CN110090308A

CN110090308A - 制备偶联物的方法

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Publication number: CN110090308A
Application number: CN201910061779.0A
Authority: CN
Inventors: 宋帅; 田强; 唐祖建; 邓汉文; 汪静; 刘登念; 胡瑞斌; 肖亮; 薛彤彤; 蔡家强; 王利春; 王晶翼
Original assignee: Sichuan Kelun Botai Biological Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Current assignee: Sichuan Kelun Botai Biological Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2019-01-23
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2039-01-23
Also published as: CN111447939A; CN110090308B; WO2019149116A1

Description

制备偶联物的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域。具体而言，本发明涉及制备靶向药物-生物活性分子偶联物的方法、由所述方法制备得到的产品以及该产品在预防和/或治疗与细胞活性异常相关的增殖性疾病(包括但不限于癌症疾病)中的用途。

背景技术

化疗一度是癌症的标准疗法，但高杀伤力的生物活性分子会误杀正常细胞，从而引起严重的副作用。靶向抗肿瘤药物由于同时具有靶向性和抗肿瘤活性，已成为当今肿瘤研究领域的热点。20世纪以来，将生物大分子药物(例如治疗性抗体或抗体片段)和靶向小分子配体用于抗肿瘤药物的开发及肿瘤靶向治疗已取得突破性进展。然而，生物大分子药物虽然靶向性强，但对实体瘤的治疗效果有限；而生物活性分子虽然对癌细胞具备高度的杀伤效力，但往往缺乏靶向性，常常误伤正常细胞，从而引起严重毒副作用。

近年来研究发现，可将治疗性抗体与生物活性分子相连，形成抗体-药物偶联物(ADC)。ADC融合了抗体的靶向作用和生物活性分子的高活性，成为一种“生物导弹”。抗体引导ADC结合到靶细胞，随后被细胞内化，释放药物以治疗疾病。由于抗体对肿瘤细胞相关靶点具有特异性和靶向性，其应用价值不仅体现在治疗方面，同时还成为药物靶向输送的理想载体，降低了药物的副作用。小分子药物偶联物(SMDC)和抗体-药物偶联物(ADC)的设计原理相同，即通过化学方法把生物活性分子和一些能选择性地结合至肿瘤细胞表面受体的小分子配体偶联，由此提高效应分子对肿瘤细胞的靶向性。SMDC的化学结构和ADC几乎完全一样，但是采用小分子配体替代抗体。目前，尚无SMDC上市。

目前，已经上市的ADC有四种：Mylotarg(Gemtuzumab Ozogamicin，吉妥珠单抗奥唑米星)、Adcetris(Brentuximab Vedotin，CD30单抗-MMAE)、Kadcyla(TrastuzumabEmtansine，曲妥珠单抗-美登素生物碱)和Besponsa(Inotuzumab ozogamicin，CD22单抗-卡奇霉素)。

通常，ADC药物由抗体、生物活性分子及连接基组成。生物活性分子通过连接基共价偶联到抗体上。抗体(例如单克隆抗体)能够特异性地识别癌细胞表面的特异性靶点，进而能够引导ADC到达癌细胞表面，并使ADC通过细胞内吞效应进入癌细胞。生物活性分子可在胞内释放，从而达到专一性杀灭癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。

赖氨酸是抗体中最常见的连接位点，其ε-氨基可以与连接基的活化羧基反应，形成酰胺键，这是目前最为常用的偶联技术。随着研究的深入，已出现可以实现定点偶联的技术，即以五氟苯酚活化连接基的羧基，再与抗体中赖氨酸ε-氨基形成酰胺键，以完成生物活性分子与抗体的偶联。但是此偶联技术也存在一些不足，由于羧基活化所得的五氟苯酚酯反应活性高，化学稳定性差，甚至在某些特定的结构中无法稳定存在，导致偶联反应难以进行，进而使得ADC偶联效率极低，甚至无法获得。

发明内容

季铵盐或氮氧化物结构具有良好的理化性质(例如亲水性)，会极大地改善ADC的药代动力学性质，并且具有季铵盐或氮氧化物结构的ADC的亲水性提高，有利于减少其抗体部分发生交联，从而有助于降低ADC药物的毒性。此外，在ADC药物制备过程中，需要采用活化基团对连接基中末端的羧基进行活化，由于五氟苯酚具有较好的离去性质，因此目前采用五氟苯酚活化羧基。但在制备具有季铵盐或氮氧化物结构的ADC过程中，发现包含季铵盐或氮氧化物结构的五氟苯酚酯反应活性太高，无法稳定存在，使得偶联反应无法进行，获得ADC的产率极低。通过深入地研究，令人惊奇地发现了本发明中靶向药物与生物活性分子偶联的新方法，即利用新的羧基活化方式极大地改善了连接基中活化羧基的稳定性，成功克服了使用五氟苯酚活化羧基的偶联技术无法获得稳定的五氟苯酚酯的难题，同时以较高的偶联比例实现生物活性分子与靶向药物的偶联。此偶联方法可广泛应用于靶向药物-生物活性分子偶联物的合成。

本发明的第一方面提供制备通式(II)的偶联物的方法，

所述方法包括将通式(I)的化合物与含有一个或多个氨基(-NH₂)的靶向药物偶联，

其中：

T选自以下结构：

L₁为所述基团通过1或2标记的两个位置之一与T连接，并且通过另一位置与L₂连接；优选地，所述基团通过1标记的位置与T连接，并且通过2标记的位置与L₂连接；

L₂为选自以下的基团：所述基团通过1或2标记的两个位置之一与L₁连接，并且通过另一位置与L₃连接；优选地，所述基团通过1标记的位置与L₁连接，并且通过2标记的位置与L₃连接；更优选地，L₂为所述基团通过1标记的位置与L₁连接，并且通过2标记的位置与L₃连接；

L₃选自任选地被一个或多个R_i取代的下列基团：

所述基团通过1或2标记的两个位置之一与R₁连接，并且通过另一位置与L₂连接；优选地，所述基团通过1标记的位置与R₁连接，并且通过2标记的位置与L₂连接；

其中：

E为平衡离子，优选为卤素阴离子，且更优选为氯离子、溴离子或碘离子；

R_q在每次出现时各自独立地选自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基和C_3-8环烷基；

R_p在每次出现时各自独立地选自C_1-6烷基、C_3-6环烷基、C_1-6烷氧基和-C_1-2烷基-氰基，优选为-CH₂CN和-CH₂CH₂CN；

β为0、1或2的整数；并且

γ在每次出现时各自独立地为1、2或3的整数；

R_i选自H(氢)、D(氘)、卤素、＝O、CF₃、CN、CH₂CN、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-10烯基、C_3-8环烷基、C_2-10炔基、COOH和SO₃H，优选地，R_i选自H(氢)、D(氘)、＝O、CN、CH₂CN、甲基和CF₃；

R₁选自任选地被一个或多个R_b取代的下列基团：C_1-6亚烷基、C_3-10亚环烷基、C_6-10亚芳基和5-10元亚杂芳基，其中R_b为H(氢)、D(氘)、卤素、氰基、硝基、三氟甲基、COOH或SO₃H；

Z为氧原子或硫原子，且优选为氧原子；

R₂选自任选地被一个或多个R_a取代的下列基团：C_1-6烷基和且R_a为氟或者硝基，条件是当R_a为氟时，R₂不是全氟代的苯基；

A为靶向药物中移除α个氨基后所得的基团，且所述靶向药物选自曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或Sacituzumab；

m、n和r在每次出现时各自独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；优选地，m、n各自独立地选自0、1、2、3，且r选自0、1、2；更优选地，m、n为1，且r为0；并且

α选自1、2、3或4，优选地，α选自1或2。

本发明的第二方面提供通式(II)的偶联物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物，所述通式(II)的偶联物通过上述方法制备得到，

其中各基团如上文所定义。

本发明的第三方面提供制备通式(I)的化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物的方法，所述方法包括将通式(I-0)的化合物与R₂-ZH反应得到通式(I)的化合物，

其中各基团如上文所定义。

本发明的第四方面提供通式(I)的化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物，

其中各基团如上文所定义。

本发明的第五方面提供药物组合物，其包含根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物以及一种或多种药学上可接受的载体，并且所述药物组合物任选地进一步包含一种或多种其他抗癌药如化疗剂和/或抗体。所述药物组合物优选为固体制剂、半固体制剂、液体制剂或气态制剂。

本发明的第六方面提供药物制剂，其包含根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物，或者包含本发明第五方面的药物组合物。

本发明的第七方面提供根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物在制备用于预防或治疗癌症疾病的药物中的用途。

本发明的第八方面提供根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物，其用于预防或治疗癌症疾病。

本发明的第九方面提供预防或治疗癌症疾病的方法，所述方法包括向需要其的个体给药有效量的根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的术语具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本发明中，术语“偶联物”是指生物活性分子与靶向药物连接得到的物质。在本发明的部分实施方案中，生物活性分子与靶向药物通过连接基相连。所述连接基在特定环境(例如胞内低pH值环境)中或特定作用(例如溶酶体蛋白酶的作用)下能够断裂，从而使生物活性分子与靶向药物分离。在本发明的部分实施方案中，所述连接基包含可切割或不可切割的单元，例如肽或二硫键。在本发明的部分实施方案中，生物活性分子与靶向药物直接通过共价键相连，所述共价键在特定环境或作用下能够断裂，从而使生物活性分子与靶向药物分离。

“小分子”在本文中定义为具有生物活性的小分子药物。在某些实施方案中，所述小分子的分子量不大于2000Da，例如不大于1500Da、1000Da或500Da。

在本发明中，术语“连接基”是指将生物活性分子与靶向药物连接起来的结构片段。

在本发明中，术语“靶向药物”指能够与细胞表面的靶标(或靶标的部分)特异性结合的药物。通过靶向药物部分与靶标的相互作用，偶联物可以被递送至特定的细胞群。

在本发明中，当靶向药物为抗体时，所述偶联物可被称为“抗体-药物偶联物”。在本发明中，“抗体-药物偶联物”与“免疫偶联物”可以互换使用。

在本发明中，术语“抗体”取其最广义的解释，包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体以及由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们具有所需的生物学活性。在本文中，“抗体”和“免疫球蛋白”可以互换使用。

在本发明的实施方案中，所述靶向药物为抗Her2的单克隆抗体，例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；或所述靶向药物为抗Trop-2的单克隆抗体，例如Sacituzumab。

在本发明的部分实施方案中，所述靶向药物为曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。曲妥珠单抗是抗Her2的单克隆抗体，其氨基酸序列是本领域技术人员已知的，其示意性序列可参见例如CN103319599。曲妥珠单抗重链末位Lys是容易缺失的，但这种缺失不影响生物活性，参见Dick,L.W.等人，Biotechnol.Bioeng.，100:1132–1143。帕妥珠单抗的示例性的重链序列和轻链序列可参见US7560111的SEQ ID No.16和SEQ ID No.15。

在本发明的部分实施方案中，靶向药物抗Trop-2抗体为记载于US2012/0237518中的hRS7(即本发明的Sacituzumab)。

在本发明中，ErbB2和Her2可互换使用，二者均表示天然序列的人Her2蛋白(Genebank登录号：X03363，参见例如Semba等人，1985，PNAS，82:6497-6501；和Yamamoto等人，1986，Nature，319:230-234)及其功能性衍生物，例如氨基酸序列变体。ErbB2表示编码人Her2的基因，neu表示编码大鼠p185neu的基因。在部分实施方案中，本发明的化合物或偶联物能够抑制或杀伤表达ErbB2受体的细胞，例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、唾液腺癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、甲状腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞或肝癌细胞。

在本发明中，Trop-2或TROP2是指人滋养层细胞表面抗原-2(human trophoblastcell-surface antigens 2)，又称为TACSTD2、M1S1、GA733-1、EGP-1，其是由许多人类肿瘤(如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、***癌或***)细胞表达的细胞表面受体。在部分实施方案中，本发明的化合物或偶联物能够抑制或杀伤表达TROP2受体的细胞，例如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、***癌或***。

在本发明中，术语“C_1-6烷基”表示直链或支链的含有1-6个碳原子的烷基，包括例如“C_1-4烷基”、“C_1-3烷基”等，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基和1,2-二甲基丙基等。术语“C_1-6亚烷基”为相应的二价基团，包括例如“C_1-4亚烷基”、“C_1-3亚烷基”等，具体实例包括但不限于：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基和亚己基等。

在本发明中，术语“C_2-10烯基”是指含有至少一个双键且碳原子数为2-10的直链、支链或环状的烯基，包括例如“C_2-6烯基”、“C_2-4烯基”等。其实例包括但不限于：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,4-己二烯基、环戊烯基、1,3-环戊二烯基、环己烯基和1,4-环己二烯基等。术语“C_2-10亚烯基”为相应的二价基团，包括例如“C_2-6亚烯基”、“C_2-4亚烯基”等。其实例包括但不限于：亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基、亚戊烯基、亚己烯基、亚环戊烯基和亚环己烯基等。

在本发明中，术语“C_2-10炔基”是指含有至少一个三键且碳原子数为2-10的直链或支链的炔基，包括例如“C_2-6炔基”、“C_2-4炔基”等。其实例包括但不限于：乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基和5-甲基-2-己炔基等。术语“C_2-10亚炔基”为相应的二价基团，包括例如“C_2-6亚炔基”、“C_2-4亚炔基”等。其实例包括但不限于：亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基等。

在本发明中，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

在本发明中，术语“3-10元环烷基”或“C_3-10环烷基”是指含有3-10个碳原子的饱和环状烷基，包括例如“C_3-8环烷基”、“C_3-6环烷基”、“C_4-6环烷基”、“C_5-7环烷基”或“C_5-6环烷基”等。具体实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基等。术语“3-10元亚环烷基”或“C_3-10亚环烷基”为相应的二价基团，包括例如“C_3-8亚环烷基”、“C_3-6亚环烷基”、“C_4-6亚环烷基”、“C_5-7亚环烷基”或“C_5-6亚环烷基”等。具体实例包括但不限于：亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基和亚环辛基等。

在本发明中，术语“3-8元杂环基”是指含有3-8个环原子(其中至少一个环原子为杂原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的环状基团。任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。“3-8元杂环基”包括例如“3-8元含氮杂环基”、“3-8元含氧杂环基”、“3-6元杂环基”、“3-6元含氧杂环基”、“4-7元杂环基”、“4-6元杂环基”、“5-7元杂环基”、“5-6元杂环基”、“5-6元含氮杂环基”，优选包括但不限于环氧乙烷基、氧代环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基和高哌嗪基等。术语“3-8元亚杂环基”为相应的二价基团，包括例如“3-8元含氮亚杂环基”、“3-8元含氧亚杂环基”、“3-6元亚杂环基”、“3-6元含氧亚杂环基”、“4-7元亚杂环基”、“4-6元亚杂环基”、“5-7元亚杂环基”、“5-6元亚杂环基”、“5-6元含氮亚杂环基”，优选包括但不限于亚环氧乙烷基、亚氧代环丁烷基、亚吡咯烷基、亚四氢呋喃基、亚哌啶基、亚哌嗪基、亚四氢吡喃基和亚高哌嗪基等。

在本发明中，术语“芳基”是指具有芳香性的单环或多环烃基，例如C_6-10芳基、C_5-8芳基等。具体的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基和菲基等。术语“亚芳基”为相应的二价基团，例如C_6-10亚芳基、C_5-8亚芳基等。具体的实例包括但不限于亚苯基、亚萘基、亚蒽基和亚菲基等。

在本发明中，术语“杂芳基”是指具有芳香性的环状基团，其中至少一个环原子为杂原子，例如氮原子、氧原子或硫原子。任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。具体实例包括但不限于5-10元杂芳基、5-10元含氮杂芳基、6-10元含氧杂芳基、6-8元含氮杂芳基和5-8元含氧杂芳基等，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-***基、1,2,4-***基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、嘧啶基、1,4-二氧杂环己二烯基、2H-1,2-噁嗪基、4H-1,2-噁嗪基、6H-1,2-噁嗪基、4H-1,3-噁嗪基、6H-1,3-噁嗪基、4H-1,4-噁嗪基、哒嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4,5-四嗪基、氮杂环庚三烯基、1,3-二氮杂环庚三烯基和氮杂环辛四烯基等。术语“亚杂芳基”为相应的二价基团，具体实例包括但不限于含氮亚杂芳基、5-10元亚杂芳基、5-10元含氮亚杂芳基、5-6元含氮亚杂芳基、6元含氮亚杂芳基、6-10元含氧亚杂芳基、6-8元含氮亚杂芳基和5-8元含氧亚杂芳基等，例如亚呋喃基、亚噻吩基、亚吡咯基、亚噻唑基、亚噁唑基、亚咪唑基、亚吡唑基、亚***基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚噁嗪基、亚哒嗪基、亚吡嗪基、亚三嗪基和亚四嗪基。

在本发明中，术语“平衡离子”是指伴随离子物质以保持电中性的离子，例如，在氯化钠中，钠阳离子是氯阴离子的平衡离子，反之亦然。

任选地，本发明中涉及到的基团中的氢可以被氘取代。

本发明中提到的基团，是由所述基团对应的化合物/偶联物中1、2或3个氢原子被其它原子取代所得到的，所述被取代的的氢原子的个数可以根据所述基团在本发明化合物或偶联物中形成的价键数所确定。例如，烷基是由烷烃中一个氢原子被取代得到的基团，亚烷基是由烷烃中两个氢原子被取代得到的基团，甲基和乙基分别是由甲烷和乙烷中一个氢原子被取代得到的基团，亚甲基和亚乙基分别是由甲烷和乙烷中两个氢原子被取代得到的基团。

如本文中所使用，术语“取代”指所指定的原子上的一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)氢被从所指出的基团的选择代替，条件是未超过所指定的原子在当前情况下的正常原子价并且所述取代形成稳定的化合物/偶联物。取代基和/或变量的组合仅仅当这种组合形成稳定的化合物/偶联物时才是允许的。

如果取代基被描述为“任选地被取代”，则取代基可(1)未被取代或(2)被取代。如果取代基的碳被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则碳上的一个或多个氢(至存在的任何氢的程度)可单独和/或一起被独立地选择的任选的取代基替代。如果取代基的氮被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则氮上的一个或多个氢(至存在的任何氢的程度)可各自被独立地选择的任选的取代基替代。

如果取代基被描述为“独立地选自”一组，则各取代基独立于另一者被选择。因此，各取代基可与另一(其他)取代基相同或不同。

如本文中所使用，术语“一个或多个”意指在合理条件下的1个或超过1个，例如2个、3个、4个、5个或10个。

除非另外指明，否则如本文中所使用，取代基的连接点可来自取代基的任意适宜位置。

当取代基的键显示为穿过环中连接两个原子的键时，则这样的取代基可键连至该可取代的环中的任一成环原子。

在本文中，术语“溶剂合物”是指化合物/偶联物与溶剂分子缔合形成的物质。所述溶剂可以是有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇、乙腈等)等。例如，本发明化合物/偶联物可以与乙醇形成乙醇化物。

在本发明中，术语“水合物”是指化合物/偶联物与水分子缔合形成的物质。

在本发明的实施方案中，如果所述化合物/偶联物存在手性碳，则本发明包括基于该手性碳的任何立体构型形成的异构体，例如包括消旋体或任何一种镜像异构体。而且，本发明包括全部可能出现的其他立体异构体。也就是说，本发明的化合物/偶联物包括所有对映异构体、非对映异构体、顺反异构体、消旋体等。

本文中可使用实线实楔形或虚楔形描绘本发明的化合物/偶联物的化学键。使用实线以描绘键连至不对称碳原子的键欲表明，包括该碳原子处的所有可能的立体异构体(例如，特定的对映异构体、外消旋混合物等)。使用实或虚楔形以描绘键连至不对称碳原子的键欲表明，存在所示的立体异构体。当存在于外消旋混合物中时，使用实及虚楔形以定义相对立体化学，而非绝对立体化学。除非另外指明，否则本发明的化合物/偶联物意欲可以立体异构体(其包括顺式及反式异构体、光学异构体(例如R及S对映异构体)、非对映异构体、几何异构体、旋转异构体、构象异构体、阻转异构体及其混合物)的形式存在。本发明的化合物/偶联物可表现一种以上类型的异构现象，且由其混合物(例如外消旋混合物及非对映异构体对)组成。

本发明涵盖本发明的化合物/偶联物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其可为单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。

本发明的化合物/偶联物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐及碱加成盐。

适合的酸加成盐由形成药学可接受盐的酸来形成。实例包括天冬氨酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、乳清酸盐、棕榈酸盐及其它类似的盐。

适合的碱加成盐由形成药学可接受盐的碱来形成。实例包括铝盐、精氨酸盐、胆碱盐、镁盐及其它类似的盐。

适合的盐的综述参见Stahl及Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,2002)。用于制备本发明的化合物/偶联物的药学上可接受的盐的方法为本领域技术人员已知的。

在本发明的范围内还包括本发明的化合物/偶联物的代谢物，即在给药本发明的化合物/偶联物时体内形成的物质。这样的产物可由例如被给药的化合物/偶联物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、酶解等产生。因此，本发明包括本发明的化合物/偶联物的代谢物，包括通过使本发明的化合物/偶联物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的时间的方法制得的化合物/偶联物。

制备方法

在一些实施方案中，本发明提供制备通式(II)的偶联物的方法，

其中：

T选自以下结构：

L₂为选自以下的基团：所述基团通过1或2标记的两个位置之一与L₁连接，并且通过另一位置与L₃连接；优选地，所述基团通过1标记的位置与L₁连接，并且通过2标记的位置与L₃连接；更优选地，L₂为所述基团通过1标记的位置与L₁连接，并且通过2标记的位置与L₃连接。

L₃选自任选地被一个或多个R_i取代的下列基团：

其中：

β为0、1或2的整数；并且

γ在每次出现时各自独立地为1、2或3的整数；

Z为氧原子或硫原子，且优选为氧原子；

R₂选自任选地被一个或多个R_a取代的下列基团：C_1-6烷基和R_a为氟或者硝基，条件是当R_a为氟时，R₂不是全氟代的苯基；

α选自1、2、3或4，优选地，α选自1或2。

在优选的实施方案中，L₃选自任选地被一个或多个R_i取代的下列基团：

其中：

R_q在每次出现时各自独立地选自C_1-3烷基、C_2-4烯基、C_2-4炔基和C_3-6环烷基；

R_i选自H(氢)、D(氘)、CN、CH₂CN、甲基和CF₃；

更优选地，L₃选自：

其中：

R_i选自H(氢)、D(氘)、CN、CH₂CN、甲基和CF₃；

进一步优选地，L₃选自：

其中：

在优选的实施方案中，选自：

所述基团通过1标记的位置与L₁连接，并且通过2标记的位置与羰基连接；

更优选地，选自：

所述基团通过1标记的位置与L₁连接，并且通过2标记的位置与羰基连接。

在优选的实施方案中，R₂为四个氟原子取代的苯基、三个氟原子取代的苯基、二个氟原子取代的苯基、一个氟原子取代的苯基、硝基取代的苯基、六个氟原子取代的C_3-6烷基、五个氟原子取代的C_2-6烷基、四个氟原子取代的C_2-6烷基或三个氟原子取代的C_1-6烷基。

更优选地，R₂选自：

进一步优选地，R₂为2,3-二氟苯基、2,4-二氟苯基、2,5-二氟苯基或2,6-二氟苯基。

在优选的实施方案中，选自：

优选地，选自：

更优选地，选自：

进一步优选地，选自：

在优选的实施方案中，所述方法包括将靶向药物与通式(I)的化合物混合。

优选地，所述靶向药物与通式(I)的化合物的摩尔比为1:(1-20)。

优选地，所述方法包括将包含靶向药物的溶液与通式(I)的化合物混合。

优选地，所述方法在水或有机溶剂中进行。

优选地，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、饱和烃类(如环己烷或己烷)、卤代烃类(如二氯甲烷、氯仿或1,2-二氯乙烷)、醚类(如四氢呋喃、***、二噁烷或1,2-二甲氧基乙烷)、腈类(如乙腈)、醇类(如甲醇或乙醇)及其任意组合。

优选地，所述方法还包括经选自离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱和亲和色谱中的一种或多种色谱方法进行纯化。

在一些实施方案中，本发明提供通式(II)的偶联物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物，

其中各基团如上文所定义。

优选地，所述通式(II)的偶联物通过上述方法制备得到。

优选地，所述通式(II)的偶联物为抗体-药物偶联物。

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中α为1、2、3或4的整数；并且A为曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或Sacituzumab中移除α个氨基后所得的基团。

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A1为曲妥珠单抗中移除2个氨基后所得的基团。

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A2为帕妥珠单抗中移除2个氨基后所得的基团。

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A3为Sacituzumab中移除2个氨基后所得的基团。

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A1'为曲妥珠单抗中移除1个氨基后所得的基团。

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A2'为帕妥珠单抗中移除1个氨基后所得的基团。

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A3'为Sacituzumab中移除1个氨基后所得的基团。

在一些实施方案中，本发明提供制备通式(I)的化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物的方法，所述方法包括将通式(I-0)的化合物与R₂-ZH反应得到通式(I)的化合物，

其中各基团如上文所定义；并且

所述反应优选在水或有机溶剂中进行。

优选地，所述反应在碱(包括有机碱(例如三乙胺、DIPEA、吡啶、NMM或DMAP)或无机碱(例如NaH、NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、K₂CO₃))和缩合试剂(例如HATU、HBTU、EEDQ、DEPC、DCC、DIC、EDC、BOP、PyAOP或PyBOP)的存在下进行。

在一些实施方案中，本发明提供通式(I)的化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物，

其中各基团如上文所定义。

在优选的实施方案中，所述通式(I)的化合物通过如上述方法进行制备。

在优选的实施方案中，所述通式(I)的化合物具有通式(Ia)的结构，

优选地，所述化合物选自：

药物组合物、药物制剂和治疗方法

在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物以及一种或多种药学上可接受的载体，并且所述药物组合物任选地进一步包含一种或多种其他抗癌药如化疗剂和/或抗体。所述药物组合物优选为固体制剂、半固体制剂、液体制剂或气态制剂。

在一些实施方案中，本发明提供药物制剂，其包含根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物，或者包含根据本发明的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物在制备用于预防或治疗癌症疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，本发明提供根据本发明的通式(II)的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物，其用于预防或治疗癌症疾病。

在一些实施方案中，本发明提供预防或治疗癌症疾病的方法，所述方法包括向需要其的个体给药有效量的通过本发明的方法制备得到的偶联物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物。

在一些实施方案中，所述癌症疾病选自食管癌(例如食管腺癌或食管鳞状细胞癌)、脑瘤、肺癌(例如小细胞性肺癌或非小细胞性肺癌)、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、***、子宫内膜癌、唾液腺癌、结肠癌、结直肠癌、肝癌、肾癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经***肿瘤(例如神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤或胶质瘤或肉瘤)、***癌和甲状腺癌。

本发明中“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

在本发明的药物组合物或药物制剂中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物或药物制剂通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)中所述。

本发明的药物组合物或药物制剂可以***地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。

对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物或药物制剂。

所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。

如本文中所使用的术语“有效量”指被给药后会在一定程度上缓解所治疗病症的一或多种症状的偶联物的量。

可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可给药单次推注，可随时间给药数个分剂量，或可如治疗情况的急需所表明而按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随要减轻的病况的类型及严重性而变化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据个体需要及给药组合物或监督组合物的给药的人员的专业判断来随时间调整。

所给药的本发明的偶联物的量会取决于所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率、偶联物的处置及处方医师的判断。一般而言，有效剂量在每日每kg体重约0.0001至约50mg，例如约0.01至约10mg/kg/日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.007mg/日至约3500mg/日，例如约0.7mg/日至约700mg/日。在一些情况下，不高于前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分成数个较小剂量以在一整天中给药。

本发明的偶联物在药物组合物或药物制剂中的含量或用量可以是约0.01mg至约1000mg，适合地是0.1-500mg，优选0.5-300mg，更优选1-150mg，特别优选1-50mg，例如1.5mg、2mg、4mg、10mg、25mg等。

除非另外说明，否则如本文中所使用，术语“治疗”意指逆转、减轻、抑制这样的术语所应用的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状的进展，或预防这样的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状。

如本文所使用的“个体”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本发明中“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。

发明的有益效果

本发明利用新的羧基活化方式，极大地改善了连接基中羧基被活化后所得中间体的稳定性，成功克服偶联技术中五氟苯酚酯中间体在季铵盐或氮氧化物结构存在下不稳定的难题，同时以较高的偶联比例(例如约33％)实现生物活性分子与靶向药物的偶联。此偶联方法可广泛应用于靶向药物-生物活性分子偶联物的合成。

附图说明

图1是裸抗的疏水作用色谱(HIC)分析图谱。

图2是化合物2与抗体偶联后的HIC分析图谱。

图3是化合物7与抗体偶联后的HIC分析图谱。

图4是化合物8与抗体偶联后的HIC分析图谱。

图5是化合物9与抗体偶联后的HIC分析图谱。

图6是化合物10与抗体偶联后的HIC分析图谱。

图7是化合物11与抗体偶联后的HIC分析图谱。

图8是化合物2与抗体偶联后的液相色谱-质谱(LCMS)图谱。

图9是化合物7与抗体偶联后的LCMS图谱。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

以下的实施例中记载的化合物/偶联物的结构通过核磁共振(¹H NMR)或质谱(MS)来确定。

核磁共振(¹H NMR)的测定仪器使用Bruker 400MHz核磁共振仪；测定溶剂为氘代甲醇(CD₃OD)、氘代氯仿(CDCl₃)或六氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)；内标物质为四甲基硅烷(TMS)。

实施例中使用的核磁共振(NMR)图谱中的缩写含义如下：

s:单峰(singlet)、d:二重峰(doublet)、t:三重峰(triplet)、q:四重峰(quartet)、dd:双二重峰(double doublet)、qd:四二重峰(quartet doublet)、ddd:双双二重峰(double double doublet)、ddt:双双三重峰(double double triplet)、dddd:双双双二重峰(double double double doublet)、m:多重峰(multiplet)、br:宽峰(broad)、J:偶合常数、Hz:赫兹、DMSO-d₆:六氘代二甲基亚砜。

将全部δ值用ppm值表示。

质谱(MS)的测定仪器使用Agilent(ESI)质谱仪，型号为Agilent 6120B。

包含生物活性分子和连接基的化合物的合成

实施例1

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基-4-((2,3,5,6-四氟苯氧基)羰基)哌啶-1-鎓碘化物(化合物1)的合成

步骤一：

1-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)哌啶-4-甲酸乙酯(化合物1-2)的合成

室温下，将化合物1-1(1.0g，6.4mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，向反应液中加4-溴丁酸叔丁酯(1.7g，7.6mmol)、碳酸钾(1.77g，12.8mmol)和碘化钾(0.53g，3.2mmol)。加毕，室温搅拌5h，将反应液倒入水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，滤除干燥剂，减压蒸除溶剂，硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3/2)，得到目标化合物1.5g。ESI-MS(m/z):300.2[M+H]⁺。

步骤二：

1-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-4-(乙氧羰基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物1-3)的合成

室温下，将化合物1-2(500mg，1.7mmol)和碘甲烷(2413mg，17.0mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，反应液室温搅拌1h。减压蒸除溶剂得到标题化合物530mg。ESI-MS(m/z):314.2[M]⁺。

步骤三：

1-(3-羧基丙基)-4-(乙氧羰基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物1-4)的合成

室温下，将化合物1-3(530mg，1.7mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，向反应液中加入三氟乙酸(5mL)反应液室温搅拌2h。减压蒸除溶剂，得到标题化合物500mg。ESI-MS(m/z):258.2[M]⁺。

步骤四：

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-4-(乙氧羰基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物1-5)的合成

室温下，将(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(300mg，0.27mmol)和化合物1-4(127mg，0.33mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，降温到0℃，依次加入N,N-二异丙基乙胺(105mg，0.81mmol)和1H-苯并***-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(281mg，0.54mmol)，加毕，反应体系室温搅拌3h。制备液相色谱纯化，得到标题化合物200mg。ESI-MS(m/z):1346.2[M]⁺。

步骤五：

4-羧基-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物1-6)的合成

将化合物1-5(200mg，0.15mmol)溶于四氢呋喃(5mL)与水(5mL)的混合溶剂中，加入氢氧化锂(36mg，1.5mmol)，室温搅拌2.0h。加入盐酸溶液(0.5mol/L)调节pH＝4，减压蒸除溶剂，制备液相色谱纯化，得到目标化合物150mg。ESI-MS(m/z):1318.2[M]⁺。

步骤六：

化合物1的合成

将化合物1-6(50mg，0.04mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，氮气保护，向反应液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(11mg，0.06mmol)和4-二甲氨基吡啶(15mg，0.12mmol)，降温到0℃，向其中加入2,3,5,6-四氟苯酚(67mg，0.4mmol)，升温至室温，反应过夜。制备液相色谱纯化，得到标题化合物5.6mg。ESI-MS(m/z):1466.2[M]⁺。

实施例2

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-4-((2,4,6-三氟苯氧基)羰基)哌啶-1-氧化物(化合物2)的合成

步骤一：

1-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-4-(乙氧羰基)哌啶-1-氧化物(化合物2-2)的合成

室温下，将化合物1-2(700mg，2.34mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，氮气保护下加入间氯过氧苯甲酸(808mg，4.68mmol)，室温搅拌过夜。用高效液相色谱-质谱联用监测原料反应完全，反应液用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭，二氯甲烷(50mL×3)萃取，饱和碳酸氢钠水溶液(100mL×2)洗涤，将合并的有机相用水洗，无水硫酸钠干燥，滤除干燥剂，减压蒸除溶剂，得到标题化合物，为黄色油状液体700mg。ESI-MS(m/z):316.2[M+H]⁺。

步骤二：

1-(3-羧基丙基)-4-(乙氧羰基)哌啶-1-氧化物(化合物2-3)的合成

采用实施例1步骤三所描述的类似操作，以化合物2-2代替化合物1-3，得到标题化合物500mg。ESI-MS(m/z):260.2[M]⁺。

步骤三：

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-4-(乙氧羰基)哌啶-1-氧化物(化合物2-4)的合成

采用实施例1步骤四所描述的类似操作，以化合物2-3代替化合物1-4，得到标题化合物15mg。ESI-MS(m/z):674.5[M/2+1]⁺。

步骤四：

4-羧酸-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)哌啶-1-氧化物(化合物2-5)的合成

采用实施例1步骤五所描述的类似操作，以化合物2-4代替化合物1-5，得到标题化合物15mg。ESI-MS(m/z):660.5[M/2+1]⁺。

步骤五：

化合物2的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以化合物2-5代替化合物1-6，以2,4,6-三氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物2.0mg。ESI-MS(m/z):725.6[M/2+1]⁺。

实施例3

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基-4-((2,4,6-三氟苯氧基)羰基)哌啶-1-鎓碘化物(化合物3)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以2,4,6-三氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物21mg。ESI-MS(m/z):1448.2[M]⁺。

实施例4

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基-4-((2,2,3,3,3-五氟丙氧基)羰基)哌啶-1-鎓碘化物(化合物4)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以2,2,3,3,3-五氟丙-1-醇代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物21mg。ESI-MS(m/z):1450.2[M]⁺。

实施例5

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-4-((3-氟苯氧基)羰基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物5)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以3-氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物5mg。ESI-MS(m/z):1412.2[M]⁺。

实施例6

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-4-((4-氟苯氧基)羰基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物6)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以4-氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物4mg。ESI-MS(m/z):1412.2[M]⁺。

实施例7

4-((2,3-二氟苯氧基)羰基)-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物7)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以2,3-二氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物5mg。ESI-MS(m/z):1430.2[M]⁺。

实施例8

4-((2,5-二氟苯氧基)羰基)-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物8)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以2,5-二氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物6mg。ESI-MS(m/z):1430.2[M]⁺。

实施例9

4-((2,6-二氟苯氧基)羰基)-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物9)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以2,6-二氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物6mg。ESI-MS(m/z):1430.2[M]⁺。

实施例10

4-((3,4-二氟苯氧基)羰基)-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物10)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以3,4-二氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物5mg。ESI-MS(m/z):1430.2[M]⁺。

实施例11

4-((2,3-二氟苯氧基)羰基)-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)喹宁-1-鎓溴化物(化合物11)的合成

步骤一：

1-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-4-(乙氧羰基)喹宁-1-鎓溴化物(化合物11-2)合成

室温下，将化合物11-1(500mg，2.7mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，向反应液中加4-溴丁酸叔丁酯(602mg，2.7mmol)。加毕，室温搅拌过夜，减压蒸除溶剂得到标题化合物1100mg，为淡黄色固体，不经纯化用于下一步反应。ESI-MS(m/z):326.2[M+H]⁺。

步骤二：

1-(3-羧基丙基)-4-(乙氧羰基)喹宁-1-鎓溴化物(化合物11-3)的合成

室温下，将化合物11-2(200mg，0.44mmol)溶于盐酸二氧六环溶液(4M，3mL)中，将反应液室温搅拌2h。减压蒸除溶剂，***重结晶得到标题化合物150mg。ESI-MS(m/z):270.2[M]⁺。

步骤三：

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-4-(乙氧羰基)喹宁-1-鎓溴化物(化合物11-4)的合成

室温下，将(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(300mg，0.27mmol)和化合物11-3(131mg，0.33mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，降温到0℃，依次加入N,N-二异丙基乙胺(105mg，0.81mmol)和1H-苯并***-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(281mg，0.54mmol)，加毕，反应体系室温搅拌3h。制备液相纯化，得到标题化合物210mg。ESI-MS(m/z):1358.2[M]⁺。

步骤四：

4-羧基-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)喹宁-1-鎓溴化物(化合物11-5)的合成

将化合物11-4(210mg，0.14mmol)溶于四氢呋喃(5mL)与水(5mL)的混合溶剂中，加入氢氧化锂(36mg，1.5mmol)，室温搅拌2.0h。加入盐酸溶液(0.5mol/L)调节pH＝3～4，减压蒸除部分溶剂，制备液相纯化，得到目标化合物140mg。ESI-MS(m/z):1330.2[M]⁺。

步骤五：

化合物11的合成

将化合物11-5(58mg，0.04mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，氮气保护，向反应液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(11mg，0.06mmol)和4-二甲氨基吡啶(15mg，0.12mmol)，降温到0℃，向其中加入2,3-二氟苯酚(52mg，0.4mmol)，升温至室温，反应过夜。经制备液相纯化，得到标题化合物4mg。ESI-MS(m/z):1442.2[M]⁺。

实施例12

4-((2,3-二氟苯氧基)羰基)-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1,4-二甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物12)的合成

步骤一：

1-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-4-甲基哌啶-4-甲酸乙酯(化合物12-2)的合成

采用实施例1步骤一所描述的类似操作，以化合物12-1代替化合物1-1，得到标题化合物130mg。ESI-MS(m/z):314.2[M+H]⁺。

步骤二：

1-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-4-(乙氧羰基)-1,4-二甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物12-3)的合成

采用实施例1步骤二所描述的类似操作，以化合物12-2代替化合物1-2，得到标题化合物，不经纯化用于下一步反应。ESI-MS(m/z):328.2[M]⁺。

步骤三：

1-(3-羧基丙基)-4-(乙氧羰基)-1,4-二甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物12-4)的合成

采用实施例1步骤三所描述的类似操作，以化合物12-3代替化合物1-3，得到标题化合物100mg。ESI-MS(m/z):270.2[M]⁺。

步骤四：

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-4-(乙氧羰基)-1,4-二甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物12-5)的合成

采用实施例1步骤四所描述的类似操作，以化合物12-4代替化合物1-4，得到标题化合物66mg。ESI-MS(m/z):1360.2[M]⁺。

步骤五：

4-羧基-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1,4-二甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物12-6)的合成

采用实施例1步骤五所描述的类似操作，以化合物12-5代替化合物1-5，得到标题化合物50mg。ESI-MS(m/z):1332.2[M]⁺。

步骤六：

化合物12的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以化合物12-6代替化合物1-6，以2,3-二氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物5mg。ESI-MS(m/z):1444.2[M]⁺。

实施例13

4-((2,4-二氟苯氧基)羰基)-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物14)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以2,4-二氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物5mg。ESI-MS(m/z):1430.2[M]⁺。

实施例14

4-((3,5-二氟苯氧基)羰基)-1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基哌啶-1-鎓碘化物(化合物15)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以3,5-二氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物5mg。ESI-MS(m/z):1430.2[M]⁺。

实施例15

1-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基-4-((3,4,5-三氟苯氧基)羰基)哌啶-1-鎓碘化物(化合物20)的合成

采用实施例1步骤六所描述的类似操作，以3,4,5-三氟苯酚代替2,3,5,6-四氟苯酚，得到标题化合物。ESI-MS(m/z):1448.2[M]⁺。

偶联物的制备

实施例16.化合物2与曲妥珠单抗的偶联

搅拌状态下，向1mL pH 7.5、浓度为18mg/ml的曲妥珠单抗溶液中加入6倍的量的溶解在N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中的化合物2，室温避光进行偶联反应4h。通过HIC-HPLC对不同出峰时间组分进行富集，得到药物/抗体比值(drug antibody ratio，DAR)为1和2的具体偶联物，分别命名为2-H1-1和2-H1-2。

实施例17.化合物7与曲妥珠单抗的偶联

采用与实施例16类似的偶联方法，将化合物2替换为化合物7，通过HIC-HPLC对不同出峰时间组分进行富集，得到DAR值为1和2的具体偶联物，分别命名为1-H1-1和1-H1-2。

实施例18.化合物8与曲妥珠单抗的偶联

采用与实施例16类似的偶联方法，将化合物2替换为化合物8，通过HIC-HPLC对不同出峰时间组分进行富集，得到DAR值为1和2的具体偶联物，分别命名为1-H1-1和1-H1-2。

实施例19.化合物9与曲妥珠单抗的偶联

采用与实施例16类似的偶联方法，将化合物2替换为化合物9，通过HIC-HPLC对不同出峰时间组分进行富集，得到DAR值为1和2的具体偶联物，分别命名为1-H1-1和1-H1-2。

实施例20.化合物10与曲妥珠单抗的偶联

采用与实施例16类似的偶联方法，将化合物2替换为化合物10，通过HIC-HPLC对不同出峰时间组分进行富集，得到DAR值为1和2的具体偶联物，分别命名为1-H1-1和1-H1-2。

实施例21.化合物11与曲妥珠单抗的偶联

采用与实施例16类似的偶联方法，将化合物2替换为化合物11，通过HIC-HPLC对不同出峰时间组分进行富集，得到DAR值为1和2的具体偶联物，分别命名为11-H1-1和11-H1-2。

实施例22.利用疏水作用色谱(HIC)对偶联物进行分析

通过HIC-HPLC监测反应，对偶联物进行HIC检测。

HIC条件如下：

液相色谱柱：TOSOH TSKgel Butyl-NPR，4.6x100mm

流动相A：1.5M硫酸铵

流动相B：25mM Na₂HPO₄，pH 7.0，25％异丙醇

流速：0.5ml/min

检测波长：280nm

柱温：30℃

样品室温度：8℃

洗脱条件：

时间(分钟)	0	3	25	30	30.1	35
							流动相A(体积％)	70	70	55	15	70	70
流动相B(体积％)	30	30	45	85	30	30

对裸抗及化合物2、7、8、9、10和11与抗体偶联后的样品进行HIC-HPLC分析，所得谱图如图1-图7所示。从图1可以看出，裸抗保留时间为8.00min左右。对图2-7整体进行分析可知，偶联后体系中裸抗剩余较少，在裸抗出峰之后出现了多个偶联物峰，证明生物活性分子与抗体发生了高效偶联。

实施例23.分子量的测定

对偶联后的样品进行LCMS分子量分析。

测定条件：

液相色谱柱：ACQUITUProtein BEH C4 1.7μm 2.1mm x 100mm

流动相A：0.1％甲酸(FA)/98％H₂O/2％乙腈(ACN)

流动相B：0.1％FA/2％H₂O/98％ACN

流速：0.25ml/min

样品室温度：8℃

时间(分钟)	1	7	8	9	13
						流动相A(体积％)	90	20	20	90	90
流动相B(体积％)	10	80	80	10	10

质谱：Triple TOF 5600+

GS1 60；GS2 60；CUR30；TEM600；ISVF5000；DP300；CE10m/z 600-5000

结果如下：化合物2、化合物7与抗体偶联后计算理论分子量均如下：

糖型	mAb	DAR1	DAR2	DAR3	DAR4
						G0F/G0F	148057.8	149359.5	150661.1	151962.8	153264.5
G0F/G1F	148220.0	149521.6	150823.3	152124.9	153426.6
						G0F/G2F	148382.1	149683.8	150985.4	152287.1	153588.7

表中，mAb代表抗体，DAR1表示包含一个生物活性分子和一个抗体的偶联物，DAR2表示包含两个生物活性分子和一个抗体的偶联物，DAR3表示包含三个生物活性分子和一个抗体的偶联物，DAR4表示包含四个生物活性分子和一个抗体的偶联物；糖型表示两条重链上的糖链结构，G0F表示岩藻糖化无半乳糖，G1F表示岩藻糖化单半乳糖，G2F表示岩藻糖化二半乳糖。

对化合物2和化合物7与抗体偶联后的样品进行LCMS分子量分析，所得谱图如图8和图9所示。由图8和图9可知，化合物2和化合物7均与抗体偶联成功，偶联产物均有DAR1和DAR2。

实施例24.偶联效率测试

根据疏水作用色谱(HIC)对偶联物的分析结果计算偶联效率，对具有新的羧基活化基团的化合物2、7、8、9、10和11与抗体的偶联效率与使用五氟苯酚活化羧基的偶联技术的对照化合物与抗体的偶联效率进行了比较，结果如表1所示。其中，偶联效率是指具有相应DAR值的偶联物占整体(全部偶联物及裸抗)的摩尔百分比。

使用五氟苯酚活化羧基的偶联技术中使用的对照化合物结构如下：

表1.偶联效率比较

从表1中可知，使用本发明中具有新的羧基活化基团的化合物能够获得包含生物活性分子和一个或两个抗体的偶联物。并且本发明中具有新的羧基活化基团的化合物显著提高了生物活性分子与抗体的偶联效率，提高倍数可达到20倍以上，优选30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上或80倍以上，成功克服了在连接基中含有季铵盐或氮氧化物结构时，生物活性分子难以与抗体偶联的难题。

生物学实验

实施例25.检测抗体-药物偶联物对体外细胞活性的抑制作用

首先培养肿瘤细胞HCC1954，培养基为RPMI1640+10％FBS。HCC1954是Her2阳性细胞，对偶联物(例如抗Her2抗体曲妥珠单抗-药物偶联物)存在内吞作用。用对应的检测培养基(含2％FBS)稀释偶联物(1μg/mL起始，2倍稀释，稀释10个浓度梯度)，使用胰酶通过常规方法对肿瘤细胞进行消化，收集肿瘤细胞，用对应的检测培养基(含2％FBS)重悬。将稀释后的偶联物加入到96孔板中，将重悬后的细胞加入到包含偶联物的对应的孔中(10000细胞/孔)，共培养3天。然后，每孔加入CCK8试剂20μL(东仁化学科技有限公司)，反应1.5小时，使用酶标仪于450nm下读数(厂家：Molecular Devices,型号：SpectraMax M2)，通过检测线粒体内的脱氢酶的活性，评价抗体-药物偶联物对细胞增殖的抑制作用。

实验结果如表2所示。

表2

ADC名称	EC<sub>50</sub>(ng/mL)
		1-H1-2	13.48±0.45

本发明的偶联物1-H1-2的EC₅₀为13.48±0.45ng/mL。已上市的Kadcyla(曲妥珠单抗-美登素生物碱T-DM1，即曲妥珠单抗-DM1偶联物)的EC₅₀为43ng/mL(参见HowardA.Burris III等人,Clinical Breast Cancer,Vol.11,No.5,275-82)。可见，本发明的偶联物对细胞增殖的抑制活性强于Kadcyla。

尽管本发明通过之前的具体实施例得到说明，但应当理解，不应将其解释为受此限制。本发明涵盖之前公开的一般方面，并且本领域技术人员可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行多种修饰或改变本发明的各种细节。因此，本说明书仅为说明的目的，而非为限制的目的。

Claims

1.制备通式(II)的偶联物的方法，

其中：

T选自以下结构：

L₃选自任选地被一个或多个R_i取代的下列基团：

其中：

β为0、1或2的整数；并且

γ在每次出现时各自独立地为1、2或3的整数；

Z为氧原子或硫原子，且优选为氧原子；

α选自1、2、3或4，优选地，α选自1或2。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，L₃选自任选地被一个或多个R_i取代的下列基团：

其中：

R_i选自H(氢)、D(氘)、CN、CH₂CN、甲基和CF₃；

更优选地，L₃选自：

其中：

R_i选自H(氢)、D(氘)、CN、CH₂CN、甲基和CF₃；

进一步优选地，L₃选自：

其中：

E为平衡离子，优选为卤素阴离子，且更优选为氯离子、溴离子或碘离子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中选自：

优选地，选自：

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，R₂为四个氟原子取代的苯基、三个氟原子取代的苯基、二个氟原子取代的苯基、一个氟原子取代的苯基、硝基取代的苯基、六个氟原子取代的C_3-6烷基、五个氟原子取代的C_2-6烷基、四个氟原子取代的C_2-6烷基或三个氟原子取代的C_1-6烷基；

更优选地，R₂选自：

并且

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中选自：

优选地，选自：

更优选地，选自：

并且

进一步优选地，选自：

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述通式(I)的化合物选自：

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其包括将靶向药物与通式(I)的化合物混合；

优选地，所述靶向药物与通式(I)的化合物的摩尔比为1:(1-20)；

优选地，所述方法包括将包含靶向药物的溶液与通式(I)的化合物混合；

优选地，所述方法在水或有机溶剂中进行；

优选地，所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、饱和烃类(如环己烷或己烷)、卤代烃类(如二氯甲烷、氯仿或1,2-二氯乙烷)、醚类(如四氢呋喃、***、二噁烷或1,2-二甲氧基乙烷)、腈类(如乙腈)、醇类(如甲醇或乙醇)及其任意组合；

8.通式(II)的偶联物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物，所述通式(II)的偶联物通过如权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到，

其中各基团如权利要求1-7中任一项所定义；

优选地，所述通式(II)的偶联物为抗体-药物偶联物；

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中α为1、2、3或4的整数；并且A为曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或Sacituzumab中移除α个氨基后所得的基团；

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A1为曲妥珠单抗中移除2个氨基后所得的基团；

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A2为帕妥珠单抗中移除2个氨基后所得的基团；

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A3为Sacituzumab中移除2个氨基后所得的基团；

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A1'为曲妥珠单抗中移除1个氨基后所得的基团；

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A2'为帕妥珠单抗中移除1个氨基后所得的基团；并且

优选地，所述抗体-药物偶联物为：

其中A3'为Sacituzumab中移除1个氨基后所得的基团。

9.制备通式(I)的化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物的方法，所述方法包括将通式(I-0)的化合物与R₂-ZH反应得到通式(I)的化合物，

其中各基团如权利要求1-8中任一项所定义。

10.通式(I)的化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物，或者它们的溶剂合物，

其中各基团如权利要求1-8中任一项所定义；

优选地，所述通式(I)的化合物通过如权利要求9所述的方法进行制备；

优选地，所述通式(I)的化合物具有通式(Ia)的结构，

优选地，所述化合物选自：

11.药物组合物，其包含通过如权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到的偶联物、权利要求8所述的偶联物、或者所述偶联物药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物以及一种或多种药学上可接受的载体，并且所述药物组合物任选地进一步包含一种或多种其他抗癌药如化疗剂和/或抗体。

12.药物制剂，其包含通过如权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到的偶联物、权利要求8所述的偶联物、所述偶联物药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物、或者权利要求11所述的药物组合物。

13.通过如权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到的偶联物、权利要求8所述的偶联物、所述偶联物药学上可接受的盐、立体异构体或代谢物或者它们的溶剂合物、权利要求11所述的药物组合物、或者权利要求13所述的药物制剂在制备用于预防或治疗癌症疾病的药物中的用途；

优选地，所述癌症疾病选自食管癌(例如食管腺癌或食管鳞状细胞癌)、脑瘤、肺癌(例如小细胞性肺癌或非小细胞性肺癌)、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、***、子宫内膜癌、唾液腺癌、结肠癌、结直肠癌、肝癌、肾癌、实体瘤、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经***肿瘤(例如神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤或胶质瘤或肉瘤)、***癌和甲状腺癌。