：
Figure BDA0002103440100000041
Figure BDA0002103440100000051
第二方面，本发明提供一种如式(I)所示的CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药的制备方法，其包括：
在惰性溶剂中，将式(a)化合物与活性试剂，在碱性试剂作用下进行缩合反应，得到中间体式(b)，然后在酸性试剂或碱性试剂作用下，脱保护得到所述式(I)化合物:
Figure BDA0002103440100000052
其中，Pro为Boc、Ts酰基类、磺酰基类保护基。
进一步的，上述反应所用的惰性溶剂包括但不限于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、氮甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮、氯苯、二氯苯、甲苯、甲醇、乙醇，优选N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
进一步的，上述反应所用的活性试剂包括但不限苯磺酸酯类、甲磺酸酯类、卤代试剂。
进一步的，上述所用的碱性试剂包括但不限于TEA、DIPEA、DBU、DMAP、二甲胺、二乙胺、正丁胺、苯胺、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化锂。优选DIPEA。
进一步的，上述所用的酸性试剂包括但不限于HCl、HBr、H2SO4、H2SO3、HNO3、H3PO4、CHCOOH、AcOH、甲酸、甲磺酸、苯磺酸、三氟乙酸。优选HCl。
进一步的，上述反应的温度为0～100℃，或者30～90℃，或者60～90℃，或者70～90℃。
第三方面，本发明提供一种式(I)所示的CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药在制备预防或***药物中的应用。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述组合物包含如前述的如式(I)所示的CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药，以及药学上可接受的添加剂。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
除另有说明，本发明中公开的术语和缩写具有它们标准的含义。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢前体或前药，具有优异的抑制CDK4/6的活性，适用于制备多种抗肿瘤药物制剂。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为CDK4/6系列化合物对人胃癌MDA-MB-436裸小鼠移植瘤的体积的影响示意图；
图2为CDK4/6系列化合物对人胃癌MDA-MB-436裸小鼠移植瘤的相对瘤体积的影响示意图；
图3为CDK4/6系列化合物对人胃癌MDA-MB-436裸小鼠移植瘤的实验治疗作用示意图；
图4为CDK4/6-01质谱检测谱图；
图5为CDK4/6-02质谱检测谱图；
图6为CDK4/6-03质谱检测谱图；
图7为CDK4/6-04质谱检测谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1. 3-乙酰基-1-环戊基7-((2-羟基乙基)(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-4-甲基喹啉-2(1H)-酮(CDK4/6-01)
Figure BDA0002103440100000071
向250ml的三口烧瓶中加入4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)叔丁基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯10.0g(16.6mmol)，N,N-二甲基甲酰胺80mL，碳酸钾9.2g(66.6mmol)，碘化钾1.0g，搅拌，升温至50～60℃，加入2-溴乙基乙酸酯4.0g(23.9mmol)，90℃保温反应，LCMS跟踪反应，如果反应不完全，可以补加适量碳酸铯和2-溴乙基乙酸酯，直至4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)叔丁基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯反应完全，过滤，滤饼用适量DMF洗涤，加入乙酸乙酯和水搅拌、分液，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，有机相依次用水洗涤三次、饱和食盐水洗涤一次。有机相浓缩至干，柱层析纯化得到4-(6-((2-乙酰氧基乙基)(6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯2.2g。
将上述4-(6-((2-乙酰氧基乙基)(6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯溶解于30mL甲醇中，加入3.0g浓盐酸，搅拌升温至60～70℃，LCMS跟踪反应，直至4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(甲基)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯反应完全，浓缩至有大量固体析出，过滤，烘干，得到3-乙酰基-1-环戊基7-((2-羟基乙基)(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-4-甲基喹啉-2(1H)-酮1.4g，两步收率：17％。
LC-MS(m/z):490[M+H+]，质谱检测谱图如图4所示。
实施例2. N-(3-乙酰基-1-环戊基-4-甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-7-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)甘氨酸钠(CDK4/6-02)
Figure BDA0002103440100000081
向250ml的三口瓶中加入4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)叔丁基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯6g(9.94mmol)，碳酸钾4.14g(29.9mmol)，N,N-二甲基甲酰胺40mL，溴乙酸乙酯3.48g(20.8mmol)，升温至60～90℃，LCMS跟踪反应，直至4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)叔丁基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯完全反应完全，降温至室温，加入水和乙酸乙酯，搅拌分液，水相用乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，有机相依次用水洗三次、饱和食盐水洗三次，有机相浓缩至干，柱层析纯化得到4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(2)乙氧基-2-氧代乙基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯3.5g。
将上述4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(2)乙氧基-2-氧代乙基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯加入50ml甲醇中，搅拌，加入5.0g浓盐酸，升温至60～70℃，LCMS跟踪反应，直至4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(2)乙氧基-2-氧代乙基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯反应结束，添加NaOH水溶液至反应液呈碱性，保温反应1小时，浓缩部分甲醇，加入适量乙酸乙酯，有固体析出，过滤，45℃真空干燥得到N-(3-乙酰基-1-环戊基-4-甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-7-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)甘氨酸钠2.2g，两步收率：42％。
LC-MS(m/z):504[M-Na++2H+]，质谱检测谱图如图5所示。
实施例3. 3-乙酰基-1-环戊基-7-(乙基(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-4-甲基喹啉-2(1H)-酮(CDK4/6-03)
Figure BDA0002103440100000082
向250ml的三口瓶中加入4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)叔丁基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯10.0g(16.6mmol)，碳酸钾8.0g(57.9mmol)，N,N-二甲基甲酰胺100ml，搅拌，升温至40～50℃，加入碘乙烷1.5ml，保温反应，LCMS跟踪反应，如果反应不完全，补加碘乙烷，直至4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)叔丁基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯反应完全，过滤，滤液中添加水和乙酸乙酯，搅拌分液，水相用乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，有机相用水洗涤两次，饱和食盐水洗涤一次，有机相浓缩至干，柱层析纯化得到4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(乙基)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯6.5g。
将上述4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(乙基)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯加入60ml甲醇中，加入7.5g浓盐酸，搅拌，升温至60～70℃，LCMS跟踪反应，直至4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(乙基)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯反应完全，浓缩除去部分甲醇，加入乙酸乙酯，室温搅拌1小时，过滤，滤饼于45℃真空干燥至干，得到3-乙酰基-1-环戊基-7-(乙基(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-4-甲基喹啉-2(1H)-酮5.2g，两步收率：67％。
LC-MS(m/z):474[M+H+]，质谱检测谱图如图6所示。
实施例4. 3-乙酰基-1-环戊基-7-(甲基(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-4-甲基喹啉-2(1H)-酮(CDK4/6-04)
Figure BDA0002103440100000091
向250ml的三口烧瓶中加入4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)叔丁基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯10.0g(16.6mmol)，N,N-二甲基甲酰胺80mL，碳酸钾9.2g(66.6mmol)，搅拌，升温至40～50℃，加入苯磺酸甲酯6.8g(39.5mmol)，60℃保温反应，LCMS跟踪反应，直至4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)叔丁基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯反应完全，过滤，滤饼用适量DMF洗涤，加入乙酸乙酯和水搅拌、分液，水相用乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，有机相依次用水、饱和食盐水洗涤。有机相浓缩至干，柱层析纯化得到4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(甲基)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯2.9g。
将上述4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(甲基)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯溶解于20mL甲醇中，加入55g浓盐酸，搅拌升温至60～70℃，LCMC跟踪反应，直至4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)叔丁基(甲基)基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯反应完全，浓缩至有大量固体析出，过滤，烘干，得到3-乙酰基-1-环戊基-7-(甲基(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-4-甲基喹啉-2(1H)-酮2.0g，两步收率：26％。
LC-MS(m/z):460[M+H+]，质谱检测谱图如图7所示。
实施例5. CDK4/6系列化合物的体外抗肿瘤活性
1.实验步骤
根据细胞生长速率接种一定量的肿瘤细胞于96孔培养板，受试物及阳性对照作用细胞72h后，弃去培养液，每孔加入预冷的10％三氯醋酸(TCA)溶液固定细胞，置于4℃冰箱进行固定2h，培养板各孔以去离子水洗涤5遍，以去除三氯醋酸溶液，在空气中干燥后，每孔加入1％乙酸配制的SRB溶液(4mg/ml)，室温下放置20分钟，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，洗净未结合的SRB染料后空气干燥，每孔加入适当体积pH10.5的10mM Tris-base(三羟甲基胺基甲烷)溶液进行溶解，在平板振荡器上振荡10分钟，酶标仪515nm波长下测定吸光度OD值。
2.数据处理
根据酶标仪测定的OD值，按下列公式计算抑制率：
抑制率(％)＝(1-OD给药/OD对照)×100％，
若抑制率≤0％，记为0％。
计算IC50，实验重复三次，计算平均值和标准差，数据表示为：平均值±标准差。
3.实验结果
CDK4/6系列化合物对12株不同组织来源的人肿瘤细胞株均有较强增殖抑制作用，作用72小时的IC50值从4.72±1.42μM到31.54±6.70μM不等，与阳性对照Palbociclib的抗肿瘤活性相当(详见表1)。
表1. CDK4/6系列化合物对人肿瘤细胞的增殖抑制作用
Figure BDA0002103440100000101
Figure BDA0002103440100000111
实施例6.CDK4/6系列化合物的体内抗肿瘤活性
1.方法
将1×107个MDA-MB-436细胞注射入裸小鼠左腋下，传三代后，剖取MDA-MB-436种鼠瘤块，放入盛有生理盐水的玻璃皿内，剥弃表面血管，切开去除坏死区域后，将瘤块切成1-2mm3，用套管针接入裸小鼠左腋下。
待肿瘤生长至平均体积80～100mm3后，将24只裸小鼠按瘤体积随机分成4组：溶剂对照组(Control)，CDK4/6-02组(100mg/kg)，CDK4/6-03组(100mg/kg)，CDK4/6-04组(100mg/kg)，于给药第17天给药剂量调整为200mg/kg，每组6只。各组按10ml/kg的给药容量每天1次灌胃给予相应浓度的受试物。
每周称重和测量肿瘤体积2次，给药周期22天，于第23天称量体重，测量肿瘤体积，处死裸小鼠取瘤块称重，计算相对肿瘤体积(RTV)、相对肿瘤增值率(T/C)和肿瘤抑制百分率(IR)，并用SPSS 19.0进行统计学分析。
2.结果
实验过程中，各组未见裸小鼠死亡。实验结束时，与Control组相比，各组裸小鼠体重均无明显下降。
与Control组肿瘤体积646±55mm3相比，CDK4/6-02 100mg/kg组，CDK4/6-03100mg/kg组,CDK4/6-04 100mg/kg组肿瘤体积分别为397±80mm3(P<0.05)，473±21mm3(P<0.05)，和514±68mm3(见表2和图1)。
与Control组RTV值7.57±0.83相比，CDK4/6-02 100mg/kg组，CDK4/6-03 100mg/kg组,CDK4/6-04 100mg/kg组RTV分别为4.25±0.34(P<0.01)，5.53±0.49和5.83±0.60；T/C值分别为56.23％，73.05％和77.01％(见表2和图2)。
与Control组瘤块重量0.4807±0.0308g相比，CDK4/6-02 100mg/kg组，CDK4/6-03100mg/kg组,CDK4/6-04 100mg/kg组瘤块重量分别为0.2231±0.0568g(P<0.01)，0.3340±0.0307g和0.3659±0.0735g，抑瘤率分别为53.59％，30.52％和23.89％。(见表3和图3)。
3.结论
本实验条件下，CDK4/6-02 200mg/kg，CDK4/6-03 200mg/kg，CDK4/6-04 200mg/kg(q.d.，共22天)灌胃给药能抑制人胃癌MDA-MB-436裸小鼠移植瘤的生长。
表2.CDK4/6系列化合物对人胃癌MDA-MB-436裸小鼠移植瘤体重及肿瘤体积影响
Figure BDA0002103440100000121
Figure BDA0002103440100000122
t-test，与Control相比，***：P<0.001，**：P<0.01，*：P<0.05。
表3. CDK4/6系列化合物对人胃癌MDA-MB-436裸小鼠移植瘤的肿瘤重量的影响
Figure BDA0002103440100000123
Figure BDA0002103440100000124
Figure BDA0002103440100000131
t-test，与Control相比，**：P<0.01，*：P<0.05。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (2)

1.一种CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐在制备预防或治疗结肠癌、肝癌、乳腺癌或乳腺管癌药物中的应用；所述CDK4/6抑制剂结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种药物组合物在制备预防或治疗结肠癌、肝癌、乳腺癌或乳腺管癌药物中的应用，其特征在于，所述组合物包含CDK4/6抑制剂、其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的添加剂；所述CDK4/6抑制剂结构式如下：
Figure 638374DEST_PATH_IMAGE001
。
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