CN107406463A - 生物分子共轭物 - Google Patents

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L·A·达戈斯蒂诺
H·奎尔沃
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Abstract

本发明涉及包含生物分子的生物分子共轭物，其中至少一种非天然氨基酸(NNAA)与该生物分子的结构成一体并且其中该NNAA是与有效负载、具体地细胞毒性剂连接的接头的连接点。更具体地，本发明涉及细胞结合剂的共轭物和包含细胞毒性剂的活性释放产物，其中这些共轭物通过环加成反应产生。在此提供了生产方法、药物组合物和使用方法。

Description

生物分子共轭物
相关申请的交叉引用
要求2014年12月4日提交的美国临时申请序列号62/087,369的权益。
发明领域
本发明涉及包含生物分子的生物分子共轭物，其中至少一种非天然氨基酸(NNAA)与生物分子的结构成一体并且其中NNAA是与有效负载、具体地细胞毒性剂连接的接头的连接点。本发明还涉及细胞结合剂与细胞毒性剂的共轭物，其中共轭物通过环加成反应产生。提供了生产方法、药物组合物和使用方法。
背景技术
具有抗体结构修饰的新一代抗体(NGA)治疗剂代表了单克隆抗体(mAb)研究和开发的关键分布区。肿瘤学是主焦点，其中约50％的肿瘤学mAb供应来源(pipeline)由NGA组成。Syed(赛义德),B.A.等人，新一代抗体(Next-Generation Antibodies)，药物发现自然评论(Nature Reviews Drug Discovery)，13:413(2014)。
最突出的新抗体技术平台抗体-药物共轭物(ADC)通常包含经由化学接头连接至mAb的细胞毒性剂。通过提供化学治疗剂直接至癌组织的靶向递送，ADC可增加mAb的临床效力并且能够部署对于全身性给予太强劲的细胞毒素。第一ADC产品吉妥珠单抗奥佐米星(；惠氏药厂(Wyeth))，用于治疗急性髓细胞白血病(AML)的一种刺孢霉素连接的CD33特异性mAb在2000年被批准，但是在2010因安全问题被撤回。已出现了用于ADC开发的新平台，诸如靶向型抗体有效负载平台(TAP；西雅图遗传学公司(Seattle Genetics)和免疫原公司(ImmunoGen))。在2011年后期，贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin)(；西雅图遗传学公司)，用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一种连接至抗有丝***剂单甲基奥瑞他汀E(MMAE)的CD30特异性mAb变成首先获得美国食品与药品管理局(FDA)的批准的新ADC。第二批准的是在2013年早期的阿多-曲妥珠单抗-恩他新(；遗传技术公司(Genentech)/罗氏公司(Roche))。阿多-曲妥珠单抗-恩他新和mAb帕妥珠单抗(；罗氏公司(在2012年批准))被开发为曲妥珠单抗的线扩展产品(；罗氏公司)，该线扩展产品以不同的作用方式靶向HER2(也称之为ERBB2)；抑制HER2-HER3二聚化，而阿多-曲妥珠单抗-恩他新向细胞递送细胞毒性有效负载。
细胞毒性分子、放射性核素和某些化学治疗药已化学连接至结合肿瘤特异性或肿瘤相关细胞表面抗原的单克隆抗体。参见，例如国际(PCT)专利申请号WO 00/02587、WO 02/060955、WO 02/092127；和美国专利8198417、8012485、5475092、6340701以及6171586。
现有的mAb开发过程常规地利用诸如铰链工程化和亲和力成熟的技术。然而，改善免疫共轭物疗法的效力并且最小化该免疫共轭物疗法的不希望的副作用仍是一种挑战。
发明概述
本发明涉及分离的生物分子共轭物并且涉及通过在此所述的环加成反应制备的分离的生物分子共轭物。
本发明还涉及通过环加成制备分离的生物分子共轭物的方法，这些方法包括
提供具有化学式I的化合物，该化合物包括附接至接头(间隔臂)((E)m)的环应变(strained)炔烃或烯烃(A)，并且其中有效负载(D)也附接至接头；并且，
提供具有化学式II的化合物，一种生物分子(CB)，该生物分子包括与其结构成一体的至少一种非天然存在的氨基酸(NNAA)(M)，其中NNAA具有叠氮(叠氮-苯丙氨酸或例如叠氮-对-甲基-苯丙氨酸)或四嗪基团(T)；并且，
使具有式I的化合物与具有化学式II的化合物反应以产生具有化学式III、化学式III’或化学式III”的化合物(生物分子缀合物)
本发明进一步涉及通过在此所述的环加成反应制备的具有化学式III、III’或III”的分离的生物分子共轭物，其中生物分子共轭物包括与下述生物分子成一体的至少一种非天然存在的氨基酸(NNAA)(M)
其中p和q各自是从0-10的整数；
R6是H、多肽内的氨基酸或键；
R7是OH、多肽内的氨基酸或键；
V是烷基或芳基碳环、杂环或不存在；并且，
W是O、N、S或不存在。
因此本发明进一步涉及通过在此所述的环加成反应制备的具有化学式III、III’(或III”(III”也应当考虑在整个本披露中的范围内))的分离的生物分子共轭物，其中生物分子共轭物包括与选自下组的生物分子结构成一体的至少一种非天然存在的氨基酸(NNAA)(M)，该组基本上由以下化学式组成：
此外，本发明涉及通过在此所述的环加成反应制备的具有化学式III或III’的分离的生物分子共轭物，其中生物分子共轭物包括为细胞毒性剂的至少一种有效负载(D)。
因此本发明进一步涉及通过在此所述的环加成反应制备的具有化学式III或III’的分离的生物分子共轭物，其中生物分子共轭物包括作为有效负载(D)的至少一种美登木素生物碱(maytansinoid)。
因此本发明进一步涉及通过在此所述的环加成反应制备的具有化学式III或III’的分离的生物分子共轭物，其中生物分子共轭物包括作为有效负载(D)的具有下述结构的至少一种细胞毒性剂：
本发明进一步涉及药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的在此所述的生物分子共轭物和药学上可接受的载体。
本发明进一步涉及一种治疗哺乳动物的异常生理病状的方法，该方法包括给予有效量的在此所述的生物分子共轭物。
因此本发明进一步涉及一种治疗哺乳动物的细胞增殖性病症的方法，该方法包括给予有效量的在此所述的生物分子共轭物。
因此本发明进一步涉及一种治疗哺乳动物的血液肿瘤学病症的方法，该方法包括给予有效量的在此所述的生物分子共轭物。
本发明还涉及一种分离的化合物
其中A是应变炔烃环或应变烯烃环，其中环是碳环基或杂环基，
D是有效负载；
每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-CO-、-CR1R2-、-NR3-、-S-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、烷基、C3-C8碳环基、-O-(CR1R2)a-、芳基、-(CR1R2)a-芳基、杂芳基、-(CR1R2)a-杂芳基、-(CR1R2)a-C3-C8碳环基、杂环基、-(CR1R2)a-杂环基、-(CH2CH2O)a-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、-(CH2)aC(O)-、氨基酸以及肽；
R1和R2各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、-SO2R3、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、聚亚乙基氧基、膦酸根、磷酸根、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、芳基、杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；或，当合在一起时，R1和R2形成羰基(＝O)、或3至7个碳原子的螺碳环；并且，
R3选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C20芳基、C5-C20杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；
烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选独立地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、C1-C8烷基磺酸根、C1-C8烷基氨基、4-二烷基氨基吡啶鎓、C1-C8烷基羟基、C1-C8烷硫基、-SO2R、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、C1-C8三氟代烷基、C1-C8烷基、C3-C12碳环、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基、C2-C20杂环基、聚亚乙基氧基、膦酸根以及磷酸根；
m是从1至100的整数；并且，
a和b各自是从1至100的整数。
本发明进一步涉及一种具有化学式I的分离的化合物，其中每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-(CH2CH2O)a-、-(CH2)aC(O)NR3-、-(CH2)aNR3C(O)-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2)b-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2CH2O)b-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2CH2O)b(CH2)c-、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2CH2O)b-、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2CH2O)b、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2)b-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、—(CH2)aC(O)-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、-S-、-SO-、-SO2-、氨基酸、二肽、三肽；
其中G选自下组，该组由以下各项组成：烷基、芳基、碳环基和杂环基；以及，
其中H1、H2和H3各自独立地选自N或CR1。
本发明进一步涉及一种具有化学式I的分离的化合物，其中每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：
其中：
J是氨基酸或肽；
d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至30的整数；
h是从0至30的整数；
R3如上文定义；
每个R4独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、烷基、-N(R3)2、-SR3以及C1-C8烷氧基、芳基；并且，
R5选自下组，该组由以下各项组成：H、-N(R3)2、-SR3、C1-C8烷氧基、芳基以及NO2。
本发明进一步涉及具有化学式I的以下示例性分离的化合物中的每一个以及其类似物和衍生物
R＝H或CH3(甲基)；以及，
附图说明
图1示出了对具有化学式I的化合物的示例性制备，通过首先形成酰胺连接基团，之后进行接头的延伸。
图2示出了具有化学式I的化合物和相应中间体的示例性制备。
图3示出了中间体的制备，其中应变炔烃连接至接头的片段。
图4描述了对具有化学式I的化合物的制备，通过首先形成酰胺连接基团，之后进行接头的延伸。
图5示出了中间体的制备，其中应变炔烃连接至接头。
图6A示出了1,3-偶极环加成反应
图6B示出了应变烯烃和四嗪4+2环加成反应。
图7示意性示出用于连接细胞毒性剂的酰胺键。
图8示出了本发明中采用的示例性NNAA。
图9A-C示出了本发明的若干种示例性化合物。
图10示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图11示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案
图12示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图13示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图14示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图15示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图16示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图17示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图18示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图19示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图20示出用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图21示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图22示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图23示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图24示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
图25示出了用于本发明的化合物的示例性合成方案。
发明详述
除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。在此提及的所有公开物和专利通过引用结合在此。
在此所述的靶向抗癌治疗剂被设计用于相对于常规癌症化学治疗降低非特异性毒性和增加效力。这种方法通过单克隆抗体向表现出癌症特异性或癌症相关抗原的细胞特异性地递送高度强劲的共轭治疗剂的强有力的靶向能力来体现。有效负载，具体地细胞毒性剂被偶联至靶向分子(诸如以高度特异性结合癌细胞的抗体或配体)以形成在此称为生物分子共轭物(共轭物)或抗体-药物共轭物(ADC)或免疫共轭物的化合物。在此所述的共轭物应当是毒性较小的，因为它们将细胞毒性剂引导至细胞，例如表现出或以其他方式过表达特定细胞表面抗原或受体的血液癌细胞。
现在将详细参照本发明的某些实施例，这些实施例的实例在随附结构和化学式中示出。虽然本发明将结合在此披露的实施例来进行描述，但应理解的是它们不旨在将本发明限制于那些实施例。相反，本发明意图涵盖可包含在如随附权利要求书所限定的本发明的范围内的所有替代方案、修改方案以及等效方案。本领域技术人员将认识到类似于或等同于在此所述的那些的可在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明绝不限于所述的方法和材料。应当理解在以下详细描述和随附权利要求中，采用的缩写和命名法是为化学中基本标准的那些。
除非另有说明，否则如在此使用的以下术语和词组具有以下定义：
“烷基”是包含正构、仲、叔或环状碳原子的C1-C18烃部分。烷基的实例包括C1-C8烃部分诸如：甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr，n-丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr，i-丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，n-丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，i-丁基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，s-丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，t-丁基，-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3、1-庚基、1-辛基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基以及环辛基。烷基基团可以是取代的或未取代的。
“烯基”是包含正构、仲、叔或环状碳原子的具有至少一个不饱和位，即碳-碳、sp2双键的C2-C18烃部分。烯基的实例包括C2-C8烃部分诸如但不限于：亚乙基或乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)、1-环己基-1-烯基、1-环己基-2-烯基以及1-环己基-3-烯基。烯基基团可以是取代的或未取代的。
“炔基”是包含正构、仲、叔或环状碳原子的具有至少一个不饱和位，即碳-碳、sp三键的C2-C18烃部分。炔基的实例包括C2-C8烃部分诸如但不限于：炔属(-C≡CH)和炔丙基(-CH2C≡CH)。炔基基团可以是取代的或未取代的。
“氨基”是取代的或未取代的，除非另有指出。氨基基团可以被选自以下项的一个或两个取代基取代：氢、烷基、烯基、炔基(alkinyl)、环烷基、环烷基烷基、芳烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、未取代的或取代的芳基、氨基烷基、酰基例如甲酰基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基或芳基磺酰基，并且优选是氨基、甲氨基、二甲氨基、丙氨基、苄氨基、羟乙基-甲基-氨基、二(羟乙基)氨基、二甲基氨基乙基氨基、乙酰氨基、乙酰基-甲基-氨基、苄氧基氨基、甲基磺酰基氨基或苯基磺酰基氨基，特别是氨基或二甲氨基。
“芳基”意指任何基于碳的芳族基团，包括但不限于苯、萘、苯基、联苯基、苯氧苯等等。芳基基团可以是取代的或未取代的。术语“杂芳基”被定义为含有具有至少一个杂原子被并入芳族基团的环内的芳族基团的基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫、10以及磷。术语“非杂芳基”包括在术语“芳基”中，明确表示含有不含有杂原子的芳族基团的基团。芳基或杂芳基基团可以是取代的或未取代的。芳基或杂芳基基团可以被一个或多个基团取代，该一个或多个基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、15卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或硫醇，如在此所述的。术语“联芳基”是芳基基团的特别类型并且包括在芳基的定义中。联芳基是指经由稠环结构结合在一起(如在萘中)，或经由两个或更多个碳-碳键连接(如在联苯基中)的两个芳基基团。
“杂环的或杂环基”是含有4-12个原子的饱和、部分饱和或不饱和的单环或双环，其中至少一个原子选自氮、硫或氧，除非另有说明，否则该环可以是碳或氮连接的，其中-CH2-基团可任选地被-C(O)-置换，并且环硫原子可以任选地氧化形成S氧化物。杂环基的实例包括但不限于吡咯烷基、吗啉代、哌啶基、吡啶基、吡喃基、吡咯基、异噻唑基、吲哚基、喹啉基、噻吩基、呋喃基、1,3-苯并二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、噻二唑基、哌嗪基、异噁唑基、噻唑基、噻唑烷基、吡咯烷基、硫代吗啉代、吡唑基、吡咯啉基、高哌嗪基、四氢吡喃基、咪唑基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、异噁唑基、4-吡啶酮、1-异喹啉酮、2-吡咯烷酮、4-噻唑烷酮、咪唑并[1,2-a]吡啶或3-氮杂-8-噁二环[3,2,1]己烷。杂环描述于以下文献中：帕克特(Paquette),利奥(Leo)A.,“当代杂环化学的原理(Principles of Modern HeterocyclicChemistry)”(W.A.本杰明(Benjamin)，纽约(New York)，1968)，具体地第1、3、4、6、7和9章；“杂环化合物的化学(The Chemistry of Heterocyclic Compounds)，专著丛集”(约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约，1950年至今)，具体地第13、14、16、19和28卷；以及美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)(1960)82:5566。杂环基团可以是取代的或未取代的。
“氨基甲酰基”可以是取代的或未取代的，除非另有指出。氨基甲酰基可以被选自以下各项的一个或两个取代基取代：氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、芳基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、未取代的或取代的芳基或氨基烷基，或可以是下述氨基甲酰基，其中取代基和氨基甲酰基基团的氮原子表示进一步包含选自N、O和S的0、1或2个杂原子的5元或6元杂环基；并且优选为氨基甲酰基、甲基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、丙基氨基甲酰基、羟乙基-甲基-氨基甲酰基、二(羟乙基)氨基甲酰基、二甲基氨基乙基氨基甲酰基或吡咯烷基羰基、哌啶基羰基、N-甲基哌嗪基羰基或吗啉代羰基，特别是氨基甲酰基或二甲基氨基甲酰基。
同义的“碳环”和“碳环基”指示具有3至7个碳原子作为单环或7至12个碳原子作为二环的饱和或不饱和的环。单环碳环具有3至6个环原子，而更典型地5或6个环原子。二环碳环具有7至12个环原子，例如布置为二环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]体系，或9或10个环原子，布置为二环[5,6]或[6,6]体系。单环碳环的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基以及环辛基。碳环基团可以是取代的或未取代的。
非天然氨基酸(NNAA)根本上是指不是自然界中发现的20种氨基酸之一的氨基酸。这种NNAA的实例包括但不限于具有叠氮基团或四嗪基团的氨基酸。示例性NNAA包括但不限于叠氮基-苯丙氨酸或叠氮基-对-甲基-苯丙氨酸。
如在此定义的“连接基团”例如是指在接头(E)与有效负载(D)之间的官能团。连接基团的实例包括但不限于酰胺、酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚、二硫化物、腙、肟、氨基脲、脲、碳酸酯、酸不稳定性基团、光不稳定性基团、肽酶不稳定性基团以及酯酶不稳定性基团。参见例如US 5208020；5475092；6441163；6716821；6913748；7276497；7276499；7368565；7388026和7414073。
“接头”(间隔臂)(E)是指两个连接基团之间的化学部分。CB-E-D。接头(E)是与细胞结合剂(CB)的连接基团与与有效负载(D)的连接基团之间的化学部分。接头(E)可以是可裂解的或不可裂解的。接头连接细胞毒性剂与细胞结合剂或可进一步连接至细胞结合剂的化学部分。例如，接头(E)将美登木素生物碱连接至化学部分诸如应变炔烃，该化学部分能够如在此所述经由胡伊斯根(Huisgen)环加成(也可以叫夏普莱斯(Sharpless)点击化学)连接至含有叠氮取代的非天然氨基酸的抗体。
接头的制备和应用是本领域的普通技术人员容易获得的。戈德马彻(Goldmacher)等人，抗体-药物共轭物和免疫毒素：从临床前发展至治疗性应用(Antibody-drug Conjugates and Immunotoxins:From Pre-clinical Development to Therapeutic Applications)，第7章，在接头技术和接头设计对ADC特性的影响(Linker Technology and Impact of Linker Design on ADC Properties)中，由菲利普(Phillips)GL编辑；施普林格科学和商业媒体出版社(Springer Science and Business Media)，纽约(2013)。本发明中使用的接头结构还披露在以下专利中：例如US 8198417；8012485；7989434；6333410；5416064和5208020；将它们的全部披露通过引用结合在此。
可裂解接头(E)是可在温和条件下裂解的接头。含有二硫化物的接头是通过在生理条件下发生的二硫化物交换可裂解的接头。酸不稳定性接头是在酸性pH下可裂解的接头。例如，某些细胞内区室诸如核内体和溶酶体具有酸性pH(pH 4-5)并且提供适于裂解酸不稳定性接头的条件。光不稳定性接头可用在身体表面和光线可到达的许多身体腔中。此外，红外线可穿透组织。某些接头可通过天然肽酶裂解。参见，例如，特鲁埃(Trouet)等人，79美国国家科学院院刊，626-629(1982)和梅本(Umemoto)等人，43国际癌症杂志(Int.J.Cancer)，677-684(1989)。肽是由α-氨基酸和肽键组成的，这些肽键是在一个氨基酸的羧酸酯与另一个氨基酸的α-氨基基团之间的酰胺键，以此类推。其他酰胺键，诸如羧酸酯与赖氨酸的ε-氨基基团之间的键不被理解为是肽键并且认为是不可裂解的。本领域中已知的许多接头可通过酯酶裂解。仅仅本领域中已知的某些酶可通过在细胞内或细胞外存在的酯酶裂解。酯通过羧酸与醇之间的缩合作用形成。简单的酯是用简单的醇产生的酯，这些简单的醇诸如脂肪醇和小的环醇以及小的芳族醇。
不可裂解的接头(E)是能够以稳定的共价方式将有效负载例如细胞毒性剂连接至细胞结合剂并且不归入上文列为可裂解接头的类别的任何化学部分。因此，不可裂解的接头通常耐受酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键诱导的裂解。如在此使用的术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的药学上可接受的有机或无机盐，包括生物分子共轭物。示例性盐包括但不限于：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆根素盐(gentisinate)、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate)“甲磺酸盐(mesylate)”、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、扑酸盐(即，l,l'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐、碱金属(例如钠和钾)盐、碱土金属(例如镁)盐以及铵盐。药学上可接受的盐可涉及包括另一分子诸如乙酸盐离子、琥珀酸盐离子或其他反离子。反离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可以在其结构中具有多于一个的带电原子。其中多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可具有多个反离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个反离子。
术语“治疗有效量”或“有效量”意指活性化合物或共轭物在受试者中引出所希望的生物应答或治疗效应的量。这种应答包括缓解待治疗疾病或病症的症状；预防、抑制或延迟疾病症状或疾病本身的复发；与不存在治疗相比增加受试者的寿命；或预防、抑制或延迟疾病症状或疾病本身的进展。有效量的确定是完全在本领域的普通技术人员的能力之内，尤其是根据在此提供的详细披露。毒性和治疗效力通过细胞培养和动物研究中的标准药物程序确定。待向受试者给予的本发明的化合物或共轭物或其他治疗剂的有效量取决于病状(例如多发性骨髓瘤或白血病)的阶段、类别和情形，以及受试者的特征诸如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性。待给予的本发明的化合物或共轭物或其他治疗剂的有效量也取决于给予途径和剂型。优选静脉内(IV)和皮下(SC)给药途径。可以个别地调节剂量和间隔，以提供足够维持所需治疗效果的活性化合物的血浆水平。
在此使用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.帕克(Parker)编,麦格劳-希尔化学术语词典(McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)(1984)麦格劳-希尔公司，纽约；以及埃利尔(Eliel),E.和威伦(Wilen),S.，“有机化合物的立体化学(Stereochemistryof Organic Compounds)”，约翰威利父子公司，纽约，1994。除非另有说明，否则本发明的化合物旨在包括所有立体异构体，这些立体异构体以单一异构体或以与其他异构体的混合物存在。
在本发明的化学式I化合物中，(A)是应变环，即应变炔烃环或应变烯烃环。应变炔烃(A)或应变烯烃(A)和细胞毒性剂例如(D)经由接头(E)m连接。(E)m的连接点(与(A)或(D)，或两者)处采用的多种连接基团包括但不限于酯、酰胺、氨基甲酸酯、胺以及硫醚。
化学式I
具有化学式I的化合物：
A是环，前提条件是当虚线表示键时A是具有应变炔烃的环，或当虚线不存在时A是具有应变烯烃的环；
换句话讲，化学式I包括两种结构：
D是细胞毒性剂；
每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-CO-、-CR1R2-、-NR3-、-S-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、烷基、C3-C8碳环基、-O-(CR1R2)a-、芳基、-(CR1R2)a-芳基、杂芳基、-(CR1R2)a-杂芳基、-(CR1R2)a-C3-C8碳环基、杂环基、-(CR1R2)a-杂环基、-(CH2CH2O)a-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、-(CH2)aC(O)-、氨基酸以及肽；
R1和R2各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、-SO2R3、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、聚亚乙基氧基、膦酸酯、磷酸根、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、芳基、杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；或当合在一起时，R1和R2形成羰基(＝O)、或3至7个碳原子的螺碳环；
R3独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；当被取代时，烷基、碳环基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基和杂环基独立地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、C1-C8烷基磺酸根、C1-C8烷基氨基、4-二烷基氨基吡啶鎓、C1-C8烷基羟基、C1-C8烷硫基、-SO2R、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、C1-C8三氟代烷基、C1-C8烷基、C3-C12碳环、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基、C2-C20杂环基、聚亚乙基氧基、膦酸根以及磷酸根；
m是从1至100的整数；并且，
a和b各自是从1至100的整数。
在某些实施例中，m是从1至30的整数。在一些实施例中，m是从1至25的整数。在一些实施例中，m是从1至20的整数。在一些实施例中，m是从1至15的整数。在一些实施例中，m是从1至10的整数。在一些实施例中，m是从1至5的整数。在一些实施例中，m是从1至3的整数。在一些实施例中，m是从1至2的整数。在一些实施例中，m是1。
在某些实施例中，a和b各自独立地是从1至100的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至30的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至25的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至20的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至15的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至10的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至5的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至3的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至2的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是1。
-(E)m-中的每个E可以是相同或不同的。在一个实施例中，例如，烷基和碳环的结合产生-(E)2-，其中一个E是烷基，另一个E是碳环。
在非限制性示例性实施例中，每个E可衍生自选自以下各项的基于马来酰亚胺基的部分：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、N-(对-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)或其磺基-琥珀酰亚胺基变体或类似物。在其他非限制性示例性实施例中，每个E还可以衍生自选自以下各项的基于卤代乙酰基的部分：N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)、N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)或其磺基-琥珀酰亚胺基变体或类似物。
在某些实施例中，每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-(CH2CH2O)a-、-(CH2)aC(O)NR3-、-(CH2)aNR3C(O)-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2)b-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2CH2O)b-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2CH2O)b(CH2)c-、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2CH2O)b-、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2CH2O)b、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2)b-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、—(CH2)aC(O)-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、-S-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-、氨基酸、肽，
其中G选自下组，该组由以下各项组成：烷基、芳基和杂环基，以及
其中H1、H2和H3各自为N或CR1；并且
R1、R2和R3如上文定义。
在一些实施例中，每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：
其中J是氨基酸或肽；
d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至30的整数；
h是从0至30的整数；
R1、R2和R3如上文定义；
每个R4独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、烷基、-N(R3)2、-SR3；以及C1-C8烷氧基、芳基；
R5选自下组，该组由以下各项组成：H、-N(R3)2、-SR3、C1-C8烷氧基、芳基以及NO2。
在某些实施例中，d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至30的整数。在一些实施例中，d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至25的整数。在一些实施例中，d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至20的整数。在一些实施例中，d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至15的整数。在一些实施例中，d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至10的整数。在一些实施例中，d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至5的整数。在一些实施例中，a和b各自独立地是从1至3的整数。在一些实施例中，d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至2的整数。在一些实施例中，d、e、g、i、j和k各自独立地是1。
在某些实施例中，h是从0至30的整数。在一些实施例中，h是从0至25的整数。在一些实施例中，h是从0至20的整数。在一些实施例中，h是从0至15的整数。在一些实施例中，h是从0至10的整数。在一些实施例中，h是从0至5的整数。在一些实施例中，h是从0至3的整数。在一些实施例中，h是从0至2的整数。在一些实施例中，h是1。在一些实施例中，h是0。
在一些实施例中，每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：
；以及，
在非限制性示例性实施例中，E可以具有下述结构中的任一种：
具有化学式I的化合物的合成是完全在本领域的普通技术人员的技能之内。在不受限于任何具体化学方法的情况下，可易于实现具有化学式I的化合物和中间体的合成的示例性途径示出在图1和图2中。
如在此使用的术语“应变环”(A)是指应变炔烃环或应变烯烃环。
具有化学式I的应变炔烃环(A)
应变炔烃环(A)的sp-杂化碳具有小于180°的键角，这与直链炔烃不同。应变炔烃环可在环上和/或在其侧链上被取代。如在此提及的应变炔烃还可包括具有用于连接接头(E)的反应性官能团的衍生物。
具有化学式I的应变炔烃环A能够与含叠氮的NNAA在温和条件下高效地反应而无需添加铜催化剂。多种应变炔烃的制备及其与含叠氮的化合物的反应在文献中是完全已知的，包括马尔泰洛(Martell)等人，分子学(Molecules)，2014,19(2),1378-93；斯特腾(Sletten)等人，有机化学通讯(Org.Lett.)2014,16(6),1634-7；德布茨(Debets)等人，化学研究评述(Acc.Chem.Res.)，2011,44(9),805-15；朱厄特(Jewett)等人，有机化学通讯2010,39(4),1272-9；朱厄特等人，化学学会评论(Chem.Soc.Rev.)2010,132,3688；贝尔托西(Bertozzi)等人，美国化学学会杂志2010，132，3688；朱厄特等人化学学会评论2010年4月；39(4):1272-9。
非限制性示例性实施例包括应变炔烃试剂二苯并环辛炔、环辛-4-炔醇、(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯以及其衍生物和类似物。
应变炔烃可以连接至接头(E)，例如通过酰胺键、胺键、醚键或酯键。
应变烯烃(包括降冰片烯和反式环辛烯)与四嗪之间的反向需电子狄尔斯-阿尔德反应已兴起为一类重要的快速生物正交反应。这些反应可常常在非常温和的条件下进行。大量的文献描述了应变烯烃的制备和反应，包括金姆(Kim)等人，生物化学目前视点(Curr.Opin.Chem.Biol.)2013,17(3),412-9；等人，生物化学目前视点，2013,17(5),761-7；Seitchik等人，美国化学学会杂志2012,134(6),2898-2901；泰勒(Taylor)等人，美国化学学会杂志2011,133,9646；戴瓦拉吉(Devaraj)等人，生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)2008,19,2297；戴瓦拉吉,N.K.；韦斯莱德尔(Weissleder),R.化学研究评述2011,44,816；泰勒,M.T.等人美国化学学会杂志2011,133,9646；布莱克曼(Blackman),M.L.等人美国化学学会杂志2008,130,13518。
应变烯烃可以连接至接头(E)，例如通过醚、酰胺、氨基甲酸酯、或酯。
具有化学式I的示例性应变烯烃环(A)
在非限制性示例性实施例中，在本发明中采用的应变烯烃可具有以下结构：
具有化学式I的示例性种类
化学式II
本发明提供了具有如下化学式II的化合物：
其中CB是细胞结合剂；M是非天然氨基酸；并且T是叠氮基团或四嗪基团。
在某些实施例中，M具有以下结构：
其中：
p和q各自独立地是从0-10的整数；
R6是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团，或键；
R7是OH、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团，或键；
V是烷基、芳基、碳环、杂环或不存在；并且，
W是O、N、S或不存在；前提条件是当R6是键时，非天然氨基酸经由R6连接至细胞结合剂，并且当R7是键时，非天然氨基酸经由R7连接至细胞结合剂。
在一些实施例中，p和q各自独立地是从0-8的整数。在一些实施例中，p和q各自独立地是从0-6的整数。在一些实施例中，p和q各自独立地是从0-4的整数。在一些实施例中，p和q各自独立地是从0-2的整数。
在非限制性示例性实施例中，M可以具有以下结构化学式：
非天然氨基酸(M)(接头(E)连接的部分和点(T))
NNAA(M)具有为与由二十种天然氨基酸中的任一种具有的侧链不同的任何取代基的侧链(T)。因为NNAA典型地仅在侧链结构上不同于天然氨基酸，所以NNAA以它们存在于天然多肽中的相同方式与其他氨基酸(包括但不限于天然氨基酸)形成酰胺键。非天然氨基酸的侧链任选地包括烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮-、羟基-、酰肼、氰基-、卤代-、酰肼、烯基、炔基(alkynl)、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸根(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基基团、四嗪等或其任何组合。可适用于本发明中的感兴趣的其他非天然存在的氨基酸包括但不限于包含可光活化的交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价地相互作用的氨基酸、光笼蔽氨基酸和/或可光致异构化的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸诸如糖取代的丝氨酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚酯的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解和/或光可裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长的侧链的氨基酸，包括但不限于聚酯或长链烃(包括但不限于大于约5个或大于约10个碳)、碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或多个毒性部分的氨基酸。多种非天然氨基酸及其合成提供于US 7632924、US 20140046030、US 20140066598和US 20140051836中，这些专利的全部披露通过引用结合在此。图8示出了本发明中采用的示例性NNAA。斯派瑟(Spicer,),CD等人，自然通讯(NatureCommunications)，5:4740(2014)。
在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括与未在20种常见氨基酸中发现的官能团高效且选择性地反应的侧链官能团(包括但不限于叠氮、酮、醛和氨基氧基基团)以形成稳定的共轭物。例如，包含含叠氮官能团的非天然编码的氨基酸的细胞结合剂可以与含有炔烃部分的化合物反应形成稳定性共轭物，该共轭物是由叠氮与炔烃官能团选择性反应形成胡伊斯根[3+2]环加成产物产生的。
用于掺入到细胞结合剂的示例性含叠氮或含四嗪的非天然氨基酸可以如下表示：
其中p和q各自是0-10；R6是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；R7是OH、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团；U是羰基、氨基-羰基-氨基、氨基甲酰基、氨基-羰氧基或不存在；V是烷基、芳基、碳环、杂环或不存在；W是O、N、S或不存在；并且T是叠氮基团或四嗪基团。
在一些实施例中，V是芳基并且W不存在。在一些实施例中，R6是H并且R7是OH。在一些实施例中，U是羰基、氨基-羰基-氨基、氨基甲酰基或氨基-羰氧基；V是杂环或不存在；W不存在；并且T是叠氮基团。本发明明显涵盖所有异构体，包括但不限于为单种异构体或混合物形式的互变体和互变异构体(R和S)，以及非天然氨基酸的所有盐形式。
示例性的含叠氮的非天然氨基酸包括但不限于以下:
术语“叠氮基”和“叠氮”在本发明中互换使用并且两者是指-N3基团。许多含叠氮的氨基酸从商业来源可获得。例如，4-叠氮基苯基丙氨酸可从国际化学进出口公司(Chem-Impex International,Inc.)(伊利诺伊州伍德戴尔市(Wood Dale,Ill.))获得。从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)可商购获得的是(S)-5-叠氮基-2-(Fmoc-氨基)戊酸、(S)-(-)-2-叠氮基-6-(Boc-氨基)己酸(二环己铵)盐、(S)-2-叠氮基-3-(4-叔-丁氧基苯基)丙酸环己基铵盐、(S)-2叠氮基-3-(3-吲哚基)丙酸环己基铵盐、(S)-2-叠氮基-3-甲基丁酸环己基铵盐、(S)-2-叠氮基-4-(甲硫基)丁酸环己基铵盐、(S)-2-叠氮基-3-苯基丙酸(二环己基铵)盐以及(S)-2-叠氮基-丙酸环己基铵盐。对于不可商购获得的那些含叠氮的氨基酸，叠氮基团可使用本领域中技术人员已知的标准方法相对容易地制备，包括例如适合的离去基团(包括但不限于卤化物、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐)或经由打开适合保护的内酯。参见例如玛奇(March)的高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)(第三版，1985，约翰威利父子公司，纽约)。
示例性的含四嗪的非天然氨基酸包括但不限于以下:
使用文献中已知的程序可容易地将含四嗪的NNAA与细胞结合剂的肽或多肽结合成一体。
使用所述的方法可将叠氮取代的和四嗪取代的非天然氨基酸位点选择性地掺入到蛋白质中。Hallam(哈勒姆),T.等人(SUTRO)，未来医药化学(Future Med Chem.)2014年7月；6(11):1309-24和生物共轭化学2014年2月19；25(2):351-61；L.王(Wang)等人，(2001)，科学(Science)292:498-500；J.W.金(Chin)等人，科学301:964-7(2003))；J.W.金等人，(2002)，美国化学学会杂志124:9026-9027；J.W.金和P.G.舒尔茨(Schultz)，(2002)，化学生物化学(Chem Bio Chem)11:1135-1137；J.W.金等人，(2002)，PNAS(美国国家科学院院刊)99:11020-11024；L.王和P.G.舒尔茨，(2002)，化学通讯(Chem.Comm.)，1-10。
生物分子合成和NNAA
包含位点特异性NNAA的抗体可以例如在体外在不含原核细胞的***中产生。叠氮基-苯丙氨酸或叠氮基-对-甲基-苯丙氨酸到例如增长的合成肽中的体外位点特异性***通过正交tRNA合成酶/tRNA对完成，其中氨基酰tRNA识别无义密码子。
用于位点特异性***NNAA和用于全能力生产包含二硫键的抗体的可扩缩的无细胞蛋白质合成***在本领域中是已知的。斯沃茨(Swartz),JR.等人，简化和流线形化基于 大肠杆菌的无细胞蛋白质合成(Simplifying and Streamlining Escherichia Coli- Based Cell-Free Protein Synthesis).生物技术进展(Biotechnol Prog.)28(2):413(2012)PMID:22275217；斯沃茨,JR.等人，用于离体检测肿瘤细胞的抗体片段生物共轭物的 无细胞产生(Cell-free Production of Antibody Fragment Bioconjugates for Ex Vivo Detection of Tumor Cells).生物化学和生物物理研究通讯(Biochem Biophys ResCommun.)390(3):971(2009)PMID:19852937；斯沃茨,JR.等人，用于蛋白质产生和合成生物 学的集成式无细胞代谢平台(An Integrated Cell-Free Metabolic Platform for Protein Production and Synthetic Biology).分子***生物学(Mol Syst Biol.)4:220(2008)。参见例如斯沃茨等人，体外蛋白质合成的方法(methods of in vitro proteinsynthesis)US 7338789和相关案件。US 8715958。还参见US 7332571、7385028、7696312、7928163以及8008428。舒尔茨,PG等人，用于体外生物合成含非天然氨基酸的蛋白质的改进 tRNA的发展(Development of Improved tRNAs for In Vitro Biosynthesis of Proteins Containing Unnatural Amino Acids).化学生物学(Chem Biol).3(12):1033(1996)；舒尔茨,PG等人，用于将非天然氨基酸位点特异性地掺入到蛋白质中的一般方法(A General Method for Site-Specific Incorporation of Unnatural Amino Acids intoProteins).科学 244(4901):182(1989)；迪特尔索尔(Dieter)等人，当蛋白质工 程面对tRNA世界时(When Protein Engineering Confronts the tRNA World).PNAS US94(19):10007(1997)。沃洛申(Voloshin)等人，8778631用于使用无细胞合成***将非天然 氨基酸引入到多肽的预选择位置中的方法(Method for Introducing Non-Native Amino Acids into Preselected Positions of a Polypeptide Using a Cell-Free Synthesis System).非天然氨基的位点特异性体内掺入：参见例如US7045337；8173392；8114648；8030074；7915025；7638300；7368275；8173364；8183012；7713721；7354761；7083970；8012739；7083970；7432092；8114629；8071344；7910345；7524647；7608423。
活性释放产物
本发明的生物分子共轭物旨在给予至哺乳动物以用于例如治疗疾病病状。生物分子共轭物包含一种生物分子，其中至少一种非天然氨基酸(NNAA)与生物分子的结构成一体并且其中NNAA是与有效负载、具体地细胞毒性剂连接的接头的连接点。在给予之后，本发明的生物分子共轭物通常释放包含有效负载细胞毒性剂的活性化合物。
因此，本发明的另一个方面是对应于在此所述的每种化学式I化合物的包含有效负载的释放产物。本发明的另外的方面是对应于在此所述的化学式I化合物中的每一种的包含接头和有效负载的释放产物。
本发明的活性释放化合物(对应于NNAA叠氮基-对-甲基-苯基丙氨酸(M2)和化学式I(化合物I4)的采用的一个实施例通常如下包含非天然存在的氨基酸、接头和有效负载：
这种活性释放产物例如以区域异构的形式存在。因为I4存在两种区域异构体，所以分解代谢物也存在两种区域异构体。如现由本领域中技术人员了解的，鉴于本披露，在给予在此所述的生物分子共轭物时/后，产生基本上包含非天然氨基酸、接头和有效负载的类似的活性释放产物。因此，本发明的另一个方面-其实例是AR4-是对应于在此所述的化学式I化合物中的每一种的释放产物，该释放产物包含在此所述的非天然氨基酸、接头和有效负载。
生物分子共轭物的产生
通过1,3-偶极环加成反应产生的化学式III共轭物
含有应变炔烃的具有化学式I的化合物与含有至少一个叠氮取代的非天然氨基酸的具有化学式II的化合物之间的环加成反应是用于产生化学式III共轭物的一种选择性且生物相容的方法(叠氮+三键[3+2]环加成(或“点击”反应))。
化学式I虚线(A)表示应变炔烃。化学式II(T)是NNAA(M)上的叠氮基团。其他基团和取代基定义同上。
方案I
叠氮和应变炔烃官能团在水性环境中对生物分子基本上是惰性的，从而允许使用在此所述的叠氮-炔烃环加成反应用于将例如细胞毒性剂(D)偶联至细胞结合剂(CB)，如方案I所示。参见，例如，图6A。
所产生的***与自然中发现的常见酰胺部分具有类似性，但是与酰胺不同的是不易于发生水解或酶催化的裂解。另外，***在生理条件下几乎不可能进行氧化或还原。在本发明的组装共轭物中采用的环加成反应(也称之为“点击”化学)是1,3-偶极，例如叠氮与亲偶极试剂，例如取代炔烃之间的反应，从而形成五元环。由应变炔烃导致的反应性增加允许具有化学式I的化合物与具有化学式II的化合物之间的环加成反应在室温下平稳地进行，而无需使用铜或其他催化剂。用于无铜环加成反应的程序在化学领域中是熟知的。参见例如，卢茨(Lutz)，应用化学国际英语版(Angew Chem Int Ed Engl.)2008,47(12),2182-4；贝尔托西等人，应用化学国际英语版2009,48,6974；贝尔托西等人，美国化学学会杂志2010,132,3688；朱厄特等人，化学学会评论2010,39(4),1272-9；舒尔茨等人，有机化学通讯2010,12(10),2398–401，这些文献的整体内容通过引用结合在此。在简单底物上的一般无铜加成的反应条件在本领域中是熟知的(例如室温，在乙腈中)。参见，例如，图6A。
产生包含至少一个叠氮取代的NNAA，优选每个NNAA中有多个，例如每个NNAA中有2-50、2-25、2-15、2-10或2-5个的生物分子的方法在在此所述的本发明的范围之内。按照推论，产生具有至少一种叠氮+三键[3+2]环加成(cycloadditon)共轭的有效负载物质(species)的生物分子例如抗体物质的方法在在此所述的本发明的范围之内。产生具有多种，例如2-100、2-50、2-25、2-10或2-5种叠氮+三键(3+2)环加成共轭的有效负载物质的生物分子例如抗体物质的方法在在此所述的本发明的范围之内。
通过4+2环加成反应产生的化学式III’共轭物
作为叠氮+三键[3+2]环加成(或“点击”反应)的替代性化学，应变反式双键(应变烯烃)与四嗪部分的反应导致[4+2]环加成，随后放出N2，产生环状二氮烯。参见，例如，图6B。
类似于炔烃与叠氮之间的反应，应变烯烃和四嗪在温和条件下进行[4+2]环加成以提供具有化学式III’的共轭物，如方案II中所示。化学式(A)虚线是不存在的，即是应变烯烃(而非应变炔烃)，并且化学式II(T)是NNAA(M)上的四嗪基团。
方案II
用于实现如在此所讨论和示出的应变烯烃和四嗪的结合的反应条件和程序是本领域中熟知的。应变烯烃和四嗪部分以这种方式进行的反应通过以下文献得到描述：例如王等人，自然化学(Nature Chem.)(2014)6,393-403；金姆等人，生物化学目前视点(2013)17(3),412-9；等人，生物化学目前视点(2013)17(5),761-7；朗(Lang)等人，自然化学(2012)4,298-304；Seitchik等人，美国化学学会杂志(2012)134(6),2898–2901；泰勒等人，美国化学学会杂志(2011)133,9646；戴瓦拉吉等人，生物共轭化学(2008)19,2297；戴瓦拉吉等人，化学研究评述(2011)44,816；泰勒等人，美国化学学会杂志(2011)133,9646；布莱克曼等人，美国化学学会杂志(2008)130,13518，所有文献通过引用结合在此。
产生包含至少一个四嗪取代的NNAA，优选每个NNAA中有多个，例如每个NNAA中有2-50、2-25、2-15、2-10或2-5个的生物分子的方法在在此所述的本发明的范围之内。按照推论，产生具有至少一种应变烯烃四嗪部分[4+2]环加成共轭的有效负载物质的生物分子例如抗体物质的方法在在此所述的本发明的范围之内。产生具有多种，例如2-100、2-50、2-25、2-10或2-5种应变烯烃四嗪部分[4+2]环加成共轭的有效负载物质的生物分子例如抗体物质的方法在在此所述的本发明的范围之内。
单独的有效负载(D)物质可通过首先产生具有两种非天然氨基酸的生物分子，例如抗体物质共轭至同一个生物分子，一种氨基酸用于接头/有效负载的[4+2]结合，并且另一种氨基酸用于不同的接头和/或有效负载[3+2]结合。因此，可将单独的有效负载(D)物质共轭至同一个如在此在其他方面所述的生物分子(CB)，通过将不同的NNAA(M)，例如(1)叠氮取代的NNAA(M-T)和(2)四嗪取代的NNAA(M-T)掺入到同一个生物分子(CB)(化学式II)中的手段。根据在此所述的方法，即通过1,3-偶极环加成反应产生的化学式III共轭物和通过[4+2]环加成反应产生的化学式III’共轭物可在同一个生物分子(CB)上完成。包含至少一个叠氮取代的NNAA和至少一个四嗪取代的NNAA(每个NNAA是在此所述的)的单一生物分子，例如单一抗体物质在本发明的范围之内。作为推论，具有两个不同的共轭的有效负载物质(D)和/或接头((E)m)的单一生物分子，例如单一抗体物质在在此所述的本发明的范围之内。产生包含至少一个叠氮取代的NNAA和至少一个四嗪取代的NNAA，优选每个NNAA中有多个，例如每个NNAA中有2-50、2-25、2-15、2-10或2-5个的此类生物分子的方法在在此所述的本发明的范围之内。产生具有两个不同的共轭的有效负载物质(D)和/或接头((E)m)的方法进一步在在此所述的本发明的范围之内。
支链接头
如在此在其他方面所述的每个抗体连接大约2个接头，每个接头具有支化点使得可连接例如两个有效负载。
存在这种方法类型的许多变更，如可由普通技术人员的了解的。
有效负载、细胞毒性剂以及美登木素生物碱
如在此使用的“细胞毒性剂”是指导致某些细胞类型的静止生长、生活力降低或死亡诱导的任何化合物。适合的有效负载细胞毒性剂包括例如美登木素生物碱及美登木素生物碱类似物、紫杉烷类、CC-1065及类似物、多拉司他汀及类似物、比则来新(zelesin)及类似物、吡咯苯并二氮杂卓二聚体及类似物；天然产物细胞毒素和合成类似物包括念珠藻环肽、毒伞肽、微管溶素以及任何其他强有力的天然或非天然小分子药剂。单甲基缬氨酸化合物。参见，例如US 7994135；7964567；7964566；7745394；7498298。
美登木素生物碱例如抑制微管形成并且对哺乳动物细胞是高毒性的。在本发明的优选实施例中，有效负载是为美登木素生物碱的细胞毒性剂，该美登木素生物碱包括美登醇、美登醇类似物、安丝菌素以及安丝菌素类似物。
美登木素生物碱
美登木素生物碱是高细胞毒性药物。美登木素首先由库普坎(Kupchan)等人从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离出并且显示出比常规的癌症化学治疗剂如氨甲蝶呤、柔红霉素和长春新碱多100倍至1000倍的细胞毒性(US 3896111)。随后，发现某些微生物还产生美登木素生物碱，诸如美登醇和美登醇的C-3酯(US 4151042)。美登醇的合成C-3酯和美登醇的类似物也已被报道(库普坎等人，21医化学杂志(J.Med.Chem.)31-37(1978)；东出(Higashide)等人，270自然721-722(1977)；卡瓦依(Kawai)等人，32化学与药学通报(Chem.Pharm.Bull.)3441-3451(1984))。已由其制备出C-3酯的美登醇的类似物的实例包括在芳族环上(例如去-氯代)或在C-9、C-14(例如羟基化甲基基团)、C-15、C-18、C-20和C-4,5处具有修饰的美登醇。已报道了许多掺入美登木素生物碱的免疫共轭物，包括US8685920、8624003、8613930、8603483、8563509、8337856、8236319、6333410、6441163和US20140023665，这些专利的全部披露内容通过引用结合在此。
适合在本发明中使用的美登木素生物碱是本领域中熟知的。合适的美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳族环和/或在其他位置处的修饰的那些。此类美登木素生物碱描述于例如以下专利中：US 4256746、4294757、4307016、4313946、4315929、4322348、4331598、4361650、4362663、4364866、4424219、4371533、4450254、5475092、5585499、5846545、6333410和US 20140023665，这些专利的全部披露内容通过引用结合在此。
具有修饰的芳族环的适合美登醇类似物的实例包括：
(1)C-19-去-氯(US 4256746)(由安丝菌素(ansamytocin)P2的LAH还原制备的)；
(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-去-氯(US 4361650和4307016)(通过使用链霉菌属或放线菌的脱甲基作用或使用LAH的脱氯作用制备的)；以及(3)C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去-氯代(US4294757)(通过使用酰氯的酰化作用制备的)。
具有其他位置的修饰的适合美登醇类似物的具体实例包括：
(1)C-9-SH(US 4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应制备的)；
(2)C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(US 4331598)；
(3)C-14-羟基甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(US 4450254)(由诺卡氏菌属制备的)；
(4)C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(通过链霉菌属对美登醇的转化制备的)；
(5)C-15-甲氧基(US 4313946和4315929)(分离自滑桃树(Trewia nudlflora))；
(6)C-18-N-脱甲基(US 4362663和4322348)(通过链霉菌属对美登醇的脱甲基化制备的)；以及，
(7)4,5-脱氧基(US 4371533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原制备的)。
此外，US 6333410，该专利的全部披露内容通过引用结合在此，提供了用于制备和纯化适合用于连接至细胞结合剂的含硫醇的美登木素生物碱的改进方法。
美登木素生物碱的实例包括但不限于以下：
在这些美登木素生物碱实施例中的一些中，p是1-8。在一些实施例中，p是1-6。在一些实施例中，p是1-4。在一些实施例中，p是1-2。在一些实施例中，p是1。
已知美登醇上的许多位置可用作键联位置，这取决于连接类型。例如，对于形成酯键联，具有羟基基团的C-3位置、修饰有羟基甲基的C-14位置、修饰有羟基基团的C-15位置和具有羟基基团的C-20位置全部是适合的。优选C-3位置。
包含美登木素生物碱的细胞毒性剂及其治疗性用途。参见，US 5208020；5416064；7276497；7851432；7473796；7601354；7303749；8198417；8163888；7989598；8088387。
美登木素生物碱连接键联
优选美登醇的C-3位置。接头(E)与美登木素生物碱之间的连接基团包括但不限于酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、醚、腙、硫醚以及二硫化物。在一些实施例中，反应性基团为酰胺。在一些实施例中，反应性基团为氨基甲酸酯。在一些实施例中，反应性基团为酯。产生接头与美登木素生物碱之间的连接基团的化学通常在本领域中是已知的。在一些实施例中，美登木素生物碱可以单步连接至(E)。在一些实施例中，美登木素生物碱可首先与接头的片段形成连接基团，然后进行接头的延伸。图1和图2例如示出了用于通过首先形成酰胺连接基团，然后进行接头的延伸而将美登木素生物碱连接至接头的非限制性方法。
包含细胞结合剂的生物分子
如在此使用的术语生物分子通常是指表现出优选在体内对某一生物靶标表的亲和力或者与该生物靶标结合或相互作用的能力的天然或合成来源的结构。在本发明中采用的生物分子为例如表现出二级结构，并且在一些实施例中三级和/或四级结构的基于蛋白质的实体。生物分子可以具有翻译后修饰，包括例如糖基化、磷酸化、脱酰胺作用和/或氧化。配体和受体各自是在本发明的共轭物中采用的生物分子的示例性种类。配体和受体的可溶性形式，例如通常为融合构建体，在本领域中是熟知的，包括例如人IgG1-Fc融合体。可溶性配体以及受体融合构建体是在本发明的共轭物结构中采用的生物分子的示例性种类。此时，对于本发明的药物共轭物优选的生物分子是抗体，特别是单克隆抗体(mAb)，包括双特异性抗体及其功能片段。抗体结构修饰也代表在本发明的共轭物中使用的生物分子的示例性分布区。参见，新一代抗体，药物发现自然评论，13:413(2014)。替代的生物分子途径是提供可实现抗体样亲和功能的替代性配体，包括DARP(设计的锚蛋白重复序列蛋白)实施例。
本发明的共轭物作为治疗剂的有效性取决于适当细胞结合剂的谨慎选择。细胞结合剂可以是目前已知的或开始变得已知的任何种类，并且包括肽和非肽。一般地说，最优选抗体、配体融合构建体以及双特异性抗体。细胞结合剂的实例包括单克隆抗体、抗体片段诸如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fv，以及特别是双特异性抗体。
活性和效力
可评估本发明的细胞结合剂美登木素生物碱共轭物的抑制各种细胞系在体外的生长和/或增殖的能力。例如，细胞系诸如人结肠癌系COLO205、人黑色素瘤细胞系A375、人髓细胞性白血病细胞系HL60、人乳腺癌系SKBR3或人鳞状细胞癌细胞系KB可用于评估这些共轭物的细胞毒性。例如可将待评价的细胞暴露于化合物24小时并且通过已知方法在直接测定中测量细胞的存活分数。参见，例如，戈德马彻等人，135免疫学杂志(J.Immunol.)3648-3651(1985)和戈德马彻等人，102细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)1312-1319(1986)。)生长抑制和/或细胞死亡的IC50值由测定的结果计算。
使用方法
在此所述的共轭物可在用于将细胞毒性剂靶向被选择的细胞群体的方法中使用，该方法包括使细胞群体或疑似含有被选择的细胞群体的组织与细胞结合剂细胞毒性剂共轭物接触，其中一种或多种细胞毒性剂经由接头共价地连接至细胞结合剂。细胞结合剂结合被选择的细胞群体的细胞。在此所述的共轭物还可在破坏细胞的方法中使用，该方法包括使细胞与细胞结合剂美登木素生物碱共轭物接触，例如其中一种或多种美登木素生物碱经由例如接头共价地连接至细胞结合剂，并且细胞结合剂结合细胞。在一些情况下，继结合例如CD74之后，整个共轭物由靶细胞内化。本发明的共轭物还可在治疗包括但不限于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主疾病、病毒感染、微生物感染和寄生虫感染的病痛的方法中使用，该方法包括向有需要治疗的受试者给予有效量的细胞结合剂细胞毒性剂共轭物，其中一种或多种细胞毒性剂经由接头共价地连接至细胞结合剂并且细胞结合剂结合病痛的患病或感染细胞。
可根据本发明的方法治疗的医学病状的实例包括但不限于任何类型的恶性肿瘤，包括例如血液学病状包括血癌、MDS、白血病病状、淋巴瘤、骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、结肠癌、***癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌以及淋巴器官的癌症；自身免疫性疾病诸如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及多发性硬化症；移植排斥，诸如肾移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥以及骨髓移植排斥；移植物抗宿主疾病；病毒感染诸如CMV感染、HIV感染；以及如通过本领域中的普通技术人员确定的其他病状。本发明的共轭物可用于***学病状肿瘤、血液学病状具体地例如B细胞恶性肿瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤。
对于体内的临床应用，本发明的共轭物可以测试了无菌度和毒素水平的溶液或冷冻干燥粉末的形式提供。共轭物可例如每周一次地、每周以静脉内推注给予，持续4周。推注剂量可于50至500ml的生理盐水中给予，可向该生理盐水添加例如5至10ml的人血清白蛋白。剂量可以是10mg至2000mg/次静脉内给予(例如100ng至200mg/kg/天的范围)。在例如一至六(1-6)周，例如两至四(2-4)周的治疗之后，患者可以每周计继续接受治疗。
临床和非临床使用的病状易于通过本领域中的普通技术人员确定。关于给予途径、赋形剂、稀释剂、剂量、次数等的具体体内临床方案可由本领域中的普通技术人员根据临床情形来确定。
其他活性剂可与共轭物一起给予。
实例I
抗体药物共轭
1.储存
将蛋白质储存在-80C下并且将药物接头储存在4C或-20C下以进行长期储存。
2.计算
计算蛋白质和药物接头的量。蛋白质母液浓度X1mg/mL、最终希望的蛋白质浓度X2mg/mL、药物母液浓度X3mM以及待共轭的CB蛋白质X4mg。推荐的蛋白质与药物摩尔比是10:1，但可以较低，例如为5:1。如果蛋白质MW不是150K，蛋白质MW可引起计算的调整。
3.共轭
适当量的蛋白质和药物接头在室温下制备并且进行混合以进行共轭。
实例1：[蛋白质母液浓度]＝4.5mg/mL，[最终希望的蛋白质浓度]＝3mg/mL，[药物母液浓度]＝5mM，0.1mg蛋白质用于共轭。
将9.8uL PBS缓冲液和1.3uL药物添加至于微管中的22.2uL蛋白质中。在室温(～22C)下将管放置在管旋转器上，持续16小时。典型地，这个量的抗体药物缀合物对于DAR分析、细胞结合和死亡测定是足够的。
实例2：[蛋白质母液浓度]＝4.5mg/mL，[最终希望的蛋白质浓度]＝3mg/mL，[药物母液浓度]＝5mM，10mg蛋白质用于共轭。
将977.8uL PBS缓冲液和133.3uL药物添加至于15mL离心管中的2222.2uL蛋白质中。在室温(～22C)下将管放置在管旋转器上，进行16小时的共轭；
共轭持续时间和温度可针对不同的抗体变体进行变化。室温和16小时是推荐的。
4.游离药物去除
可通过使用赛默飞世尔科技(Thermo scientific)zeba旋转7K MWCO脱盐柱脱盐共轭混合物去除游离药物。基于样品体积选择柱尺寸。
样品体积
zeba旋转脱盐柱，7K MWCO，0.5mL 30-130uL
zeba旋转脱盐柱，7K MWCO，2mL 200-700uL
zeba旋转脱盐柱，7K MWCO，5mL 500-2000uL
zeba旋转脱盐柱，7K MWCO，10mL 700-4000uL
实施II
细胞死亡测定
共轭生物分子对靶阳性细胞的细胞毒性效应用细胞增殖测定测量。靶阳性细胞和靶阴性细胞获自ATCC并且维持在高葡萄糖RPMI(赛尔格罗-密迪亚泰克公司(Cellgro-Mediatech)；弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))中，该高葡萄糖RPMI补充有20％热灭活的胎牛血清(海克隆公司(Hyclone)；赛默飞世尔科技公司；马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))、2mM glutamax(英杰公司(Invitrogen)；加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))和1x青霉素(Pencillin)/链霉素(赛尔格罗-密迪亚泰克公司；弗吉尼亚州马纳萨斯)。在测定的当天，将于40μl体积的总共20,000个细胞接种在96孔半区域平底白色聚苯乙烯板中。将共轭的先导化合物以2x浓度配制在RPMI培养基中并且通过MultiScreen HTS 96孔过滤器板(密理博公司(Millipore)，马萨诸塞州比尔里卡(Billerica))过滤。将过滤法消毒的共轭的先导化合物添加到处理孔中并且将板在37C下在CO2孵育箱中培养72小时。对于细胞活力测量，将80μl Cell试剂(普洛麦格公司(Promega Corp.)；威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))添加到每个孔中，并且根据产品说明书处理板。在读板仪(珀金-埃尔默公司(Perkin-Elmer)；马萨诸塞州沃尔瑟姆)上测定相对发光。使用未处理的细胞作为对照将相对发光读数转换为％生活力。使用GraphPad Prism(GraphPad v 5.00软件，加利福尼亚州圣迭哥(San Diego))、利用log(抑制剂)相对于应答、可变斜率、4参数拟合方程通过非线性回归分析拟合数据。将数据表达为％相对细胞活力相对于ADC剂量(nM)。
实例III
合成I1
A.由Maytan(美登素)-N-Me-L-Ala合成Maytan-N-Me-L-Ala戊二酸
将Maytan-N-Me-L-Ala(250mg，0.385mmol)(根据药物化学杂志(J.Med.Chem.)2006,49,4392中给出的程序制备)和戊二酐(440mg，3.85mmol)和水性饱和的NaHCO3(1ml)溶解在THF(10ml)中。将反应混合物在氩气下在室温下搅拌2小时。将反应混合物用水稀释并且用浓甲酸将pH调节至2。将所得的反应混合物用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并且进行过滤。将粗制的残余物通过反相色谱法纯化，使用C18柱，20-40微米(50g)，用于水(0.1％AcOH)中的乙腈(0.1％AcOH)的梯度(在18min内10％-95％)洗脱，进行冷冻干燥，产生白色固体状maytan-N-Me-L-Ala戊二酸32(205mg，0.268mmol，70％收率)。MS m/z:764.7[MH+],747.1[M-18],786.7[M+Na]；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:0.74(3H,S),1.19-1.27(8H,m),1.38-1.42(1H,m),1.62(3H,S),1.80-1.85(1H,m),1.91-1.96(2H,m),2.12-2.18(1H,m),2.30-2.45(5H,m),2.55(1H,t),2.79(3H,s),2.95(1H,d),3.05(1H,d),3.15(3H,s),3.32(3H,s),3.44(1H,d),3.58(1H,d),3.93(3H,s),4.24(1H,t),4.68-4.72(1H,m),5.32(1H,bs),5.58-5.63(1H,m),6.34-6.39(1H,m),6.58-6.65(2H,m),6.78(1H,s)。
B.由Maytan-N-Me-L-Ala戊二酸合成Maytan-N-Me-L-Ala戊二酸NSH酯
将Maytan-N-Me-L-Ala戊二酸(205mg，0.268mmol)的溶液溶解在二氯甲烷(10ml)中，并且用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，62mg，0.54mmol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，128mg，0.67mmol)处理。将该反应混合物在氩气下在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水，然后用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并且过滤。在减压下蒸发溶剂以得到粗制残余物。将粗制的残余物通过反相色谱法纯化，使用C18柱，20-40微米(50g)，用于水(0.1％AcOH)中的乙腈(0.1％AcOH)的梯度(在18min内10％-95％)洗脱，进行冷冻干燥，提供白色固体状maytan-N-Me-L-Ala戊二酸NHS酯33(190mg，0.22mmol，82％收率)。MS m/z:862.0[MH+],844.6[M-18],884.0[M+Na]；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:0.73(3H,s),1.16-1.24(8H,m),1.35-1.42(1H,m),1.45-1.54(4H,m),1.58(3H,s),1.85-1.91(1H,m),2.01-2.12(2H,m),2.29-2.36(1H,m),2.42-2.57(3H,m),2.62(2H,t),2.78(3H,s),2.98(1H,d),3.05(1H,d),3.12(3H,s),3.21(1H,bs),3.29(3H,s),3.43(1H,d),3.56(1H,d),3.92(3H,s),4.21(1H,t),4.71(1H,dd),5.28-5.34(1H,m),5.57-5.63(1H,m),6.15(1H,s),6.33-6.38(1H,m),6.58(1H,s),6.67(1H,d),6.75(1H,s)。
C.由maytan-N-Me-L-Ala戊二酸NHS酯合成maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4-酸
将maytan-N-Me-L-Ala戊二酸NHS酯(190mg，0.22mmol)和氨基-PEG4-酸(133mg，0.50mmol)的溶液溶解在乙腈(25ml)和水(8ml)的混合物中并且用水性饱和的NaHCO3(6ml)处理。将该反应混合物在氩气下在室温下搅拌过夜并且在减压下浓缩。将粗制的残余物通过反相色谱法纯化，使用C18柱，20-40微米(50g)，用于水(0.1％AcOH)中的乙腈(0.1％AcOH)的梯度(在18min内10％-95％)洗脱，进行冷冻干燥，产生白色固体状maytan-N-Me-L-Ala戊二酸PEG4酸(170mg，0.168mmol，76％收率)。MS m/z:1012.7[MH+],995.4[M-18],1034.2[M+Na]；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:0.73(3H,s),1.13-1.28(8H,m),1.32-1.42(1H,m),1.53-1.61(5H,m),1.78-1.85(1H,m),1.89-1.95(1H,m),2.08-2.13(1H,m),2.15-2.28(3H,m),2.39-2.47(1H,m),2.49-2.55(2H,m),2.82(3H,s),2.93(1H,d),3.05(1H,d),3.12(3H,s),3.29-3.38(5H,m),3.42(1H,d),3.50-3.61(16H,m),3.66-3.72(2H,m),3.95(3H,s),4.23(1H,t),4.71-4.77(1H,m),5.13-5-19(1H,bs),5.57-5.62(1H,m),6.32-6.38(2H,m),6.51-6.59(2H,m),6.75(1H,s)。
D.由Maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4-酸合成Maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4-酸NSH酯
将Maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4酸(170mg，0.168mmol)的溶液溶解在二氯甲烷(15ml)中，并且用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，39mg，0.336mmol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，81mg，0.42mmol)处理。将该反应混合物在氩气下在室温下搅拌过夜并且在减压下浓缩。将粗制的残余物通过反相色谱法纯化，使用C18柱，20-40微米(50g)，用于水(0.1％AcOH)中的乙腈(0.1％AcOH)的梯度(在18min内10％-95％)洗脱，进行冷冻干燥，得到白色固体状maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4-酸NHS酯(150mg，0.135mmol，80％)。MS m/z:1109.6[MH+],1092.5[M-18],1131.3[M+Na]；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:0.74(3H,s),1.14-1.27(8H,m),1.34-1.42(1H,m),1.43-1.52(4H,m),1.59(3H,s),1.77-1.84(1H,m),1.88-1.96(1H,m),2.10-2.18(3H,m),2.21-2.28(1H,m),2.37-2.43(1H,m),2.53(1H,t),2.82-2.88(4H,m),2.96(1H,d),3.05(1H,d),3.15(3H,s),3.29-3.36(5H,m),3.42-3.49(4H,m),3.52-3.61(16H,m),3.78(1H,t),3.92(3H,s),4.20(1H,t),4.69-4.73(1H,m),5.28(1H,bs),5.55-5.63(1H,m),6.18(1H,s),6.32-6.40(1H,m),6.60-6.68(2H,m),6.75(1H,s)。
E.由maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4酸NHS酯合成maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4-DIBCO(I1)
将maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4酸NHS酯(150mg，0.135mmol)和三环胺(55mg，0.173mmol)的溶液溶解在乙腈(12ml)和水(4ml)的混合物中并且用水性饱和的NaHCO3(3ml)处理。将该反应混合物在氩气下在室温下搅拌过夜并且在减压下浓缩。将粗制的残余物通过反相色谱法纯化，使用C18柱，20-40微米(50g)，用于水(0.1％AcOH)中的乙腈(0.1％AcOH)的梯度(在18min内10％-95％)洗脱，进行冷冻干燥，获得白色固体状maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4-DIBCO(105mg，0.08mmol，60％收率)。MS m/z:1312.9[MH+],1295.4[M-18],1334.6[M+Na]；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:0.82(3H,s),1.01-1.08(2H,m),1.23-1.32(8H,m),1.39-1.51(3H,m),1.58-1.66(4H,m),1.88-1.96(2H,m),1.98-2.03(1H,m),2.19-2.26(4H,m),2.30-2.36(1H,m),2.42(2H,t),2.47-2.52(1H,m),2.59-2.65(1H,m),2.88(3H,s),3.02-3.14(4H,m),3.21(3H,s),3.35-3.43(5H,m),3.49-3.52(3H,m),3.58-3.70(18H,m),4.00(3H,s),4.31(1H,t),4.79-4.82(1H,m),5.17(1H,d),5.33(1H,bs),5.65-5.70(1H,m),6.19(1H,dd),6.26(1H,d),6.32(1H,dd),6.41-6.47(1H,m),6.68-6.71(2H,m),6.84(1H,s),7.31-7.44(7H,m),7.70-7.72(1H,m)。
F.由6-氨基己酸合成6-(2,2,2-三氟乙酰丙酮)己酸
将三氟乙酸乙酯(5.7mL，6.8g，48mmol)和三乙胺(5.4mL，3.9g，39mmol)添加至6-氨基己酸(5.00g，38.1mmol)于无水甲醇(19mL)中的悬浮液中。将该反应混合物在氩气下在室温下搅拌17小时。然后添加***(100mL)，并且用100mL水性2M HCl洗涤。将水层用100mL***萃取两次。将有机层合并，用150mL盐水洗涤，并且用无水硫酸钠干燥。在真空中过滤、浓缩和干燥之后，获得灰白色固体状产物(8.66g，100％，38.1mmol)。MS(ESI+)m/z:228[M++H+]；MS(ESI-)m/z:226[M--H-]；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:1.21-1.29(2H,m),1.41-1.53(4H,m),2.16-2.21(2H,t),3.12-3.18(2H,q),9.39(1H,s,br),11.99(1H,s)。
G.由6-(2,2,2-三氟乙酰丙酮)己酸合成6-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-已酰氯
将Maytan-N-Me-L-Ala戊二PEG4-DIBCO(8.66g，38.1mmol)于二氯甲烷(190mL)中的悬浮液冷却至0C。将草酰氯(16.1mL，24.2g，190mmol)经6分钟逐滴添加。然后添加DMF(8滴)。将反应混合物在0C下搅拌1小时，并且然后在室温下搅拌2.5小时。然后在真空中浓缩和干燥，产生淡琥珀色浆料状产物(9.36g，100％，38.1mmol)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:1.36-1.46(2H,m),1.57-1.67(2H,m),1.70-1.80(2H,m),2.89-2.94(2H,t),3.34-3.41(2H,q),6.40(1H,br)。
H.由二苯并[a,d]环庚烯-5-酮合成二苯并[a,d]环庚烯-5-酮肟
将二苯并[a,d]环庚烯-5-酮(25.0g，121mmol)和羟胺HCl(12.6g，181mmol)于吡啶(70mL)中的溶液回流15.5小时。允许该反应混合物冷却至室温，并且在真空中浓缩。将残余物分配在300mL 5％水性HCl/冰与200mL乙酸乙酯之间。将水层用150mL乙酸乙酯萃取两次。将有机层合并并且用250mL盐水洗涤。在用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩并干燥之后，获得淡黄色-棕灰色固体状产物(26.8g，121mmol)。MS(ESI+)m/z:222[M++H+]；MS(ESI-)m/z:220[M--H-]；1HNMR(300MHz,CDCl3)6.91-6.92(2H,d),7.33-7.43(6H,m),7.56-7.61(1H,m),7.65-7.68(1H,m),8.55(1H,s)。
I.从二苯并[a,d]环庚烯-5-酮肟至5,6-二氢-二苯并[b,f]吖辛因
将二异丁基氢化铝于二氯甲烷(1.0M，192mL)中的溶液在水浴上冷却并且将固体二苯并[a,d]环庚烯-5-酮肟(8.48g，38.3mmol)以将温度维持在15C与27C之间的速率分批添加。移开水浴并且将所得溶液在环境温度下搅拌3天。将溶液在水浴上冷却并且将固体十水硫酸钠(20.4g，63.3mmol)以将温度维持在12C与30C之间的速率分批添加。添加硅藻土并且将混合物在环境温度下搅拌1小时。将无机物通过过滤分离并且用乙酸乙酯充分洗涤。将有机溶液合并并且在真空中蒸发溶剂。将残余物施加至硅胶柱(150g)并且用二氯甲烷(20％至100％)于己烷中的梯度洗脱，提供黄色固体状产物5.0g(63％)。MS m/z:208.4MH+；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:4.29(1H,br s),4.59(2H,s),6.39(1H,d),6.50(1H,dd),6.58(1H,d),6.61-6.66(1H,m),6.89-6.95(1H,m),7.00(1H,dd),7.19-7.32(4H,m)。
J.由5,6-二氢-二苯并[b,f]吖辛因和6-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-己酰氯合成N-[6-(6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-乙酰胺(26)
将吡啶(8.5mL，8.3g，110mmol)添加至5,6-二氢-二苯并[b,f]吖辛因(7.29g，35.2mmol)于无水二氯甲烷(72mL)中的溶液中。接下来，经4分钟添加于25mL二氯甲烷中的6-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-己酰氯(10.7g，45.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌约2小时，然后用180mL二氯甲烷稀释，并且用3x150mL水洗涤。将有机层用150mL盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩。使粗制产物在330g硅胶柱上、用0％-50％乙酸乙酯/己烷进行快速层析(Isco)。在浓缩和干燥之后，获得14.0g(95.9％，33.6mmol)非常淡的、澄清琥珀色胶质状纯产物。MS(ESI+)m/z:417[M++H+],MS(ESI-)m/z:415[M--H-]；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ0.95-1.03(2H,m),1.22-1.37(4H,m),1.69-1.79(1H,m),1.87-1.97(1H,m),3.00-3.06(2H,q),4.14-4.19(1H,d),5.34-5.39(1H,d),6.61-6.65(1H,d),6.74-6.78(1H,d),7.15-7.19(3H,m),7.27-7.38(5H,m),9.31(1H,br)。
K.由N-[6-(6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-乙酰胺合成N-[6-(11,12-二溴-11,12-二氢-6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-乙酰胺
将吡啶鎓三溴化物(8.48g，26.5mmol)添加至N-[6-(6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-乙酰胺(9.95g，23.9mmol)于二氯甲烷(200mL)中的溶液中。将反应混合物在氩气下在室温下搅拌4.5小时，然后用1)2X120mL 0.5M水性HCl、2)120mL水和3)120mL盐水洗涤。在用无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩之后，使粗制产物在330g硅胶柱上用0％-50％乙酸乙酯己烷进行快速层析(Isco)。在浓缩和干燥之后，将产物两次溶解于150mL二氯甲烷中并进行浓缩。在真空中进行干燥，得到10.5g(76.1％，18.2mmol)非常淡的青灰色泡沫状产物。MS(ESI+)m/z:577[M++H+]；MS(ESI-)m/z:575[M--H-]；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:1.13-1.20(2H,m),1.35-1.59(4H,m),1.95-2.29(2H,m),3.07-3.13(2H,q),4.17-5.08(1H,m),5.69-5.87(2H,m),6.97-7.31(7H,m),7.55-7.65(1H,m),9.33(1H,s)。
L.由N-[6-(11,12-二溴-11,12-二氢-6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-乙酰胺合成N-(6-三氟乙酰胺基己酰基)-5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因
将N-[6-(11,12-二溴-11,12-二氢-6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-乙酰胺于无水THF(31mL)中的溶液添加至1M叔丁醇钾/THF溶液(35mL，35mmol)中。将反应混合物在氩气下在室温下搅拌2小时。缓慢添加约8.5mL水以淬灭反应，并且用约180mL乙酸乙酯稀释。然后将该混合物用200mL 1％水性HCL、200mL水和200mL盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩。通过在120g硅胶柱上用0％-10％乙酸乙酯/二氯甲烷的快速色谱法(Isco)将粗制产物纯化。在浓缩和干燥之后，获得珊瑚色胶质/泡沫状产物(3.05g，62.8％，7.36mmol)。MS(ESI-)m/z:413[M--H-]；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ0.96-1.15(2H,m),1.23-1.49(4H,m),1.88-1.98(1H,m),2.04-2.26(1H,m),3.02-3.27(2H,m),3.64-3.69(1H,d),5.14-5.18(1H,d),6.58(1H,br),7.24-7.44(7H,m),7.68-7.70(1H,d)。
M.由N-(6-三氟乙酰胺基己酰基)-5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因合成N-(6-氨基己酰基)-5,6-二氢-11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因
将碳酸钾(1.00g，7.24mmol)于水(7.5mL)中的溶液缓慢添加至N-(6-三氟乙酰胺基己酰基)-5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因(1.04g，2.51mmol)于甲醇(10mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌49小时。进行浓缩并分配在40mL氯仿/40mL盐水中。将水层用40mL氯仿萃取。将有机层合并，并且添加40mL乙酸乙酯以有助于溶解性。在用无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩之后，将粗制产物以两份注射液形式通过反向快速色谱法(Isco)纯化，使用275g C18柱20-40微米、用5％-95％乙腈(0.1％AcOH)/水(0.1％AcOH)洗脱。在冷冻干燥之后，获得乙酸盐形式的产物(淡黄色-棕灰色泡沫：0.577g，60.7％，1.52mmol)。MS(ESI+)m/z:319[M++H+]。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ0.98-1.07(2H,m),1.27-1.44(4H,m),1.85-1.95(4H,m),2.14-2.23(1H,m),2.54-2.59(2H,t),3.62-3.67(2H,d),5.13-5.17(1H,d),6.20(3H,br),7.23-7.42(7H,m),7.67-7.70(1H,d)。
实例IV
合成I4
A.由maytan-N-Me-L-Ala戊二酸NHS酯和DIBCO-二甲基-PEG4-胺合成maytan-N-Me-L-Ala戊二N-Me-PEG4-N-Me-DIBCO(I4)
将maytan-N-Me-L-Ala戊二酸NHS酯(160mg，0.186mmol)和DIBCO-二甲基-PEG4-胺(210mg，0.354mmol)的溶液溶解在乙腈(5ml)和水(1ml)的混合物中并且用水性饱和NaHCO3(0.5ml)处理。然后将该反应混合物在氩气下在室温下搅拌过夜并且在减压下浓缩。将粗制的残余物通过反相色谱法纯化，使用C18柱，20-40微米(50g)，用于水(0.1％AcOH)中的乙腈(0.1％AcOH)的梯度(18min内10％-95％)洗脱，进行冷冻干燥，获得白色固体状maytan-N-Me-L-Ala戊二N-Me-PEG4-N-Me-DIBCO(I4)(135mg，0.10mmol，54％收率)。MS m/z:1340.9[MH+],1323.4[M-18],1362.6[M+Na]；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ:0.82(3H,s),0.99-1.01(2H,m),1.26-1.33(8H,m),1.42-1.48(3H,m),1.60-1.67(4H,m),1.88-1.96(2H,m),1.98-2.03(1H,m),2.11(3H,s),2.19-2.21(2H,m),2.36-2.38(2H,m),2.42-2.44(1H,m),2.53-2.64(5H,m),2.82-2.90(6H,m),3.00-3.14(5H,m),3.19-3.22(4H,m),3.38(3H,s),3.47-3.70(17H,m),3.78(2H,m),4.00(3H,s),4.31(1H,t),4.78-4.81(1H,m),5.19(1H,d),5.40(1H,bs),5.67-5.72(1H,m),6.35(1H,s),6.42-6.48(1H,m),6.70-6.76(2H,m),6.85(1H,s),7.29-7.44(8H,m),7.72-7.74(1H,m)。
B.由3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸和三氟乙酸乙酯合成3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸
将三氟乙酸乙酯(1.4mL，1.7g，12mmol)和三乙胺(1.3mL，0.94g，9.3mmol)添加至3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸(2.43g，9.16mmol)于甲醇(8.0mL)中的溶液中。将反应混合物在氩气下在室温下搅拌17.5小时并且浓缩。然后通过在275g C18Isco金柱上、用5％-95％乙腈/水(具有0.1％乙酸)的反相快速色谱法(Isco)纯化粗制产物。在冷冻干燥之后，获得淡黄色浆料状产物(1.79g，54.1％，4.95mmol)。
MS m/z MH+362；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:2.40-2.45(2H,t),3.32-3.36(2H,m),3.47-3.51(14H,m),3.56-3.60(2H,m),9.47(1H,br),12.15(1H,br)。
C.由3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸合成3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯
将3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸(0.520g，1.43mmol)于二氯甲烷(10mL)和甲醇(5mL)中的溶液用(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷于二***(1mL，2mmol)中的2M溶液处理，并且在室温下搅拌1小时。添加另外的等份部分的(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷于二***(1mL，2mmol)中的2M溶液，并且将溶液在室温下搅拌1天。在真空中蒸发溶剂。将产物施加至硅胶柱(40g)并且用甲醇于二氯甲烷中的梯度(1％-10％)洗脱，提供淡黄色油状最终产物0.536g(100％)。MS(ESI+)m/z:376.0[MH+]。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:2.60(2H,t),3.51-3.56(2H,m),3.60-3.64(14H,m),3.66(3H,s),3.73(2H,t)和7.86(1H,br s)。
D.由3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯合成3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯
将3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙酰氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸甲酯175(0.290g，0.77mmol)于DMF(4mL)中的溶液用碳酸钾(0.320g，2.31mmol)和碘甲烷(0.287mL，4.63mmol)处理，并且将所得混合物在室温下搅拌1天。将混合物在冰浴上冷却并且用冷的1N盐酸(1mL)处理。将所得溶液施加至反相C18柱，20-40微米(50g)并且用乙腈(0.1％AcOH)于水(0.1％AcOH)中的梯度(5％-95％)洗脱并且冷冻干燥，提供无色油0.29g(64％)状产物0.217g(72％)。LCMS(ESI+)m/z:390.0[MH+]。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:2.60(2H,t),3.21(2H,q),叠加于3.68(3H,s)上的3.58-3.70(17H,m)和3.75(2H,t)。
E.由3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯合成3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸钠盐
将3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸甲酯(0.433g，1.1mmol)于甲醇(1mL)中的溶液用1M水性氢氧化钠(2.9mL，2.9mmol)处理，并且在60C下加热2小时。将溶液冷却至室温并且在真空中蒸发溶剂。将材料溶解在乙腈中，并且在真空中蒸发溶剂(重复两次)。将所得残余物在真空中干燥，并且在未进一步纯化的情况下用于后续步骤中。MS(ESI+)m/z:280.4[MH+]。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:1.89(2H,t),1.94-1.99(6H,m),2.99-3.14(10H,m),2.95(6H,d)和8.90(1H,br s)。
F.由3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸钠盐合成3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸
将三氟乙酸酐(6mL)添加至3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸钠盐中并且将混合物在室温下搅拌3小时。在真空中蒸发溶剂。将残余物溶解在乙腈:水(1:1)中并且施加至反相C18柱，20-40微米(150g)并且用乙腈(0.1％AcOH)于水(0.1％AcOH)中的梯度(5％-95％)洗脱并且冷冻干燥，提供无色油状产物0.383g(92％，对于2步)。MS(ESI+)m/z:376.0[MH+]。MS(ESI-)m/z:374.0[M-H]-。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:2.58-2.71(2H,m),3.13和3.22(3H,每个s),3.63(16H,m)和3.76(2H,t)。
G.由1-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-甲基氨基-己烷-1-酮乙酸盐和3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸合成N-[6-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-N-甲基-3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰胺
将1-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-甲基氨基-己烷-1-酮乙酸盐(0.283g，0.721mmol)于二氯甲烷(20mL)中的溶液用饱和的水性碳酸氢钠(20mL)洗涤并经硫酸钠干燥。在真空中蒸发溶剂以提供1-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-甲基氨基-己烷-1-酮的游离碱0.22g(92％)，该游离碱用于后续步骤中。
将3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酸(0.248g，0.660mmol)于DMF(4mL)中的溶液用五氟苯基二苯基亚膦酸酯(0.305g，0.794mmol)和N,N-二异丙基乙胺处理。将所得溶液添加至1-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-甲基氨基-己烷-1-酮的游离碱(0.22g，0.662mmol)中并且在室温下搅拌20小时。添加水(1mL)并且将溶液施加至反相C18柱，20-40微米(150g)并且用乙腈(0.1％AcOH)于水(0.1％AcOH)中的梯度(30％-95％)洗脱并且冷冻干燥，提供无色油状产物0.322g(71％)。MS(ESI+)m/z:690.0[MH+]和712.0[MNa+]。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:0.92-1.03(2H,m),1.26-1.34(2H,m),1.35-1.46(2H,m),1.87-1.97(1H,m),2.15-2.21(1H,m),2.50-2.57(2H,m),2.79和2.89(共3H,每个s),3.04-3.07(1H,m),3.10和3.21(共3H,每个s),3.14-3.19(1H,m),3.61-3.69(17H,m),3.73-3.77(2H,m),5.16(1H,dd),7.22-7.43(7H,m)和7.70(1H,d)。
H.由N-[6-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-N-甲基-3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰胺合成N-[6-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-N-甲基-3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰胺
将N-[6-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-N-甲基-3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰胺(0.322g，0.467mmol)于甲醇(10mL)中的溶液用碳酸钾(0.323g，2.33mmol)处理，并且将混合物在室温下搅拌一天。添加另外部分的碳酸钾(0.323g，2.33mmol)并且再持续搅拌。通过过滤去除无机物，并且在真空中蒸发溶剂。将残余物溶解在乙腈/水(1/1)中并且施加至反相C18柱，20-40微米(150g)并且用乙腈(0.1％AcOH)于水(0.1％AcOH)中的梯度(5％-95％)洗脱并且冷冻干燥，提供N-[6-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-N-甲基-3-{2-[2-(2-{2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰胺0.218g(71％)和稍微不纯的产物0.048g(16％)。MS(ESI+)m/z:594.0[MH+]。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:0.85-0.90(2H,m),1.11-1.29(4H,m),1.75-1.86(1H,m),2.12-2.17(1H,m),2.27(3H,m),2.40(1H,t),2.46(1H,t),2.59(2H,t),2.66和2.80(共3H，每个s),2.98-3.09(2H,m),3.42-3.63(17H,m),5.04(1H,d),7.30-7.49(6H,m),7.57(1H,d)和7.63(1H,d)。
I.由N-甲基己内酰胺合成6-甲基氨基已酸盐酸盐
将N-甲基己内酰胺(1.12g，8.81mmol)于5.3mL浓的水性HCl和6.7mL水中的溶液回流19.5小时。允许该反应混合物冷却至室温，并且添加20mL水。然后进行浓缩。添加10mL水，并且再次浓缩混合物。将以下进行两次：然后添加5mL丙酮并且浓缩混合物。在真空中干燥，产生奶油色半固体状产物(1.57g，98.1％，8.64mmol)。(45-149)
MS m/z MH+146；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:1.24-1.34(2H,m),1.44-1.62(4H,m),2.18-2.23(2H,t),2.77-2.86(2H,m),8.70(2H,br),12.05(1H,s,br)。(45-149-1NMR)
J.由6-甲基氨基已酸盐酸盐合成6-[甲基-(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-己酸
将6-甲基氨基已酸盐酸盐(5.38g，29.6mmol)溶解于20mL甲醇中，并且添加三氟乙酸乙酯(4.4mL，5.3g，37mmol)和三乙胺(8.3mL，6.0g，60mmol)。将该反应混合物在氩气下在室温下搅拌19.5小时。添加80ml 2M水性HCl，并且将混合物用3X60mL***萃取。然后将合并的有机层用100mL盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥、在真空中过滤、浓缩并干燥，产生澄清、淡黄色浆料状产物(6.86g，96.1％，28.4mmol)。(53-15)
MS m/z MH+242；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:1.16-1.28(2H,m),1.45-1.60(4H,m),2.17-2.24(2H,m),2.94(1H,s),3.06-3.07(2H,q),3.32-3.39(2H,m)。(45-150-1NMR)
K.由6-[甲基-(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-己酸合成6-[甲基-(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-己酰氯
将6-[甲基-(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-己酸(6.84g，28.4mmol)于二氯甲烷(140mL)中的溶液在氩气下预冷至0C。缓慢添加草酰氯(12mL，18g，142mmol)，并且然后添加6滴DMF。将混合物在0C下搅拌1小时，并且在室温下搅拌1.5小时。然后在真空中进行浓缩和干燥，产生淡琥珀色油状产物(6.54g，88.9％，25.2mmol)。(53-16)
1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:1.35-1.43(2H,m),1.57-1.81(4H,m),2.89-2.94(2H,m),3.02(1H,s),3.11-3.13(2H,q),3.37-3.46(2H,m)。(对于NMR 45-152-1)。
L.由二苯并[a,d]环庚烯-5-酮合成二苯并[a,d]环庚烯-5-酮肟
将二苯并[a,d]环庚烯-5-酮(25.0g，121mmol)和羟胺HCl(12.6g，181mmol)于吡啶(70mL)中的溶液回流15.5小时。允许该反应混合物冷却至室温，并且在真空中浓缩。将残余物分配在5％水性HCl/冰(300mL)与乙酸乙酯(200mL)之间。将水层用乙酸乙酯(150mL)萃取两次。将有机层合并并且用盐水(250mL)洗涤，并且经硫酸钠干燥。在真空中蒸发溶剂，提供淡黄色-棕灰色固体状产物26.8g(100％)。MS(ESI+)m/z:222[MH+]；MS(ESI-)m/z:220[M-H-]；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:6.91-6.92(2H,d),7.33-7.43(6H,m),7.56-7.61(1H,m),7.65-7.68(1H,m),8.55(1H,s)。
M.二苯并[a,d]环庚烯-5-酮肟至5,6-二氢-二苯并[b,f]吖辛因
将二异丁基氢化铝于二氯甲烷(1.0M，192mL)中的溶液在水浴上冷却并且将固体二苯并[a,d]环庚烯-5-酮肟(8.48g，38.3mmol)以将温度维持在15C-27C之间的速率分批添加。移开水浴并且将所得溶液在室温下搅拌3天。将溶液在水浴上冷却并且将固体十水硫酸钠(20.4g，63.3mmol)以将温度维持在12 C-30 C之间的速率分批添加。添加硅藻土并且将混合物在室温下搅拌1小时。将无机物通过过滤分离并且用乙酸乙酯充分洗涤。将有机溶液合并并且在真空中蒸发溶剂。将残余物施加至硅胶柱(150g)并且用二氯甲烷(20％-100％)于己烷中的梯度洗脱，提供黄色固体状产物5.0g(63％)。MS m/z:208.4[MH+]；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:4.29(1H,br s),4.59(2H,s),6.39(1H,d),6.50(1H,dd),6.58(1H,d),6.61-6.66(1H,m),6.89-6.95(1H,m),7.00(1H,dd),7.19-7.32(4H,m)。
N.由5,6-二氢-二苯并[b,f]吖辛因(24)和6-[甲基-(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-己酰氯合成N-[6-(6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺
将于二氯甲烷(8mL)中的吡啶(3.6mL，3.5g，45mmol)和6-[甲基-(2,2,2-三氟乙酰基)-氨基]-己酰氯(4.64g，17.9mmol)添加到来自5,6-二氢-二苯并[b,f]吖辛因(3.11g，15.0mmol)的N-[6-(6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺(26a)于二氯甲烷(40mL)中的溶液。将反应混合物在氩气下在室温下搅拌2.5小时。然后用150mL二氯甲烷稀释并且用150mL水洗涤。用150mL的二氯甲烷萃取水层。然后将合并的有机层用150mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩。使粗制产物在220g硅胶柱(Isco)上、用0％-50％乙酸乙酯/己烷进行快速层析(Isco)。在真空中浓缩和干燥之后，获得稠的黄色浆料状产物。(5.64g，87.4％，13.1mmol)。(53-36)
MS m/z MH+431；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:0.90-1.00(2H,m),1.26-1.40(4H,m),1.70-1.82(1H,m),1.88-1.98(1H,m),2.86(1H,s),2.99-3.01(2H,q),3.18-3.26(2H,m),4.12-4.18(1H,dd),5.32-5.39(1H,dd),6.61-6.66(1H,dd),6.73-6.79(1H,dd),7.13-7.20(3H,m),7.25-7.38(5H,m)。(对于NMR 53-6-1)。
O.由N-[6-(6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺合成N-[6-(11,12-二溴-11,12-二氢-6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺
将吡啶鎓三溴化物(1.47g，4.60mmol)添加至N-[6-(6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺(1.80g，4.18mmol)于二氯甲烷(7.8mL)中的溶液中。将反应混合物搅拌约3小时。然后用100mL二氯甲烷稀释并且用2X55mL 5％水性HCl洗涤。然后将有机层用55mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩。使粗制产物在120g硅胶柱(Isco Gold)上、用0％-50％乙酸乙酯/己烷进行快速层析(Isco)。然后在真空中进行浓缩和干燥，产生白色泡沫状产物(1.93g，78.1％，3.27mmol)。(53-21)
MS m/z MH+591；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:1.10-1.19(2H,m),1.38-1.63(4H,m),2.02-2.33(2H,m),2.90(1H,s),3.02-3.03(2H,d),3.28-3.34(2H,m),4.18-5.09(1H,m),5.69-5.75(1H,m),5.81-5.87(1H,t),6.97-7.31(7H,m),7.55-7.65(1H,m)。(45-162-1NMR)
P.由N-[6-(11,12-二溴-11,12-二氢-6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺合成N-[6-(5,6-二氢-11,12-二氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺
将叔丁醇钾于THF(1.0M，5.3mL，5.3mmol)中的溶液逐滴添加至N-[6-(11,12-二溴-11,12-二氢-6H-二苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺(1.2g,2.03mmol)于THF(15mL)中的溶液中，在冰浴上冷却，并且搅拌1小时。将溶液用乙酸乙酯稀释并且在快速搅拌下缓慢倒入1N HCl中，在冰浴上冷却。将有机层分离并且用乙酸乙酯萃取水层。将合并的有机相用盐水洗涤并且经硫酸钠干燥。在真空中蒸发溶剂，并且将残余物施加至硅胶柱(40g)并且用乙酸乙酯于己烷中的梯度(20％-80％)洗脱，产生琥珀油状产物0.681g(80％)。MS(ESI+)m/z:429.2[MH+]。1HNMR(300MHz,CDCl3):0.93-1.05(2H,m),1.31-1.48(4H,m),1.87-1.99(1H,m),2.15-2.24(1H,m),2.94(3H,d),3.14-3.27(2H,m),3.66(1H,dd),5.16(1H,dd),7.24-7.431(7H,m)和7.70(1H,d)。
Q.由N-[6-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺(28a)合成1-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因-5-基)-6-甲基氨基-己烷-1-酮乙酸盐(29a)。
将N-[6-(5,6-二氢-11,12-二脱氢苯并[b,f]吖辛因)-6-氧代-己基]-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺(0.681g，1.61mmol)于甲醇(10mL)中的溶液用碳酸钾(0.67g，4.85mmol)和水(1mL)处理并且在室温下搅拌18小时。在真空中蒸发溶剂，并且将残余物溶解于二氯甲烷中并且用水洗涤。在真空中蒸发溶剂，并且将残余物施加至反相C18柱，20-40微米(150g)并且用乙腈(0.1％AcOH)于水(0.1％AcOH)中的梯度(5％-95％)洗脱。通过冷冻干燥去除溶剂，产生乙酸盐形式的粘性褐色固体状产物0.533g(84％)。MS(ESI+)m/z:333.2[MH+]。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:0.88-0.96(2H,m),1.11-1.28(4H,m),叠加于1.80(3H,s)上的1.75-1.85(1H,m),2.07-2.18(1H,m),2.22(3H,s),2.31(2H,t),3.61(1H,d),5.04(1H,d)和7.28-7.64(8H,m)。
在此引用的所有公开物和专利通过引用结合在此。在不偏离本披露的范围和精神的情况下，所描述的组合物和方法的修改和变化现在对于本领域的技术人员将是清楚的。虽然已结合特定实施例描述了本发明，但应当理解，要求保护的本发明不应限于特定实施例。实际上，鉴于本披露，对于本领域技术人员来说清楚的用于实施本发明所描述的组合物和方式的修改旨在所要求保护的主题的范围内。

Claims (20)

1.一种具有化学式I的分离的化合物
其中
A是应变炔烃环或应变烯烃环，其中该环是碳环基或杂环基；
D是有效负载；
每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-CO-、-CR1R2-、-NR3-、-S-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、烷基、C3-C8碳环基、-O-(CR1R2)a-、芳基、-(CR1R2)a-芳基、杂芳基、-(CR1R2)a-杂芳基、-(CR1R2)a-C3-C8碳环基、杂环基、-(CR1R2)a-杂环基、-(CH2CH2O)a-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、-(CH2)aC(O)-、氨基酸以及肽；
R1和R2各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、-SO2R3、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、聚亚乙基氧基、膦酸根、磷酸根、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、芳基、杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；或，当合在一起时，R1和R2形成羰基(＝O)、或3至7个碳原子的螺碳环；并且，
R3选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；
烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选独立地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、C1-C8烷基磺酸根、C1-C8烷基氨基、4-二烷基氨基吡啶鎓、C1-C8烷基羟基、C1-C8烷硫基、-SO2R、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、C1-C8三氟代烷基、C1-C8烷基、C3-C12碳环、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基、C2-C20杂环基、聚亚乙基氧基、膦酸根以及磷酸根；
m是从1至100的整数；并且，
a和b各自是从1至100的整数。
2.根据权利要求1所述的具有化学式I的分离的化合物，其中每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-(CH2CH2O)a-、-(CH2)aC(O)NR3-、-(CH2)aNR3C(O)-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2)b-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2CH2O)b-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2CH2O)b(CH2)c-、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2CH2O)b-、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2CH2O)b、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2)b-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、—(CH2)aC(O)-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、-S-、-SO-、-SO2-、二肽、三肽；
以及，
其中G选自下组，该组由以下各项组成：烷基、芳基、碳环基和杂环基；以及，
其中H1、H2和H3各自独立地选自N或CR1。
3.根据权利要求1所述的具有化学式I的分离的化合物，其中每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：
其中：
J是氨基酸或肽；
d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至30的整数；
h是从0至30的整数；
每个R4独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、烷基、-N(R3)2、-SR3以及C1-C8烷氧基、芳基；并且，
R5选自下组，该组由以下各项组成：H、-N(R3)2、-SR3、C1-C8烷氧基、芳基以及NO2。
4.根据权利要求1所述的具有化学式I的分离的化合物，该分离的化合物选自下组，该组由以下各项组成：
R＝H或CH3(甲基)；以及，
5.一种具有化学式III或化学式III’的分离的共轭物
其中：
CB是细胞结合剂；
M是非天然氨基酸；
A’是碳环基或杂环基
D是有效负载；
每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-CO-、-CR1R2-、-NR3-、-S-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、烷基、C3-C8碳环基、-O-(CR1R2)a-、芳基、-(CR1R2)a-芳基、杂芳基、-(CR1R2)a-杂芳基、-(CR1R2)a-C3-C8碳环基、杂环基、-(CR1R2)a-杂环基、-(CH2CH2O)a-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、-(CH2)aC(O)-、氨基酸以及肽；
R1和R2各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、-SO2R3、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、聚亚乙基氧基、膦酸根、磷酸根、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、芳基、杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；或，当合在一起时，R1和R2形成羰基(＝O)、或3至7个碳原子的螺碳环；并且，
R3选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；
烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选独立地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、C1-C8烷基磺酸根、C1-C8烷基氨基、4-二烷基氨基吡啶鎓、C1-C8烷基羟基、C1-C8烷硫基、-SO2R、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、C1-C8三氟代烷基、C1-C8烷基、C3-C12碳环、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基、C2-C20杂环基、聚亚乙基氧基、膦酸根以及磷酸根；
m是从1至100的整数；并且，
a和b各自是从1至100的整数。
6.根据权利要求5所述的分离的共轭物，其中每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-(CH2CH2O)a-、-(CH2)aC(O)NR3-、-(CH2)aNR3C(O)-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2)b-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2CH2O)b-、-(CH2)aC(O)NR3(CH2CH2O)b(CH2)c-、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2CH2O)b-、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2CH2O)b、-(CH2CH2O)aC(O)NR3(CH2)b-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、—(CH2)aC(O)-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、-S-、-SO-、-SO2-、二肽、三肽；
以及，
其中G选自下组，该组由以下各项组成：烷基、芳基、碳环基和杂环基；以及，
其中H1、H2和H3各自独立地选自N或CR1。
7.根据权利要求5所述的分离的共轭物，其中每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：
以及，
其中：
J是氨基酸或肽；
d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至30的整数；
h是从0至30的整数；
每个R4独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、烷基、-N(R3)2、-SR3以及C1-C8烷氧基、芳基；并且，
R5选自下组，该组由以下各项组成：H、-N(R3)2、-SR3、C1-C8烷氧基、芳基以及NO2。
8.根据权利要求5所述的分离的共轭物，其中M具有以下结构
其中p和q各自是从0-10的整数；
R6是H、氨基酸、多肽或键；
R7是OH、氨基酸、多肽或键；
V是烷基、芳基、碳环、杂环或不存在；并且，
W是O、N、S或不存在。
9.根据权利要求8所述的分离的共轭物，其中M选自下组，该组基本上由以下各项组成：
10.一种具有化学式III或化学式III’的分离的共轭物，是通过使具有化学式I的化合物与具有化学式II的化合物反应的方法产生的
其中，参考化学式I，
A是应变炔烃环或应变烯烃环，其中该环是碳环基或杂环基；
D是有效负载；
每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：-CO-、-CR1R2-、-NR3-、-S-S-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-、-CR3＝N-NR3-、-CR3＝N-O-、-CR3＝N-NR3-CO-、-N＝N-CO-、烷基、C3-C8碳环基、-O-(CR1R2)a-、芳基、-(CR1R2)a-芳基、杂芳基、-(CR1R2)a-杂芳基、-(CR1R2)a-C3-C8碳环基、杂环基、-(CR1R2)a-杂环基、-(CH2CH2O)a-、-(CH2CH2O)a-(CH2)b、-(CH2)aC(O)-、氨基酸以及肽；
R1和R2各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、-SO2R3、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、聚亚乙基氧基、膦酸根、磷酸根、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、芳基、杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；或，当合在一起时，R1和R2形成羰基(＝O)、或3至7个碳原子的螺碳环；并且，
R3选自下组，该组由以下各项组成：H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基以及C1-C20杂环基；
烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基和杂环基任选独立地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：F、Cl、Br、I、OH、-N(R3)2、-N(R3)3 +、C1-C8卤代烷、羧酸根、硫酸根、氨基磺酸根、磺酸根、C1-C8烷基磺酸根、C1-C8烷基氨基、4-二烷基氨基吡啶鎓、C1-C8烷基羟基、C1-C8烷硫基、-SO2R、-S(＝O)R3、-SR3、-SO2N(R3)2、-C(＝O)R3、-CO2R3、-C(＝O)N(R3)2、-CN、-N3、-NO2、C1-C8烷氧基、C1-C8三氟代烷基、C1-C8烷基、C3-C12碳环、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C3-C8碳环基、C2-C20杂环基、聚亚乙基氧基、膦酸根以及磷酸根；
m是从1至100的整数；
a和b各自是从1至100的整数；并且，
其中，参考化学式II，
CB是细胞结合剂；M是非天然氨基酸；T是叠氮基团或四嗪基团；并且，
参考化学式III和化学式III’，
A’是碳环基或杂环基。
11.根据权利要求10所述的通过该方法产生的具有化学式III或化学式III’的分离的共轭物，其中参考化学式I，每个E独立地选自下组，该组由以下各项组成：
其中J是氨基酸或肽；
d、e、g、i、j和k各自独立地是从1至30的整数；
h是从0至30的整数；
每个R4独立地选自下组，该组由以下各项组成：H、烷基、-N(R3)2、-SR3以及C1-C8烷氧基、芳基；并且，
R5选自下组，该组由以下各项组成：H、-N(R3)2、-SR3、C1-C8烷氧基、芳基以及NO2。
12.根据权利要求10所述的通过该方法产生的具有化学式III或化学式III’的分离的共轭物，其中具有化学式I的每种化合物独立地选自下组，该组由以下各项组成：
R＝H或CH3(甲基)；以及，
13.根据权利要求1所述的分离的化合物，其中D是美登木素生物碱。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中该美登木素生物碱具有以下结构
15.根据权利要求5所述的分离的共轭物，其中D是美登木素生物碱。
16.根据权利要求15所述的分离的共轭物，其中该美登木素生物碱具有以下结构
17.一种药物组合物，包含有效量的根据权利要求5所述的共轭物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
18.一种药物组合物，包含有效量的根据权利要求15所述的共轭物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
19.一种治疗哺乳动物的病症的方法，包括给予有效量的根据权利要求5所述的共轭物。
20.一种治疗哺乳动物的病症的方法，包括给予有效量的根据权利要求15所述的共轭物。
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