CN107384898A

CN107384898A - 一种利用酒曲中甲醇芽孢杆菌发酵生产耐高温凝乳酶的方法

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Publication number: CN107384898A
Application number: CN201710680314.4A
Authority: CN
Inventors: 杨贞耐; 郑喆; 李柳; 赵笑; 赵娟; 郝晓娜
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-08-10
Also published as: CN107384898B

Abstract

本发明公开了一种利用酒曲中甲醇芽孢杆菌发酵生产耐高温凝乳酶的方法。本发明的甲醇芽孢杆菌分离筛选自黄酒麦曲，保藏编号为CGMCC No.14424。本发明还提供了一种利用甲醇芽孢杆菌液态发酵制备高活性凝乳酶的方法。所述方法包括活化菌株后利用响应面方法对其培养条件进行优化，在其最佳产酶条件下提取凝乳酶并研究酶学性质。试验结果表明：培养条件优化后，制备得到一种新型具有高凝乳酶活性的高温耐受型凝乳酶，凝乳活力高达3.2×10⁶±0.35SU/mg。本发明的凝乳酶生产方法简单易行，成本低，适用于工业化生产。

Description

一种利用酒曲中甲醇芽孢杆菌发酵生产耐高温凝乳酶的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用酒曲中甲醇芽孢杆菌发酵生产耐高温凝乳酶的方法。

背景技术

酿酒过程中酒曲的使用是中国酒的特色，也是中国的伟大发明之一，传统酒曲的本质为粗酶制剂，其中发挥作用的主要是酒曲中的微生物，它们不仅能赋予酒独特的香气还能产生各种酶类，包括淀粉酶和蛋白酶。黄酒麦曲中的凝乳酶就是酒曲中微生物的代谢产物，属于微生物凝乳酶，利用黄酒麦曲中微生物发酵生产的凝乳酶制作干酪能保证产品的食用安全性。

牛奶凝固是干酪制造的基本步骤，在干酪成熟过程中发挥着巨大作用。最早的凝乳酶是从小牛皱胃中获得，但随着干酪需求量的逐渐增加，单靠屠宰大量的犊牛已经远远不能满足人类的需求，而且引发了一些相关的伦理问题，于是研究学者们开始研究从别的途径获取凝乳酶。目前报道产凝乳酶的来源主要有动物源、植物源以及微生物源，由于微生物生长繁殖迅速、不受气候的影响而且具有发酵周期短的特点，已经成为凝乳酶生产的主要来源。目前发现有40余种微生物可生产一定量的凝乳酶，例如米黑毛霉(Mucor michei)、总状毛霉(Mucor racelnosus)和芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等。但由于霉菌有易传播、易污染、生长条件不易控制等特点，使其发展受到了限制。与之相比，细菌的液态发酵生产凝乳酶的发酵周期短、生长和产酶过程易控制、所产的凝乳酶为胞外酶易于提取分离、生产成本低，具有很好的研究开发前景，且文献中未见甲醇芽孢杆菌发酵生产凝乳酶的研究报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus LB-1。

本发明提供的甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus LB-1的保藏编号为CGMCCNo.14424。

上述甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus LB-1的分类命名为甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus，已于2017年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

本发明的另一个目的是提供上述甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液的新用途。

本发明提供了上述甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在生产凝乳酶中的应用。

本发明还提供了上述甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在制备生产凝乳酶的产品中的应用。

本发明还提供了上述甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在生产干酪中的应用。

本发明还提供了上述甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在制备生产干酪的产品中的应用。

上述应用中，所述甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus为甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus LB-1。

本发明还有一个目的是提供一种生产凝乳酶的方法。

本发明提供的生产凝乳酶的方法包括如下步骤：将甲醇芽孢杆菌在产酶培养基中进行发酵培养，得到发酵液，从所述发酵液中提取得到所述凝乳酶；

所述产酶培养基包括α-乳糖、干酪素、K₂HPO₄和酵母浸粉。

上述方法中，所述α-乳糖在所述产酶培养基中的浓度为4.14g/L；

所述干酪素在所述产酶培养基中的浓度为7.47g/L；

所述K₂HPO₄在所述产酶培养基中的浓度为0.60g/L；

所述酵母浸粉在所述产酶培养基中的浓度为8.31g/L；

所述产酶培养基的pH为6.77。

本发明的产酶培养基是将α-乳糖、干酪素、K₂HPO₄、酵母浸粉和水混匀得到的培养基。

上述方法中，所述发酵培养的条件为32.43℃，140r/min发酵培养57.23h。

上述方法中，所述将甲醇芽孢杆菌在产酶培养基中进行发酵培养的方法为将所述甲醇芽孢杆菌种子液接种于产酶培养基中进行发酵培养；

所述甲醇芽孢杆菌种子液是将甲醇芽孢杆菌在LB培养基中培养12h后得到的菌液；

所述甲醇芽孢杆菌种子液按照体积分数为3％的比例接种于所述产酶培养基中；

所述产酶培养基的装液量为30％。

上述方法中，所述甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus为甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus LB-1。

本发明还有一个目的是提供上述产酶培养基。

上述方法制备得到的凝乳酶也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供上述产酶培养基的新用途。

本发明提供了上述产酶培养基在生产凝乳酶中的应用。

本发明还提供了上述产酶培养基在提高凝乳酶的凝乳活力中的应用。

本发明还提供了上述产酶培养基在提高凝乳酶的高温耐性中的应用。

本发明还提供了上述产酶培养基在生产干酪中的应用。

本发明首先提供了一株产凝乳酶的甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus，保藏编号为CGMCC No.14424，该菌株分离筛选自黄酒麦曲。本发明还提供了一种利用甲醇芽孢杆菌液态发酵制备高活性凝乳酶的方法。所述方法包括活化菌株后利用响应面方法对其培养条件进行优化，在其最佳产酶条件下提取凝乳酶并研究酶学性质。试验结果表明：培养条件优化后，制备得到一种新型具有高凝乳酶活性的高温耐受型凝乳酶，凝乳活力高达3.2×10⁶±0.35SU/mg。本发明的凝乳酶生产方法简单易行，成本低，适用于工业化生产。

附图说明

图1为筛菌及鉴定图。

图2为LB-1菌株发酵液的凝乳活力与蛋白水解活力测定结果及凝块风味谱图。图2A为LB-1菌株发酵液的凝乳活力和蛋白水解活力测定结果；图2B是气相色谱法检测得到的凝块风味谱图。

图3为响应面优化培养条件等高线图。

图4为乙醇体积分数对凝乳酶提取的影响及凝乳酶的酶学性质。

保藏说明

菌种名称：甲醇芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus methanolicus

菌株编号：LB-1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2017年7月14日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.14424

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的黄酒麦曲购买自张家口北宗黄酒酿造有限公司。

实施例1、甲醇芽孢杆菌LB-1的获得及鉴定

一、甲醇芽孢杆菌LB-1的分离纯化

称取0.5g粉碎好的麦曲(黄酒麦曲)加入装有4.5mL无菌生理盐水的试管中，在振荡器中混匀，使麦曲均匀分散在无菌生理盐水中，制得的样品稀释度为10^-1。然后将样品依次进行10倍梯度稀释，直到稀释度为10^-7。各取100μL 10^-3到10^-7的稀释液分别涂布于LB(酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉15g，蒸馏水1L)、YEPD(酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水1L)和PDA(马铃薯浸粉15g，葡萄糖3g，琼脂粉15g，蒸馏水1L)三种固体培养基中，实验重复三次。然后将培养基倒置于30℃恒温培养箱中进行培养，在培养第2d、3d和4d时挑取少量形态大小不同的菌落接种于相应的固体培养基中进行分离纯化，直至得到单菌株，并进行编号。分离纯化后将已编号的单菌株保存在甘油管中。

将初筛中得到的单一菌株以三点法接种于酪蛋白固体培养基(蛋白胨2.5g，葡萄糖10g，酵母膏1g，干酪素10g，琼脂粉20g，脱脂牛乳50g，琼脂粉15g，蒸馏水1L)中，在37℃恒温培养2d，产凝乳酶的菌株可形成凝乳圈和水解圈，取少量产凝乳圈和水解圈的菌株接种在LB液体培养基中，30℃，120r/min振荡培养24h后测定菌株发酵液的凝乳活力和蛋白水解活力。并从结果中选取一株凝乳活力高、蛋白水解活力低的菌株，将其命名为LB-1，接种在斜面培养基中保存在4℃冰箱。

二、LB-1菌株的鉴定

1、LB-1菌株的形态鉴定

将分离得到的LB-1菌株接种于LB固体培养基中，然后放在37℃恒温培养24h后分别通过肉眼和显微镜观察菌株形态。

肉眼观察结果：LB-1菌株呈乳白色、不透明、不光滑、较干燥(图1A)，革兰氏染色后在显微镜下观察结果：LB-1菌株为长杆状，革兰氏阳性反应(图1B)。

2、LB-1菌株的生理生化特征分析

用无菌棉签将平板培养好的新鲜菌体(LB-1菌株)全部挑取置含有1mL无菌生理盐水的试管中制成细菌悬液，将两滴细菌悬液接种于10mL API 50CHB/E培养基(硫酸铵2g，酵母膏0.5g，胰蛋白胨1g，酚红0.18g)的安甁中，然后分别加入API 50CHB试剂盒各孔内，37℃静置培养24h和48h，通过观察试剂盒各孔颜色的变化确定各反应结果的阴阳性，其中红色代表反应结果阴性，黄色和黑色代表反应结果阳性。根据其主要糖反应结果(表1)并参考伯杰式细菌鉴定手册可初步确定LB-1菌株为芽孢杆菌属。

表1、LB-1菌株的生理生化特征分析

3、LB-1菌株的分子鉴定

将LB-1菌株接种于LB液体培养基中，30℃，120r/min振荡培养12h后离心，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取LB-1菌株的全基因组DNA。并以提取的基因组DNA作为PCR反应的模板，采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，得到PCR产物，即为LB-1菌株的16SrDNA基因。引物序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增是否成功。电泳结果如图1C所示。将有特异性条带的PCR产物送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。测序结果表明：LB-1菌株的16S rDNA基因序列为序列1。基于LB-1菌株的16S rDNA基因序列及其他序列利用MEGA6.0软件构建***发育进化树。结果表明：LB-1菌株与Bacillus methanolicus PB1(AFEU01000004.1)在同一分支上且置信度支持率高达99％(图1D)。

综合上述鉴定结果，确定LB-1菌株的分类命名为甲醇芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus，该菌株已于2017年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.14424。

实施例2、LB-1菌株的凝乳活力测定和蛋白水解活力测定

一、LB-1菌株的凝乳活力测定

1、LB-1菌株发酵液的制备

取少量LB-1菌株接种于LB液体培养基中，在30℃，120r/min条件下振荡12h，作为活化种子液，然后以3％(体积分数)的接种量接种于LB液体培养基中，装液量为40％(v/v)，在30℃，120r/min条件下振荡培养，得到LB-1发酵液。分别在培养0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h时，取LB-1发酵液作为待测菌液。实验重复三次。

2、LB-1发酵液的凝乳活力测定

将脱脂乳(购买自恒天然商贸上海有限公司)溶解在浓度为0.01mol/L的CaCl₂溶液中制成体积分数为10％的脱脂乳溶液，室温下静置30min，分别量取5mL 10％的脱脂乳溶液分装到小试管中，于35℃恒温水浴箱中保温5min，在35℃条件下分别取0.5mL待测菌液加入到装有5mL 10％的脱脂乳溶液的试管中，摇匀后开始计时，当开始出现絮状沉淀时立即停止计时。按照如下公式计算凝乳酶凝乳活力(MCA)：MCA＝2400×V1×n/t/V2。式中：凝乳酶凝乳活力单位为SU/mL；V1为脱脂牛奶溶液体积/mL；t为凝乳时间/s；V2为所加菌液体积/mL；n为菌液稀释倍数。并计算C/P值(C指凝乳活力MCA，P指蛋白水解活力PA，凝乳活力与蛋白水解活力的比值即为C/P值)。

结果表明：LB-1菌株发酵液在发酵24h时其凝乳活力最高，达到269.66±1.4SU/mL，C/P值为187.5(图2A)。

3、凝块的质构特性检测

将培养24h的LB-1发酵液在10000r/min，4℃条件下离心30min，收集LB-1上清液，同时以酶活力为3.5×10⁵SU/g的商品凝乳酶(购买自科汉森有限公司，产品目录号为Material 142514)稀释1000倍作为对照。按照步骤2中的方法分别添加相同量的商品酶与LB-1上清液测定其凝乳时间，并利用TexturePro CT V1.8Build 31质构仪对凝块进行质构分析。

结果表明：LB-1上清液和商品凝乳酶形成凝块的硬度、粘性、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性均无显著性差异(表2)。

表2、LB-1上清液和商品凝乳酶的质构特性检测结果

TPA参数	对照	LB-1	主体间效应检验(P值)
				第一循环硬度(g)	309.25±0.05	287.85±0.17	0.116
粘力(g)	2.80±0.56	5.35±0.17	0.254
				粘性(mJ)	0.03±0.47	0.04±0.71	0.073
内聚性	0.56±0.26	0.44±0.06	0.593
				弹性(mm)	1.78±0.23	1.68±0.12	0.896
弹性指数	0.36±0.24	0.34±0.12	0.450
				胶着性(g)	156.60±0.09	128.20±0.23	0.200
咀嚼性(mJ)	3.69±0.32	2.15±0.34	0.323

4、凝块的持水性能检测

添加相同量的商品酶与LB-1上清液至装有5mL 10％的脱脂乳溶液的离心管中，凝乳后进行离心操作，离心操作条件：4℃，7000r/min离心10min，分别收集上清液并称重。按照如下公式计算持水力：持水力(％)＝上清质量/样品质量×100％。

结果表明：商品酶的持水力为90.05±0.027％，LB-1菌株的持水力为90.19±0.010％。LB-1菌株凝块持水力与商品凝乳酶无显著性差异。

综合上述凝块的质构特性和持水性能的分析结果，LB-1菌株上清液所形成凝块的细腻度和爽滑性优良，且持水力高，可用于干酪的生产。

5、凝块的风味检测

通过GC-MS法分别检测LB-1发酵后的离心上清液(步骤3中的LB-1上清液)和商品凝乳酶所形成的凝块风味。具体方法如下：量取9mL脱脂乳溶液加入到50mL萃取瓶中，分别加入1mL的LB-1上清液和稀释1000倍的商品凝乳酶，盖好盖子后放在40℃恒温水浴锅中平衡30min，将进样针***萃取瓶中40℃吸附30min后，拔出进样针***气相色谱进样口中，250℃条件下解析5min。

(1)GC条件

程序升温：初始温度为40℃，保持3min，然后以5℃/min升温到200℃，保持0min，再以10℃/min升温到250℃，保持3min后运行3min。载气(He)，恒定流速为1.2mL/min，进样口温度250℃，分流比5:1。

(2)质谱条件

电子轰击离子源，电子能量为70eV，传输线温度为280℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，质量扫描范围为40～250m/z。

结果表明：LB-1上清液和商品凝乳酶所形成凝块的主要风味物质均为醛类且均无异味物质产生(图2B)。

二、LB-1菌株的蛋白水解活力测定

1、取3支试管编号为1、2、3，每管中加入LB-1发酵液(培养0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h时的LB-1发酵液)1mL，置于40℃水浴中预热2min。

2、然后向各管中加入经同样预热的1mL 1％的酪蛋白溶液(将5g干酪素溶于50mL蒸馏水中)，精确保温10min，再立即向各管中加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸溶液来终止反应。

3、继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后过滤，收集滤液。

4、然后另取三支试管，每管中加入1mL滤液、5mL 0.4mol/L的碳酸钠溶液和5mL稀释5倍(浓度为0.2mol/L)的福林酚试剂(购买自北京半夏科技发展有限公司)，摇匀，在40℃水浴中保温发色20min后测定光密度(OD₆₆₀)。空白对照组在加入酪蛋白之前先加入2mL0.4mol/L的三氯乙酸使酶失活，再加入酪蛋白溶液，其他步骤不变。

5、根据如下公式计算凝乳酶蛋白水解活力：PA＝OD₆₆₀×K×4/T。式中：PA为凝乳酶蛋白水解活力；K为每度OD₆₆₀所相当的酪氨酸量；T为反应时间。

结果表明：LB-1菌株发酵液在发酵24h时其蛋白水解活力为3.11U/mL(图2A)。

实施例3、LB-1菌株培养条件的优化

一、培养基组分的优化

1、不同碳源对凝乳活性的影响

(1)不同碳源培养基的配制

分别选取如下不同种类的碳源：果糖(北京半夏科技发展有限公司，货号为a3125)、可溶性淀粉(国药集团化学试剂有限公司，货号为20120405)、葡萄糖(北京半夏科技发展有限公司，货号为b2657)、α-乳糖(国药集团化学试剂有限公司，货号为20111025)、蔗糖(北京半夏科技发展有限公司，货号为b3075)、半乳糖(北京半夏科技发展有限公司，货号为b2650)添加到原培养基(酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1L)中，使其浓度均为5g/L，其余成分保持不变。并以原培养基作为对照。

(2)不同碳源对凝乳活性的影响

将LB-1活化种子液(实施例2步骤一中的1)按照体积分数为3％的接种量分别接种于步骤(1)中的不同碳源培养基中，在30℃、120r/min条件下培养24h，收集LB-1发酵液，按照实施例2步骤一的2中的方法测定LB-1发酵液的凝乳活力。

结果表明：当碳源为α-乳糖时凝乳活力最高，达到299.66±0.02SU/mL。

(3)不同浓度的α-乳糖对凝乳活性的影响

将α-乳糖碳源培养基中的α-乳糖浓度分别替换为1g/L、3g/L、7g/L、9g/L、11g/L、13g/L和15g/L进行实验，且保持其他步骤不变。

结果表明：当α-乳糖浓度为5g/L时凝乳活力最高，达到320.00±0.01SU/mL。

2、不同氮源对凝乳活性的影响

(1)不同氮源培养基的配制

分别选取如下不同种类的氮源替换原培养基中的胰蛋白胨：蛋白胨(北京全品速生物科技有限公司，货号为p6463-1kg)、大豆蛋白胨(北京金锐林科技发展有限公司，货号为hb8275)、脱脂乳粉(北京半夏科技发展有限公司，货号为p2216)、干酪素(北京伊诺凯科技有限公司，货号为88892b)、牛肉膏(北京奥博星生物技术有限责任公司，货号为01-009)、硫酸铵(北京半夏科技发展有限公司，货号为d2091)、柠檬酸铵(北京半夏科技发展有限公司，货号为b2338)，使其浓度均为10g/L，其余成分保持不变。并以原培养基作为对照。

(2)不同氮源对凝乳活性的影响

将LB-1活化种子液按照体积分数为3％的接种量分别接种于步骤(1)中的不同氮源培养基中，在30℃、120r/min条件下培养24h，收集LB-1发酵液，按照实施例2步骤一的2中的方法测定LB-1发酵液的凝乳活力。

结果表明：当氮源为干酪素时凝乳活性最高，达到268.16±0.01SU/mL。

(3)不同浓度干酪素对凝乳活性的影响

将干酪素氮源培养基中的干酪素浓度分别替换为2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、12g/L、14g/L和16g/L进行实验，且保持其他步骤不变。

结果表明：当干酪素浓度为8g/L时凝乳活力最高，达到406.78±0.01SU/mL。

3、酵母浸粉浓度对凝乳活性的影响

(1)不同浓度酵母浸粉培养基的配制

分别选取如下不同浓度的酵母浸粉(北京奥博星生物技术有限责任公司，货号为01-002)：0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L和12g/L添加到原培养基中，其余组分保持不变，并以原培养基作为对照。

(2)不同浓度酵母浸粉对凝乳活性的影响

将LB-1活化种子液按照体积分数为3％的接种量分别接种于步骤(1)中的不同浓度酵母浸粉培养基中，在30℃、120r/min条件下培养24h，收集LB-1发酵液，按照实施例2步骤一的2中的方法测定LB-1发酵液的凝乳活力。

结果表明：当酵母浸粉浓度为8g/L时凝乳活力最高，达到296.30±0.02SU/mL。

4、金属离子种类对凝乳活性的影响

(1)不同金属离子培养基的配制

选取如下不同种类的金属离子替换原培养基中的氯化钠：氯化钙、氯化钾、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰以及不添加任何金属离子，使金属离子在培养基中的浓度均为10g/L，其余成分保持不变。并以原培养基作为对照。

(2)金属离子种类对凝乳活性的影响

将LB-1活化种子液按照体积分数为3％的接种量分别接种于步骤(1)中的不同金属离子培养基中，在30℃、120r/min条件下培养24h，收集LB-1发酵液，按照实施例2步骤一的2中的方法测定LB-1发酵液的凝乳活力。

结果表明：当不加金属离子时凝乳活性最高，达到406.78±0.01SU/mL。说明金属离子的存在对菌株发酵液的凝乳活性没有促进作用。

5、不同磷酸盐种类对凝乳活性的影响

(1)不同磷酸盐种类培养基的配制

选取如下不同种类的磷源：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠添加到原培养基中，使磷酸盐浓度均为1g/L，其余成分保持不变。并以原培养基作为对照。

(2)不同磷酸盐种类对凝乳活性的影响

将LB-1活化种子液按照体积分数为3％的接种量分别接种于步骤(1)中的不同磷酸盐种类培养基中，在30℃、120r/min条件下培养24h，收集LB-1发酵液，按照实施例2步骤一的2中的方法测定LB-1发酵液的凝乳活力。

结果表明：当磷酸盐为磷酸氢二钾时凝乳活性最高，达到287.43±0.01SU/mL。

(3)不同浓度磷酸盐种类对凝乳活性的影响

将磷酸氢二钾磷酸盐培养基中的磷酸氢二钾浓度分别替换为0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L和1.8g/L进行实验。

结果表明：当磷酸氢二钾浓度为0.6g/L时凝乳活力最高，达到282.35±0.01SU/mL。

6、最优产酶培养基

通过单因素实验分析了不同碳源、氮源、金属盐、磷酸盐对甲醇芽孢杆菌发酵生产凝乳酶的影响，并采用响应面法(图3A)对筛选出的产酶培养基中α-乳糖、干酪素、K₂HPO₄、酵母浸粉含量四个主要因素通过Box-Benhnken试验设计并经过方差分析确定了甲醇芽孢杆菌产凝乳酶的优化培养基组成为：α-乳糖4.14g/L，干酪素7.47g/L，K₂HPO₄ 0.60g/L，酵母浸粉8.31g/L。

最优产酶培养基是将α-乳糖、干酪素、K₂HPO₄、酵母浸粉和水混匀得到的培养基，各溶质在培养基中的浓度为α-乳糖4.14g/L，干酪素7.47g/L，K₂HPO₄ 0.60g/L，酵母浸粉8.31g/L。

7、最优产酶培养基的应用

将LB-1活化种子液按照体积分数为3％的接种量接种于步骤6中的最优产酶培养基中，在30℃、120r/min条件下培养24h，收集LB-1发酵液，按照实施例2步骤一的2中的方法测定LB-1发酵液的凝乳活力。

结果表明：LB-1菌株在最优产酶培养基中培养24h后获得的LB-1发酵液的凝乳活力为329.90±0.04SU/mL，接近理论预测值379.53SU/mL。

二、最优培养条件

在最优培养基组分条件下，通过单因素试验并采用Plackett-Burman试验设计对影响甲醇芽孢杆菌发酵产酶的7个因素(发酵时间、发酵温度、转速、发酵液初始pH、接种量、装液量、种龄)进行评价，筛选出了3个具有显著影响作用的因素即发酵温度、发酵时间和发酵液初始pH(图3B)。并通过响应面中的中心组合试验设计(图3C)确定了甲醇芽孢杆菌发酵产凝乳酶的最佳工艺条件为：发酵温度32.43℃，发酵时间57.23h，pH 6.77，接种量(V/V)3％，装液量(V/V)30％，转速140r/min，种龄12h。

三、最优产酶培养基及最优培养条件在甲醇芽孢杆菌发酵产酶中的应用

1、将LB-1菌株接种于LB培养基中进行种子培养，培养12h，得到LB-1活化种子液；

2、将LB-1活化种子液按照体积分数为3％的接种量接种于步骤一6中的最优产酶培养基(pH 6.77)中，装液量(V/V)为30％，在32.43℃，转速140r/min条件下发酵培养57.23h，收集LB-1发酵液，按照实施例2步骤一的2中的方法测定LB-1发酵液的凝乳活力。

结果表明：LB-1菌株在最优产酶培养基及最优培养条件下发酵培养，获得的LB-1发酵液的凝乳活力为578.40±0.02SU/mL，接近理论预测值530.682SU/mL。经过对其培养条件进行优化，发酵产酶活力为原来的2.14倍。

实施例4、凝乳酶的制备及酶学性质研究

一、甲醇芽孢杆菌所产凝乳酶的提取

1、将实施例3步骤三中发酵结束后获得的LB-1发酵液在10000rpm、4℃条件下离心30min(目的是去除菌体细胞)，收集上清液(粗酶液)。

2、在4℃条件下向粗酶液中加入预冷的无水乙醇，使无水乙醇的体积分数分别为为20％、30％、40％、50％、60％、70％和80％。在4℃条件下静置24h后在10000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清液，收集沉淀。

3、用5mmol/L的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到凝乳酶溶液。按照实施例2步骤一的2中的方法测定凝乳酶溶液的凝乳酶活力。

实验结果表明：当无水乙醇的体积分数为70％时凝乳酶活力最高，达到470.77±0.03SU/mL(图4A)。

4、选用体积分数为70％的无水乙醇对凝乳酶进行沉淀分离后用透析袋(8000-14000Da)在4℃条件下透析48h，冷冻干燥后即得凝乳酶冻干粉，放在-78℃冰箱中保存备用。

二、甲醇芽孢杆菌所产凝乳酶的酶学性质研究

1、温度对凝乳活力的影响及凝乳酶的热稳定性

(1)分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃条件下按照实施例2步骤一的2中的方法测定步骤一中提取得到的凝乳酶的凝乳活力，试验重复三次，绘制不同温度下凝乳酶的酶活力曲线图。

结果表明：当温度为50℃时凝乳酶活力最高为3.2×10⁶±0.35SU/mg(图4B)。

(2)将酶液分装于试管中，在25℃、35℃、45℃、55℃和65℃条件下分别保温10min、20min、30min、40min、50min和60min，冷却后在最适温度50℃条件下按照实施例2步骤一的2中的方法测定发酵液的剩余凝乳活力。

结果表明：在60℃和65℃条件下凝乳酶损失较严重，40℃时几乎无损失，其余温度条件下该菌株所产凝乳酶损失较少，保持1h后剩余凝乳酶活力最低仍为6.7×10⁵SU/mg，酶活较高(图4C)。说明LB-1菌株所产凝乳酶是一种新型的具有高凝乳酶活性的高温耐受型凝乳酶。

2、pH对凝乳活力的影响及凝乳酶的pH稳定性

(1)用0.1mol/L的盐酸和0.1mol/L的氢氧化钠将脱脂乳调节为如下不同pH值：5、5.5、6、6.5、7和7.5，在酶最适宜的凝乳温度(50℃)下按照实施例2步骤一的2中的方法测定步骤一中提取得到的凝乳酶溶液的凝乳活力。

结果表明：在pH为6.5的条件下凝乳酶活性最高为1.007×10⁶±0.12SU/mg(图4D)。

(2)用0.1mol/L的盐酸和0.1mol/L的氢氧化钠将步骤一中提取得到的凝乳酶溶液调为如下不同pH值：5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5，在4℃条件下放置1h后，再将酶液的pH调回到最适pH值(6.5)并按照实施例2步骤一的2中的方法测定其凝乳活性。

结果表明：在pH值为6.5时凝乳酶的稳定性最好，过酸或过碱的条件下均不利于凝乳酶的稳定存在(图4E)。

3、金属离子对凝乳酶活力的影响

(1)在体积分数为10％的脱脂乳溶液中分别添加如下金属离子：Ca²⁺、Na⁺、Al³⁺、Fe³ ⁺、K⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺，使其浓度均为5mmol/L，在50℃条件下按照实施例2步骤一的2中的方法测定步骤一中提取得到的凝乳酶的凝乳活力，以不添加金属离子的体积分数为10％的脱脂乳溶液作为对照组。

结果表明：添加Ca²⁺能显著提高凝乳酶的凝乳活力，凝乳活力达到4.72×10⁵±0.083SU/mg。对照组与添加Na⁺和K⁺金属离子时均不能使凝乳酶发生凝结(图4F)。

(2)在体积分数为10％的脱脂乳溶液中添加Ca²⁺，使其浓度分别为0.005mol/L、0.010mol/L、0.015mol/L、0.020mol/L、0.025mol/L、0.030mol/L、0.035mol/L、0.040mol/L、0.045mol/L和0.050mol/L，在50℃条件下按照实施例2步骤一的2中的方法测定步骤一中提取得到的凝乳酶的凝乳活力。

结果表明：随着Ca²⁺浓度增加，凝乳酶活力先增加后下降，当浓度为0.025mol/L时，凝乳酶活力最高，达到1.27×10⁶±0.07SU/mg(图4G)。

4、酶动力学特性研究

分别配制如下不同浓度的0g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、14g/L、16g/L和18g/L的酪蛋白溶液，在40℃条件下按照实施例2步骤一的2中的方法测定步骤一中提取得到的凝乳酶的蛋白水解活力，并取倒数作图。

结果如图4H和图4I所示。结果表明：Km值为8.045g/L，Vmax为23.70U/mL。

序列表

<110>北京工商大学

<120>一种利用酒曲中甲醇芽孢杆菌发酵生产耐高温凝乳酶的方法

<160>1

<210>1

<211>1443bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ctgcaccttc ggcggctggc tcataaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc 60

tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat 120

ccgcgattac tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga 180

gaacagattt gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg 240

tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc 300

tccggtttgt caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca 360

agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca 420

tgcaccacct gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat 480

gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540

tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt 600

gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg 660

tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca 720

gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca 780

tttcaccgct acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca 840

atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc 900

cctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc 960

acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta tttgaacggc 1020

acttgttctt ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg 1080

ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 1140

ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc 1200

gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg 1260

tagccgaagc caccttttat gtctgaacca tgcggttcaa acaaccatcc ggtattagcc 1320

ccggtttccc ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc 1380

cgccgctaac atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gacttgcatt atagcacgcc 1440

gcc 1443

Claims

1.一株甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus LB-1，其保藏编号为CGMCC No.14424。

2.甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在生产凝乳酶中的应用；

或，甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在制备生产凝乳酶的产品中的应用；

或，甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在生产干酪中的应用；

或，甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在制备生产干酪的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述甲醇芽孢杆菌Bacillusmethanolicus为甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus LB-1。

4.一种生产凝乳酶的方法，包括如下步骤：将甲醇芽孢杆菌在产酶培养基中进行发酵培养，得到发酵液，从所述发酵液中提取得到所述凝乳酶；

所述产酶培养基包括α-乳糖、干酪素、K₂HPO₄和酵母浸粉。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述α-乳糖在所述产酶培养基中的浓度为4.14g/L；

所述干酪素在所述产酶培养基中的浓度为7.47g/L；

所述K₂HPO₄在所述产酶培养基中的浓度为0.60g/L；

所述酵母浸粉在所述产酶培养基中的浓度为8.31g/L；

所述产酶培养基的pH为6.77。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为32.43℃，140r/min发酵培养57.23h。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述将甲醇芽孢杆菌在产酶培养基中进行发酵培养的方法为将甲醇芽孢杆菌种子液接种于产酶培养基中进行发酵培养；

或，所述甲醇芽孢杆菌种子液是将甲醇芽孢杆菌在LB培养基中培养12h后得到的菌液；

或，所述甲醇芽孢杆菌种子液按照体积分数为3％的比例接种于所述产酶培养基中；

或，所述产酶培养基的装液量为30％。

8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述甲醇芽孢杆菌Bacillusmethanolicus为甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus LB-1。

9.权利要求4中所述的产酶培养基；

或，权利要求4-8所述的方法制备得到的凝乳酶。

10.权利要求9所述的产酶培养基在生产凝乳酶中的应用；

或，权利要求9所述的产酶培养基在提高凝乳酶的凝乳活力中的应用；

或，权利要求9所述的产酶培养基在提高凝乳酶的高温耐性中的应用；

或，权利要求9所述的产酶培养基在生产干酪中的应用。