CN110133150B

CN110133150B - 一种分离测定lcz696异构体杂质的方法

Info

Publication number: CN110133150B
Application number: CN201910469003.2A
Authority: CN
Inventors: 代广会; 谢青山; 柳玲; 何伟; 彭磊; 黄雄鸠; 唐安凤; 晏香兰
Original assignee: Chongqing Sansheng Industrial Co ltd
Current assignee: Chongqing Sansheng Industrial Co ltd
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110133150A

Abstract

一种分离测定LCZ696异构体杂质的方法，具有以下步骤：1)取LCZ696或含有LCZ696的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为0.1‑10mg/ml的试样溶液；2)取步骤1)得到的试样溶液，加稀释剂稀释50‑1000倍，得到对照溶液；3)采用多糖衍生物或纤维素衍生物反相涂敷型手性色谱柱，设置流动相的流速为0.4‑0.8ml/min，所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为体积浓度是0.0001‑1.0％的缓冲溶液，流动相B为乙腈‑甲醇混合液，乙腈、甲醇的体积比为75‑85:25‑15，100体积份的流动相B中添加有0‑1体积份的磷酸，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱；4)分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1)试样溶液、步骤2)对照溶液，进样量为5μl‑100μl，利用200nm至280nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中异构体的分离测定。

Description

一种分离测定LCZ696异构体杂质的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种分离测定LCZ696异构体杂质的方法。

背景技术

LCZ696是一种兼具血管紧张素受体阻断作用和中性肽链内切酶抑制剂双重作用(ARB-NEPi)的单分子前体药。口服给药后，LCZ696释放血管紧张素受体阻断剂(ARB)缬沙坦和中性肽链内切酶抑制剂(NEPi)前体药物AHU377，后者随后转化为活性NEP抑制剂LBQ657。拟用于治疗高血压和心力衰竭。其分子式为C48H55N6O8.2.5(H2O).3Na，结构式如式(a)所示。

LCZ696具有两个手性中心，即缬沙坦有一个手性中心，AHU377有一个手性中心，故其具有对映异构体与非对映异构体，统称为异构体杂质，分别为：杂质AHUA、杂质AHUB、杂质AHUC、杂质VAI-A，其结构式分别如式(b)、(c)、(d)、(e)所示。

其中杂质AHUA、杂质VAI-A为对映异构体，杂质AHUB、杂质AHUC为非对映异构体。对于异构体的分离检测，特别是对映异构体，一般采用常规手性柱，利用正向色谱法对其进行分离检测，这种检测方法形成的基线较差，峰形不好，很难达到检测要求。

为了准确地控制LCZ696的质量，有必要寻找一种能将LCZ696与其异构体有效分离的HPLC测定方法，实现LCZ696与其异构体的分离在LCZ696的合成和制剂的质量控制中具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种分离测定LCZ696异构体杂质的方法，其操作简单、方便，可有效分离测定LCZ696异构体杂质，有效控制LCZ696及其产品的质量。

本发明的技术方案是：一种分离测定LCZ696异构体杂质的方法，具有以下步骤，

1)制备试样溶液

取LCZ696或含有LCZ696的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为0.1-10mg/ml的试样溶液；

2)制备对照溶液

取步骤1)得到的试样溶液，加稀释剂稀释50-1000倍，得到对照溶液；

3)采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱或者纤维素衍生物反相涂敷型手性色谱柱，设置流动相的流速为0.4-0.8ml/min，所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为体积浓度是0.0001-1.0％的缓冲溶液，流动相B为乙腈-甲醇混合液，乙腈、甲醇的体积比为75-85:25-15，100体积份的流动相B中添加有0-1体积份的磷酸，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积百分数为65％～75％，流动相B的体积百分数为35％～25％；0分钟至50分钟，流动相A的体积百分数线性减少至55％～45％，流动相B的体积百分数线性增加至45％～55％；50分钟至50.1分钟，流动相A的体积百分数线性增加至65％～75％，流动相B的体积百分数线性减少至35％～25％；50.1分钟至60分钟，流动相A的体积百分数为65％～75％，流动相B的体积百分数为35％～25％；

4)分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1)试样溶液、步骤2)对照溶液，进样量为5μl-100μl，利用200nm至280nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中异构体的分离测定。

步骤1)、步骤2)所述稀释剂为甲醇和水的混合物，甲醇与水的体积比为75-95：25-5。

甲醇与水的体积比为80：20。

步骤3)流动相A为体积浓度是0.001-0.2％的缓冲溶液。

步骤3)所述缓冲溶液为磷酸或磷酸盐溶液或两者的混合物，所述磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵或任意混合。

步骤3)多糖衍生物为直链淀粉或纤维素衍生物；所述纤维素衍生物为纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)。

步骤3)流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积百分数为70％，流动相B的体积百分数为30％；0分钟至50分钟，流动相A的体积百分数线性减少至550％，流动相B的体积百分数线性增加至50％；50分钟至50.1分钟，流动相A的体积百分数线性增加至70％，流动相B的体积百分数线性减少至30％；50.1分钟至60分钟，流动相A的体积百分数为70％，流动相B的体积百分数为30％。

步骤4)进样时，进样量为10μl，利用255nm波长检测，色谱柱的柱温为15-40℃。

色谱柱的柱温为30℃。

采用上述技术方案具有以下有益效果：

1、本发明分离测定方法采用高效液相色谱法，以多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，以缓冲溶液为流动相A，乙腈-甲醇混合液为流动相B，可以有效分离测定LCZ696异构体杂质，主峰与异构体杂质峰分离度及异构体杂质间分离度均符合要求，专属性强。

2、本发明分离测定方法采用加校正因子的自身对照法计算试品中各异构体杂质含量，准确度高，各杂质最小相对检测限为0.002％，表明大于0.002％杂质均能被检出。

3、本发明分离测定方法使用的流动相A及流动相B配制简单、方便，所用试剂均为常见试剂，经济实惠。选用水与甲醇的混合液作为稀释剂溶解样品，可避免样品在流动相中析出；采用梯度洗脱方式调整流动相A、流动相B的体积比，确保能够使LCZ696与异构体之间得到有效分离；配合流动相A，可以增强保留，改善分离度，确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效，本品及各杂质的理论板数大于15000，各已知杂质峰的拖尾因子均在0.95～1.05之间。若流动相A、流动相B的体积比不以梯度调整，或流动相B乙腈、甲醇组分比例不为75-85:25-15，则会导致主峰与异构体杂质峰分离度差甚至无法分离。

本发明分离测定方法有效解决了LCZ696及其异构体难分离的问题，可以准确测定LCZ696及其异构体杂质的含量，从而保证了LCZ696及其制剂的质量可控。

下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。

附图说明

图1为实施例一甲醇-水混合液的液相色谱图；

图2为实施例一混合对照溶液的液相色谱图；

图3为实施例二试样溶液的液相色谱图；

图4为实施例二对照溶液的液相色谱图；

图5为实施例三试样溶液的液相色谱图；

图6为实施例三对照溶液的液相色谱图；

图7为实施例三空白辅料供试液的液相色谱图。

具体实施方式

仪器与条件

高效液相色谱仪选用岛津LC-16型液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以CHIRALCEL OJ-RH柱(5μm，150×4.6mm)为色谱柱。紫外检测器波长：255nm。流动相：以体积浓度为0.01％的磷酸溶液为流动相A，以乙腈-甲醇-磷酸(体积比为800：200：1)为流动相B。梯度洗脱方式：0分钟，流动相A的体积百分数为70％，流动相B的体积百分数为30％；0分钟至50分钟，流动相A的体积百分数线性减少至50％，流动相B的体积百分数线性增加至50％；50分钟至50.1分钟，流动相A的体积百分数线性增加至70％，流动相B的体积百分数线性减少至30％；50.1分钟至60分钟，流动相A的体积百分数为70％，流动相B的体积百分数为30％。柱温为35℃，流速：0.6ml/min。进样体积为10μl。

实施例一：

分别取杂质AHUA、杂质AHUB、杂质AHUC、杂质VAL-A各50mg(AHUA、AHUB、AHUC、VAL-A的纯度均在99％以上)，精密称量，置于50ml量瓶中，加甲醇-水(体积比为80：20)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液；取LCZ696 50mg，精密称定，置于50ml量瓶中，精密加入杂质贮备液0.25ml，加甲醇-水(体积比为80：20)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液，混合对照溶的溶质中，LCZ696浓度为1mg/ml，各已知杂质浓度均为5μg/ml。

分别取甲醇-水(体积比为80：20)、混合对照溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果如图1、图2所示。

图1表明，甲醇-水的混合液及色谱***不干扰测定。

图2中依次出峰的顺序是缬沙坦、杂质VAL-A、AHU377、杂质AHUC、杂质AHUA、杂质AHUB。图2表明，本发明分离测定方法可以有效分离LCZ696及其异构体，可以用于LCZ696中异构体的测定。

实施例二LCZ696原料药(由重庆三圣实业股份有限公司提供)的测定

取LCZ696 50mg，精密称定，置于50ml量瓶中，加甲醇-水(体积比为80：20)超声处理溶解并稀释至刻度，摇匀，作为试样溶液；精密量取试样溶液1ml，置于100ml量瓶，用甲醇-水(体积比为80：20)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；按实施例一的色谱条件进行液相色谱分析。记录色谱图，结果如图3、图4所示。采用加校正因子的自身对照法计算试品中各异构体杂质含量，检测结果如表1：

表1

杂质	含量(wt％)
		VAI-A	0.0179
AHUC	0.0013
		AHUB	0.0052
AHUA	0.0099

实施例三LCZ696片(由重庆三圣实业股份有限公司提供)的测定

取LCZ696片的细粉约210mg(约相当于LCZ696 50mg)，置于50ml量瓶中，加甲醇-水(体积比为80：20)超声处理溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为试样溶液；精密量取试样溶液1ml，置于100ml量瓶，用甲醇-水(体积比为80：20)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另按LCZ696片处方比例取空白辅料适量，照试样溶液相同的方法制备空白辅料供试液；按实施例一的色谱条件进行液相色谱分析。记录色谱图，结果如图5、图6、图7所示。采用加校正因子的自身对照法计算试品中各异构体杂质含量，检测结果如表2：

表2

杂质	含量(wt％)
		VAI-A	0.0154
AHUC	0.0011
		AHUB	0.0022
AHUA	0.0112

Claims

1.一种分离测定LCZ696异构体杂质的方法，其特征在于，具有以下步骤，

1)制备试样溶液

取LCZ696或含有LCZ696的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为0.1-10mg/ml的试样溶液，LCZ696或含有LCZ696的制剂中含有包括如下结构式的异构体杂质(b)、(c)、(d)、(e)，

2)制备对照溶液

3)采用纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)反相涂敷型手性色谱柱，设置流动相的流速为0.4-0.8ml/min，所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为体积浓度是0.0001-1.0％的磷酸溶液，流动相B为乙腈-甲醇混合液，乙腈、甲醇的体积比为75-85:25-15，100体积份的流动相B中添加有0-1体积份的磷酸，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积百分数为65％～75％，流动相B的体积百分数为35％～25％；0分钟至50分钟，流动相A的体积百分数线性减少至55％～45％，流动相B的体积百分数线性增加至45％～55％；50分钟至50.1分钟，流动相A的体积百分数线性增加至65％～75％，流动相B的体积百分数线性减少至35％～25％；50.1分钟至60分钟，流动相A的体积百分数为65％～75％，流动相B的体积百分数为35％～25％；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)、步骤2)所述稀释剂为甲醇和水的混合物，甲醇与水的体积比为75-95：25-5。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，甲醇与水的体积比为80：20。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)流动相A为体积浓度是0.001-0.2％的磷酸溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积百分数为70％，流动相B的体积百分数为30％；0分钟至50分钟，流动相A的体积百分数线性减少至50％，流动相B的体积百分数线性增加至50％；50分钟至50.1分钟，流动相A的体积百分数线性增加至70％，流动相B的体积百分数线性减少至30％；50.1分钟至60分钟，流动相A的体积百分数为70％，流动相B的体积百分数为30％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)进样时，进样量为10μl，利用255nm波长检测，色谱柱的柱温为15-40℃。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，色谱柱的柱温为30℃。